绪论 生物化学(biochemistry)是用化学、物理学和生物学的原理和方法,研究生物体内物质的化学组成、结构和功能,以及生命活动过程中各种化学变化过程及其与环境之间相互关系的基础生命学科。生物化学早期主要采用化学、物理学和数学的原理和方法,研究各种形式的生命现象,随着研究的发展,融入了生理学、细胞生物学、遗传学和免疫学等的理论和技术,加之近年来生物信息学的介入,使之与众多学科有着广泛的联系和交叉。 20世纪50年代,伴随着(生物)物理学、遗传学、细胞学、生物信息学等学科的发展和渗透,生物化学发展进入了以研究生物大分子(主要是蛋白质和核酸)的结构与功能、进而阐明生命现象本质为核心的分子生物学(molecul ar biology)时期。分子生物学的发展揭示了生命本质的高度有序性和一致性,是人类在认识论上的重大飞跃。从广义上理解,分子生物学是生物化学的重要组成部分,也被视作生物化学的发展和延续,因此,分子生物学的飞速发展,无疑为生物化学的发展注入了生机和活力。近年来迅猛发展的生物化学学科,研究成果累累,促进了相关和交叉学科,特别是医学的发展,已成为生命科学的重要学科之一。 第一节生物化学与分子生物学发展简史 生物化学一词出自於德国的Felix H,他千1877年提出“biochemie”一词,译成英语为"biochemistry",即生物化学。人们很早就认识到生物化学是关于生物体的组成和功能的研究,但直到19世纪才真正发展成为一门独立的学科,并在20世纪初期蓬勃发展起来,近50年来又有许多重大的进展和突破,成为生命科学领域重要的前沿学科之一。20世纪50年代,苏联生物化学家提出,生物化学的发展可分为叙述生物化学、动态生物化学和机能生物化学三个阶段。第三个阶段正是分子生物学崛起、并迅速发展成为一门独立学科的阶段,故亦称为分子生物学阶段。 一、叙述生物化学阶段 18世纪中叶至20世纪初是生物化学的初期阶段,也称为叙述生物化学阶段,主要研究生物体的化学组成,并对其进行分离、纯化、合成、结构测定及理化性质的研究。期间的重要贡献有:发现了生物氧化作用的本质;对脂质、糖类及氨基酸的性质进行了较为系统的研究;发现并分离了核酸;发现了维生素对人体的作用;从血液中分离了血红蛋白;证实了连接相邻氨基酸的肤键的形成,提出了蛋白质分子结构的多肤学说;体外合成了尿素、嗦呤和简单的多肤;发现酵母发酵可产生醇并产生CO2,酵母发酵过程中存在“可溶性催化剂",奠定了酶学的基础等。 二、动态生物化学阶段 从20世纪20年代开始,生物化学学科蓬勃发展,开始认识体内各种分子的代谢变化,进入了动态生物化学阶段。例如:在营养方面,发现了人类必需氨基酸、必需脂肪酸及多种维生素;在内分泌方面,发现了多种激素,并将其分离合成;在酶学方面,认识到酶的化学本质是蛋白质,酶晶体制备获得成功;在物质代谢方面,由于化学分析及核素示踪技术的发展与应用,对生物体内主要物质的代谢途径已基本确定,包括糖代谢途径的酶促反应过程、脂肪酸B-氧化、尿素合成途径及三狻酸循环等。在生物能研究中,提出了生物能产生过程中的ATP循环学说。在这一阶段,一些技术方法在生物化学研究中的应用,如放射性核素标记、电泳和X射线晶体学等,极大地推动了学科发展。 三、机能生物化学阶段(分子生物学阶段) 20世纪后半叶以来,生物化学发展的显著特征是分子生物学的崛起。其间,物质代谢途径的研究继续发展,并进入合成代谢与代谢调节的研究。 1.蛋白质结构与生物合成20世纪50年代初期发现了蛋白质的a-螺旋的二级结构形式;完成了胰岛素和核糖核酸酶的氨基酸序列分析;发现了转运RNA和氨酰-tRNA合成酶以及它们在蛋白质合成中的作用,阐明了氨基酸参与蛋白质合成的活化机制;利用X-射线衍射和冷冻电镜技术解析了烟草花叶病病毒的结构等。 2. DNA双螺旋结构和中心法则关千遗传物质DNA的研究可以看作是第三阶段的标志性研究。1953年,Watson JD和C rick FH提出DNA双螺旋结构模型,为揭示遗传信息传递规律奠定了基础;同年,Brenner S提出信使RNA的概念,并证实了其在指导合成蛋白质中的作用;随后,tRNA的序列和结构被确立,遗传密码被破译。此后,对DNA的复制机制、RNA的转录过程以及蛋白质合成过程进行了深入研究;通过对大肠杆菌乳糖代谢的研究,阐明了基因通过控制酶的生物合成调节细胞代谢的模式,提出了操纵子学说。这些成果深化了人们对核酸与蛋白质的关系及其在生命活动中作用的认识。 2003年9月,DNA元件百科全书(the Encyclopedia of DNA Elements, ENCODE)计划正式启动,其目的在于鉴定人类基因组中所有的功能片段。 蛋白质组学(proteomics)研究包括阐明蛋白质的定位、结构与功能、相互作用以及特定时空的蛋白质表达谱等,已成为生物化学的又一研究热点。由于蛋白质具有更为复杂的三维结构,无疑确定人类所有蛋白质的结构比测定大类基因组序列更具挑战性。 转录物组学(transcriptomics)研究细胞在某一功能状态下基因组转录产生的全部转录物的种类、结构和功能。RNA组学(RNomics)主要研究snmRNA的种类、结构、功能等,探讨同一生物不同组织细胞或同一细胞在不同时空状态下snmRNA的表达谱及其功能的变化及其与蛋白质的相互作用。 代谢组学(metabonomics)研究的是生物体对外源性物质的刺激、环境变化或遗传修饰所作出的所有代谢应答的全貌和动态变化过程,其研究对象为完整的多细胞生物系统,包括了生命个体与环境的相互作用。 糖组学(glycomics)主要研究单个生物体所包含的所有聚糖的结构、功能(包括与蛋白质的相互作用)等生物学作用,糖组学的出现使人类可以更深刻理解第三类生物信息大分子—一聚糖在生命活动中的作用。 绪论 总之,阐明人类基因组功能是一项多学科的任务,正吸引着生物学、医学、化学、物理、数学、工程和计算机等领域的学者共同参与,从中整合所有基因组信息,分析各种数据并提取其生物学意义,因而产生了一门前景广阔的新兴学科一生物信息学(bioinformat ics)。尽管生物化学与分子生物学的发展异常迅速,但人类基因组序列的揭晓仅是序幕而已,生命本质的阐明任重而道远。 四、中国科学家对生物化学发展的贡献 早在西方生物化学诞生之前,我们的祖先就已在生产、饮食以及医疗等方面积累的丰富的经验,其中许多成为现代生物化学的发展基础。 公元前22世纪,我国人民已能酿酒,这是我国古代用“曲”作“媒"(即酶)催化谷物淀粉发酵的实践。周礼中有造酱、制怡的记载,伤寒论中用豆鼓作为健胃剂;内经素问中有关千糖的营养价值的记载,并记载了完全膳食必备的条件,且区分了谷、畜、果、蔬四类食物的营养性质。我们现在也已知道,古入用于治疗预防"脚气病”“夜盲症”的药品或食品富含维生素B1或维生素A。本草纲目中不仅记录了上千种的药物,并且对人体的代谢物及分泌物进行了比较详细的记载。 近代生物化学发展时期,我国生物化学家吴宪等在血液化学分析方面,创立了血滤液的制备和血糖测定法;在蛋白质研究中提出了蛋白质变性学说。我国生物化学家刘思职在免疫化学领域,用定量分析方法研究抗原抗体反应机制,成为免疫化学的创始人之一。1965年,我国科学家首先采用人工方法合成了具有生物活性的牛胰岛素,解出了猪胰岛素的晶体结构;1981年,采用了有机合成和酶促相结合的方法成功地合成了酵母丙氨酰tRNA。此外,在酶学、蛋白质结构、生物膜结构与功能方面的研究都有举世瞩目的成就。近年来,我国的基因工程、蛋白质工程、新基因的克隆与功能、疾病相关基因的定位克隆及其功能研究均取得了重要的成果。特别要指出的是,人类基因组序列草图的完成也有我国科学家的一份贡献。 第二节当代生物化学与分子生物学研究的主要内容生物化学与分子生物学因其应用领域不同,可分为工业、农业、海洋、医学生物化学与分子生物学等。又可因研究对象不同,分为动物、植物、微生物生物化学与分子生物学等。生物化学与分子生物学的研究内容十分广泛,包括生物个体的物质结构、化学组成、化学变化、生物合成及其调节,以及这些物质组成、变化、调节与功能的关系等,从分子水平阐明生物体生命活动的本质和规律。当代生物化学与分子生物学的研究主要集中在以下几个方面。 一、生物分子的结构与功能 组成生物个体的化学成分,包括无机物、有机小分子和生物大分子。体内生物大分子的种类繁多,结构复杂,但其结构有一定的规律性,都是由基本结构单位按一定顺序和方式连接而形成的多聚体(polyme1),分子量一般大千l04kD。核酸、蛋白质、多糖、蛋白聚糖和复合脂质等是体内重要的生物大分子,它们都是由各自基本组成单位构成的多聚体。例如,由核背酸作为基本组成单位,通过磷酸二酣键连接形成多核昔酸——核酸;由氨基酸作为基本组成单位,通过肤键连接形成多肤链-蛋白质;聚糖也是由一定的基本单位聚合而成。生物大分子的重要特征之一是具有信息功能,由此也称之为生物信息分子。 对生物大分子的研究,除了确定其一级结构(基本组成单位的种类、排列顺序和方式)外,更重要的是研究其空间结构及其与功能的关系。分子结构是功能的基础,而功能则是结构的体现。生物大分子的功能还需通过分子之间的相互识别和相互作用而实现。例如,蛋白质与蛋白质的相互作用在细胞信号转导中起重要作用;蛋白质与蛋白质、蛋白质与核酸、核酸与核酸的相互作用在基因表达调控中发挥着决定性作用。由此可见,分子结构、分子识别和分子的相互作用是执行生物信息分子功能的基本要素,而这一领域的研究是当今生物化学的热点之一。 二、物质代谢及其调节 生命体不同千无生命体的基本特征是新陈代谢。每个个体一刻不停地与外环境进行物质交换,摄入养料排出废物,以维持体内环境的相对稳定,从而延续生命。据估计,以60岁年龄计算,一个人在一生中与环境进行着大量的物质交换,约相当千60000kg水、10000kg糖类、600kg蛋白质以及1000kg脂质。因此,正常的物质代谢是正常生命过程的必要条件,若物质代谢发生紊乱则可引起疾病。目前对生物体内的主要物质代谢途径已基本清楚,但仍有众多的问题有待探讨。例如,物质代谢中的绝大多数化学反应是由酶催化的,酶的结构和酶量的变化对物质代谢的调节起着重要作用。物质代谢有序性调节的分子机制尚需进一步阐明。此外,细胞信息传递参与多种物质代谢及与其相关的生长、增殖、分化等生命过程的调节。细胞信息传递的机制及网络也是现代生物化学研究的重要课题。 三、基因信息传递及其调控 基因信息传递涉及遗传、变异、生长、分化等诸多生命过程,也与遗传病、恶性肿瘤、心血管病等多种疾病的发病机制有关。因此,基因信息的研究在生命科学中的作用越显重要。关千基因信息的研究,不仅包括DNA的结构与功能,更重要的是对DNA复制、基因转录、蛋白质生物合成等基因信息传递过程的机制及基因表达的时空规律进行研究。目前基因表达调控主要集中在细胞信号转导研究、转录因子研究和RNA剪辑研究三个方面。DNA重组、转基因、基因敲除、新基因克隆、人类基因组及功能基因组研究等的发展,将大大推动这一领域的研究进程。 第三节生物化学与分子生物学与其他学科的联系 一、生物化学已成为生物学、医学各学科之间相互联系的共同语言以研究生命现象与本质为基础的生物学是一个涵盖众多学科的生命科学领域,包括形态学、分类学、生理学、生物化学、遗传学、生态学等。当今生物化学又是生命科学中进展迅速的重要学科之一,它的理论和技术巳渗透到生物学各学科乃至基础医学和临床医学的各个领域,使之产生了许多新兴的交叉学科,如分子遗传学、分子免疫学、分子微生物学、分子病理学和分子药理学等。总而言之,生物化学已成为生物学各学科之间、医学各学科之间相互联系的共同语言。 二、生物化学为推动医学各学科发展作出了重要的贡献生物化学与分子生物学是基础医学的必修课程,讲述正常入体的生物化学以及疾病过程中的生物化学相关间题,与医学有着紧密的联系。基础医学各学科主要是阐述人体正常、异常的结构与功能等,临床医学各学科则研究疾病发生、发展机制及诊断、治疗等,而生物化学与分子生物学为医学各学科从分子水平上研究正常或疾病状态时人体结构与功能乃至疾病预防、诊断与治疗,提供了理论与技术,对推动医学各学科的新发展作出了重要的贡献。例如,近年来对人们十分关注的心脑血管疾病、恶性肿瘤、代谢性疾病、免疫性疾病、神经系统疾病等重大疾病进行了分子水平的研究,在疾病的发生、发展、诊断和治疗方面取得了长足的进步。疾病相关基因克隆、重大疾病发病机制研究、基因芯片与蛋白质芯片在诊断中的应用、基因治疗以及应用重组DNA技术生产蛋白质、多肤类药物等方面的深入研究,无不与生物化学与分子生物学的理论与技术相关。可以相信,随着生物化学与分子生物学的进一步发展,将给临床医学的诊断和治疗带来全新的理念。 生物化学与分子生物学的发展推动这些交叉学科发展的同时,也使自身吸取了众学科之长,更具生命力。随着近代医学的发展,越来越多地将生物化学与分子生物学的理论和技术应用千疾病的预防、诊断和治疗,从分子水平探讨各种疾病的发生、发展机制,也已成为当代医学研究的共同目标。因此,学习和掌握生物化学知识,除理解生命现象的本质与入体正常生理过程的分子机制外,更重要的是为进一步学习基础医学其他各课程和临床医学打下扎实的生物化学基础。(周春燕药立波) 第一篇 生物大分子结构与功能 本篇讨论生命体内重要生物大分子的结构与功能,包括蛋白质、核酸、酶和聚糖,共四章。 众所周知,机体是由数以亿万计分子隘大小不等的分子组成。参与机体构成并发挥重要生理功能的生物大分子通常都具有一定的分子结构规律,即由一定的基本结构单位,按一定的排列顺序和连接方式而形成的多聚体。蛋白质和核酸是体内主要的生物大分子,各自有其结构特征,并分别行使不同的生理功能。核酸具有传递遗传信息等功能,而蛋白质几乎涉及所有的生理过程。两者的存在与配合,是诸如遗传、繁殖、生长、运动、物质代谢等生命现象的基础。因此研究机体的分子结构与功能必须先深入了解这两类生物大分子。 酶是由活细胞产生的具有催化活性和专一性的生物分子(蛋白质、RNA、DNA),其中绝大部分酶是蛋白质。酶是生物体内的催化剂,体内几乎所有的化学反应都由特异性的酶来催化,这为生物体能进行如此复杂而周密的新陈代谢及其精细的时空调节,提供了基本保证。绝大多数的酶的本质是蛋白质,酶的催化作用有赖于酶分子的一级结构及空间结构的完整。能使蛋白质变性的因素也能使酶变性。若酶分子变性或亚基解聚均可能导致酶活性丧失。 聚糖是继蛋白质、核酸后被重视的结构复杂且有规律可循的重要分子之一,与蛋白质、脂质等构成复合糖类,如糖蛋白、蛋白多糖、糖脂,在各种生命活动发挥作用。 学习这一部分内容时,要重点掌握上述生物体内重要分子的结构特性、功能及基本的理化性质与应用,这对理解生命的本质具有重要意义,也为后续课程的学习打下基础。例如蛋白质与DNA,尽管这两类生物大分子有不同的结构,但其中都含有螺旋结构。认真分析比较这两种螺旋结构的特点及区别,有助于在分子水平上理解DNA与蛋白质的结构与功能。 (汤其群) 第一章蛋白质的结构与功能 蛋白质是生命活动的最主要的载体,更是功能执行者。因此,蛋白质是生物体内最重要的生物大分子之一。早在1838年,荷兰科学家G. J. Mulder引入“protei n"(源自希腊字proteios,意为pri mary)一词来表示这类分子。1833年从麦芽中分离淀粉酶,随后从胃液中分离到类似胃蛋白酶的物质,推动了以酶为主体的蛋白质研究;1864年,血红蛋白被分离并结晶;19世纪末,证明蛋白质由氨基酸组成,并利用氨基酸合成了多种短肤;20世纪初,应用X线衍射技术发现了蛋白质的二级结构-a-螺旋,以及完成了胰岛素一级结构测定;20世纪中叶各种蛋白质分析技术相继建立,促进了蛋白质研究迅速发展;1962年,确定了血红蛋白的四级结构;20世纪90年代以后,随着入类基因组计划实施,功能基因组与蛋白质组计划的展开,特别是对蛋白质复杂多样的结构功能、相互作用与动态变化的深入研究,使蛋白质结构与功能的研究达到新的高峰。 第一节蛋白质的分子组成 生物体结构越复杂,其蛋白质种类和功能也越繁多。具有复杂空间结构的蛋白质(protein)不仅是生物体的重要结构物质之一,而且承担着各种生物学功能,其动态功能包括化学催化反应、免疫反应、血液凝固、物质代谢调控、基因表达调控和肌收缩等功能;就其结构功能而言,蛋白质提供结缔组织和骨的基质、形成组织形态等。显而易见,普遍存在于生物界的蛋白质是生物体的重要组成成分和生命活动的基本物质基础,也是生物体中含量最丰富的生物大分子(biomacromolecule),约占人体固体成分的45%,而在细胞中可达细胞干重的70%以上。蛋白质分布广泛,几乎所有的器官组织都含有蛋白质。一个真核细胞可有数万种蛋白质,各自有特殊的结构和功能。 尽管蛋白质的种类繁多,结构各异,但元素组成相似,主要有碳(50%-55%)、氢(6%-7%)、氧(19%-24%)、氮(13%-19%)和硫(0~4%)。有些蛋白质还含有少量磷或金属元素铁、铜、锌、猛、钻、铝等,个别蛋白质还含有候。各种蛋白质的含氮量很接近,平均为16%。由千蛋白质是体内的主要含氮物质,因此测定生物样品的含氮量就可按下式推算出蛋白质大致含量:每克样品含氮克数X6.25X100=100g样品中蛋白质含量(g%)—、L-o:-氨基酸是蛋臼质的基本结构单位人体内蛋白质是以20种氨基酸(amino ac id)为原料合成的多聚体,因此氨基酸是组成蛋白质的基本单位,只是不同蛋白质的各种氨基酸的含量与排列顺序不同而巳。蛋白质受酸、碱或蛋白酶作用而水解产生游离氨基酸。存在于自然界中的氨基酸有300余种,参与蛋白质合成的氨基酸一般有20种,通常是L-cx-氨基酸(除甘氨酸外)。(动画1-1"L型氨基酸3D结构展示“)由图1-1可见,连在—coo一基上的碳称为(X-碳原子,为不对称碳原子(甘氨酸除外),不同的氨基酸其侧链(R)结构各异。除了20种基本的氨基酸外,近年发现硒代半胱氨酸在某些情况下也可用千合成蛋白质。硒代半胱氨酸从结构上来看,硒原子替代了半胱氨酸分子中的硫原子。硒代半胱氨酸存在于少数天然蛋白质中,包括过氧化物酶和电子传递链中的还原酶严严等。硒代半胱氨酸参与蛋白质合成时,并不是由目前已HO—C-I H沁{—C-H知的密码子编码,具体机制尚不完全清楚。另外在产甲CH20H阮烧菌的甲胺甲基转移酶中发现了咄咯赖氨酸。D型氨基L-甘油醋L-丙氨酸酸至今仅发现于微生物膜内的D-谷氨酸、个别抗生素中coo-coo-(例如短杅菌肤含有D-苯丙氨酸)及低等生物体内(例如H3N一c一H H3N一c一H蚳躬I D-丝氨酸)。(动画1-2"D型氨基酸3D结构展CH3R不)L-丙氨酸L-氨基配通式体内也存在若干不参与蛋白质合成但具有重要生理(R为侧链)作用的L-a-氨基酸,如参与合成尿素的鸟氨酸(orn ithine)、图1-1L甘油程和L氨基酸瓜氨酸(citrulline)和精氨酸代唬珀酸(argininosuccinate)。 二、氨基酸可根据其侧链结构和理化性质进行分类20种氨基酸根据其侧链的结构和理化性质可分成5类:CD非极性脂肪族氨基酸;@极性中性氨基酸;@芳香族氨基酸;@酸性氨基酸;@碱性氨基酸(表1-1)。 结构式中文名英文名缩写符号等电点{pl) l非极性脂肪族氨基酸 妯甘氨酸Glycine Gly5.97 妯丙氨酸Alanin e Ala6.00 H3C\H3C/CH-CH-Coo-颌氨酸Valin e Val v5.96 LCH— CH2-CH-cooH3C/ 亮氨酸Leucine Leu5.98 异亮氨酸[soleucine Ile6.02 N coo-脯氨酸Prol111e Pro p6.30 CH2-CH2-CH—coo I I甲硫氨酸Met hionine Met M5.74 2.极性中性氨基酸 I I丝氨酸Serine Ser s5.68 CH2—CH—coo I I半胱氨酸Cysteine Cys c5.07 比N—C-CH2-CH-coo-NII天冬酰胺Asparagine Asn5.41 10第—篇生物大分子结构与功能 续表结构式中文名英文名缩写符号等电点(pl)比N—C—CH2-CH2-CH-coo-II I1谷氨酰胺Glutam ine Gin Q5.65CH3-CH-CH-Coo-I I苏氨酸Threonin e Thr T5.60苯丙氨酸Phenylalanin e Phe F5.48NH3+HO勹CH2飞H-coo-酪氨酸Tyrosm e Tyr Y5.66NH3+C=NH2+NH3+精氨酸Arginin e Arg R10.76「1-CH2—CH—cooHI组氨酸Histidine His7.59一般而言,非极性脂肪族氨基酸在水溶液中的溶解度小千极性中性氨基酸;芳香族氨基酸中苯基的疏水性较强,酚基和时1啋基在一定条件下可解离;酸性氨基酸的侧链都含有狻基;而碱性氨基酸的侧链分别含有氨基、肌基或咪挫基。 脯氨酸和半胱氨酸结构较为特殊。脯氨酸应属亚氨基酸,N在杂环中移动的自由度受限制,但其亚氨基仍能与另一狻基形成肤键。脯氨酸在蛋白质合成加工时可被修饰成经脯氨酸;半胱氨酸琉基失去质子的倾向较其他氨基酸为大,其极性最强;2个半胱氨酸通过脱氢后以二硫键相连接,形成胱氨酸(图1-2)。蛋白质中有不少半胱氨酸以胱氨酸形式存在。 ,-----------,-2H_三碑愿-ooc—CH—CH2-SH ll:S-CH2-CH-COO一一一—..-ooc-<;:H-CH,-S-S-CH,—CH-COO+NH3·----------•+NH3+NH3如在蛋白质翻译后的修饰过程中,脯氨酸和赖氨酸可分别被轻化为轻脯氨酸和轻赖氨酸。蛋白质分子中20种氨基酸残基的某些基团还可被甲基化、甲酰化、乙酰化、异戊二烯化和磷酸化等。这些翻译后修饰,可改变蛋白质的溶解度、稳定性、亚细胞定位和与其他细胞蛋白质相互作用的性质等,体现了蛋白质生物多样性的一个方面。 三、氨基酸具有共同或特异的理化性质 (一)氨基酸具有两性解离的性质 由千所有氨基酸都含有碱性的a-氨基和酸性的a-狻基,可在酸性溶液中与质子(W)结合呈带正电荷的阳离子(-NH3+),也可在碱性溶液中与Off结合,失去质子变成带负电荷的阴离子(—COO-),因此氨基酸是一种两性电解质,具有两性解离的特性。氨基酸的解离方式取决于其所处溶液的酸碱度。在某一pH的溶液中,氨基酸解离成阳离子和阴离子的趋势及程度相等,成为兼性离子,呈电中性,此时色氨酸溶液的pH称为该氨基酸的等电点(amino acid isoelectnc point,pl)。 通常氨基酸的pI是由a-狻基和a-氨基的解离常数的负对数p凡和pK2决定的。pI计算公式为:pI=-(pK1+沁)。如丙氨酸pK-COOH=2.34,pK-NH2=9.69,所以丙氨酸的pI=½(2.34+9.69)=6.02c若一个氨基酸有3个可奋解离基团,写出它们电离式后取兼性离子两边的pK的平均值,即为此氨基酸的pI。 (二)含共扼双键的氨基酸具有紫外线吸收性质酪氨酸根据氨基酸的吸收光谱,含有共扼双键的色氨酸、酪氨酸的最大吸收峰在280nm波长附近(图1-3)。由千大多数蛋白质含有酪氨酸和色氨酸残基,所以测定蛋白质溶液280nm的光吸收值,是分析溶液中蛋白质含量的快速简便的0240250260270280290300310方法。波长(nm)(三)氨基酸与苟三酮反应生成蓝紫色化合物图1-3芳香族氨基酸的紫外线吸收苗三酮反应(n inhydrin reaction)指的是苗三酮水合物在弱酸性溶液中与氨基酸共加热时,氨基酸被氧化脱氨、脱狻,而苗三酮水合物被还原,其还原物可与氨基酸加热分解产生的氨结合,再与另一分子讳三酮缩合成为蓝紫色的化合物,此化合物最大吸收峰在570nm波长处。由千此吸收峰值的大小与氨基酸释放出的氨量成正比,因此可作为氨基酸定量分析方法。 四、氨基酸通过脓键连接而形成蛋白质或肤 早在1890—1910年间,德国化学家E. Fischer已充分证明蛋白质中的氨基酸相互结合而生成肤(peptide),例如1分子甘氨酸的a-狻基和1分子甘氨酸的a-氨基脱去1分子水缩合成为甘氨酰甘氨酸,这是最简单的肤,即二肤。在甘氨酰甘氨酸分子中连接两个氨基酸的酰胺键称为肤键(peptid e bond)(图1-4)。二肤通过肤键与另一分子氨基酸缩合生成三肤。此反应可继续进行,依次生成四肤、五肤......一般而言,由2~20个氨基酸相连而成的肤称为寡肤(oligopeptide),而更多的氨基酸相连而成的肤称为多肤(polypeptide)。多肤链有两端,其游离a-氨基的一端称氨基末端(amino terminal)或N-端,游离a-狻基的一端称为狻基末端(carboxyl terminal)或C-端。肤链中的氨基酸分子因脱水缩合而基团不全,被称为氨基酸残基(amino acid residu e)。 12第一篇生物大分子结构与功能 肤键 —I夕诧。n-----「|夕\。-比0|()II||/\。H_______凡H OH H H H OH蛋白质是由许多氨基酸残基组成、折叠成特定的空间结构、并具有特定生物学功能的多肤。一般而论,蛋白质的氨基酸残基数通常在50个以上,50个氨基酸残基以下则仍称为多肤。例如,常把由39个氨基酸残基组成的促肾上腺皮质激素称作为多肤,而把含有51个氨基酸残基、分子量为5733的胰岛素称作蛋白质。 五、生物活性脓具有生理活性及多样性 人体内存在许多具有生物活性的低分子量的肤,有的仅三肤,有的属寡肤或多肤,在代谢调节、神经传导等方面起着重要的作用。随着肤类药物的发展,许多化学合成或重组DNA技术制备的肤类药物和疫苗巳在疾病预防和治疗方面取得成效。 1谷胱甘脓谷胱甘肤(glutathione, GSH)是由谷氨酸、半胱氨酸和甘氨酸组成的三肤。第一个肤键是非a肤键,由谷氨酸丫-狻基与半胱氨酸的氨基组成(图1-5),分子中半胱氨酸的琉基是该化合物的主要功能基团。GSH的琉基具有还原性,可作为体内重要的还原剂保护体内蛋白质或酶分子中硫基免遭氧化,使蛋白质或酶处在活性沪状态。在谷胱甘肤过氧化物酶的催化下,GSH可还原细胞内产生的『f比r H202,使其变成H20,与此同时,GSH被氧化成氧化型谷胱甘肤(GSSG)/C\/CH\/N\(图1-6),后者在谷胱甘肤还原酶催化下,再生成GSH。此外,GSH的伴?『严严2H O coo硫基还有嗜核特性,能与外源的嗜电子毒物如致癌剂或药物等结合,从而阻断这些化合物与DNA、RNA或蛋白质结合,以保护机体免遭毒物H—C|—NH2COOH损害。 2.多肤类激素及神经肤体内有许多激素属霖肤或多肤,例如属图1-5谷胱甘肤于下丘脑-垂体-肾上腺皮质轴的催产素(9肤)、加压素(9肤)、促肾上腺皮质激素(39肤)、促甲状腺素释放激素(3肤)等。促甲状腺素释放激素是一个特殊结构的三肤(图1-7),其N-端的谷氨酸环化成为焦谷氨酸(pyroglutamjc acid), C-端的脯氨酸残基酰化成为脯氨酰胺,它由下丘脑分泌,可促进腺垂体分泌促甲状腺素。 NADI).焦谷氨酸。:组氨酸。:脯氨酰胺H2022GSH 三了12 飞飞—` 有一类在神经传导过程中起信号转导作用的肤类被称为神经肤(neuropeptide)。较早发现的有脑啡肤(5肤)、B-内啡肤(31肤)和强啡肤(17肤)等。近年还发现孤啡肤(17肤),其一级结构类似于强啡肤。它们与中枢神经系统产生痛觉抑制有密切关系。因此很早就被用千临床的镇痛治疗。除此以外,神经肤还包括P物质(10肤)、神经肤Y等。随着脑科学的发展,相信将发现更多的在神经系统中起着重要作用的生物活性肤或蛋白质。 第一章蛋白质的结构与功能 第二节蛋白质的分子结构 蛋白质分子是由许多氨基酸通过肤键相连形成的生物大分子。入体内具有生理功能的蛋白质大都是有序结构,每种蛋白质都有其一定的氨基酸种类、组成百分比、氨基酸排列顺序以及肤链空间的特定排布位置。因此由氨基酸排列顺序及肤链的空间排布等所构成的蛋白质分子结构,才真正体现蛋白质的个性,是每种蛋白质具有独特生理功能的结构基础。由于参与蛋白质生物合成的氨基酸有20种,且蛋白质的分子量均较大,因此蛋白质的氨基酸排列顺序和空间位置几乎是无穷尽的,足以为人体多达数以万计的蛋白质提供各异的氨基酸序列和特定的空间结构,使蛋白质完成生命所赋予的数以千万计的生理功能。 1952年丹麦科学家L. Linderstrom建议将蛋白质复杂的分子结构分成4个层次,即一级、二级、三级、四级结构,后三者统称为高级结构或空间构象(conformation)。蛋白质的空间构象涵盖了蛋白质分子中的每一原子在三维空间的相对位置,它们是蛋白质特有性质和功能的结构基础。但并非所有的蛋白质都有四级结构,由一条肤链形成的蛋白质只有一级、二级和三级结构,由2条或2条以上肤链形成的蛋白质才有四级结构。 —、氨基酸的排列顺序决定蛋白质的一级结构 蛋白质一级结构是理解蛋白质结构、作用机制以及生理功能的必要基础。在蛋白质分子中,从N端至C-端的氨基酸排列顺序称为蛋白质一级结构(pro tein primary structure)。蛋白质一级结构中的主要化学键是肤键;此外,蛋白质分子中所有二硫键的位置也属千一级结构范畴。牛胰岛素是第一个被测定一级结构的蛋白质分子,由英国化学家F. Sanger于1953年完成,因此他于1958年获得诺贝尔化学奖。图1-8为牛胰岛素的一级结构,胰岛素有A和B二条多肤链,A链有21个氨基酸残基,B链有30个氨基酸残基。如果把氨基酸序列(amino acid sequence)标上数码,应以氨基末端为1号,依次向狻基末端排列。牛胰岛素分子中有3个二硫键,1个位于A链内,称为链内二硫键,由A链的第6位和第11位半胱氨酸的琉基脱氢而形成,另2个二硫键位于A、B两链间(图1-8),称为链间二硫键。 体内种类繁多的蛋白质,其一级结构各不相同,一级结构是蛋白质空间构象和特异生物学功能的基础。然而,随着对蛋白质结构研究的深入,已认识到蛋白质一级结构并不是决定蛋白质空间构象的唯一因素。 目前巳知一级结构的蛋白质数量已相当可观,并且还以更快的速度增加。国际互联网有若干重要的蛋白质数据库(updated protein database),例如EMBL(European Molecular Biology Laboratory Data V价岔14第一篇生物大分子结构与功能Library)、Genbank(Genetic Sequence Databank)和PIR(Protein Identification Resource Sequence Database)等,收集了大量最新的蛋白质一级结构及其他资料,为蛋白质结构与功能的深入研究提供了便利。 二、多肤链的局部有规则重复的主链构象为蛋白质二级结构蛋白质二级结构(protein secondary structure)是指蛋白质分子中某一段肤链的局部空间结构,也就是该段肤链主链骨架原子的相对空间位置,并不涉及氨基酸残基侧链的构象。所谓肤链主链骨架原子即N(氨基氮原子)、Ca(a-碳原子)和C(叛基碳原子)3个原子依次重复排列。蛋白质二级结构主要包括a-螺旋、B-折叠、B-转角和0环。由于蛋白质的分子扯硕大,因此,一个蛋白质分子可含有多种二级结构或多个同种二级结构,而且在蛋白质分子内空间上相邻的2个以上的二级结构还可协同完成特定的功能。 图1-9肤键与肤单元与立的键角以0表示,立与C的键旋转角度以申表示(一)参与肤键形成的6个原子在同一平面上20世纪30年代末,L. Pauling和R. B. Corey应用X-射线衍射技术研究氨基酸和霖肤的晶体结构,其目的是要获得一组标准键长和键角,以推导肤的构象,最终提出了肤单元(peptide unit)概念。参与肤键的6个原子cal、C、0、N、H、心位于同一平面,己和C心在平面上所处的位置为反式(trans)构型,此同一平面上的6个原子构成了所谓的肤单元(图19)。其中肤键(C—N)的键长为0.132nm,该键长介于C-N的单键长(O.149nm)和双键长(O.127nm)之间,所以有一定程度双键性能,不能自由旋转。而立分别与N和C(朕 基碳)相连的键都是典型的单键,可以自由旋转,N与立的键角以0表示,立与C的键 T旋转角度以申表示(图1-9)。也正由千肤单元上立原子所连的两个单键的自由旋转角度,决定了两个相邻的肤单元平面的相对空.间位置。(二)cx-螺旋是常见的蛋白质二级结构Pauling和Corey根据实验数据提出了两种肤链局部主链原子的空间构象的分子模型,称为a-螺旋(a-helix)和B折叠(~pleated sh eet),它们是蛋白质二级结构的主-----氢键佐礼要形式。在a-螺旋结构(图1-10)中,多肤链图1-10a-螺旋平行。(动画1-3飞-螺旋3D结构展示“)(三)B折叠使多肤链形成片层结构1-4"[3-折叠3D结构展示“)(四)p转角和Q-环存在于球状蛋白质中角常发生于肤链进行180°回折时的转角上。B-转角通常由4个氨基酸残基组成,其第一个残基的朕基氧(O)与第四个残基的氨基氢(H)可形成氢键。B-转角的结构较特殊,第二个残基常为脯氨酸,其他常见残基有甘氨酸、天冬氨酸、天冬酰胺和色氨酸。有2种类型的B-转角,分别是转角I和转角lI。 I型B转角和Il型B转角非常相似,只是其中肤键的二面角申和0角有所不同。lI型B转角的第3个残基往往是甘氨酸。 的主链围绕中心轴作有规律的螺旋式上升,螺旋的走向为顺时针方向,即所谓右手螺旋,其申为-47°'中为-57°,氨基酸侧链伸向螺旋外侧。每3.6个氨基酸残基螺旋上升一圈(即旋转360°),螺距为54nm。嫘旋的每个肤键的NH和第四个肤键的朕基氧形成氢键,氢键的方向与螺旋长轴基本0. a—一般而言,20种氨基酸均可参与组成螺旋结构,但是Ala、Glu、Le和Me比Gl、Pro、Ser及T汀ta-uy更常见。在蛋白质表面存在的-螺旋,常具有两性特点即由3至4个疏水氨基酸残基组成的肤段与a,由3~4个亲水氨基酸残基组成的肤段交替出现,致使螺旋的一侧为疏水性氨基酸,另一侧为亲水a-性氨基酸,使之能在极性或非极性环境中存在。这种两性螺旋可见于血浆脂蛋白、多肤激素和钙a-调蛋白激酶等。肌红蛋白和血红蛋白分子中有许多肤链段落呈-螺旋结构。毛发的角蛋白、肌组织a的肌球蛋白以及血凝块中的纤维蛋白,它们的多肤链几乎全长都卷曲成螺旋。数条螺旋状的多a-a-肤链可缠绕起来,形成缆索,从而增强其机械强度,并具有可伸缩性(弹性)。B折叠与螺旋的形状截然不同,呈折纸状。在住折叠结构(图1-11)中多肤链充分伸展,每个a肤单元以立为旋转点,依次折叠成锯齿状结构,氨基酸残基侧链交替地位于锯齿状结构的上下方。所形成的锯齿状结构一般比较短,只含5~8个氨基酸残基。一条肤链内的若干肤段的锯齿状结构可平行排列,分子内相距较远的两个肤段可通过折叠而形成相同走向,也可通过回折而形成相反走向。走向相反时,两个反平行肤段的间距为0.70nm并通过肤链间的肤键跋基氧和亚氨基氢形成氢键,来,稳固B折叠结构,蚕丝蛋白几乎都是B-折叠结构,许多蛋白质既有-螺旋又有B-折叠结构。(动画-a除-螺旋和B-折叠外,蛋白质二级结构还包括B-转角([3-turn)(图1-12)和0环(flloop)。B-转a.. 0环是存在于球状蛋白质中的一种二级结构。这类肤段形状象希腊字母0,所以称0环。9环这种结构总是出现在蛋白质分子的表面,而且以亲水残基为主,在分子识别中可能起重要作用。 (五)氨基酸残基的侧链影响二级结构的形成 蛋白质二级结构是以一级结构为基础的。一段肤链其氨基酸残基的侧链适合形成a-螺旋或B.. 行平反 行平 ------------氢键 16第—篇生物大分子结构与功能 |,'\三、多肤链进一步折叠成蛋白质三级结构. 旋形成。脯氨酸的N原子在刚性的五元环中,其形成的肤键N原子上没有H,所以不能形成氢键,结、\I型转角Il型转角pp7.0折叠,它就会出现相应的二级结构。例如一段肤链有多个谷氨酸或天冬氨酸残基相邻,则在pH时这些残基的游离狻基都带负电荷,彼此相斥,妨碍螺旋的形成。同样,多个碱性氨基酸残基在一a-肤段内,由千正电荷相斥,也妨碍螺旋的形成。此外天冬酰胺、亮氨酸的侧链很大,也会影响螺a-a-果肤链走向转折,不形成-螺旋。形成f3-折叠的肤段,氨基酸残基的侧链要比较小,能容许两条肤段a肌红蛋白是由153个氨基酸残基构成的单一肤链蛋白质,含有1个血红素辅基。图113显示肌-红蛋白的三级结构。肌红蛋白分子中-螺旋占75%,构成A至H8个螺旋区,两个螺旋区之间有一a段柔性连接肤,脯氨酸位于转角处。由于侧链R基团的相互作用,多肤链缠绕,形成一个球状分子(4.5nmx3.5nmx25nm),球表面主要有亲水侧链,疏水侧链位千分子内部。蛋白质三级结构的形成. der Waals和稳定主要靠次级键如疏水键、盐键、氢键和范德华力(vanforce)等(图1-14)。(二)结构模体可由2个或2个以上二级结构肤段组成结构模体(structuralmotif)是蛋白质分子中具有特定空间构象和特定功能的结构成分。一个模体总有其特征性的氨基酸序列,并发挥特殊的功能。一般而言,常见的结构模体可以有以下几种形式:螺旋书-转角(或环)仅-螺旋模体(见于多种DNA结合蛋白);链B转角-链(见千反平行a---B-折叠的蛋白质);链-B转角嫘旋-住转角链模体(见于多种-螺旋/f3-折叠蛋白质)。在这些结aa构模体中,f3-转角常为含3~4个氨基酸残基的片段;而环(loop)为较大的片段,常连接非规则的二彼此靠近。 (—)三级结构是指整条肤链中全部氨基酸残基的相对空间位置蛋白质三级结构(prote in tertiary strnctme)是指整条肤链中全部氨基酸残基的相对空间位置,也就是整条肤链所有原子在三维空间的排布位置。已知球状蛋白质的三级结构有某些共同特征,如折叠成紧密的球状或椭球状;含有多种二级结构并具有明显的折叠层次,即一级结构上相邻的二级结构常在三级结构中彼此靠近并形成超二级结构,进一步折叠成相对独立的三维空间结构;以及疏水侧链常分布在分子内部等。 级结构。 第—章蛋白质的结构与功能 氨基末端((1 面平丿素 红血 酸{(4筑,` 酸氨 的图 链意 肤示 与氧素合红结血盼 )中(白庄蛋蛋红红 肌肌 主 、 亡[ 0兰C—0一,' 圈1-14维持蛋白质分子构象的各种化学键 (a)氢键;(b)离子键;(c)疏水键 18第一篇生物大分子结构与功能 在许多蛋白质分子中,可由2个或2个以上具有二级结构的肤段在空间上相互接近,形成一个有规则的二级结构组合,称为超二级结构,此概念由M. G. Rossman千1973年提出。目前已知的二级结构组合有aa、B哗、部等几种形式(图1-15)。研究发现,a-螺旋之间、B-折叠之间以及a-螺旋与B-折叠之间的相互作用,主要是由非极性氨基酸残基参与的。 (a)加队(b)部;(c)亮氨酸拉链;(d)ct-螺旋-环-a-螺旋;(e)锌指结构亮氨酸拉链(leucine zipper)(图l-15c)是出现在DNA结合蛋白和其他蛋白质中的一种结构模体。当来自同一个或不同多肤链的两个两用性的C\'.-螺旋的疏水面(常含有亮氨酸残基)相互作用形成一个圈对圈的二聚体结构,亮氨酸有规律地每隔6个氨基酸就出现一次,亮氨酸拉链常出现在真核生物DNA结合蛋白的C-端,往往与癌基因表达调控功能有关。 在许多钙结合蛋白分子中通常有一个结合钙离子的模体,它由螺旋-环-螺旋(helix-loop-helix)三个肤段组成(图l-15d),在环中有几个恒定的亲水侧链,侧链末端的氧原子通过氢键而结合钙离子。近年发现的锌指(zinc finger)结构也是一个常见的模体例子,它由1个a-螺旋和2个反平行的B折叠三个肤段组成(图1-15e),具有结合锌离子功能。该模体的N-端有1对半胱氨酸残基,C-端有1对组氨酸残基,此4个残基在空间上形成一个洞穴,恰好容纳1个Zn2+。由于Z汒可稳固模体中的a-螺旋结构,使此a-螺旋能镶嵌于DNA的大沟中,因此含锌指结构的蛋白质都能与DNA或RNA结合(动画1-5"锌指结构3D结构展示“)。可见结构模体的特征性空间构象是其特殊功能的结构基础。 (三)结构域是三级结构层次上具有独立结构与功能的区域分子量较大的蛋白质常可折叠成多个结构较为紧密且稳定的区域,并各行其功能,称为结构域(domain)。大多数结构域含有序列上连续的100~200个氨基酸残基,若用限制性蛋白酶水解,含多个结构域的蛋白质常分解出独立的结构域,而各结构域的构象可以基本不改变,并保持其功能。超二级结构则不具备这种特点。因此,结构域也可看作是球状蛋白质的独立折叠单位,有较为独立的三维空间结构。 例如,由2个亚基构成的3-磷酸甘油睦脱氢酶,每个亚基由2个结构域组成,N-端第1-146个氨基酸残基形成的第一个结构域能与NAD+结合,第二个结构域(第147-333氨基酸残基)与底物3-磷酸甘油醒结合(图1-16)。有些蛋白质各结构域之间接触较紧密,从结构上很难划分,因此,并非所有伈L蛋白质的结构域都明显可分。 第一章蛋白质的结构与功能 圈1-163-磷酸甘油醒脱氢酶亚基的结构示意图 (四)蛋白质的多肤链须折叠成正确的空间构象 理论上讲,如果蛋白质的多肤链随机折叠,可能产生成于上万种可能的空间构象。而实际上,蛋白质合成后,在一定的条件下,可能只形成一种正确的空间构象。除一级结构为决定因素外,还需要在一类称为分子伴侣(molecular chaperone)的蛋白质辅助下,合成中的蛋白质才能折叠成正确的空间构象(见第十五章)。只有形成正确的空间构象的蛋白质才具有生物学功能。 四、含有两条以上多肤链的蛋白质可具有四级结构体内许多功能性蛋白质含有两条或两条以上多肤链。每一条多肤链都有其完整的三级结构,称为亚基(subuni t),亚基与亚基之间呈特定的三维空间排布,并以非共价键相连接。蛋白质分子中各个亚基的空间排布及亚基接触部位的布局和相互作用,称为蛋白质四级结构(protein quaternary stru c ture)。 在四级结构中,各亚基间的结合力主要是氢键和离子键。在2个亚基组成的四级结构蛋白质中,若亚基结构相同,称之为同二聚体(homodimer),若亚基分子不同,则称之为异二聚体(heterodimer),多个亚基可以此类推。对千2个以上亚基构成的蛋白质,单一亚基一般没有生物学功能,完整的四级结构是其发挥生物学功能的保证。 成人血红蛋白的a亚基和B亚基分别含有141个和146个氨基酸。两种亚基的三级结构颇为相似,且每个亚基都可结合l个血红素(heme)辅基(图1-17)。4个亚基通过8个离子键相连,形成血红蛋白四聚体,具有运输02和CO2的功能(动画1-6“血红蛋白3D结构展示")。但每一个亚基单独存在时,虽可结合氧且与氧亲和力增强,但在体内组织中难于释放氧,失去了血红蛋白原有的运输氧的作用。 20第—篇生物大分子结构与功能 五、蛋白质可依其组成、结构或功能进行分类 除氨基酸外,某些蛋白质还含有其他非氨基酸组分。因此根据蛋白质组成成分可分成单纯蛋白质和结合蛋白质,前者只含氨基酸,而后者除蛋白质部分外,还含有非蛋白质部分,为蛋白质的生物学活性或代谢所依赖。结合蛋白质中的非蛋白质部分被称为辅基,绝大部分辅基是通过共价键方式与蛋白质部分相连。构成蛋白质辅基的种类也很广,常见的有色素化合物、寡糖、脂质、磷酸、金属离子甚至分子量较大的核酸。细胞色素c(cytoc hrome c, Cyt c)是含有色素的结合蛋白质,其铁卧啾环上的乙烯基侧链与蛋白质部分的半胱氨酸残基以硫酰键相连,铁叶啾中的铁离子是细胞色素c的重要功能位点。免疫球蛋白是一类糖蛋白,作为辅基的数支寡糖链通过共价键与蛋白质部分连接。 蛋白质还可根据其形状分为纤维状蛋白质和球状蛋白质两大类。一般来说,纤维状蛋白质形似纤维,其分子长轴的长度比短轴长10倍以上。纤维状蛋白质多数为结构蛋白质,较难溶千水,作为细胞坚实的支架或连接各细胞、组织和器官的细胞外成分,如胶原蛋白、弹性蛋白、角蛋白等。大量存在于结缔组织中的胶原蛋白就是典型的纤维状蛋白质,其长轴为300nm,而短轴仅为1.5nm。球状蛋白质的形状近似于球形或椭球形,多数可溶于水,许多具有生理学功能的蛋白质如酶、转运蛋白、蛋白质类激素、代谢调节蛋白、基因表达调节蛋白及免疫球蛋白等都属于球状蛋白质。 随着蛋白质结构与功能研究的不断深入,发现体内氨基酸序列相似而且空间结构与功能也十分相近的蛋白质有若干,即产生了"蛋白质家族(protein family)”这一概念。属于同一蛋白质家族的成钮』员,称为同源蛋白质(homologous protein)。人们通过对蛋白质家族成员的比较,可得到许多物种进化的重要证据。在体内还发现,2个或2个以上的蛋白质家族之间,其氨基酸序列的相似性并不高,但含有发挥相似作用的同一模体结构,通常将这些蛋白质家族归类为超家族(s uperfamily)。这些超家族成员是由共同祖先进化而来的一大类蛋白质。 第三节蛋白质结构与功能的关系 人体的每一个细胞和所有重要组成部分都有蛋白质存在。蛋白质是生命活动的执行者,参与完成体内的各种生理生化反应。 一、蛋白质的主要功能 已知有些蛋白质具有多种功能,也有些蛋白质功能至今尚未阐明,蛋白质在机体内几乎无处不发挥各种特有的功能。 1构成细胞和生物体结构蛋白质是组成人体各种组织、器官、细胞的重要成分。人的肌肉、内脏、神经、血液、骨骼等,包括皮肤、毛发都含有丰富的蛋白质。蛋白质是细胞的重要结构组分,如膜蛋白质、细胞器的组成蛋白质、染色体蛋白质等。这些组织细胞每天都在不断地更新。因此,人体必须每天摄入一定量的蛋白质,作为构成和补充组织细胞的原料。 2.物质运输体内的各种物质主要通过血液进行运输。入体不断地将从外界获取的营养物质和氧气运输到组织细胞,将代谢产生的废物排出体外。血红蛋白可以携带氧气到身体的各个部分,供组织细胞代谢使用。体内有许多营养素必须与某种特异的蛋白质结合,将其作为载体才能运转,例如血液中的载脂蛋白不仅运输脂质,还具有调节被运输脂质代谢的作用。清蛋白能与脂肪酸、Ca气胆红素、磺胺等多种物质结合。此外,血浆中还有皮质激素传递蛋白、运铁蛋白、铜蓝蛋白等。 3.催化功能人体内每时每刻都进行着化学反应来实施新陈代谢。大量的酶类快速精准地催化化学反应,所有的生命活动都离不开酶和水的参与,没有酶就没有生命。这些各具特殊功能的酶,绝大多数是蛋白质。 4信息交流存在千细胞膜上使细胞对外界刺激产生相应的效应的受体是蛋白质。信号转导通路中的衔接蛋白,含有各种能与其他蛋白质结合的结构域,能形成各种信号复合体。通过特异性的蛋白质蛋白质相互作用形成蛋白质复合体来激活下游信号通路。 5免疫功能保护机体抵抗相应病原体的感染的抗体、淋巴因子等免疫分子都是蛋白质。6.氧化供能体内的蛋白质可以彻底氧化分解为水、二氧化碳,并释放能量。正常膳食情况下,机体首先利用糖提供能量。饥饿时,组织蛋白质分解增加,故氧化供能是蛋白质的生理功能。 7.维持机体的酸碱平衡机体内组织细胞必须处于合适的酸碱度范围内,才能完成其正常的生理活动。机体的这种维持酸碱平衡的能力是通过肺、肾以及血液缓冲系统来实现的。蛋白质缓冲体系是血液缓冲系统的重要组成部分,因此,蛋白质在维持机体酸碱平衡方面起着十分重要的作用。 8.维持正常的血浆渗透压血浆胶体渗透压主要由蛋白质分子构成,其中,血浆清蛋白分子量较小,数目较多,决定血浆胶体渗透压的大小。血浆渗透压能使血浆和组织之间的物质交换保持平衡,如果血浆蛋白质特别是清蛋白的含批降低,血液内的水分便会过多地渗入周围组织,造成临床上的营养不良性水肿。 二、蛋白质执行功能的主要方式 (一)蛋白质与小分子相互作用生物体内众多生命活动是与物质代谢及能量代谢密切相关的。细胞在特定时间或环境下含有众多低分子量代谢物,其中包括各种代谢路径的酶催化底物、抑制剂、代谢中间物和产物、副产物等小分子代谢物。蛋白质通过与小分子代谢物的相互作用参与众多的生命活动过程,如酶的催化作用、物22第一篇生物大分子结构与功能质转运、信息传递等,从整体上维持生物体新陈代谢活动的进行。 (二)蛋白质与核酸的相互作用 蛋白质和核酸是组成生物体的两种重要的生物大分子。蛋白质是基因表达的产物,基因的表达又离不开蛋白质的作用。蛋白质与核酸的相互作用存在于生物体内基因表达的各个水平之中。蛋白质有几种模体,如锌指模体、亮氨酸拉链、螺旋-转角-螺旋等专门结合DNA并发挥生物学效应。 RNA存在千细胞质和细胞核中,目前发现的RNA除了少部分能以“核酶”形式单独发挥功能以外,绝大部分RNA都是与蛋白质形成RNA-蛋白质复合物。例如核糖体是细胞内蛋白质合成的场所,核糖体的两个亚基由精确折叠的蛋白质和rRNA组成;端粒酶(telomerase)是一种由催化蛋白和RNA模板组成的酶,可合成染色体末端的DNA;剪接体(spliceosome)是指进行RNA剪接时形成的多组分复合物,主要是由小分子的核RNA和蛋白质组成。蛋白质与RNA的相互作用在蛋白质合成、细胞发育调控等生理过程中起着决定性的作用。 (三)蛋白质相互作用是蛋白质执行功能的主要方式蛋白质-蛋白质相互作用(pro tein-protein interaction, PPI)是指两个或两个以上的蛋白质分子通过非共价键相互作用并发挥功能的过程。细胞进行生命活动过程是蛋白质在一定时空下相互作用的结果。生物学中的许多现象如物质代谢、信号转导、蛋白质翻译、蛋白质分泌、蛋白质剪切、细胞周期调控等均受蛋白质间相互作用的调控。通过蛋白质间相互作用,可改变细胞内酶的动力学特征,也可产生新的结合位点,改变蛋白质对底物的亲和力。蛋白质相互作用控制着大量的细胞活动事件,如细胞的增殖、分化和凋亡。 人体具有非常复杂的生物学功能,即使简单的功能也需要若干蛋白质共同参与完成。两个或多个蛋白质相互作用时,通过各自分子中特殊的局部空间结构,通过稳定的相互作用或瞬间的相互作用而相互识别并结合。 下面列举蛋白质相互作用的实例。 1主要组织相容性复合物参与的分子识别主要组织相容性复合物(major histocompatib山ty complex,MHC)是表达千脊椎动物细胞表面的一类具有高度多态性的蛋白质,分为I型MHC蛋白和II型MHC蛋白。所有I型MHC蛋白为跨膜蛋白,都包含有两条不相连的多肤链,一条为a链,分子量45kD;另一条为队m(化-微球蛋白),分子量12kD。a链包括4个区域,分别为抗原结合区(a卢C=O CI H3NAD+NADH+W CI H3HO-六H H飞-OH H-C础|—OH乳酸脱氢酶X CH3CH3R1氨1酶:j飞上胰蛋白酶弹性蛋白酶狻肤酶i言:。35:////::三:::/:/:了COOH量。例如,胰岛素诱导HMG-CoA还原酶的合成,而胆固醇则阻遏该酶合成。机体通过对酶的活性与酶量的调节使得体内代谢过程受到精确调控,以使机体适应内外环境的不断变化。(四)酶具有不稳定性酶的化学本质是蛋白质。在某些理化因素(如高温、强酸、强碱等)的作用下,酶会发生变性而失去催化活性。因此,酶促反应往往都是在常温、常压和接近中性的条件下进行的。 二、酶通过促进底物形成过渡态而提高反应速率 (—)酶比一般催化剂更有效地降低反应的活化能化学反应中,由于反应物分子所含的能量高低不一,所含自由能较低的反应物分子,很难发生化学反应。只有那些达到或超过一定能量水平的分子,才有可能发生相互碰撞并进入化学反应过程,这样的分子称为活化分子。若将低自由能的反应物分子(基态)转变为能量较高的过渡态(trans山on state)分子,化学反应就有可能发生。活化能(activation energy)是指在一定温度下,lmol反应物从基态转变成过渡态所需要的自由能,即过渡态中间物比基态反应物高出的那部分能量。活化能是决定化学反应速率的内因,是化学反应的能障(energy barrier)。欲使反应速率加快,给予反应物活化能(如加热)或降低反应的活化能,均能使基态反应物转化为过渡态。酶与一般催化剂一样,通过降低反应的活化能,从而提高反应速率,但酶能使其底物分子获得更少的能量便可进入过渡态(图3-6)。据计算,在25气时活化能每减少4.184kJ/mol,反应速率可增高5.4倍。衍生于酶与底物相互作用的能量叫做结合能(binding energy),这种结合能的释放是酶降低反应活化能所利用的自由能的主要来源。 (二)酶与底物结合形成中间产物酶催化底物反应时,必须首先与底物结合形成中间产物。酶与底物结合的过程是释能反应,释放的结合能是降低反应活化能的主要能量来源。酶活性部位的结合基团能否有效地与底物结合,并将底物转化为过渡态,是酶能否发挥其催化作用的关键。 第三章酶与酶促反应 产物平均能址 反应进程 底物结合到酶的活性中心,使它们相互接近并形成有利千反应的正确定向关系(图38)。这种邻近效应(proximity effect)与定向排列(orien tation arrangement)实际上是将分酶-底物复合物子间的反应变成类似于分子内的反应,从而酶提高反应速率。图3-7酶与底物结合的诱导契合作用3.表面效应使底物分子去溶剂化酶的活性中心多形成疏水”口袋"(图3-9)这样就造成一种有利于酶与其特定底物结合并催化其反应的环境。酶促反应在此疏水环境中进行,使底物分子去溶剂化(desolvation),排除周即大量水分子对酶和底物分子中功能基团的干扰性吸引和排斥,防止水化膜的形成,利于底物与酶分子的密切接触和结合,这种现象称为表面效应(s urface effect)。(三)酶的催化机制呈现多元催化作用酶酶-底物复合物酶分子所含有的多种功能基团具有不同的图3-8酶与底物的邻近效应与定向排列解离常数,即使同一种功能基团处千不同的微X衍@第—篇生物大分子结构与功能图3-9胰蛋白酶、胰凝乳蛋白酶和弹性蛋白酶与底物结合时的"口袋''状活性中心环境时,解离程度也有差异。酶活性中心上有些基团是质子供体(酸),有些基团是质子受体(碱)(表3-5)。这些基团参与质子的转移,可使反应速率提高102~10环音。这种催化作用称为普通酸-碱催化共价催化是指催化剂与反应物形成共价结合的中间物,降低反应活化能,然后把被转移基团传递给另外一个反应物的催化作用。当酶分子催化底物反应时,它可通过其活性中心上的亲核催化基团给底物中具有部分正电性的原子提供一对电子形成共价中间物(亲核催化),或通过其酶活性中心上的亲电子催化基团与底物分子的亲核原子形成共价中间物(亲电子催化),使底物上被转移基团传递给其辅酶或另外一个底物。因此,酶既可起亲核催化作用,又可起亲电子催化作用。许多酶催化的基团转移反应都是通过共价催化方式进行的。例如,胰凝乳蛋白酶195位丝氨酸残基的—OH是该酶活性中心的催化基团,当底物结合在酶上后,由于此一OH基团中氧原子含有孤对电子,在57位组氨酸残基碱催化的帮助下,能对底物蛋白肤键中跋基C(具有部分正电性)进行亲核攻击,导致肤键的断裂,形成一个不稳定的中间产物酰基化酶,后者易将酰基转移给水完成水解作用(图3-10)。 第三章酶与酶促反应 第三节酶促反应动力学 (一)米曼方程揭示单底物反应的动力 1902年,Victor Henri提出了酶-底物中间 H人。钾I II—R1O=CH0促各种因素对酶是研究酶促反应速率以及reactions)(kinetics酶促反应动力学enzyme-catalyzed of且温度、抑制。酶促反应速率可受多种因素的影响,如酶浓度、底物浓度、反应速率影响机制的科学p。。研究酶促反应动力学具有重要的理论和实践意义剂及激活剂等—、底物浓度对酶促反应速率的影响呈矩形双曲线。当作图呈矩形双曲线[S](v)对底物浓度在酶浓度和其他反应条件不变的情况下,反应速率上升的幅度不着[S]的不断增加,段);随随[S]的增加而升高,呈一级反应(曲线的[S]很低时,vav的不断增加,以至于所[S]b段);再随着断变缓,呈现出一级反应与零级反应的混合级反应(曲线的V,,,.x)此(maximum velocity,达最大反应速率便不再增加,此时有酶的活性中心均被底物所饱和,vv,3-11)。段)(图时的反应可视为零级反应(曲线的c vm}学特性竺(S)生(E)与底物复合物学说,认为首先是酶成酶底物中间复合物(ES),然后ES分解生成产物(P)和游离的酶。 I式3-1中的K1、构和k3分别为各向反应的 丘底物浓度[S]速率常数。 图3-11底物浓度对酶促反应速率的影响1913年,Michaelis L和Menten M根据酶底物中间复合物学说,经过大量实验,将v对。 [S]的矩形双曲线加以数学处理,得出单底物v与[S]的数学关系式,即著名的米曼:方程,简称米氏方程(Michaelis equation)。 式3-2中的凡为米氏常数(Michaelis constant), Vm.,为最大反应速率。当[S]远远小于凡时,式32分母中的[S]可以忽略不计,米氏方程可以简化为v=二竺[S],此时v与[S]成正比关系,反应呈一级反应(相当于图3-10中曲线的a段)。当[S]远远大于Kn,时,方程中的凡可以忽略不计,此时V=,飞?}第—篇生物大分子结构与功能vm旺,反应呈零级反应(相当于图3-10中曲线的c段)。 米氏方程的推导基于这样的假设(或前提):心反应是单底物反应;@测定的反应速率为初速率(即指反应刚刚开始,各种影响因素尚未发挥作用时的酶促反应速率);@当[S]远远大于[E]时,在初速率范围内,底物的消耗很少(<5%),可以忽略不计。米氏方程的推导如下:根据式3-1,ES的生成速率=丸([E,]-[ES])[S], ES的分解速率=k2[ES]+伈[ES]。式中[E』表示酶的总浓度,[E.]-[ES]表示游离酶的浓度[E]。当反应系统处于稳态时,ES的生成速率=ES的分解速率,即:九([E,]-[ES])[S]=k2[ES]+k3[ES](式3-3)将式3-5代入式3-4并整理得:[E,][S][ES]=Km+[S](式3-6)由于在初速率范围内,反应体系中剩余的底物浓度(>95%)远超过生成的产物浓度。因此,逆反应可不予考虑,整个反应的速率与ES的浓度成正比,即:v=k3[E,][S](式3-8)当所有的酶均形成ES时(即[ES]=[Et]),反应速率达到最大,即:将式3-9代入式3-8即得米氏方程:(二)凡与vmax是重要的酶促反应动力学参数1. Km值等于酶促反应速率为最大反应速率—半时的底物浓度当v等千vnmx的一半时,米氏方程可变换为:经整理得K'"=[S]。?记2. Km值是酶的特征性常数k,n值的大小并非固定不变,它与酶的结构、底物结构、反应环境的pH、温度和离子强度有关,而与酶浓度无关。各种酶的凡值是不同的,酶的凡值多在lO-6~10-2moV L的范围(表3-6)。 酶底物Km(mol/L)已糖激酶(脑)ATP4xlO-4D-葡萄糖5xlO-5D-果糖1.5x l0刁胰凝乳蛋白酶甘氨酰酪氨酰甘氨酸1.08X10-lN-苯甲酰酪氨酰胺2.5x10一3B-半乳糖甘酶D-乳糖4. OxlO一3过氧化氢酶H2022.5xl0一2溶菌酶N-乙酰氨基葡糖6. OxlO刁3.位在一定条件下可表示酶对底物的亲和力米氏常数(Km)是单底物反应中3个速率常数的k2+k3当丛远远小于k2时,Km=k2/kl,即相当于ES分综合,即K产kl。已知,伈为限速步骤的速率常数。 解为E+S的解离常数(dissociation constant, K,)。此时,凡代表酶对底物的亲和力。凡越大,表示酶对底物的亲和力越小;凡越小,酶对底物的亲和力越大。但并非所有的酶促反应都是k3远远小于k2,有时甚至伈远远大于k2,这时的凡就不能表示酶对底物的亲和力。 对于生理性底物来说,大多数酶的转换数在1-104/s之间(表3-7)。 '转换数是在酶被底物饱和的条件下测定的,受反应温度和pH等因素影响(三)凡和vmax常通过林-贝作圈法求取酶促反应的v对[S]作图为矩形双曲线,从此曲线上很难准确地求得反应的凡和vm立。千是,人们对米氏方程进行种种变换,采用直线作图法准确求得kn,和V“心,其中以林-贝(Lineweaver-Burk)作图法最为常用。 第—篇生物大分子结构与功能林-贝作图法又称双倒数作图法。即将米氏方程的两边同时取倒数,并加以整理得一线性方程,V-Vma , . [S], V'""'以1/v对1/[s]作图,纵轴上的截距为1/Vm缸,横轴上的截距为-1/Km(图3-12)。二、底物足够时酶浓度对酶促反应速率的影响呈直线关系当[S]远远大于[E]时,反应中[S]浓度的变化量可以忽略不计。此时,随着酶浓度的增加,酶促反应速率增大,两者呈现正比关系(图3-13)。 斜率=玉巴 ,夕,夕 志淀避 三、温度对酶促反应速率的影响具有双重性 酶促反应时,随着反应体系温度的升高,底物分子的热运动加快,增加分子碰撞的机会,提高酶促反应速率;但当温度升高达到一定临界值时,温度的升高可使酶变性,使酶促反应速率下降。大多数酶在60"C时开始变性,80"C时多数酶的变性已不可逆。酶促反应速率达最大时的反应系统的温度称为酶的最适温度(optimum temperature)。反应系统的温度低千最适温度时,温度每升高10"C反应速率可增加1.7~2.5倍。当反应温度高于最适温度时,反应速率则因酶变性2.0失活而降低(图3-14)。 酶的最适温度不是酶的特征性常数,它与反应时间有关。酶在低温下活性降低,随着温度的回升酶活性逐渐恢1.5复。医学上用低温保存酶和菌种等生物制品就是利用了酶的这一特性。临床上采用低温麻醉时,机体组织细胞中的1酶在低温下活性降低,物质代谢速率减慢,组织细胞耗氧量减少,对缺氧的耐受性升高,对机体具有保护作用。 哺乳类动物组织中酶的最适温度多在35~40"C之间。能在较高温度生存的生物,细胞内酶的最适反应温度亦较高。0.51969年从美国黄石国家森林公园火山温泉中分离得到一种能在70~75"C环境中生长的栖热水生菌(Thermusaquatic出),从该菌的YTl株中提取到的Taq DNA聚合酶,其最适温度0102030405060温度t为72"C,95吃时该酶的半寿期长达40分钟。此酶作为工具酶已被应用于DNA的体外扩增。图3-14温度对酶促反应速率的影响四、pH通过改变酶分子及底物分子的解离状态影响酶促反应速率酶分子中的许多极性基团,在不同的pH条件下解离状态不同,酶活性中心的某些必需基团往往仅在某一解离状态时才最容易同底物结合或具有最大的催化活性。许多具有可解离基团的底物和辅酶的荷电状态也受pH改变的影响,从而影响酶对它们的亲和力。此外,pH还可影响酶活性中心的空间构象,从而影响酶的活性。因此,pH的改变对酶的催化作用影响很大。酶催化活性最高时反应体系的pH称为酶促反应的最适pH(op timum pH)(图3-15)。 』胃:白酶\\// 虽然不同酶的最适pH各不相同,但除少数(如胃蛋白酶的最适pH约为1.8,肝精氨酸酶的最适pH为9.8)外,动物体内多数酶的最适pH接近中性。23456789IO11酶的最适pH也不是酶的特征性常数,它受底物pH浓度、缓冲液种类与浓度以及酶的纯度等因素的影图3-15pH对胃蛋白酶、胆碱酷酶和响。溶液pH高于或低于最适pH时,酶活性降低,远胰蛋白酶活性的影响离最适pH时还会导致酶变性失活。在测定酶活性时,应选用适宜的缓冲液以保持酶活性的相对恒定。 五、抑制剂可降低酶促反应速率 凡能使酶活性下降而又不引起酶蛋白变性的物质统称为酶的抑制剂(inh加tor)。抑制剂可与酶活性中心或活性中心之外的调节位点结合,从而抑制酶的活性。根据抑制剂和酶结合的紧密程度不同,酶的抑制作用分为不可逆性抑制与可逆性抑制两类。去除可逆性抑制剂,可使酶活性得以恢复。 (一)不可逆性抑制剂与酶共价结合 不可逆性抑制剂和酶活性中心的必需基团共价结合,使酶失活。此类抑制剂不能用透析、超滤等方法予以去除。例如,有机磷农药(敌百虫、敌敌畏、乐果和马拉硫磷等)特异地与胆碱酷酶(choline esterase)活性中心丝氨酸残基的胫基结合,使胆碱酷酶失活,导致乙酰胆碱堆积,引起胆碱能神经兴奋,病人可出现恶心、呕吐、多汗、肌肉震颤、瞳孔缩小、惊厥等一系列症状。 R10,p戎R10\、乡0/、+HO-E~R20/p:___O-E 有机磷化合物轻基酶磷酰化酶R!:烧基、胺基等;民:烧基、胺基、氨基等;X:卤基、烧氧基、酚氧基等解救有机磷衣药中毒时,可给予乙酰胆碱拈抗剂阿托品和胆碱酷酶复活剂解磷定。 HON=CH-0十凡O:P/\°一RO:P乡\。仁 解磷定磷酰化酶磷酰化解磷定游离的经基酶 低浓度的重金属离子(Hg气Ag\Pb2+等)及As”等可与琉基酶分子中的琉基结合使酶失活。例如,路易士气(一种化学毒气)能不可逆地抑制体内琉基酶的活性,从而引起神经系统、皮肤、黏膜、毛细血管等病变和代谢功能紊乱。 `\ ,,第一篇生物大分子结构与功能Cl Cl/\As-CH=CHCl+E:/\SH SH-E:/\S/S\~As一CH=CHCl+HCI二琉基丙醇(British anti-lewisite, BAL)可以解除这类抑制剂对琉基酶的抑制。 H2C-OH 失活的酶H2C-OH BAL 硫基酶BAL-与珅化物的复合物(二)可逆性抑制剂与酶非共价结合可逆性抑制剂与酶非共价可逆性结合,使酶活性降低或消失。采用透析、超滤或稀释等物理方法可将抑制剂除去,使酶的活性恢复。可逆性抑制作用遵守米氏方程。这里仅介绍三种典型的可逆性抑制作用。 1.竞争性抑制剂与底物竞争结合酶的活性中心抑制剂和酶的底物在结构上相似,可与底物竞争结合酶的活性中心,从而阻碍酶与底物形成中间产物,这种抑制作用称为竞争性抑制作用(competitive inhibition)。 反应式中K为EI的解离常数,又称抑制常数。抑制剂与酶形成二元复合物EI,增加底物浓度可使EI转变为ES。按照米氏方程的推导方法,竞争性抑制剂存在时的米氏方程为:将上述方程两边同时取倒数,则得其双倒数方程为:若以1/v对1/[s]作图,得图3-16。 与无抑制剂时相比,竞争性抑制剂存在时的直线斜率增大,此时横轴截距所代表的表观k,n(appai·ent K"')增大,即酶对底物的亲和力降低,但不影响Vmax0Vm1红由千抑制剂和酶的结合是可逆的,抑制程度取1---,户决于抑制剂与酶的相对亲和力及与底物浓度的相--—-k m-----',','/,。对比例。例如,丙二酸对唬珀酸脱氢酶的抑制作用km k,是竞争性抑制作用,当丙二酸与骁珀酸的浓度比为图3-16竞争性抑制作用双倒数作图1:50时,酶活性便被抑制50%。若增大唬珀酸浓度,此抑制作用可被削弱。 磺胺类药物的抑菌机制属千对酶的竞争性抑制作用。细菌利用鸟昔三磷酸(GTP)从头合成四氢叶酸(FH4)(图3-17),其中6-轻甲基-7,8-二氢蝶呤焦磷酸和对氨基苯甲酸生成7,8-二氢蝶酸这步反应是由二氢蝶酸合酶(dihydropteroate synthase)来催化。磺胺类药物与对氨基苯甲酸的化学结构相似,竞争性地与二氢蝶酸合酶结合,抑制FH2以至于FH4合成,干扰一碳单位代谢,进而干扰核酸合成,使细菌的生长受到抑制。人类可直接利用食物中的叶酸,体内核酸合成不受磺胺类药物。 氨合 酸酶 鸟昔三磷酸(GTP) 醴畔 图3-17细菌从头合成四氢叶酸的途径和磺胺类药物抑菌的作用机制根据竞争性抑制的特点,服用磺胺类药物时必须保持血液中足够高的药物浓度,以发挥其有效的抑菌作用。 2.非竞争性抑制剂结合活性中心之外的调节位点有些抑制剂与酶活性中心外的结合位点相结合,不影响酶与底物的结合,底物也不影响酶与抑制剂的结合。底物和抑制剂之间无竞争关系,但抑制剂-酶-底物复合物(IES)不能进一步释放出产物。这种抑制作用称为非竞争性抑制作用(noncompetitive inhibition)。 E+s士干ES-=-----E+P k2+ 非竞争性抑制剂存在时的米氏方程为: 其双倒数方程为: +=亡(1+干)占心于) 若以1/v对1/[s]作图,得图3-18。 非竞争性抑制剂存在时,直线的斜率增大,而凡不变,即非竞争性抑制剂不影响酶对底物的亲和第—篇生物大分子结构与功能 1-V 力,但使vm旺降低。亮氨酸对精氨酸酶的抑制、毒毛\花昔G(哇巴因)对细胞膜Na•, K•-ATP酶的抑制、麦芽糖对a淀粉酶的抑制都属千非竞争性抑制。3.反竞争性抑制剂的结合位点由底物诱导产+,,z,活性中心外的调节位点结合。不同的是,没有底物生与非竞争性抑制剂一样,此类抑制剂也是与酶/, z /z_f l/v结合时,游离的酶并不能与抑制剂结合,当底物与酶结合后,酶才能与抑制剂结合。因此,抑制剂仅与反竞争性抑制剂存在时的米氏方程为:尸 亡 km 了文(1+口同样,若以l lv对1/[s]作图,得图3-19。 反竞争性抑制剂不改变直线的斜率,但使酶促 冗认 1 1+恩) 反应的Vmax降低,这是由于一部分ES与I结合,生'成不能转变为产物的IES的缘故。反竞争性抑制,,,-,.,"'剂使酶促反应的表观凡降低。其原因是由于IES,,"'"',.,.,.,. \抑制 的形成,使ES量下降,增加酶对底物的亲和力,从_士(1+恩) 而增进底物与酶结合的作用。苯丙氨酸对胎盘型 碱性磷酸酶的抑制属于反竞争性抑制作用。图3-19反竞争性抑制作用双倒数作图现将三种可逆性抑制作用的特点比较列于表3-8。表3-8三种可逆性抑制作用的比较六、激活剂可提高酶促反应速率使酶由无活性变为有活性或使酶活性增加的物质称为酶的激活剂(ac tivator)。激活剂大多为金属离子,如Mg2+,K+,Mn正等;少数为阴离子,如Cl一。也有许多有机化合物激活剂,如胆汁酸盐。 大多数金属离子激活剂对酶促反应是不可缺少的,否则将测不到酶的活性。这类激活剂称为酶的必需激活剂(essenti al acti vator)。必需激活剂参加酶与底物或与酶-底物复合物结合反应,但激活剂本身不转化为产物。例如,已糖激酶催化的反应中,Mg2+与底物ATP结合生成Mg2+-ATP,后者作为酶的真正底物参加反应。有些酶即使激活剂不存在时,仍有一定的催化活性,激活剂则可使其活性增加,这类激活剂称为非必需激活剂(non-essential activator)。非必需激活剂通过与酶或底物或酶-底物复合物结合,提高酶的活性。例如,Cl一是唾液淀粉酶的非必需激活剂。 第四节酶的调节 细胞内许多酶的活性是可以受调节的。通过调节,有些酶可在有活性和无活性、或者高活性和低活性两种状态之间转变。此外,某些酶在细胞内的含量也可以发生改变,从而改变酶在细胞内的总活性。细胞根据内外环境的变化而调整细胞内代谢时,主要是通过对催化限速反应的调节酶(亦称为关键酶)的活性进行调节而实现的(见第十章)。 —、酶活性的调节是对酶促反应速率的快速调节 细胞对现有酶活性的调节包括酶的别构调节和酶的化学修饰调节,它们属于对酶促反应速率的快速调节。 (—)别构效应剂通过改变酶的构象而洞节酶活性体内一些代谢物可与某些酶的活性中心外的某个部位非共价可逆结合,引起酶的构象改变,从而改变酶的活性,酶的这种调节方式称为酶的别构调节(allos teric regulation of en~ymes),亦曾称为变构调节。 受别构调节的酶称为别构酶(allosteri c enzyme),引起别构效应的物质称为别构效应剂(allosteric effector)。酶分子与别构效应剂结合的部位称为别构部位(allosteric site)或调节部位(regulatory si te)。有些酶的调节部位与催化部位存在千同一亚基;有的则分别存在千不同的亚基,从而有催化亚基和调节亚基之分。根据别构效应剂对别构酶的调节效果,有别构激活剂(allosteric activator)和别构抑制剂(allosteric inh伽tor)之分。别构效应剂可以是代谢途径的终产物、中间产物、酶的底物或其他物质。 别构酶分子中常含有多个(偶数)亚基,具有多亚基的别构酶也与血红蛋白一样,存在着协同效应,包括正协同效应和负协同效应。如果效应剂与酶的一个亚基结合,此亚基的别构效应使相邻亚基也发生构象改变,并增加对此效应剂的亲和力,这种协同效应称为正协同效应;如果后续亚基的构象改变降低对此效应剂的亲和力,则称为负协同效应。如果效应剂是底物本身,正协同效应的反应速率-底物浓度曲线呈“S”形(图3-20)。 (二)酶的化学修饰调节是通过某些化学基团与酶的共价可逆结合来实现酶蛋白肤链上的一些基团可在其他酶的催化下,与某些化学基团共价结合,同时又可在另一种酶的催化下,去掉已结合的化学基团,从而影响酶的活性,酶的这种调节方式称为酶的共价修饰(covalen t modification of enzymes)或称酶的化学修饰(chemical mod山cation)。在化学修饰过程中,酶发生无活性(或低活性)与有活性(或高活性)两种形式的互变。酶的共价修饰有多种形式,其中最常见的形式是磷酸化和去磷酸化。酶蛋白的磷酸化是在蛋白激酶的催化下,来自ATP的丫-磷酸基共价地结合在酶蛋白的Ser、Thr或Tyr残基的侧链轻基上。反之,磷酸化的酶蛋白在磷蛋白磷酸酶催化下,磷酸酷键被水解而脱去磷酸基(图3-21)。 第—篇生物大分子结构与功能 制抑 酶}构} ,, ., ,, E(Serffm厅yr)—OH E(Serffhrffyr)一0—f P—o(三)酶原需要通过激活过程才能转变为有活性的酶有些酶在细胞内合成或初分泌、或在其发挥催化功能前处于无活性状态,这种无活性的酶的前体称作酶原(zymogen或proenzyme)。在一定条件下,酶原向有催化活性的酶的转变过程称为酶原的激活。酶原的激活大多是经过蛋白酶的水解作用,去除一个或几个肤段后,导致分子构象改变,从而表现出催化活性。酶原激活实际上是酶的活性中心形成或暴露的过程。例如,胰蛋白酶原进入小肠后,在Ca2+存在下受肠激酶的作用,第6位赖氨酸残基与第7位异亮氨酸残基之间的肤键断裂,水解掉一个六肤,分子构象发生改变,形成酶的活性中心,从而成为有催化活性的胰蛋白酶(图3-22)(动画3-1"胰蛋白酶原激活”)。 肠激酶/胰蛋白酶 离子键或氢键• \,胰蛋白酶原 峦刁 活性中心 此外,胃蛋白酶原、胰凝乳蛋白酶原、弹性蛋白酶原及狻基肤酶原等均需水解掉一个或几个肤段后,才具有消化蛋白质的活性(表3-9)。 酶原的存在和酶原激活具有重要的生理意义。消化道蛋白酶以酶原形式分泌可避免胰腺的自身消化和细胞外基质蛋白遭受蛋白酶的水解破坏,同时还能保证酶在特定环境和部位发挥其催化作用。生理情况下,血管内的凝血因子以酶原形式存在,不发生血液凝固,可保证血流畅通。一旦血管破损,一系列凝血因子被激活,凝血酶原被激活生成凝血酶,后者催化纤维蛋白原转变成纤维蛋白,产生血疑块以阻止大量失血,对机体起保护作用。 酶原激活因素激活形式激活部位 胃蛋白酶原W或胃蛋白酶胃蛋白酶+六肤胃腔 胰疑乳蛋白酶原胰蛋白酶胰凝乳蛋白酶+两个二肤小肠腔弹性蛋白酶原胰蛋白酶弹性蛋白酶+几个肤段小肠腔狻基肤酶原A胰蛋白酶狻基肤酶A+几个肤段小肠腔二、酶含量的调节是对酶促反应速率的缓慢调节酶是机体的组成成分,各种酶都处于不断合成与降解的动态平衡过程中。因此,除改变酶的活性外,细胞也可通过改变酶蛋白合成与降解的速率来调节酶的含量,进而影响酶促反应速率。 (—)酶蛋白合成可被诱导或阻遏 某些底物、产物、激素、生长因子及某些药物等可以在转录水平上影响酶蛋白的生物合成。一般在转录水平上能促进酶合成的物质称为诱导物(inducer),诱导物诱发酶蛋白合成的作用称为诱导作用(induction)。反之,在转录水平上能减少酶蛋白合成的物质称为辅阻遏物(co-repressor),辅阻遏物与无活性的阻遏蛋白结合而影响基因的转录,这种作用称为阻遏作用(repression)。酶基因被诱导表达后,尚需经过转录水平和翻译水平的加工修饰等过程,所以从诱导酶的合成到其发挥效应,一般需要几小时以上方可见效。但是,一旦酶被诱导合成后,即使去除诱导因素,酶的活性仍然待续存在,直到该酶被降解或抑制。因此,与酶活性的调节相比,酶合成的诱导与阻遏是一种缓慢而长效的调节。例如,胰岛素可诱导合成HMG-CoA还原酶,促进体内胆固醇合成,而胆固醇则阻遏HMG-CoA还原酶的合成;糖皮质激素可诱导磷酸烯醇式丙酮酸狻激酶的合成,促进糖异生。镇静催眠类药物苯巴比妥可诱导肝微粒体单加氧酶合成。 (二)酶的降解与一般蛋白质降解途径相同 细胞内各种酶的半寿期相差很大。如鸟氨酸脱狻酶的半寿期很短,仅30分钟,而乳酸脱氢酶的半寿期可长达130小时。组织蛋白的降解途径有:心组织蛋白降解的溶酶体途径(非ATP依赖性蛋白质降解途径),由溶酶体内的组织蛋白酶非选择性催化分解一些膜结合蛋白、长半寿期蛋白和细胞外的蛋白;@组织蛋白降解的胞质途径(ATP依赖性泛素介导的蛋白降解途径),主要降解异常或损伤的蛋白质,以及几乎所有短半寿期(10分钟至2小时)的蛋白质。 第五节酶的分类与命名 目前已发现4000多种酶,为了研究和使用方便,1961年,国际生物化学学会酶学委员会推荐一套系统命名法及分类方法。 —、酶可根据其催化的反应类型予以分类 根据酶催化的反应类型,酶可以分为六大类。(一)氧化还原酶类催化氧化还原反应的酶属于氧化还原酶类(oxidoreductases),包括催化传递电子、氢以及需氧参加反应的酶。例如乳酸脱氢酶、唬珀酸脱氢酶、细胞色素氧化酶、过氧化氢酶、过氧化物酶等。.、(,对i}74第一篇生物大分子结构与功能催化底物之间基团转移或交换的酶属千转移酶类(transferases)。例如甲基转移酶、氨基转移酶、乙酰转移酶、转硫酶、激酶和多聚酶等。(三)水解酶类催化底物发生水解反应的酶属千水解酶类(hydrolases)。按其所水解的底物不同可分为蛋白酶、核酸酶、脂肪酶和脉酶等。根据蛋白酶对底物蛋白的作用部位,可进一步分为内肤酶和外肤酶。同样,核酸酶也可分为外切核酸酶和内切核酸酶。(四)裂合酶类催化从底物移去一个基团并形成双键的反应或其逆反应的酶属于裂合酶类(lyases)。例如脱水酶、脱狻酶、醋缩酶、水化酶等。(五)异构酶类催化分子内部基团的位置互变,几何或光学异构体互变,以及醒酮互变的酶属于异构酶类(i somerases)。例如变位酶、表异构酶、异构酶、消旋酶等。 (六)连接酶类 催化两种底物形成一种产物并同时偶联有高能键水解和释能的酶属于连接酶类(ligases)(旧称合成酶类,synthetases)。此类酶催化分子间的缩合反应,或同一分子两个末端的连接反应;在催化反应时需核昔三磷酸(NTP)水解释能。例如DNA连接酶、氨基酰-tRNA合成酶、谷氨酰胺合成酶等。 系统命名法最初对合酶(synthase)和合成酶(synthetase)进行了区分,合酶催化反应时不需要NTP供能,而合成酶需要。生物化学命名联合委员会(JCBN)规定:无论利用NTP与否,合酶能够被用于催化合成反应的任何一种酶。因此合酶属于连接酶类。 国际系统分类法除按上述六类将酶依次编号外,还根据酶所催化的化学键的特点和参加反应的基团不同,将每一大类又进一步分类。每种酶的分类编号均由四组数字组成,数字前冠以EC(enzyme commission)。编号中第一个数字表示该酶属千六大类中的哪一类;第二组数字表示该酶属于哪一亚类;第三组数字表示亚-亚类;第四组数字是该酶在亚-亚类中的排序(表340)。 二、每—种酶均有其系统名称和推荐名称在酶学研究早期,酶的命名缺乏系统的规则,酶的名称多由发现者确定。虽然这些习惯名称多是根据酶所催化的底物、反应的性质以及酶的来源而定的,但常出现混乱。有的名称(如心肌黄酶、触酶等)完全不能说明酶促反应的本质。为了克服习惯名称的弊端,国际生物化学与分子生物学学会(JU BMB)以酶的分类为依据,于1961年提出系统命名法。系统命名法规定每一个酶都有一个系统名称(systematic name),它标明酶的所有底物与反应性质。底物名称之间以“:"分隔。由于许多酶促反应是双底物或多底物反应,且许多底物的化学名称太长,这使许多酶的系统名称过长和过于复杂。为了应用方便,国际酶学委员会又从每种酶的数个习惯名称中选定一个简便实用的推荐名称(recommended name)(表3-10)。 第六节酶在医学中的应用 酶在医学中的应用十分广泛和重要,多种遗传病与酶的先天缺陷有关,许多酶已成为临床上诊断疾病的良好指标,有些酶还可作为药物用来治疗疾病。 —、酶与疾病的发生、诊断及治疗密切相关 (一)许多疾病与酶的质和量的异常相关 1.酶的先天性缺陷是先天性疾病的重要病因之一现已发现140多种先天性代谢缺陷中,多由酶的先天性或遗传性缺损所致。例如,酪氨酸酶缺乏引起白化病;苯丙氨酸胫化酶缺乏使苯丙氨酸和苯丙酮酸在体内堆积,高浓度的苯丙氨酸可抑制5-轻色胺的生成,导致精神幼稚化;肝细胞中葡糖-6磷酸酶缺陷,可引起I a型糖原贮积症。 2.一些疾病可引起酶活性或量的异常许多疾病引起酶的异常,这种异常又使病情加重。例如,急性胰腺炎时,胰蛋白酶原在胰腺中被激活,造成胰腺组织被水解破坏。许多炎症都可以导致弹性蛋白酶从浸润的白细胞或巨噬细胞中释放,对组织产生破坏作用。激素代谢障碍或维生素缺乏可引起某些酶的异常。例如,维生素K缺乏时,凝血因子II、VlI、IX、X的前体不能在肝内进一步狻化生成成熟的凝血因子,病人表现出因这些凝血因子质的异常所导致的临床征象。 酶活性受到抑制多见于中毒性疾病。例如,有机磷农药中毒时,抑制胆碱酣酶活性,引起乙酰胆碱堆积,导致神经肌肉和心脏功能的严重紊乱。重金属中毒时,一些琉基酶的活性被抑制而导致代谢紊乱。 (二)体液中酶活性的改变可作为疾病的诊断指标组织器官损伤可使其组织特异性的酶释放入血,有助于对组织器官疾病的诊断。如急性肝炎时血清谷丙转氨酶活性升高;急性胰腺炎时血、尿淀粉酶活性升高;前列腺癌病人血清酸性磷酸酶含量增高;骨癌病人血中碱性磷酸酶含量升高;卵巢癌和睾丸肿瘤病人血中胎盘型碱性磷酸酶升高。因此,血清中酶的增多或减少可用于辅助诊断和预后判断。 (三)某些酶可作为药物用于疾病的治疗,1.有些酶作为助消化的药物酶作为药物最早用于助消化。如消化腺分泌功能下降所致的消化不良,可服用胃蛋白酶、胰蛋白酶、胰脂肪酶、胰淀粉酶等予以纠正。 2.有些酶用千清洁伤口和抗炎在清洁化脓伤口的洗涤液中,加入胰蛋白酶、溶菌酶、木瓜蛋白酶、疲萝蛋白酶等可加强伤口的净化、抗炎和防止浆膜粘连等。在某些外敷药中加入透明质酸酶可以增强药物的扩散作用。 3有些酶具有溶解血栓的疗效临床上常用链激酶、尿激酶及纤溶酶等溶解血栓,用于治疗心、脑血管栓塞等疾病。 此外,许多药物的作用机制是通过抑制体内的某些酶来达到治疗目的。前述的磺胺类药物是细菌二氢蝶酸合酶的竞争性抑制剂;氯霉素可抑制某些细菌转肤酶的活性从而抑制其蛋白质的合成;抗抑郁药通过抑制单胺氧化酶而减少儿茶酚胺的灭活,治疗抑郁症;洛伐他汀通过竞争性抑制HMG第—篇生物大分子结构与功能CoA还原酶的活性,减少胆固醇合成。甲氨蝶呤、5-氪尿啥唗、6-琉基嗦呤等用于治疗肿瘤也是因为它们都是核昔酸合成途径中相关酶的竞争性抑制剂。 二、酶可作为试剂用于临床检验和科学研究 (一)有些酶可作为酶偶联测定法中的指示酶或辅助酶有些酶促反应的底物或产物含量极低,不易直接测定。此时,可偶联另一种或两种酶,使初始反应产物定量地转变为另一种较易定量测定的产物,从而测定初始反应中的底物、产物或初始酶活性。这种方法称为酶偶联测定法。若偶联一种酶,这个酶即为指示酶(ind icator enzyme);若偶联两种酶,则前一种酶为辅助酶(aux山ary enzyme),后一种酶为指示酶。例如,临床上测定血糖时,利用葡糖氧化酶将葡萄糖氧化为葡萄糖酸,并释放H202,过氧化物酶催化H202与4-氨基安替比林及苯酚反应生成水和红色酣类化合物,测定红色酣类化合物在505nm处的吸光度即可计算出血糖浓度。此反应中的过氧化物酶即为指示酶。 (二)有些酶可作为酶标记测定法中的标记酶 临床上经常需检测许多微量分子,过去一般都采用放射性核素标记法。鉴于其应用不便,现今多以酶标记代替核素标记。例如,酶联免疫吸附测定(enzyme-linked immunosorbent assays, ELISA)法就是利用抗原-抗体特异性结合的特点,将标记酶与抗体偶联,对抗原或抗体进行检测的一种方法国。常用的标记酶有辣根过氧化物酶、碱性磷酸酶、葡糖氧化酶、B-D-半乳糖甘酶等。 (三)多种酶成为基因工程常用的工具酶多种酶现已常规用于基因工程操作过程中。例如,II型限制性内切核酸酶、DNA连接酶、逆转录酶、DNA聚合酶等。 酶是对其特异底物起高效催化作用的蛋白质。结合酶由酶蛋白和辅因子组成,只有全酶才具有催化作用。同工酶是指催化相同的化学反应,但酶蛋白的分子结构、理化性质乃至免疫学性质不同的一组酶。 酶对底物具有极高的催化效率、对底物具有高度的特异性以及具有可调节性。酶的特异性包括绝对特异性与相对特异性。酶的活性中心是酶分子中能与底物特异地结合并催化底物转变为产物的具有特定三维结构的区域。活性中心内外的必需基团对于维持酶活性中心的构象是不可或缺的。酶催化反应时,先与底物结合形成酶-底物复合物,通过邻近效应、定向排列、表面效应使底物转变成过渡态,并呈现多元催化作用。 酶促反应速率受底物浓度、酶浓度、温度、pH、抑制剂和激活剂等影响。米氏方程揭示了单底物反应的动力学特性,米氏方程的双倒数作图常用来准确求取凡和Vmax。凡值等于反应速率为最大反应速率一半时的底物浓度,在一定条件下可反映酶与底物的亲和力大小。 三种可逆性抑制剂作用的特点:竞争性抑制剂存在时表观凡增大,vmax不变;非竞争性抑制剂存在时k,',不变,Vmux下降;反竞争性抑制剂存在时表观Km和Vmux均降低。别构调节是由于别构效应剂与酶的活性中心外的某个部位非共价可逆结合,而改变酶的催化活性。化学修饰调节是因酶蛋白肤链上的一些基团在其他酶的催化下,与某些化学基团共价可逆结合,而影响酶的活性。酶原是无活性的酶前体。酶原激活的实质是酶的活性中心形成或暴露的过程。根据酶催化的反应类型将其分为6大类:氧化还原酶类、转移酶类、水解酶类、裂合酶类、异构酶类和连接酶类。 第三章酶与酶促反应 1.用什么办法能证明酶的化学本质是蛋白质?2.在测定某一酶活性时,应当注意控制哪些条件? 3.欲使一个酶促反应的速率(v)达到最大反应速率(v,,,.x)的80%,则[S]与凡的关系如何?4.温度如何对酶促反应速率发挥双重影响?5.当某种酶制剂中混有抑制剂时,怎样未鉴别这是可逆性抑制剂还是不可逆性抑制剂?假如混有的是可逆性抑制剂,怎样来证明?(田余祥) 第四章聚糖的结构与功能 细胞中存在着种类各异的由糖基分子与蛋白质或脂以共价键连接而形成的复合生物大分子,如糖蛋白、蛋白聚糖和糖脂等,统称为复合糖类(complex cru·bohydrate),又称为糖复合体(glycoconjugate)。组成复合糖类中的糖组分是由单糖通过糖昔键聚合而成的寡糖或多糖,称为聚糖(glycan)。就结构而言,糖蛋白和蛋白聚糖均由共价连接的蛋白质和聚糖两部分组成,而糖脂由聚糖与脂质组成。体内也存在着蛋白质、糖与脂质三位一体的复合物,主要利用糖基磷脂酰肌醇(glycosylphosphatidyl inositol, GPI)将蛋白质铀定千细胞膜中。 大多数真核细胞都能合成一定数量和类型的糖蛋白和蛋白聚糖,分布于细胞表面、细胞内分泌颗粒和细胞核内;也可被分泌出细胞,构成细胞外基质成分。糖蛋白分子中蛋白质重量百分比大于聚糖,而蛋白聚糖中聚糖所占重量在一半以上,甚至高达95%,以致大多数蛋白聚糖中聚糖分子质量高达10万以上。由于组成糖蛋白和蛋白聚糖的聚糖结构迥然不同,因此两者在合成途径和功能上存在显著差异。 第一节糖蛋白分子中聚糖及其合成过程 糖蛋白(glycopro tein)是指糖类分子与蛋白质分子共价结合形成的蛋白质,其分子中的含糖量因蛋白质不同而异,有的可达20%,有的仅为5%以下。此外,糖蛋白分子中的单糖种类、组成比和聚糖的结构也存在显著差异。组成糖蛋白分CH20H如子中聚糖的单糖有7种:葡萄糖(glucose,H}如尸o\NH i CH2CH C0天冬酰胺Gl c)、半乳糖(galactose, Gal)、甘露糖(manHO、.--V H nose,Man)、N-乙酰半乳糖胺(N-ace tylgaH NHCOCH, N-连接型lactosamine, GalNAc)、N-乙酰葡糖胺(NN-乙酰葡糖胺忑|acetylglucosamine, GlcNAc)、岩藻糖(fucose,Fuc)和N-乙酰神经氨酸(N-acetylneuraminic CH20H CH20H R=H或CH3HO匕—o HO尸0H acid,NeuAc)。 H\、10_-HO,;;-o H R仁。H OH H H由上述单糖构成结构各异的聚糖可H OH H NHCOCH3NH经两种方式与糖蛋白的蛋白质部分连接,B半乳糖基-(1-3)-cx-N-乙酰半乳糖胺-丝氨酸闭;氨酸因此,根据连接方式不同可将糖蛋白聚糖分为N连接型聚糖(N-linked glycan)和图4-1糖蛋白聚糖的N连接型和0连接型O-连接型聚糖(0-lin k ed glycan)。N连接注:X为脯氨酸以外的任何氨基酸型聚糖是指与蛋白质分子中天冬酰胺残基的酰胺氮相连的聚糖;O-连接型聚糖是指与蛋白质分子中丝氨酸或苏氨酸胫基相连的聚糖(图4l)。所以,糖蛋白也相应分成N-连接糖蛋白和O-连接糖蛋白。 不同种属、组织的同一种糖蛋白的N-连接型聚糖的结合位置、糖基数目、糖基序列不同,可以产生不同的糖蛋白分子形式。即使是同一组织中的某种糖蛋白,不同分子的同一糖基化位点的N-连接型聚糖结构也可以不同,这种糖蛋白聚糖结构的不均一性称为糖形(glycoform)。 第四章聚糖的结构与功能 一、N-连接型糖蛋白的糖基化位点为Asn-X-Ser(Thr 聚糖中的N-乙酰葡糖胺与蛋白质中天冬酰胺残基的酰胺氮以共价键连接,形成N-连接型糖蛋白,这种蛋白质等非糖生物分子与糖形成共价结合的反应过程称为糖基化。但是并非糖蛋白分子中所有天冬酰胺残基都可连接聚糖,只有糖蛋白分子中与糖形成共价结合的特定氨基酸序列,即Asn-XSer/Thr(其中X为脯氨酸以外的任何氨基酸)3个氨基酸残基组成的序列子(sequon)才有可能,这一序列子被称为糖基化位点(图4-1)。一个糖蛋白分子可存在若干个Asn-X-Ser/Thr序列子,这些序列子只能视为潜在糖基化位点,能否连接上聚糖还取决于周围的立体结构等。 二、N连接型聚糖结构有高甘露糖型、复杂型和杂合型之分根据结构可将凡连接型聚糖分为3型:高甘露糖型、复杂型和杂合型。这3型N-连接型聚糖都有一个由2个N-GlcNAc和3个Man形成的五糖核心(图4-2)。高甘露糖型在核心五糖上连接了2~9个甘露糖,复杂型在核心五糖上可连接2、3、4或5个分支聚糖,宛如天线状,天线末端常连有N-乙酰神经氨酸。杂合型则兼有两者的结构。 :2.3,或6~23,或6 小1,4 Man -,扣/4i—-l I磷酸已糖异构酶葡糖-6-磷酸--------已-葡萄糖和糖蛋白的消化产物。甘露糖在体内通过两C02+H心步反应转变成果糖-6-磷酸而进入糖酵解代谢。首先,甘露糖在已糖激酶的催化下,磷酸葡糖-1-磷酸玉糖原化生成甘露糖-6-磷酸,接着被磷酸甘露糖异构酶催化转变为果糖-6-磷酸,从而进入糖酵图5-4甘露糖的代谢解进行代谢转变,最终可生成糖原、乳酸、葡萄糖、戊糖等多种产物(图5-4)。 第三节糖的有氧氧化 机体利用氧将葡萄糖彻底氧化成CO2和I-120的反应过程称为糖的有氧氧化(aerobic oxidation of glucose)。有氧氧化是体内糖分解供能的主要方式,绝大多数细胞都通过它获得能量。在肌组织中葡萄糖通过无氧氧化所生成的乳酸,也可作为运动时机体某些组织(如心肌)的重要能源,彻底氧化生成CO2和H20,提供较为充足的能量。糖的有氧氧化可概括如图5-5。 葡萄糖4侚糖6-磷酸_-内忭船丙卧悄友--4乙冼CoA—只荔笠勹-贮CO2胞质线粒体一、糖的有氧氧化分为三个阶段糖的有氧氧化分为三个阶段:第一阶段葡萄糖在细胞质中经糖酵解生成丙酮酸;第二阶段丙酮酸进入线粒体氧化脱狻生成乙酰CoA;第三阶段乙酰CoA进入三狻酸循环,并偶联进行氧化磷酸化。第一阶段反应如前所述,氧化磷酸化将在第六章中讨论。在此主要介绍丙酮酸氧化脱狻和三狻酸循环的反应过程。 (一)葡萄糖经糖酵解生成丙酮酸 同糖无氧氧化的第一阶段。 (二)丙酮酸进入线粒体氧化脱狻生成乙酰CoA 丙酮酸在线粒体经过5步反应氧化脱狻生成乙酰CoA(acetyl CoA),总反应式为:丙酮酸+NAD++HS-CoA-一乙酰CoA+NADH+W+CO2此反应由丙酮酸脱氢酶复合体(pyruvate dehydrogenase complex)催化。在真核细胞中,该酶复合体存在千线粒体中,是由丙酮酸脱氢酶(E1汃二氢硫辛酰胺转乙酰酶(E2)和二氢硫辛酰胺脱氢酶(E3)按一定比例组合而成的。在哺乳动物细胞中,丙酮酸脱氢酶复合体由60个凡组成核心,周围排列着6个E3、20或30个E!。参与反应的辅因子有焦磷酸硫胺素(TPP)、硫辛酸、FAD、NA厅和CoA。二氢硫辛酰胺转乙酰酶的辅因子是硫辛酸和CoA,其中硫辛酸是带有二硫键的八碳狻酸,通过与转乙酰酶的赖氨酸残基的e-氨基相连,形成与酶结合的硫辛酰胺而成为酶的柔性长臂,可将乙酰基从酶复合体的一个活性部位转到另一个活性部位。丙酮酸脱氢酶的辅因子是TPP,二氢硫辛酰胺脱氢酶的辅因子是FAD、NAD+。包丙酮酸脱氢酶复合体催化的反应分为5步(图5-6):O由丙酮酸脱氢酶(El)催化,丙酮酸脱狻形成轻乙基-TPP-E10TPP嗟嗤环上的N与S之间活泼的碳原子可释放出H+,而成为负碳离子,与丙酮酸的碳基作用,使丙酮酸脱狻产生CO2,同时形成轻乙基-TPP。@由二氢硫辛酰胺转乙酰酶(E2)催化,使胫乙基-TPP丑上的胫乙基被氧化成乙酰基,同时转移给硫辛酰胺,形成乙酰硫辛酰胺-E2a@二氢硫辛酰胺转乙酰酶(E2)继续催化,使乙酰硫辛酰胺上的乙酰基转移给CoA生成乙酰CoA后,离开酶复合体,同时氧化过程中的2个电子使硫辛酰胺还原生成二氢硫辛酰胺。@由二氢硫辛酰胺脱氢酶(E3)催化,二氢硫辛酰胺脱氢重新生成硫辛酰胺,以进行下一轮反应,同时将氢传递给FAD,生成FADH20@由二氢硫辛酰胺脱氢酶(E3)继续催化,将FADH2上的氢转移给NAD十,形成NADH+H飞。 CH3一CI|一c(0o- N AD勹HN顷应 在整个反应过程中,中间产物并不离开酶复合体,这就使得上述各步反应得以迅速完成,而且因没有游离的中间产物,所以不会发生副反应。丙酮酸氧化脱狻反应的LiG0'=-33.4kJ/mol,故反应是不可逆的。 (三)乙酰CoA经三狻酸循环及氧化磷酸化提供能量三狻酸循环的第一步是由乙酰CoA与草酰乙酸缩合生成6个碳原子的拧檬酸,然后拧檬酸经过一系列反应重新生成草酰乙酸,完成一轮循环。经过一轮循环,发生2次脱狻反应,释放2分子CO五发生1次底物水平磷酸化,生成1分子GTP(或ATP)包;有4次脱氢反应,氢的接受体分别为NAD+或FAD,生成3分子NADH+甘和1分子FADH2,它们既是三狻酸循环中脱氢酶的辅因子,又是电子传递链的第一个环节。电子传递链由一系列氧化还原体系组成,它们的功能是将W或电子依次传递至氧,生成水。在W或电子沿电子传递链传递过程中逐步释放能量,同时伴有ADP磷酸化生成ATP,即氧化与磷酸化反应是偶联在一起的(见第六章)。,叩fi二、三狻酸循环使乙酰CoA彻底氧化(-)三狻酸循环由八步反应组成及4次脱氢、2次脱狻和1次底物水平磷酸化。 1.乙酰CoA与草酰乙酸缩合成拧檬酸此为三狻酸循环的第一个限速步骤,由拧檬酸合酶(citrate synthase)催化,1分子乙酰CoA与1分子草酰乙酸(oxaloacetate)缩合生成拧檬酸,缩合反应所形式存在。 严c20严 三狻酸循环(tricarboxylicycle)亦称拧檬酸循环(citriccycle),是线粒体内一acid cycle, TCA acidc系列酶促反应所构成的循环反应体系,由于其第一个中间产物是含有3个狻基的拧檬酸(citric acid)而得名。因为该学说由Krebs正式提出,亦称为Krebs循环。乙酰CoA(主要来自于三大营养物质的分解代谢)经三狻酸循环分解时,共经历8步反应,主要涉需能量来自乙酰CoA的高能硫酷键。由千高能硫酣键水解时可释放较多的自由能,LlG0'为322kJ/-. mol,故为不可逆反应。拧檬酸合酶对草酰乙酸的凡很低,即使线粒体内草酰乙酸的浓度很低,反应机——CCH3+H20-HOC-CooHSCoA H++++-草酰乙酸乙酰CoA拧檬酸辅酶A2.拧檬酸经顺乌头酸转变为异拧檬酸拧檬酸与异拧檬酸(isocie)的异构化可逆互变反应由trat顺乌头酸酶催化,将3上的胫基移至c2上。反应的中间产物顺乌头酸与酶结合在一起,以复合物的c1—H20HC-OHf比H20/HO。。 一乌 物合 拧檬酸 异拧檬酸 3.异拧檬酸氧化脱狻转变为0:-酮戊二酸异拧檬酸在异拧檬酸脱氢酶(isocitrate dehydrogenas e)催化下氧化脱狻产生CO2,脱下的氢由NAD十接受,生成NADH+H+,其余碳链骨架部分转变为a-酮戊二酸(a-ketoglu匡ate)。这是三狻酸循环中的第一次氧化脱狻反应,也是第二个限速步骤,反应不可逆,释出的CO2可被视作乙酰CoA的1个碳原子氧化产物。 一二 异拧檬酸a 4. ex-酮戊二酸氧化脱狻生成唬珀酰CoA a-酮戊二酸继续发生氧化脱狻产生CO2,脱下的氢 由NAD+接受,生成NADH+H飞其余碳链骨架部分转变为唬珀酰CoA(s uccinyl CoA),它含有高能硫酷键。催化此反应的酶是a-酮戊二酸脱氢酶复合体(a-ketoglutarate dehydrogenas e complex),其组成和催化反应过程与丙酮酸脱氢酶复合体类似,这就使得a-酮戊二酸的脱狻、脱氢、形成高能硫酣键等反伈I,应可迅速完成。此为三狻酸循环中的第二次氧化脱狻反应,也是第三个限速步骤,反应不可逆,释出的CO2可被视作乙酰CoA的另1个碳原子氧化产物。 a-酮戊二酸骁珀酰CoA 5.唬珀酰CoA合成酶催化底物水平磷酸化反应唬珀酰CoA含有高能硫酷键,6.G0'约为-36kJ/mol。它水解生成唬珀酸(succinic acid)的同时,与核昔二磷酸的磷酸化偶联,生成高能磷酸键,反应是可逆的。这是三狻酸循环中唯一的底物水平磷酸化反应,由唬珀酰CoA合成酶(succinyl CoA synthetase)催化。该酶在哺乳动物体内有两种同工酶,分别以GDP或ADP作为辅因子,生成GTP或ATP,两者具有不同的组织分布特点,与不同组织的代谢偏好相适应。 严CDP(ADP)+Pi GTP(ATP)妯~f'2+HSCoA严2CH2 coo一心00 骁珀酰CoA骁珀酸 6.唬珀酸脱氢生成延胡索酸反应由唬珀酸脱氢酶(succinate dehydrogenase)催化。该酶结合在线粒体内膜上,是三狻酸循环中唯一与内膜结合的酶,其辅因子是FAD。反应脱下的氢由FAD接受,生成FADH2,经电子传递链被氧化,生成1.5分子ATP(见第六章)。 C00一如。一 貌珀酸延胡索酸 7.延胡索酸加水生成苹果酸延胡索酸酶(fumarate hydratase)催化此可逆反应。 严HO—严C—H 如。一加。 一 H 延胡索酸苹果酸 8.苹果酸脱氢生成草酰乙酸在苹果酸脱氢酶(malate dehydrogenase)催化下,苹果酸(malic acid)脱氢生成草酰乙酸。脱下的氢由NAD十接受,生成NADH+H飞在细胞内草酰乙酸不断地被用于拧檬酸合成,故这一可逆反应向生成草酰乙酸的方向进行。 coo-加。一 苹果酸草酰乙酸V`ifC恤“ 100第二篇物质代谢及其调节 三狻酸循环的上述八步反应过程可归纳如图5-7,其主要特点是:心4次脱氢生成3分子NADH和1分子FADH2。三狻酸循环中,从乙酰CoA与草酰乙酸缩合成拧檬酸开始,反复地进行脱氢氧化,4次脱氢反应中的3次由NAD十接受生成3分子NADH+H',1次由FAD接受生成1分子FADH2。这4分子还原当量(reducing equivalent,一般是指以氢原子或氢离子形式存在的一个电子或一个电子当量)将电子传给氧时,才能生成ATP。@2次脱狻生成2分子CO2。1分子乙酰CoA进入三狻酸循环后,中间产物三狻酸和二狻酸通过脱狻方式共生成2分子CO"这是体内CO2的主要来源。@l次底物水平磷酸化生成1分子GTP(或ATP)。三狻酸循环每进行一轮,底物水平磷酸化只能发生1次,故不是线粒体内的主要产能方式。三狻酸循环的总反应为:CH3CO-SCoA+3NAD++FAD+GDP(ADP)+Pi+2H20-一2C02+3NADH+3W`丘°索酸酶}顺乌头1归b水合如-珧珀酸脱氢酶上异拧檬酸H]:吼-COO@脱氢妯彰珀酰辅酶A$)忘枷*平芯酚,(y Pi+v[2H]值得注意的是,每一次三狻酸循环消耗1分子乙酰CoA(2个碳),释出2分子CO2,但并非直接将乙酰CoA的2个碳原子氧化。用14C标记乙酰CoA进行的实验观察到,脱狻生成的2个CO2的碳原子来自草酰乙酸而不是乙酰CoA,这是由千中间反应过程中碳原子置换所致。因此,每进行一轮三狻酸循环,最后再生的草酰乙酸的碳架就被更新一半,但其含量并没有增减。 另外,三狻酸循环的各种中间产物本身并无量的变化,不可能通过三狻酸循环从乙酰CoA合成草酰乙酸或其他中间产物;同样,这些中间产物也不可能直接在三狻酸循环中被氧化成CO2和H20。三狻酸循环中的草酰乙酸主要来自丙酮酸的直接狻化,也可通过苹果酸脱氢生成,两者的根本来源都是葡萄糖。 (二)三狻酸循环在三大营养物质代谢中占核心地位1.三狻酸循环是三大营养物质分解产能的共同通路糖、脂肪、氨基酸都是能源物质,它们在体内分解最终都将产生乙酰CoA,然后进入三狻酸循环彻底氧化。三狻酸循环中,只有一个底物水平磷酸化反应生成高能磷酸键,因此三狻酸循环本身并不是直接释放能量、生成ATP的主要环节,而是通过4次脱氢反应提供足够的还原当量,以便进行后续的电子传递过程和氧化磷酸化反应生成大量ATP。 2.三狻酸循环是糖、脂肪、氨基酸代谢联系的枢纽三大营养物质通过三狻酸循环在一定程度上相互转变。例如,饱食时糖可以转变成脂肪,其中拧檬酸发挥重要枢纽作用。葡萄糖分解成丙酮酸后,进入线粒体内氧化脱狻生成乙酰CoA,乙酰CoA必须再转移到细胞质以合成脂肪酸。由千乙酰CoA不能通过线粒体内膜,于是它先与草酰乙酸缩合成拧檬酸,再通过载体转运至细胞质,在拧檬酸裂解酶(citrate lyase)作用下裂解释放出乙酰CoA和草酰乙酸,然后乙酰CoA可作为细胞质中脂肪酸合成及胆固醇合成的原料。 又如,绝大部分氨基酸可以转变成糖。许多氨基酸的碳架是三狻酸循环的中间产物,通过草酰乙酸可转变为葡萄糖(见本章第六节糖异生)。相反,糖也可通过三狻酸循环中的各中间产物接受氨基,从而合成非必需氨基酸如天冬氨酸、谷氨酸等(见第八章)。 三、糖的有氧氧化是糖分解供能的主要方式糖的有氧氧化是产能的主要途径。三狻酸循环中4次脱氢反应产生的NADH和FADH2,通过电子传递链和氧化磷酸化生成大量ATP。线粒体内,每分子NADH的氢传递给氧时,可生成2.5分子ATP;每分子FADH2的氢则只能生成1.5分子ATP。加上底物水平磷酸化生成的1分子ATP, l分子乙酰CoA经三狻酸循环彻底氧化,共生成10分子ATP。若从丙酮酸脱氢开始计算,共产生12.5分子ATP。此外,糖酵解中3-磷酸甘油睦在细胞质中脱氢生成的NADH,在氧供应充足时也要转运至线粒体内,经电子传递链和氧化磷酸化产生ATP。将NADH从细胞质运到线粒体的机制有两种,分别产生2.5分子或者1.5分子ATP(见第六章)。综上,lmol葡萄糖彻底氧化生成CO2和H20,可净生成30或32mol ATP(表5-1)。总的反应为:葡萄糖+30/32ADP+30/32Pi+602-30/32ATP+6C02+36H20第一阶段葡萄糖-+葡糖-6-磷酸-1果糖-6-磷酸一果糖-l,6-二磷酸-12x3-磷酸甘油醒-+2x l,3-二磷酸甘油酸2NADH(细胞质)3或5. 2xl,3-二磷酸甘油酸一2x3-磷酸甘油酸2 2x磷酸烯醇式丙酮酸一2x丙酮酸2 第二阶段2x丙酮酸-+2x乙酰CoA2NADH(线粒体)5 第三阶段2x异拧檬酸-+2x cx-酮戊二酸2NADH(线粒体)5由1分子葡萄糖总共获得30或32注:.获得ATP的数批取决于还原当批进入线粒体的穿梭机制四、糖的有氧氧化主要受能量供需平衡调节机体对能量的需求变动很大,因此糖的有氧氧化作为主要产能途径,其代谢流量必须受到动态调节,才能维持体内的能量供需平衡。糖进行有氧氧化时,丙酮酸经三狻酸循环代谢的速率被两个阶段的关键酶所调节:一是调节丙酮酸脱氢酶复合体的活性,从而调控由丙酮酸生成乙酰CoA的速率;二是调节三狻酸循环中的3个关键酶活性,从而调控乙酰CoA彻底氧化的速率。 (—)丙酮酸脱氢酶复合体调节乙酰CoA的生成速率快速调节丙酮酸脱氢酶复合体的活性有两种方式:别构调节和化学修饰。诱发别构调节的主要因素包括:心细胞内能量状态:ATP别构抑制丙酮酸脱氢酶复合体,AMP则能将其激活。因此,ATP/AMP比值可动态调节此酶活性。能量缺乏时该比值降低,酶被激活;能量过剩时该比值升高,酶被抑制。@代谢产物生成量:丙酮酸脱氢酶复合体的反应产物乙酰CoA和NADH对其有别构抑制作用,而相应的底物CoA和NAD+则使之激活。当乙酰CoAICoA比值升高、或NADHINAD十比值升高时,此酶的活性被抑制。总之,丙酮酸脱氢酶复合体发生别构抑制的情况,可见于餐后糖分解过盛、或饥饿状态下大量脂肪酸氧化时,前者目的是避免糖分解产能过多造成浪费,后者目的是使大多数组织器官改用脂肪酸为能源,节约葡萄糖以确保对脑等重要组织的糖供给。 除别构调节外,丙酮酸脱氢酶复合体的活性还受到可逆的化学修饰调节。在丙酮酸脱氢酶激酶催化下,丙酮酸脱氢酶复合体可被磷酸化而失去活性;丙酮酸脱氢酶磷酸酶则使之去磷酸化而恢复活性。乙酰CoA和NADH除直接别构抑制丙酮酸脱氢酶复合体之外,也可间接通过增强丙酮酸脱氢酶激酶的活性而使该酶复合体失活(图5-8)。 丙酮酸 乙酰CoA A沺乙酰CoA 胰岛素 (二)三狻酸循环的关键酶调节乙酰CoA的氧化速率三狻酸循环有3步不可逆反应,分别由拧檬酸合酶、异拧檬酸脱氢酶和a-酮戊二酸脱氢酶复合体催化。三狻酸循环的速率主要取决于这些关键酶的活性(图5-9),其中异拧檬酸脱氢酶和a-酮戊二酸脱氢酶复合体的活性调节更为重要,主要调节方式包括:心底物的别构激活作用:乙酰CoA和草酰乙酸作为拧檬酸合酶的底物,其含量随细胞代谢状态而改变,从而影响拧檬酸合成的速率。@产物的别构抑制作用:拧檬酸生成过剩时,反馈抑制拧檬酸合酶的活性;唬珀酰CoA和NADH作为直接产物和远端产物,分别抑制a-酮戊二酸脱氢酶复合体和拧檬酸合酶的活性。@能量状态的调节作用:ATP别构抑制拧檬酸合酶与异拧檬酸脱氢酶的活性;ADP则可将这两者别构激活。@Ca2+的激活作用:当线粒体内Ca2+浓度升高时,Ca2•不仅可直接与异拧檬酸脱氢酶和a-酮戊二酸脱氢酶复合体相结合,降低其对底物的凡而增强酶活性;也可激活丙酮酸脱氢酶复合体,从而增加丙酮酸经有氧氧化代谢的流量。 4`.,,需要注意的是,拧檬酸的生成量和亚细胞分布,不仅调节三狻酸循环本身的速率,还可调节脂质j丙酮酸合成的速率。当糖分解产能不足时,拧檬丙酮酸脱氢酶复合体l8ATP,乙酰CoA,NADH,脂肪酸酸留在线粒体中,继续进行三狻酸循环分EBAMP,CoA,NAD+,Ca2•解供能;当糖分解产能过多时,拧檬酸可乙醮CoA通过拧檬酸-丙酮酸循环转移至细胞质,裂EEJADP解释出乙酰CoA作为合成原料,同时拧檬、拧桉酸酸通过激活脂肪酸合成的关键酶,促进脂\质合成(见第七章)。因此,拧檬酸是协同调节糖代谢和脂代谢的枢纽物质。 (三)糖的有氧氧化各阶段相互协调 糖进行有氧氧化时,各阶段的代谢速 率调节并非彼此孤立,而是紧密联系、相 互协调,这主要是因为其中的多种关键酶 苹果酸NADH\—勹芦,ADP 可被一些相同的别构剂所调节。 姚珀酰CoA 1.通过共同的代谢物别构调节各阶段的关键酶在正常情况下,糖酵解和丙酮酸经三狻酸循环代谢的速度是相协调AC[的。在糖酵解中产生了多少丙酮酸,三狻酰CoA。这种协调主要通过同一别构剂对多种关键酶的调节而实现:CD拧檬酸别构剂:糖产能过多时,拧檬酸不仅在线粒体内抑制拧檬酸合酶,还可转运至细胞质抑制磷酸果糖激酶-l,从而使糖酵解和三狻酸循环同时受到负反馈调节。®NADH别构剂:线粒体内NADH不仅抑制丙酮酸脱氢酶复合体,还可抑制拧檬酸合酶、a-酮戊二酸脱氢酶复合体,从而使丙酮酸氧化脱狻和三狻酸循环受到协同的负反馈调节。此外,如果糖分解产生的大量NADH进入下游氧化磷酸化的代谢速度减慢,就会导致NADH积累,进而抑制上游丙酮酸的氧化分解。总之,在糖有氧氧化的所有阶段,糖酵解、丙酮酸氧化脱狻、三狻酸循环和氧化磷酸化的运行速率彼此配合、相互适应。 2.能量状态协同调节糖有氧氧化各阶段的关键酶糖有氧氧化的调节是为了适应机体对能量的需要,为此,细胞内ATP/ADP或ATP/AMP比值同时调节糖的有氧氧化各阶段中诸多关键酶的活性,使其流量调控始终保持协调一致。当细胞消耗ATP时,引起ADP和AMP浓度升高,别构激活磷酸果糖激酶-l、丙酮酸激酶、丙酮酸脱氢酶复合体、拧檬酸合酶、异拧檬酸脱氢酶以及氧化磷酸化的相关酶,加速进行有氧氧化以补充ATP。反之,当细胞内ATP充足时,上述酶的活性降低,从而减弱有氧氧化以避免浪费。 与ATP/ADP相比,ATP/AMP对有氧氧化的调节作用更为明显。这是因为ATP被水解成ADP后,ADP也被消耗,经腺昔酸激酶催化再生成一些ATP(2ADP----+ATP+AMP)。因此,ATP和ADP的同时消耗,使得ATP/ADP的变化相对较小。而细胞内ATP的浓度约为AMP的50倍,由于AMP的浓度很低,所以每生成1分子AMP,ATP/AMP的变动就比ATP/ADP的变动大得多,从而发挥更有效的调节作用。 五、糖氧化产能方式的选择有组织偏好 对于存在线粒体的细胞,利用葡萄糖分解产能时选择有氧氧化还是无氧氧化,主要取决于不同类型组织器官的代谢特点。例如,肌组织在有氧条件下,糖的有氧氧化活跃,而无氧氧化则受到抑制,这一现象称为巴斯德效应(Pas teur effec t)。该效应最初在酵母菌中被发现,无氧时酵母菌进行生醇发酵(无氧氧化),将其转移至有氧环境后,生醇发酵即被抑制。肌组织发生巴斯德效应的机制是,细胞质中糖酵解所产生NADH的去路,决定了酵解产物丙酮酸的代谢去向。有氧时,细胞质中NADH一旦产生立即进入线粒体内氧化,糖酵解最后生成的丙酮酸也就接着运入线粒体进行有氧氧化;缺氧时,NADH留在细胞质,以丙酮酸为受氢体,使之还原生成乳酸。因此,糖的有氧氧化可抑制糖的无氧氧化。 又如,增殖活跃的组织(如肿瘤)即使在有氧时,葡萄糖也不被彻底氧化,而是被分解生成乳酸,此现象称为瓦伯格效应(W釭burg effect)。一般来说,无氧氧化时的葡萄糖消耗量显著多于有氧氧化,这是因为无氧氧化产能偏少,ATP/ADP比值相对较低,对磷酸果糖激酶-1和丙酮酸激酶的激活作用显著,从而使无氧分解的葡萄糖更多。瓦伯格效应使肿瘤细胞获得生存优势,其重要原因之一是无氧氧化可避免将葡萄糖全部分解成CO2,从而为肿瘤快速生长积累大量的生物合成原料。肿瘤的这一代谢特征已成为疾病诊治的新依据和突破点。 第四节磷酸戊糖途径 葡萄糖在细胞内除通过有氧氧化和无氧氧化分解产能外,还存在其他不产能的分解代谢途径,如磷酸戊糖途径。磷酸戊糖途径(pentose phosphate pathway)是指从糖酵解的中间产物葡糖-6-磷酸开始形成旁路,通过氧化、基团转移两个阶段生成果糖-6-磷酸和3-磷酸甘油醒,从而返回糖酵解的代谢途径。磷酸戊糖途径不能产生ATP,但可生成NADPH和磷酸核糖两种重要产物。 一、磷酸戊糖途径分为两个阶段葡糖-6-磷酸进入磷酸戊糖途径分解,其过程分为两个阶段:第一阶段是氧化反应,生成磷酸戊糖、NADPH和CO2;第二阶段是基团转移反应,最终生成果糖-6-磷酸和3-磷酸甘油醋。全部反应在细胞质中进行。(-)氧化阶段生成NADPH和磷酸核糖葡糖-6-磷酸进入第一阶段的反应包括:心在葡糖-6-磷酸脱氢酶(glucose-6-phosphate dehydrogenase)催化下,葡糖-6-磷酸氧化成6-磷酸葡糖酸内酷,脱下的氢由NADP+接受而生成NADPH,此反应需要M忙参与。@由内酷酶(lactonase)催化,6-磷酸葡糖酸内酕水解为6-磷酸葡糖酸。@由6-磷酸葡糖酸脱氢酶催化,6-磷酸葡糖酸氧化脱狻生成核酮糖-5-磷酸,同时生成NADPH及C020@核酮糖-5磷酸经异构酶催化,转变成核糖-5-磷酸;或者经差向异构酶催化,转变为木酮糖-5-磷酸。这些磷酸戊糖之间的相互转变均为可逆反应。总之,第一阶段中,1分子葡糖-6-磷酸生成2分子NADPH和1分子核糖-5-磷酸,释出1分子C020CH20H CHO H-<;:-OHINADP+H—C-OH比0H-<;:-OH NADP+<;:=O H-<;:I-OHHO-{-H?气Ho-{-H?LHo气-H\H—尸—OH~H—?-OH二NAD&尸:三勹二NA唱f+H+CO2H—f-OHH斗-OHI CH20—@CH心—@CH20—@CH20—@CH20—@葡糖-6-磷酸6-磷酸葡糖酸内酷6-磷酸葡糖酸核酮糖-5-磷酸核糖-5-磷酸(二)基团转移阶段生成磷酸已糖和磷酸丙糖第一阶段生成的NADPH和磷酸核糖,可用作体内诸多合成代谢的原料,但由千细胞对NADPH的需求量大得多,为避免磷酸核糖积累,多余的戊糖就会进入第二阶段,以便重新返回糖酵解途径而被再次利用。 106第二篇物质代谢及其调节 (一)提供磷酸核糖参与核酸的生物合成 核糖是核昔酸的基本组分。体内的核糖并不依赖从食物摄入,而是通过磷酸戊糖途径生成。磷酸核糖的生成方式有两种:一是发生在氧化阶段,由葡糖-6-磷酸氧化脱狻生成;二是发生在基团转移阶段,由糖酵解的中间产物3-磷酸甘油醒和果糖-6-磷酸通过基团转移生成。这两种方式的相对重要性因物种而异,因器官而异。例如,人体主要通过第一种方式生成磷酸核糖,但肌组织内因缺乏葡糖6-磷酸脱氢酶故通过第二种方式生成磷酸核糖。(二)提供NADPH作为供氢体参与多种代谢反应与NADH不同,NADPH携带的氢并不通过电子传递链氧化释出能量,而是参与许多代谢反应,发挥不同的功能。 还原型谷胱甘肤是体内重要的抗氧化剂,可保护一些含琉基的蛋白质或酶免受氧化剂(尤其是过氧化物)的损害。对于红细胞,还原型谷胱甘肤的意义更为重要,可保护红细胞膜的完整性。葡糖-6磷酸脱氢酶缺陷者,其红细胞不能经磷酸戊糖途径获得充足的NADPH,不足以使谷胱甘肤保持还原状态,因而表现出红细胞(尤其是较老的红细胞)易千破裂,发生溶血性黄疽。这种溶血现象常在食用蚕豆(是强氧化剂)后诱发,故称为蚕豆病。 第五节糖原的合成与分解 摄入的糖类除满足供能外,大部分转变成脂肪(甘油三酣)储存于脂肪组织,还有一小部分用于合成糖原。糖原(glycogen)是葡萄糖的多聚体,是动物体内糖的储存形式。糖原分子呈多分支状,其葡萄糖单位主要以a-1,4-糖昔键连接,只有分支点形成a-1,6-糖昔键。糖原具有一个还原性末端和多个非还原性末端。在糖原的合成与分解过程中,葡萄糖单位的增减均发生在非还原性末端。 糖原作为葡萄糖储备的意义在于,当机体需要葡萄糖时可以迅速动用糖原以供急需,而动用脂肪的速度则较慢。糖原主要储存于肝和骨骼肌,但肝糖原和肌糖原的生理意义不同。肝糖原是血糖的重要来源,这对于一些依赖葡萄糖供能的组织(如脑、红细胞等)尤为重要。而肌糖原则主要为肌收缩提供急需的能量。 一、糖原合成是将葡萄糖连接成多聚体糖原合成(glycogenesis)是指由葡萄糖生成糖原的过程,主要发生在肝和骨骼肌。糖原合成时,葡萄糖先活化,再连接形成直链和支链(图5-11)。 原糖 (二)糖原合成的起始需要引物 如果细胞内糖原已耗尽而需要重新合成时,不能以游离葡萄糖作为起始分子来接受UDPG的葡萄糖基,只能以糖原蛋白(glycogenin)作为最初的葡萄糖基受体而起始糖原的合成。糖原蛋白是一种蛋白酪氨酸-葡糖基转移酶,可对自身进行糖基化修饰,将UDPG分子的葡萄糖基连接到自身的酪氨酸残基上。随后,糖原蛋白继续催化糖链初步延伸,由第一个结合到糖原蛋白上的葡萄糖分子接受下一个UDPG的葡萄糖基,形成第一个a-1,4-糖昔键。这样的延伸反应持续进行,直至形成与糖原蛋白相连接的八糖单位,即成为糖原合成的初始引物。 (三)UDPG中的葡萄糖基连接形成直链和支链 在糖原引物基础上的糖链进一步延伸则由糖原合酶(glycogen synthase)所催化。在糖原合酶作用下,UDPG的葡萄糖基转移到糖原引物的非还原性末端,形成a-1,4-糖昔键,此反应不可逆。糖原合酶是糖原合成过程中的关键酶,它只能使糖链不断延长,但不能形成分支。 当糖链长度达到至少11个葡萄糖基时,分支酶(branching enzyme)从该糖链的非还原末端将约6~7个葡萄糖基转移到邻近的糖链上,以a-1,6-糖昔键相接,从而形成分支(图5-12)。分支的形成不仅可增加糖原的水溶性,更重要的是可增加非还原性末端的数量,以便磷酸化酶迅速分解糖原。 (四)糖原合成是耗能过程 葡萄糖单位活化时,生成葡糖-6-磷酸需消耗l个ATP,焦磷酸水解成2分子磷酸时又损失1个高能磷酸键,共消耗2个ATP。糖原合酶催化反应时,生成的UDP必须利用ATP重新生成UTP,即ATP的高能磷酸键转移给了UTP,故并无高能磷酸键的损失。综上,糖原分子每延长1个葡萄糖基,需消耗2个ATP。 (一)葡萄糖活化为尿昔二磷酸葡萄糖 糖原合成起始于糖酵解的中间产物葡糖-6-磷酸。首先,葡糖-6-磷酸变构生成葡糖-l-磷酸。后者再与尿背三磷酸(UTP)反应生成尿昔二磷酸葡萄糖(UDPG)和焦磷酸。此反应可逆,由UDPG焦磷酸化酶(UDPG pyrophosphorylase)催化。但由千焦磷酸在体内迅速被焦磷酸酶水解,故实际上反应向生成UDPG的方向进行。体内许多合成代谢反应都伴有副产物焦磷酸生成,因此焦磷酸水解有利于合成代谢的进行。UDPG可看作”活性葡萄糖",在体内充当葡萄糖供体。 三三 c@P(a)磷酸葡糖变位酶;(b)UDPG焦磷酸化酶; (c)糖原合酶和分支酶;(d)糖原磷酸化酶和 心厂 葡糖-1磷酸 ADP ATP脱支酶G-6-P夕\~G 固5-12分支酶的作用 二、糖原分解是从非还原性末端进行磷酸解 糖原分解(glycogenolys is)是指糖原分解为葡糖-1-磷酸而被机体利用的过程,它不是糖原合成的逆反应(图5-11)。糖原首先解聚为葡萄糖单体,以葡糖-1-磷酸为主,也有少量游离葡萄糖。肝糖原和肌糖原的解聚过程一样,释出的主要产物葡糖-1-磷酸可转变为葡糖-6-磷酸,但肝和肌组织对葡糖6-磷酸的后续利用则完全不同。 (一)糖原磷酸化酶分解a-1,4-糖昔键释出葡糖-1-磷酸糖原分解的第一步是从糖链的非还原性末端开始,由糖原磷酸化酶(glycogen phosphorylase)催化分解l个葡萄糖基,生成葡糖-1-磷酸。此反应是磷酸解,自由能变动较小,理论上虽为可逆反应,但由于细胞内无机磷酸盐的浓度约为葡糖-l-磷酸的100多倍,所以实际上反应只能向糖原分解方向进行。糖原磷酸化酶是糖原分解过程中的关键酶,它只能作用于a-1,4-糖昔键,而对分支处的a-1,6-糖昔键无作用。 (二)脱支酶分解a-1,6-糖昔键释出游离葡萄糖当a-1,4糖昔键逐个分解,使糖链缩短至距分支点约4个葡萄糖基时,由于空间位阻,糖原磷酸化酶不能再发挥作用。这时由葡聚糖转移酶催化,将3个葡萄糖基转移到邻近糖链的末端,仍以a-1,4-糖节键连接。分支处仅剩下1个葡萄糖基以a-1,6-糖背键连接,在a-1,6-葡糖昔酶作用下水解成游离葡萄糖。葡聚糖转移酶和a-1,6-葡糖昔酶是同一酶的两种活性,合称脱支酶(debranching enzyme)(图5-13)。除去分支后,糖原磷酸化酶即可继续发挥作用。 转移酶 (三)肝利用葡糖-6-磷酸生成葡萄糖而肌不能肝糖原和肌糖原分解的起始阶段一样,主要磷酸化酶,6-糖昔酶 释出葡糖-1-磷酸,进而转变为葡糖-6~磷酸,但葡糖-6-磷酸在肝和肌内的代谢去向差异显著。肝 i l l内存在葡糖-6-磷酸酶(glu(,ose-6-phosph atase),可卢知已将葡糖~6-磷酸水解成葡萄糖释放入血,因此饥饿图5-13脱支酶的作用时肝糖原能够补充血糖,维待血糖稳定。而肌组织中缺乏此酶,葡糖-6-磷酸只能进行糖酵解,故肌糖原不能分解成葡萄糖,只能为肌收缩提供能量。需要注意的是,从葡糖-6-磷酸进入糖酵解直接绕过了葡萄糖磷酸化的起始步骤,因此肌糖原中的1分子葡萄糖基进行无氧氧化净产生3分子ATP。 三、糖原合成与分解的关键酶活性调节彼此相反 糖原合成与糖原分解是两条代谢途径,分别进行调控,并且相互制约。当糖原合成活跃时,糖原分解被抑制;反之亦然。这种合成与分解代谢通过两条途径进行独立的、反向的精细调节,是生物体内存在的普遍规律。 糖原合酶与糖原磷酸化酶均作用于a-1,4-糖昔键,分别是糖原合成与分解途径中的关键酶,它们的酶活性主要受磷酸化修饰和激素的调节,还可受别构调节。肝和肌内糖原代谢调节的特点有所不同,与各自的代谢功能相适应。 (一)磷酸化修饰对两个关键酶进行反向调节 糖原磷酸化酶与糖原合酶的活性均受磷酸化和去磷酸化的可逆调节,它们进行修饰的方式相似,但效果相反。例如,同样经磷酸化修饰后,糖原磷酸化酶被激活而糖原合酶被抑制,此时只有糖原分解活跃,这样就避免了分解与合成同时进行而造成无效循环。 1.磷酸化的糖原磷酸化酶是活性形式糖原磷酸化酶有磷酸化(a型,活性型)和去磷酸化(b型,无活性)两种形式。当它的第14位丝氨酸残基被磷酸化时,原来活性很低的磷酸化酶b就转变为活性强的磷酸化酶a。这种磷酸化过程由磷酸化酶b激酶催化;而去磷酸化过程则由磷蛋白磷酸酶-1催化(图5-14)。 激素(胰裔血糖素、肾上腺素等) 腺昔酸环化酶-腺昔酸环化酶(无活性)(活性) 三(二;二:产;白磷, 糖原合酶糖原口酶-@磷酸化酶b磷酸化酶a p心1〉飞三磷酸酶l 心Pi但 -------------------------------------磷蛋白磷酸酶抑制剂o蛋白激酶A(活性) 一( 罗 2.去磷酸化的糖原合酶是活性形式糖原合酶亦分为磷酸化(b型,无活性)和去磷酸化(a型,活性型)两种形式。去磷酸化的糖原合酶a有活性,其去磷酸化反应也由磷蛋白磷酸酶-1所催化。而磷酸化的糖原合酶b则失去活性,其磷酸化过程可由多种激酶所催化,如蛋白激酶A可将糖原合酶的多个丝氨酸残基磷酸化(图5-14),磷酸化酶b激酶、糖原合酶激酶等也可使糖原合酶发生不同位点的磷酸化修饰。(二)激素反向调节糖原的合成与分解糖原磷酸化酶与糖原合酶的磷酸化和去磷酸化修饰,归根结底,是由激素所引发的一系列连锁酶\。叶份}促反应(称为级联放大系统,cascade system)中的一环,这种激素调节作用具有快速放大效应。肝糖原分解与合成的生理性调节主要靠胰高血糖素和胰岛素,而肌糖原则主要靠肾上腺素和胰岛素。 1肝糖原分解主要受胰高血糖素调节肝糖原的功能是短期饥饿时补充血糖,因此其分解主要受胰高血糖素调节。在肝内,胰高血糖素通过一系列反应促进糖原分解(图s-14):CD活化腺昔酸环化酶,催化ATP生成cAMP。@当cAMP存在时,蛋白激酶A被激活,但其活化时间较短。cAMP在体内很快被磷酸二酷酶水解成AMP,蛋白激酶A随即转变为无活性形式。@活化的蛋白激酶A对磷酸化酶b激酶进行磷酸化修饰,使之活化。磷酸化酶b激酶也有磷酸化(活性型)和去磷酸化(无活性)两种形式。蛋白激酶A将其转变为磷酸化的活性形式;而磷蛋白磷酸酶-l使之去磷酸而失活。@在活化的磷酸化酶b激酶作用下,糖原磷酸化酶发生磷酸化修饰而激活,最终结果是促进糖原分解。另一方面,由于蛋白激酶A也可磷酸化糖原合酶,将其失活,因此同时抑制了糖原合成。 2.肌糖原分解主要受肾上腺素调节肌糖原不能补充血糖,而是为骨骼肌收缩紧急供能,最终分解生成乳酸。促进肌糖原分解的主要激素不是胰高血糖素,而是肾上腺素。肾上腺素引起糖原分解的级联反应系统与胰高血糖素类似(图5-14),同样通过对糖原磷酸化酶和糖原合酶的磷酸化修饰,产生促进糖原分解、抑制糖原合成的效果。 3.糖原合成主要受胰岛素调节饱食时胰岛素分泌,促进肝糖原和肌糖原合成。其作用机制较复杂,可部分解释为激活磷蛋白磷酸酶-l而使糖原合酶脱去磷酸,或抑制糖原合酶激酶而阻止对糖原合酶的磷酸化。磷蛋白磷酸酶-1催化广泛的去磷酸反应,其底物不仅有糖原合酶,还有糖原磷酸化酶b激酶、糖原磷酸化酶等。脱去磷酸后,糖原合酶活化,糖原磷酸化酶b激酶和糖原磷酸化酶失活,从而控制糖原代谢仅向合成方向进行。 磷蛋白磷酸酶-1的活性也受到精细的负调节,可被磷蛋白磷酸酶抑制剂所抑制。磷蛋白磷酸酶抑制剂是一种胞内蛋白质,其磷酸化形式为活性形式,磷酸化活化过程也由蛋白激酶A所催化。由此看出,蛋白激酶A可以从不同层次参与糖原代谢关键酶的化学修饰调节:CD直接调节酶:通过磷酸化糖原合酶、糖原磷酸化酶b激酶,直接阻止糖原合成、激活糖原分解;@间接调节抑制剂:通过磷酸化磷蛋白磷酸酶抑制剂,间接阻止糖原合酶、糖原磷酸化酶b激酶和糖原磷酸化酶的去磷酸化,以避免糖原合成被激活,同时避免糖原分解的活跃状态被抑制。 (三)肝糖原和肌糖原分解受不同的别构剂调节 糖原分解与合成的关键酶还受到别构调节。葡糖-6-磷酸可别构激活糖原合酶,促进肝糖原和肌糖原合成。但肝和肌内的糖原磷酸化酶则分别由不同的别构剂调节,这是与肝糖原和肌糖原的功能相适应的。 1肝糖原磷酸化酶主要受葡萄糖别构抑制葡萄糖是肝糖原磷酸化酶最主要的别构抑制剂,可避免在血糖充足时分解肝糖原。当血糖升高时,葡萄糖进入肝细胞,与糖原磷酸化酶a的别构部位相结合,引起酶构象改变而暴露出磷酸化的第14位丝氨酸,此时磷蛋白磷酸酶-l使之去磷酸化转变成磷酸化酶b而失活,抑制肝糖原分解。 此外,果糖-1,6-二磷酸和果糖-l-磷酸也可别构抑制肝糖原磷酸化酶,这就解释了当体内缺乏果糖-l-磷酸酪缩酶(见于果糖不耐受病人)或者果糖二磷酸酶-1时,即使肝糖原储备丰富,仍会发生低血糖的原因。前者是产生过量的果糖-l-磷酸所致,后者则是由果糖-1,6-二磷酸堆积所致。 2肌糖原分解主要受能量和Ca2+的别构调节骨骼肌内糖原分解的别构调节主要有两种机制。一种调节机制取决于细胞内的能量状态,由AMP、ATP及葡糖-6-磷酸别构调节糖原磷酸化酶。AMP使之激活;ATP、葡糖-6-磷酸则抑制其活性。当肌收缩时,ATP被消耗,葡糖-6-磷酸水平亦低,而AMP浓度升高,可激活糖原磷酸化酶,加速糖原分韶。当静息时,肌内ATP和葡糖-6-磷酸水平升高,可抑制糖原磷酸化酶,有利于糖原合成。 另一种调节机制与肌收缩引起Ca2+升高有关,由C汒别构激活磷酸化酶b激酶。当神经冲动引起肌收缩时,肌细胞中内质网储存的Ca“大量释放入细胞质,Ca2+与磷酸化酶b激酶的别构部位(8亚基)结合而使之激活,进而催化磷酸化酶b磷酸化,成为活化的磷酸化酶a,促进肌糖原分解,为肌收缩供能。 四、糖原贮积症由先天性酶缺陷所致 糖原贮积症(glycogen storage disease)是一类遗传性代谢病,病人某些组织器官中出现大量糖原堆积的现象,其病因是先天性缺乏糖原代谢的相关酶类。根据所缺陷的酶种类不同,受累的器官部位也不同,糖原的结构亦有差异,对健康的危害程度也不同(表5-2)。例如,缺乏肝糖原磷酸化酶时,婴儿仍可成长,肝糖原沉积导致肝大,并无严重后果。若葡糖-6-磷酸酶缺乏,则不能通过肝糖原和非糖物质补充血糖,后果严重。溶酶体的C\'.-葡糖昔酶可分解C\'.一1,4-糖昔键和Q'.-1,6-糖昔键,缺乏此酶使所有组织受损,病人常因心肌受损而猝死。 第六节糖 体内糖原的储备有限,如果没有补充,在12~24小时肝糖原即被耗尽,血糖来源断绝。但事实上即使禁食更长时间,血糖仍保持在正常范围。这时除了周围组织减少对葡萄糖的利用外,主要还依赖肝将氨基酸、乳酸等转变成葡萄糖,不断补充血糖。这种由非糖化合物(乳酸、甘油、生糖氨基酸等)转变为葡萄糖或糖原的过程称为糖异生(gluconeogenesis)。糖异生的主要器官是肝;肾的糖异生能力相对较弱,但在长期饥饿时可增强。 一、糖异生不完全是糖酵解的逆反应 丙酮酸能够逆着糖酵解反应方向生成葡萄糖,乳酸和一些生糖氨基酸(见第八章)就是经由丙酮酸进行糖异生的。葡萄糖经糖酵解生成丙酮酸时,6.Go'为-85kJ/mol,从热力学角度看,由丙酮酸进行糖异生不可能全部循糖酵解逆行。糖酵解与糖异生的多数反应是可逆的,但糖酵解中3个限速步骤所对应的逆反应需要由糖异生特有的关键酶来催化。 (一)丙酮酸经丙酮酸狻化支路生成磷酸烯醇式丙酮酸糖酵解的最后一步反应由丙酮酸激酶催化,将磷酸烯醇式丙酮酸转变成丙酮酸。在糖异生中其逆过程需要丙酮酸进入线粒体,启动丙酮酸狻化支路。 1丙酮酸狻化支路包括两步反应丙酮酸转变为磷酸烯醇式丙酮酸的反应分两步进行,分别由两个关键酶催化。催化第一个反应的是丙酮酸狻化酶(pyruvate carboxylase),其辅因子为生物素。CO2先与生物素结合,需消耗ATP;然后活化的CO2再转移给丙酮酸生成草酰乙酸。第二个反应由磷酸烯醇式丙酮酸狻激酶催化,将草酰乙酸脱狻转变成磷酸烯醇式丙酮酸,消耗一个高能磷酸键。上述\IITf. 112第二篇物质代谢及其调节 两步反应共消耗2个ATP。 由于丙酮酸狻化酶仅存在千线粒体内,故细胞质中的丙酮酸必须进入线粒体,才能狻化生成草酰乙酸。而磷酸烯醇式丙酮酸狻激酶在线粒体和细胞质中都存在,因此,草酰乙酸可在线粒体中直接转变为磷酸烯醇式丙酮酸再进入细胞质;也可先转运至细胞质再转变为磷酸烯醇式丙酮酸,这就涉及草酰乙酸从线粒体到细胞质的转运过程。 CH3>\声COOH/<潭CH2心 丙酮酸草酰乙酸磷酸烯醇式丙酮酸 2将草酰乙酸运出线粒体有两种方式草酰乙酸不能直接透过线粒体内膜,需借助两种方式将其从线粒体转运到细胞质(图5-15):心经苹果酸转运:由线粒体内苹果酸脱氢酶催化,草酰乙酸还原成苹果酸后运出线粒体,再经细胞质中苹果酸脱氢酶催化,苹果酸氧化而重新生成草酰乙酸,需注意此过程伴随着NADH从线粒体到细胞质的转运;@经天冬氨酸转运:由线粒体内谷草转氨酶催化,草酰乙酸转变成天冬氨酸后运出线粒体,再经细胞质中谷草转氨酶催化,天冬氨酸再恢复生成草酰乙酸,此过程并无NADH的伴随转运。 草酰乙酸通过哪一种方式转运,主要取决于不同糖异生原料对供氢体的需求。糖异生在细胞质阶段的后续反应中有一步还原反应,I,3-二磷酸甘油酸还原成3-磷酸甘油酸,需NADH供氢。不同原料进行糖异生时,此供氢体的来源不同。例如,从乳酸开始糖异生时,所需的NADH来源于细胞质。乳酸脱氢生成丙酮酸时,已在细胞质中产生了NADH以供利用,所以草酰乙酸经由天冬氨酸方式运出线粒体。又如,从丙酮酸或生糖氨基酸开始糖异生时,所需的NADH必须由线粒体提供,这些NADH可来自脂肪酸B-氧化或三狻酸循环。此时草酰乙酸经由苹果酸方式运出线粒体,以便同时将线粒体内的NADH运至细胞质以供利用。 (二)果糖-1,6-二磷酸水解为果糖-6-磷酸 此反应由果糖二磷酸酶-1催化(图5-15)。G位的磷酸酷进行水解是放能反应,并不生成ATP,所以反应易于进行。(三)葡糖-6-磷酸水解为葡萄糖此反应由葡糖-6-磷酸酶催化(图5-15),也是磷酸酷水解反应,而不是葡糖激酶催化反应的逆反应,热力学上是可行的。 综上,糖异生的4个关键酶是丙酮酸狻化酶、磷酸烯醇式丙酮酸狻激酶、果糖二磷酸酶-1和葡糖6-磷酸酶,它们与糖酵解中3个关键酶所催化的反应方向正好相反,使乳酸、丙氨酸等生糖氨基酸(见第八章)经丙酮酸异生为葡萄糖。 二、糖异生和糖酵解的反向调节主要针对两个底物循环糖异生与糖酵解是方向相反的两条代谢途径,其中3个限速步骤分别由不同的酶催化底物互变,称为底物循环(substrate cycle)。如果催化互变反应的两种酶活性相等时,代谢不能向任何方向推进,结果是无谓地消耗ATP而释放热能,形成无效循环(fu tile cycle)。通常情况下,细胞内两酶的活性不相等,因此代谢朝着酶活性强的方向进行岱。 要进行有效的糖异生,就必须抑制糖酵解;反之亦然。这种协调主要依赖对2个底物循环的调节。维持底物循环虽然损失一些ATP,但却使代谢调节更为灵敏、精细。 (—)第—个底物循环调节果糖-6-磷酸与果糖-1,6-二磷酸的互变糖酵解时,果糖-6-磷酸发生磷酸化而生成果糖-I,6-二磷酸,反应耗能;糖异生时,果糖-1,6-二磷葡占;;仄,葡萄糖``-6磷酸酶葡糖1磷酸糖原果糖-6-磷酸冶磷酸果糖 激酶 ATP 1x/!x 果糖 Pi 二磷酸酶1ADP习^ADP果糖1,6-二磷酸比0ATP甘油3磷酸甘油醒--·磷酸二胫丙酮◄~3磷酸甘油NAD+NADH+W习 NAD+NADH+Ir NADH+H•NAO+ 糖酵解途径1,3-二磷酸甘油酸3-磷酸甘油酸(细胞质) 糖异生途径 2-磷酸甘油酸 磷酸烯醇式丙酮酸 GDP+C0习磷酸烯醇式丙酮酸狻激酶 萃酰乙酸◄了>苹果酸谷氨酸NADH+H'NAD "-酮戊二酸习 天冬氨酸 ATP天冬氨酸苹果酸 a-酮戊古:>\//乏AH?+H+ 草酰乙酸`拧橡酸循环中间产物 CO2+ATP习丙酮酸狻化酶i (线粒体内)丙酮酸生糖氨基酸 丙酮酸 气今 / 雇 \\ 乳酸丙氨酸等生糖氨基酸 酸水解去磷酸而转变为果糖-6-磷酸,反应并无产能,由此构成第一个底物循环。催化此互变反应的两种酶活性常呈相反的变化。 果糖_磷酸;三:::::王三尸@ 114第二篇物质代谢及其调节 1果糖-2,6-二磷酸和AMP反向调节第一个底物循环果糖-2,6-二磷酸和AMP既是磷酸果糖激酶-l的别构激活剂,又是果糖二磷酸酶-1的别构抑制剂。这一底物循环的调控最为重要,通过能量负反馈与果糖二磷酸正反馈的双重调节作用,对互逆反应中两个关键酶进行高效的同步反向调节,确保糖酵解活跃进行、而糖异生被抑制。 2.果糖-2,6-二磷酸是肝内糖异生与糖酵解的主要调节信号果糖-2,6-二磷酸的生成晕可受激素调节。胰高血糖素使果糖-2,6-二磷酸的生成减少,这是因为胰高血糖素通过cAMP和蛋白激酶A,使磷酸果糖激酶-2磷酸化而失活,引起果糖-2,6-二磷酸水平降低,因此饥饿时肝糖异生增强而糖酵解减弱。胰岛素则作用相反,可升高果糖-2,6-二磷酸水平,因此进食后肝糖异生减弱而糖酵解增强。 (二)第二个底物循环调节磷酸烯醇式丙酮酸与丙酮酸的互变草酰乙酸果糖-l,6-二磷:三;;P酶~-~~-=-3(活性) ©、`、、、《\,打酸 、乙酰CoA 糖酵解时,磷酸烯醇式丙酮酸转变为丙酮酸并产生能批;糖异生时,丙酮酸消耗能量生成磷酸烯醇式丙酮酸,由此构成第二个底物循环。在这一底物循环中,所涉及的3个关键酶的调节方式有所差异。 1丙酮酸激酶受别构调节和磷酸化修饰调节丙酮酸激酶的活性受到别构调节:心果糖-1,6-二磷酸是其别构激活剂,可促进糖酵解。果糖-1,6-二磷酸的生成量也受胰高血糖素调节,这是因为胰高血糖素可降低果糖-2,6-二磷酸水平,从而减少果糖-1,6-二磷酸的生成。@丙氨酸是肝内丙酮酸激酶的别构抑制剂,可阻止肝进行糖酵解。饥饿时,丙氨酸是主要的糖异生原料,故丙氨酸抑制糖酵解有利于肝内糖异生。 此外,丙酮酸激酶的活性还可受到化学修饰调节。胰高血糖素通过cAMP使丙酮酸激酶发生磷酸化,从而抑制其活性,减弱糖酵解。 2.磷酸烯醇式丙酮酸狻激酶受激素诱导的含量调节胰高血糖素通过cAMP,快速升高磷酸烯醇式丙酮酸狻激酶的mRNA水平,促进合成酶蛋白,加强糖异生。胰岛素则显著降低磷酸烯醇式丙酮酸狻激酶的mRNA和酶蛋白含量,使糖异生减弱。 3丙酮酸狻化酶受乙酰CoA的别构激活乙酰CoA是丙酮酸狻化酶的别构激活剂,也是丙酮酸脱氢酶复合体的别构抑制剂。这种双重调节作用使第二个底物循环与丙酮酸氧化脱狻的反应相协调。饥饿时,大量脂酰CoA在线粒体内进行B-氧化,生成大量乙酰CoA,一方面激活丙酮酸狻化酶,使丙酮酸转变为草酰乙酸,加速糖异生;另一方面抑制丙酮酸脱氢酶复合体,阻止葡萄糖经由丙酮酸氧化分解。 (三)两个底物循环的调节相互联系和协洞 两个底物循环的调节并非孤立进行,而是通过一些代谢物和激素共同发挥调节作用:O通过中间代谢物协调两个底物循环。例如,果糖-1,6-二磷酸既可以激活第一个底物循环中的磷酸果糖激酶-1'又可以激活第二个底物循环中的丙酮酸激酶,从而使两个底物循环同时向促进糖酵解的方向进行。@通过激素协调两个底物循环。例如,胰高血糖素既可以作用千第一个底物循环,降低果糖-2,6-二磷酸的水平;还可以作用于第二个底物循环,使丙酮酸激酶磷酸化而失活,从而协同抑制糖酵解、促进糖异生。 第五章糖代谢115 三、糖异生的主要生理意义是维持血糖恒定 肝的糖异生作用主要是饥饿或运动时调节血糖,也可在饥饿后进食初期恢复合成肝糖原储备。肾的糖异生可在长期饥饿时维持酸碱平衡。 (一)维持血糖恒定是肝糖异生最重要的生理作用即使在饥饿状况下,机体也需消耗一定量的葡萄糖,以维持生命活动。正常成人的脑组织对葡萄糖依赖程度大,脑中已糖激酶k,n低于其他组织,即使在血糖水平较低时也能利用葡萄糖。红细胞只能通过糖的无氧氧化获得能量。骨髓、视网膜、神经等组织常由糖的无氧氧化提供部分能量。此时这些葡萄糖全部依赖糖异生生成。经异生补充的血糖有限,所以除此之外的其他大多数组织改用脂质供能,以节约葡萄糖。 饥饿导致肝糖原耗尽后,肝通过糖异生维待血糖水平恒定。蛋白质的分解产物生糖氨基酸、脂肪的分解产物甘油是饥饿时糖异生的主要原料。一方面,肌内大噩的蛋白质分解为氨基酸,再以丙氨酸和谷氨酰胺的形式运输至肝进行糖异生,这是饥饿时血糖补给的主要来源;另一方面,随着脂肪组织中脂肪分解增强,运送至肝的甘油增多,也可经糖异生补充少盘葡萄糖。但在长期饥饿时,如果持续大量消耗蛋白质,将无法维待生命。经过适应,脑每天消耗的葡萄糖可减少,其余依赖酮体供能;此时甘油仍可经糖异生持续供应少址葡萄糖,这样可使机体对蛋白质的消耗量显著降低。 在剧烈运动时,肌糖原分解生成乳酸,机体可利用乳酸进行糖异生。肌内糖异生活性低,生成的乳酸不能在肌内重新合成糖,需经血液转运至肝内进行糖异生,从而完成对乳酸的回收再利用,这样既输出血糖,又避免酸中毒。 (二)糖异生是补充或恢复肝糖原储备的重要途径糖异生可补充或恢复肝糖原储备,这在饥饿后进食尤为重要。肝糖原的合成并不完全是利用肝细胞直接摄入的葡萄糖。事实上,肝内葡糖激酶的凡很高,因而对葡萄糖的亲和力低,在饥饿后进食初期血糖虽有升高,但尚不足以达到葡糖激酶催化所需的有效底物浓度。此时进行糖异生,就可经由丙酮酸等生成葡糖-6-磷酸而进入糖原合成途径,从而绕开葡糖激酶催化的瓶颈反应。 这一解释已被实验证实:O向肝灌注液中加入一些可异生成糖的甘油、谷氨酸、丙酮酸和乳酸,可使肝糖原迅速增加;@以放射性核素标记葡萄糖的不同碳原子后输入动物,分析其肝糖原中葡萄糖的标记情况,结果表明相当一部分摄入的葡萄糖先分解成丙酮酸、乳酸等三碳化合物,后者再异生成糖,合成糖原。这条途径称为糖原合成的三碳途径,它既解释了肝摄取葡萄糖的能力低,但仍可合成糖原;又可解释为什么进食2~3小时内,肝仍要保持较高的糖异生活性。 (三)肾糖异生增强有利于维持酸碱平衡 长期饥饿时,肾糖异生增强。这是由于长期禁食导致酮体代谢旺盛,此时体液pH降低,促进肾小管中磷酸烯醇式丙酮酸狻激酶的合成,从而使糖异生作用增强。肾糖异生的增强有利于维待酸碱平衡。其原因是肾中a-酮戊二酸因异生成糖而减少,可促进谷氨酰胺脱氨生成谷氨酸和后续的谷氨酸脱氨。肾小管细胞将脱下的NH3分泌入管腔,与原尿中W结合,从而降低原尿的W浓度,利于排氢保钠,对防止酸中毒有重要作用。 四、肌收缩产生的乳酸在肝内糖异生形成乳 糖异生 酸循环丙酮酸FN AADHD K NADH N肌收缩(尤其是氧供应不足时)通过糖的无氧氧化生NAD*成乳酸,乳酸通过细胞膜弥散进入血液后入肝,在肝内异乳酸乳酸肝血液生为葡萄糖。葡萄糖释入血液后又可被肌摄取,由此构成了一个循环,称为乳酸循环,又称Cori循环(图5-16)。乳图5-16乳酸循环酸循环的形成取决千肝和肌组织中酶的特点:肝内糖异生活跃,又有葡糖-6-磷酸酶,可将葡糖-6-磷酸水解为葡萄糖;而肌内糖异生活性低,且没有葡糖-6-磷酸酶,因此肌内生成的乳酸不能异生为葡萄糖。乳酸循环的生理意义在于,既能回收乳酸中的能量,又可避免乳酸堆积而引起酸中毒。乳酸循环是耗能的过程,2分子乳酸异生成葡萄糖需消耗6分子ATP。 第七节葡萄糖的其他代谢途径 细胞内葡萄糖除了氧化供能或进入磷酸戊糖途径外,还可代谢生成葡糖醋酸、多元醇等重要代谢产物。 一、糖痊酸途径生成葡糖醒酸 糖醋酸途径(glucuronate pathway)是指以葡糖醒酸为中间产物的葡萄糖代谢途径,在糖代谢中所占比例很小。首先,葡糖-6-磷酸转变为尿昔二磷酸葡萄糖(UDPG),过程葡糖-6-磷酸见糖原合成。然后在UDPG脱氢酶催化下,UDPG氧化生成尿背二磷酸葡t糖醋酸(uridine diphosphale glucuronic acid, UDPGA)。后者再转变为木酮葡糖1-磷酸糖-5-磷酸,与磷酸戊糖途径相衔接(图5-l7)。t对人类而言,糖醋酸途径的主要生理意义是生成活化的葡糖酪酸——tUDPGA。葡糖酪酸是组成蛋白聚糖的糖胺聚糖(如透明质酸、硫酸软骨素、t肝素等)的组成成分(见第四章)。此外,葡糖酸酸在肝内生物转化过程中1-磷酸葡糖醋酸参与很多结合反应(见第十九章)。葡糖醋酸二、多元醇途径生成少量多元醇L-古洛糖酸t葡萄糖代谢还可生成一些多元醇,如山梨醇(sorbitol)、木糖醇(xylitol)L-木酮糖t等,称为多元醇途径(pol yo!pathway)。这些代谢过程仅局限于某些组织,木糖醇在葡萄糖代谢中所占比例极小。例如,在酪糖还原酶作用下,由NADPH供D-木酮糖氢,葡萄糖可还原生成山梨醇。在2种木糖醇脱氢酶催化下,糖酸酸途径木酮糖-5t磷酸中的L-木酮糖可生成中间产物木糖醇,后者再转变为D-木酮糖。t多元醇本身无毒且不易通过细胞膜,在肝、脑、肾上腺、眼等组织具有重要的生理、病理意义。例如,生精细胞可利用葡萄糖经山梨醇生成果糖,使得入体精液中果糖浓度超过lOmmo]/L。精子以果糖作为主要能源,而周围组织主要利用葡萄糖供能,这样就为精子活动提供了充足的能源保障。1型糖尿病病人血糖水平高,透入眼中晶状体的葡萄糖增加从而生成较多的山梨醇,山梨醇在局部增多可使渗透压升高而引起白内障。 第八节血糖及其调节 血糖(blood sugar·, blood glucose)指血中的葡萄糖。血糖的来源为肠道吸收、肝糖原分解和糖异生生成的葡萄糖释入血液内。血糖的去路则是被机体各组织器官所摄取,用于氧化供能、合成糖原、转变成其他糖和脂肪或者氨基酸等。 食物糖氧芒竺笆-千C02+H20-糖原合成】肝、肌糖原磷酸戊糖途径等声其他糖脂类、氨基酸非糖物质代谢,1忙,脂肪、氨基酸等血糖水平相当恒定,始终维持在3.9-6. OmmoVL,这是由于血糖的来源与去路保持动态平衡所致。餐后血糖来自食物消化吸收,此时所有去路均活跃进行;短期饥饿时,血糖来自肝糖原分解,仅用于满足基本供能需求;长期饥饿时,血糖来自非糖物质的糖异生,此时除少数对葡萄糖极为依赖的组织仍用糖供能外,其他大多数组织改用脂质能源,以节约葡萄糖。因此,恒定的血糖水平是糖、脂肪、氨基酸代谢相协调的结果,也是肝、肌、脂肪组织等各器官组织代谢相协调的结果。 二、血糖稳态主要受激素调节 血糖的来去平衡主要受激素调控。调节血糖的激素主要有胰岛素、胰高血糖素、肾上腺素和糖皮质激素等。这些激素联合作用,通过整合调节各组织中各代谢途径的关键酶,不断适应体内能量需求和燃料供给的变化,从而维持血糖稳态。 (一)胰岛素是降低血糖的主要激素 胰岛素(insulin)由胰腺B细胞分泌,是体内具有降糖作用的主要激素。胰岛素的分泌受血糖控制,血糖升高使胰岛素分泌加强,血糖降低使之分泌减少。胰岛素降低血糖的机制是使血糖的去路增强、来源减弱,主要包括:CD促进肌、脂肪组织等通过GLUT4摄取葡萄糖;@通过激活磷酸二酣酶而降低cAMP水平,使糖原合酶被活化、磷酸化酶被抑制,从而加速糖原合成、抑制糖原分解;@通过激活丙酮酸脱氢酶磷酸酶而使丙酮酸脱氢酶复合体活化,加快糖的有氧氧化;@抑制肝内糖异生,这一方面是因为磷酸烯醇式丙酮酸狻激酶的合成受到抑制,另一方面是由于氨基酸加速合成肌蛋白质从而使糖异生的原料减少;@糖的分解产物乙酰CoA和NADPH供应增多,有利千以此为原料合成脂肪酸。简而言之,胰岛素的总效应是促进葡萄糖分解利用,抑制糖异生,同时将多余的血糖转变为糖原(储存千肝和肌)和甘油三酣(储存于脂肪组织),从而控制餐后血糖水平不至千过高。 (二)体内有多种升高血糖的激素饥饿或应激等状况发生时,机体可分泌多种升高血糖的激素。其中,胰高血糖素对千饥饿时的血糖生理调节尤为重要。 1胰高血糖素是升高血糖的主要激素胰高血糖素(glucagon)由胰腺a细胞分泌,是体内升高血糖的主要激素。血糖降低或血中氨基酸升高可促进胰高血糖素分泌。胰高血糖素升高血糖的机制是使血糖的来源增强、去路减弱,主要包括:CD抑制糖原合酶而激活磷酸化酶,加速肝糖原分解;@通过抑制磷酸果糖激酶-2、激活果糖二磷酸酶-2,减少果糖-2,6-二磷酸的合成。由于后者是磷酸果糖激酶-l的最强别构激活剂,也是果糖二磷酸酶-l的抑制剂,故糖酵解被抑制而糖异生则加速;@抑制肝内丙酮酸激酶从而阻止磷酸烯醇式丙酮酸进行糖酵解,同时促进磷酸烯醇式丙酮酸狻激酶的合成,使糖异生加强;@激活脂肪组织内激素敏感性脂肪酶,促进脂肪分解供能,以节约血糖。以上作用均通过cAMP依赖的磷酸化反应而实现。简而言之,胰高血糖素的总效应是促进肝糖原分解和糖异生,以补充血糖,同时抑制糖酵解而改用脂质供能,从而使血糖回升到正常水平。 值得注意的是,胰腺分泌的胰岛素和胰高血糖素相互拈抗,两者比例的动态变化使血糖在正常范围内保持较小幅度的波动。例如,进食后血糖升高,使胰岛素分泌增多而胰高血糖素分泌减少,血糖水平趋千回落;但胰岛素分泌增加到一定程度又会促进胰高血糖素分泌,使后者快速发挥相反的升血糖作用,以保证血糖不会无限制地降低。反之亦然。 2糖皮质激素可升高血糖糖皮质激素(glucocorticoid)升高血糖的机制主要包括:CD促进肌蛋白质分解而使糖异生的原料增多,同时使磷酸烯醇式丙酮酸狻激酶的合成加强,从而加速糖异生;@通过抑制丙酮酸的氧化脱狻,阻止体内葡萄糖的分解利用;@协同增强其他激素促进脂肪动员的效应,促进机体利用脂肪酸供能。 3.肾上腺素是强有力的升高血糖的激素肾上腺素(adrenaline或epinephrine)升高血糖的效力很强。给动物注射肾上腺素后,血糖水平迅速升高且持续几小时,同时血中乳酸水平也升高。其作用机制是引发肝和肌细胞内依赖cAMP的磷酸化级联反应,加速糖原分解。肝糖原分解为葡萄糖,直接升高血糖;肌糖原无氧氧化生成乳酸,再经乳酸循环间接升高血糖。肾上腺素主要在应激状态下发挥调节作用,对经常性血糖波动(尤其是进食-饥饿循环)没有生理意义。 三、糖代谢障碍导致血糖水平异常 正常人体内存在一整套精细调节糖代谢的机制,当一次性食入大量葡萄糖后,血糖水平不会持续升高,也不会出现大的波动。此过程可通过糖耐量试验(glucose tolerance test)进行检测:先测量空腹静脉血糖,饮用75g无水葡萄糖后,分别于30分钟、1小时、2小时测量静脉血糖值,绘制曲线已。正常人对摄入的葡萄糖具有很强的耐受能力:服糖后血糖在0.5~1小时达到高峰,但一般不超过肾小管的重吸收能力(约为lOmmoVL,称为肾糖阙),所以很难检测到糖尿;血糖在此峰值之后逐渐降低,一般在2小时左右降至7.8rnmoVL以下,3小时左右回落至接近空腹血糖水平。 临床上可由糖代谢障碍引发血糖水平紊乱,导致出现低血糖或高血糖。其中,糖尿病是最常见的糖代谢紊乱疾病。糖尿病病人空腹血糖高于正常值;服糖后血糖浓度急剧升高,超过肾糖阙,从而出现糖尿;血糖在此峰值之后缓慢降低,—般2小时后仍可高于11. l rnmoVL。 (一)低血糖是指血糖浓度低于2.8m mol/L 对于健康人群,血糖浓度低于2.8mmoVL时称为低血糖(hypoglycemia)。脑细胞主要依赖葡萄糖氧化供能,因此血糖过低就会影响脑的正常功能,出现头晕、倦怠无力、心悸等,严重时发生昏迷,称为低血糖休克。如不及时给病人静脉补充葡萄糖,可导致死亡。出现低血糖的病因有:O胰性(胰腺B细胞功能亢进、胰腺a细胞功能低下等);@肝性(肝癌、糖原贮积症等);@内分泌异常(垂体功能低下、肾上腺皮质功能低下等);@肿瘤(胃癌等);@饥饿或不能进食者等。 (二)高血糖是指空腹血糖高于7mmol/L 空腹血糖浓度高于7mmoVL时称为高血糖(hyperglycem ia)。如果血糖浓度高于肾糖闾,就会形成糖尿。引起糖尿的原因分为病理性和生理性两大类,具体包括:O遗传性胰岛素受体缺陷;@某些慢性肾炎肾病综合征等引起肾对糖的重吸收障碍,但血糖及糖耐量曲线均正常;@情绪激动时交感神经兴奋,肾上腺素分泌增加,使肝糖原大量分解,导致生理性高血糖和糖尿;@临床上静脉滴注葡萄糖速度过快,使血糖迅速升高而出现糖尿。 (三)糖尿病是最常见的糖代谢紊乱疾病 糖尿病(diabetes mellitus)的特征是持续性高血糖和糖尿,特别是空腹血糖和糖耐量曲线高于正常范围。其主要病因是部分或完全胰岛素缺失、胰岛素抵抗(因细胞胰岛素受体减少或受体敏感性降低,导致对胰岛素的调节作用不敏感)。临床上将糖尿病分为四型:胰岛素依赖型(1型)、非胰岛素依赖型(2型)、妊娠糖尿病(3型)和特殊类型糖尿病(4型)。1型糖尿病多发生千青少年,因自身免疫而使胰腺B细胞功能缺陷,导致胰岛素分泌不足。2型糖尿病和肥胖关系密切,可能是由细胞膜上胰岛素受体功能缺陷所致。 糖尿病常伴有多种并发症,如糖尿病视网膜病变、糖尿病性周围神经病变、糖尿病周围血管病变、糖尿病肾病等。这些并发症的严重程度与血糖水平升高的程度、病史的长短有相关性。 四、高糖刺激产生损伤细胞的生物学效应 引起糖尿病并发症的生化机制仍不太清楚,目前认为血中持续的高糖刺激能够使细胞生成晚期糖化终产物(advanced glycation end products, AGEs),同时发生氧化应激。例如,红细胞通过GLUTl摄取血中的葡萄糖,首先使血红蛋白的氨基发生不依赖酶的糖化作用(hemoglobin glycation),生成糖化血红蛋白(glycated hemoglobin, GHB),此过程与酶催化的糖基化反应(glycosylation)不同。GHB可进一步反应生成AGEs,如狻甲基赖氨酸、甲基乙二醒等,它们与体内多种蛋白质发生广泛交联,对肾、视网膜、心血管等造成损伤。AGEs还能被其受体(AGER)识别,激活多条信号通路,产生活性氧而诱发氧化应激,使细胞内多种酶类、脂质等发生氧化,从而丧失正常的生理功能。氧化应激又可进一步促进AGEs的形成及交联,两者交互作用,共同参与糖尿病并发症的发生与发展。 糖化血红蛋白(GHB)可作为临床诊治糖尿病的参考。红细胞的寿命约为120天,因此检测GHB的相对数量可反映近期血糖控制的平均水平,这比实时检测葡糖氧化酶活性的血糖绝对定量方法更为稳定、准确。目前国外已将GHB纳入糖尿病的诊断指标,超过6.5%-7.0%即可确诊;国内尚未将其用作诊断指标,而仅是评价疗效的重要参考,糖尿病的治疗目标是将GHB控制在7.0%以下。 糖类消化后主要以单体形式在小肠被吸收。细胞摄取糖需要葡糖转运蛋白。细胞进行糖代谢,可通过元氧氧化、有氧氧化和磷酸戊糖途径分解葡萄糖,提供能量或其他重要产物;也可将糖储存为糖原形式;亦或将非糖物质异生转化为糖尽上糖的无氧氧化是指机体不利用氧将葡萄糖分解为乳酸的过程,在细胞质中进行,分为两个阶段:葡萄糖分解为丙酮酸,称为糖酵解;丙酮酸还原生成乳酸。其中,糖酵解是糖分解的必经之路,其流量受关键酶磷酸果糖激酶-l(尤为重要)、丙酮酸激酶和已糖激酶所调节。糖的无氧氧化可为机体快速供能,1分子葡萄糖通过底物水平磷酸化净生成2分子ATP。 糖的有氧氧化是指机体利用氧将葡萄糖彻底氧化为CO2和H20的过程,在细胞质和线粒体中进行,分为三个阶段:糖酵解、丙酮酸氧化脱狻生成乙酰CoA、三狻酸循环。其中,三狻酸循环主要通过偶联氧化磷酸化生成大量ATP,而经底物水平磷酸化生成的ATP则很少。糖的有氧氧化是主要产能途径,1分子葡萄糖经有氧氧化可净生成30或32分子ATP,关键酶是磷酸果糖激酶-l、丙酮酸激酶、已糖激酶、丙酮酸脱氢酶复合体、拧橡酸合酶、异拧橡酸脱氢酶和a-酮戊二酸脱氢酶复合体。糖的有氧氧化主要受能量供需平衡所调节。 磷酸戊糖途径在细胞质中进行,不产能而可产生磷酸核糖和NADPH。关键酶是葡糖-6-磷酸脱氢酶,主要受NADPH供需平衡所调节。 肝糖原和肌糖原是体内糖的储存形式。肝糖原在饥饿时补充血糖,肌糖原通过无氧氧化为肌收缩供能。糖原合成与分解的关键酶分别为糖原合酶和糖原磷酸化酶,两者的酶活性调节彼此相反,主要受磷酸化与去磷酸化修饰调节。 糖异生是指非糖物质在肝和肾转变为葡萄糖或糖原的过程,主要作为饥饿时的血糖补给。关键酶是丙酮酸狻化酶、磷酸烯醇式丙酮酸狻激酶、果糖二磷酸酶-1和葡糖-6-磷酸酶。糖异生和糖酵解的反向调节主要针对两个底物循环。 血糖水平相对恒定,受多种激素调控。胰岛素可降低血糖;胰高血糖素、糖皮质激素、肾上腺素则可升高血糖。糖代谢紊乱可导致高血糖或低血糖,糖尿病是最常见的糖代谢紊乱疾病。 l归纳葡糖-6-磷酸在糖代谢中的来源与去路,并分析不同生理情况下如何选择不同的代谢途径。2.百术短跑时,骨骼肌收缩产生大量乳酸,试述该乳酸的主要代谢去向。不同组织中的乳酸代谢具有不同特点,这取决于什么生化机制?3营养不良的人饮酒,或者剧烈运动后饮酒,常出现低血糖。试分析酒精干预了体内糖代谢的哪些环节? 4.列举几种临床上治疗糖尿病的药物,想一想它们为什么有降低血糖的作用?(赵晶) 第六章生物氧化 化学物质在生物体内的氧化分解过程称为生物氧化(biological oxidation)。由千机体的反应条件温和,因此生物氧化有其特点:需要有酶催化,而且是分阶段、逐步完成。细胞胞质、线粒体、微粒体等均可进行生物氧化,但氧化过程及产物各不相同。在线粒体内的生物氧化,其产物是CO2和H20,需要消耗氧并伴随能量的产生,能量主要用于生成ATP等。而在微粒体、内质网等发生的氧化反应主要是对底物进行氧化修饰、转化等,并无ATP的生成。本章重点介绍线粒体氧化体系及能量的产生机制。 第一节线粒体氧化体系与呼吸链 线粒体氧化体系的主要功能是为机体提供能量,包括热能、ATP等。在线粒体内,糖、脂肪、蛋白质等营养物质在被彻底氧化分解为CO2和H20的过程中释放能量,但其氧化过程需要在酶的催化下逐步进行,能量也不会在瞬间大量释放产生高温、高热,而是逐渐释放并储存在ATP中。营养物质被氧化时常发生脱氢反应,脱下来的氢(H勹e一)以NADH+H+(简写为NADH)、FADH2等形式存在。NADH和FAD儿在线粒体被氧化时,需要一系列的酶催化,逐步脱氢、失电子,最终将电子和W传递给氧而生成水,同时释放能量用千生成ATP~。因此,线粒体需要多种具有传递氢和电子的组分参与氧化还原反应。 一、线粒体氧化体系含多种传递氢和电子的组分 底物脱氢和失去电子是生物氧化的基本化学过程。能够传递氢和电子的物质,如金属离子、小分子有机化合物、某些蛋白质等称之为递电子体或递氢体。线粒体氧化体系主要将NADH和FADH2中的W和电子传递给氧,参与其过程的递氢体和递电子体如下。 (—)烟酰胺腺噤呤核苦酸传递氢和电子 烟酰胺腺嗦呤二核昔酸(nicotinamide adenine dinucleotide, NAD+)(图6-1),通过烟酰胺环传递H+和电子。烟酰胺环的五价氮原子,能接受2H中的双电子成为三价氮,为双电子传递体,同时芳环接受一个W进行加氢反应。由千此反应只能接受l个W和2个电子,游离出一个W在介质中,因此将还原型的NAD十写成NADH+H+(简写为NADH)(图6-2)。NAO十是许多脱氢酶的辅酶,有传递氢和电子的功能。此外,NAD+结构中核糖的2位轻基被磷酸化后生成烟酰胺腺嗦呤二核昔酸磷酸(nicotinamide adenine dinucleotide phosphate, NADP+)。NADP通过相同的机制接受氢后生成NADPH+H+,发挥传递氢和电子的作用,但参与不同的反应。 NA订或NADP+NADH或NADPH (二)黄素核昔酸衍生物传递氢和电子 黄素单核昔酸(flavin mononucleotide, FMN)和黄素腺嗦呤二核昔酸(flavin adenine dinucl eotide,FAD)是维生素B2与核昔酸形成的有机化合物,两者均通过维生素B2中的异咯嗟环进行可逆的加氢和脱氢反应。异咯嗟环可接受l个W和l个电子形成不稳定的FMNH"和FADH",再接受l个W和l个电子转变为还原型FMN儿和FADH2。因此FMN、FAD发挥传递氢和电子的作用(图6-3),是黄素蛋白(flavoprotein)的辅基。 勹:|2:三2N;N丁—-H3C:N H I°丫 一[[丫二二 异咯嗦 (三)有机化合物泛醒传递氢和电子 泛酰(ubiquinone)又称辅酶Q(coenzyme Q, CoQ或Q),是一种脂溶性酰类化合物,其结构中异戊二烯单位的数目因物种而异,人体内的Q是10个异戊二烯单位连接的侧链,用QIO表示。Q的疏水特性使其能在线粒体内膜中自由扩散。Q结构中的苯酣部分接受l个电子和1个甘还原为半酰(QH勹,再接受1个电子和1个H还原为二氢泛酣(QH2)。反之,Q凡可逐步失去W和电子被氧化为Q。因此Q可进行双、单电子的传递(图6-4)。 122第二篇物质代谢及其调节 HHCe:CHH—CH=i厂CH)三亨三勹 泛酿泛酿H·二氢泛酿(酿型或氧化型)(半醒型)(氢酣型或还原型) (四)铁硫蛋白和细胞色素蛋白传递电子 铁硫蛋白(iron-sulfur protein),因其含有铁硫中心(iron-sulfur center, Fe-S center)而得名。Fe-S是Fe离子通过与无机硫(S)原子及铁硫蛋白中半胱氨酸残基的SH连接而成。Fe-S有多种形式,可以是单个Fe离子与4个半胱氨酸残基的SH相连,也可以是2个、4个Fe离子通过与无机S原子及半胱氨酸残基的SH连接,形成Fe2S2、Fe4S4(图6-5)。Fe-S通过Fe2•-Fe3•+e一的可逆反应,每次传递一个电子,因此铁硫蛋白是单电子传递体。 蛋白质 固6-5铁硫中心的结构@表示无机硫 细胞色素(cytochrome, Cyt)是一类含血红素样辅基的蛋白质。各种还原型Cyt均有3个特征性的a、B、'Y可见光吸收峰,根据其吸光度和最大吸收波长不同,分为Cyt a、Cyt b和Cyt C三类及不同的亚类(表6-1),其所含的血红素辅基分别称为血红素a、b和c(图6-6)。Cyt光吸收的差异是由于血红素中叶啾环的侧链基团、血红素在蛋白质中所处环境不同所致。血红素a的卧啾环侧链中,1个甲基被甲酰基取代,1个乙烯基连接聚异戊二烯长链;血红素b的结构与血红蛋白中的血红素相同。血红素a和b都通过非共价键与Cyt a和Cyt b蛋白相连。而Cyt C蛋白,其血红素叶啾环的乙烯基侧链通过共价键与蛋白质中半胱氨酸残基的—SH相连。细胞色素蛋白通过辅基血红素中的Fe离子发挥单电子传递体的作用。 波长(nm)细胞色素 二、具有传递电子能力的蛋白质复合体组成呼吸链线粒体是真核细胞生成ATP的主要部位。NADH、FAD凡在线粒体中通过逐步、连续的酶促反应/\/\/CH2\/\/CH2\t CH2CH CH2CH CH2c矿\CH3~.Fe~. O=C---<\人/人》-CH3 血红素a蛋白质 飞勹丁=CH,飞\`N/Fe N/:-CH, 俨C邸 -严氓2 血红素b血红素c 被氧化,并逐步释放能量,除了产生热能外,释放的能量主要被ADP捕获用千生成ATP。催化此连续反应的酶是由多个含辅因子的蛋白质复合体组成,按一定顺序排列在线粒体内膜中,形成一个连续传递电子/氢的反应链,氧分子最终接受电子和H十生成水,故称为电子传递链(electron transfer chain)。由于此体系需要消耗氧,与需氧细胞的呼吸过程有关,也称之为呼吸链(respiratory chain)(图6-7)。 呼吸链主要由位于线粒体内膜上的4种蛋白质复合体(complex)组成,分别称之为复合体I、II、皿和W。每个复合体都由多种酶蛋白、金属离子、辅酶或辅基组成(表6-2)。复合体的辅因子通过得失电子的方式传递电子;有些复合体是跨膜蛋白质,可将H十从线粒体基质侧转运至细胞质侧,形成线粒体内膜两侧甘浓度和电荷的梯度差。因此,呼吸链在传递电子的过程中,伴随着订的跨膜转运,下面将分别叙述各复合体的组成、辅因子、结构特点以及功能。 复合体酶名称质量(kO)多肤链数功能辅基含结合位点复合体I NADH-泛酰还原酶85043FMN,Fe-S NADH(基质侧)Q(脂质核心) 复合体1I骁珀酸-泛酰还原酶1404FAD, Fe-S骁珀酸(基质侧)Q(脂质核心) 复合体皿泛酰-细胞色素c还原酶25011血红素,Fe-S Cyt C(膜间隙侧) 复合体W细胞色素c氧化酶16213血红素,CuA,Cu8Cyt C(膜间隙侧) 124第二篇物质代谢及其调节 胞质侧 线粒体内膜 基质侧H20 图6-7电子传递链的组成示意图泛酰和细胞色素c是可移动的电子载体(—)复合体I将NADH中的电子传递给泛醒复合体I又称NADH-Q还原酶或NADH脱氢酶,是呼吸链的主要入口,其功能是接受来自NADH的电子并转移给Q。复合体I是由黄素蛋白、铁硫蛋白等组成的跨膜蛋白质,呈“L”型,其长臂的一端突出于线粒体基质中,包括黄素蛋白(含FMN和Fe-S辅基)、铁硫蛋白(含Fe-S辅基),可结合基质中的NADH;嵌于内膜的横臂为复合体的疏水部分,含Fe-S辅基。黄素蛋白和铁硫蛋白均通过辅基发挥传递电子作用(见图6-7)。尽复合体I传递电子的过程:黄素蛋白辅基FMN从基质中接受NADH中的2甘和2e一生成FMNH2,经过一系列的Fe-S将电子传递给内膜中的Q,形成QH2(见图6-7),即:NADH一FMN一Fe-S-Q。由于Q在线粒体内膜中可自由移动,在各复合体间募集并穿梭传递氢,因此在电子传递和质子的移动中发挥核心作用。 复合体I还具有质子泵功能:将一对电子从NADH传递给Q的过程中,能将4个W从线粒体的基质侧(negative side, N侧)泵到膜间隙侧(pos山ve side, P侧),泵出质子所需的能量来自电子传递过程。 (二)复合体Il将电子从唬珀酸传递到泛醒 复合体Il是唬珀酸-泛酰还原酶,即三狻酸循环中的唬珀酸脱氢酶,其功能是将电子从唬珀酸传递给Q。人复合体Il通过其疏水亚基铀定于线粒体内膜,而伸向基质的亚基含有结合底物唬珀酸的位点,以及Fe-S和FAD辅基(见图6-7)。3复合体Il传递电子的过程:催化底物唬珀酸的脱氢反应,使FAD转变为FADH2,后者再将电子经Fe-S传递到Q。即:唬珀酸一FAD一Fe-S一Q。此过程释放的自由能较小,不足以将甘泵出线粒体内膜,因此复合体Il没有订泵的功能。代谢途径中另外一些含FAD的脱氢酶,如脂酰CoA脱氢酶、"磷酸甘油脱氢酶、胆碱脱氢酶等,通过不同的方式将相应底物脱下的氢经FAD传递给Q,进入呼吸链。 (三)复合体皿将电子从还原型泛醒传递至细胞色素c复合体皿又称泛酿-细胞色素c还原酶,其功能是接受Q凡的电子并传递给Cyt C。Q从复合体I复合体II募集氢,产生的Q凡穿梭至复合体III,后者将电子传递给Cyt C蛋白。 126第二篇物质代谢及其调节 胞质侧正电侧(P侧) 基质侧负电侧(N侧) Fe”还原为Fe”并形成Cu广和Fe“各结合1个OH基团的中间态。最后再获得2个H十,双核中心解离出2个H20分子后恢复初始的氧化态(图6-10)。即:Cyt c-+C uA-+Cy t a一Cyt a3-CuB一02。生成的H20通过亚基l和3之间的亲水通道排入胞质侧。 上述02在获得电子过程产生的具有强氧化性的O;.和022窟离子中间物始终和双核中心紧密结合,通常不会对细胞组分造成损伤。 三、NADH和FAD比是呼吸链的电子供体 营养物质的分解代谢中,大部分脱氢酶以NAD+,NADP+,FMN或者FAD为辅酶或辅基,用来接受从底物上脱下来的成对氢,生成还原态的NADH+W,NADPH+W,FMN凡和FADH2,它们都是水溶性的电子载体。由千呼吸链的复合体I即为NADH脱氢酶,可使线粒体中的NADH通过呼吸链彻底氧化参与能量代谢。虽然NADPH通过相同的机制传递氢,但所含的磷酸基团可被生物合成过程中的酶特异性识别,主要用于还原反应,而非参与能量代谢。复合体1I是三狻酸循环中的唬珀酸脱氢酶,通过结合底物唬珀酸并将其脱氢氧化,产生的FAD凡直接进入呼吸链进行氧化释能。因此NADH和FAD凡是呼吸链的电子供体,而FMN和FAD作为黄素蛋白的辅基参与电子传递。 呼吸链由NADH和FAD凡提供氢,通过4个蛋白质复合体、Q,以及介于复合体皿与W之间的Cyt C共同完成电子的传递。复合体1I并不是处千复合体I的下游,复合体I和复合体1I分别获取各自的氢,向Q传递。因此4个复合体与Q和Cyt C组成了两条电子传递链。一条称为NADH呼吸链,以NADH为电子供体,从NADH开始到还原02生成H20。电子传递顺序是:NADH-复合体I一Q一复合体皿一Cyt C一复合体w-02另一条称为FAD凡呼吸链,也称唬珀酸氧化呼吸链,以FADH2为电子供体,经复合体Il到02而生成H20。电子传递顺序是:唬珀酸一复合体Il一►Q一复合体皿一Cyt C一复合体N一02呼吸链各组分的排列顺序是由下列实验确定的:O根据呼吸链各组分的标准氧化还原电位进行排序。标准氧化还原电位E°(单位:电压Volts)是指在特定条件下,参与氧化还原反应的组分对电子的亲和力大小。电位高的组分对电子的亲和力强,易接受电子。相反,电位低的组分倾向于给出电子。因此,呼吸链中电子应从电位低的组分向电位高的组分进行传递(表6-3)。@底物存在时,利用呼吸链特异的抑制剂阻断某一组分的电子传递,在阻断部位以前的组分处于还原状态,后面的组分处于氧化状态。根据各组分的氧化和还原状态吸收光谱的改变分析其排列次序。@利用呼吸链各组分特有的吸收光谱,以离体线粒体无氧时处千还原状态作为对照,缓慢给氧,观察各组分被氧化的顺序。@在体外将呼吸链拆开和重组,鉴定四种复合体的组成与排列。 氧化还原对E"(V)氧化还原对E"(V) 第二节氧化磷酸化与ATP的生成 细胞内由ADP磷酸化生成ATP的方式有两种,一种是与高能键水解反应偶联,直接将高能代谢物的能量转移至ADP,生成ATP的过程,称为底物水平磷酸化(见第五章),能够产生少量的ATP。人体90%的ATP是由线粒体中的氧化磷酸化产生的,而产生ATP所需的能量由线粒体氧化体系提供。\il吓{t}即NADH和FAD儿通过线粒体呼吸链逐步失去电子被氧化生成水,电子传递过程伴随着能量的逐步释放,此释能过程驱动ADP磷酸化生成ATP,所以NADH和FAD凡的氧化过程与ADP的磷酸化过程相偶联,因而称之为氧化磷酸化(oxidative p h osph011lation)。 —、氧化磷酸化偶联部位在复合体I、皿、IV内 氧化磷酸化在线粒体中进行,包含两个关键过程,一是电子传递,二是将电子传递过程中释放的能量用于产生ATP,使能量通过ATP被储存起来供机体使用。成对电子经呼吸链传递所能合成ATP的分子数可反映该过程的效率。理论推测,将呼吸链中能够产生足够的能量使ADP磷酸化的部位称之为氧化与磷酸化的偶联部位,也就是能够生成ATP的部位,可根据下述实验方法及数据大致确定。 (-)P/0比值 一对电子通过氧化呼吸链传递给1个氧原子生成1分子H20,其释放的能量使ADP磷酸化合成ATP,此过程需要消耗氧和磷酸。PIO比值(phosphate/oxygenrat i o)是指氧化磷酸化过程中,每消耗1/2mol02所需磷酸的摩尔数,即所能合成ATP的摩尔数(或一对电子通过呼吸链传递给氧所生成ATP分子数)。 实验证明,丙酮酸等底物脱氢反应产生NADH+H+,通过NADH呼吸链传递,PIO比值接近2.5,说明一对电子传递给l个氧原子需消耗约2.5分子的磷酸,因此NADH呼吸链可能存在3个ATP生成部位。而唬珀酸脱氢时,PI O比值接近1.5,说明唬珀酸呼吸链可能存在2个ATP生成部位。根据NADH、唬珀酸呼吸链PIO比值的差异,提示在NADH和泛醋之间(复合体I)存在1个ATP生成部位。抗坏血酸底物可以直接通过Cyt C传递电子进行氧化,其PIO比值接近1,推测Cyt C和02之间(复合体W)存在1个ATP生成部位。由此推测另1个ATP生成部位应在Q和Cyt C之间(复合体皿)。所以,复合体I、皿、IV可能是氧化磷酸化的偶联部位、用于产生ATP。一对电子经NADH呼吸链传递,PIO比值约为2.5,生成2.5分子的ATP;一对电子经唬珀酸呼吸链传递,PIO比值约为1.5,可产生1.5分子的ATP。 (二)自由能变化根据热力学公式,pH7.0时标准自由能变化(t::,.G)与还原电位变化(t::,.E,标准还原电位表示物质对电子的亲和力,还原电位高更易于接受电子)之间有以下关系:n为传递电子数;F为法拉第常数(96.5kJ/mol·V)。 从NAD+到Q之间测得的还原电位差约0.36V,从Q到Cyt C电位差为0.19V,从Cyt a、a3到分子氧为0.58V,分别对应复合体I、皿、N的电子传递。计箕结果,它们相应释放的AG分别约为69.5kJ/mol、36.7kJ/mol、112kJ/mol,而生成lmol ATP约需要30.5kJ,可见复合体I、III、N传递一对电子释放的能量能够满足生成ATP所需的能量。需要指出的是,偶联部位并非意味着这三个复合体是直接产生ATP的部位,而是指电子传递释放的能盘,能满足ADP磷酸化生成ATP的需要。 电子传递过程中,一对电子经复合体I、III、N传递分别向膜间隙侧泵出4W,4:W和2H+,共10个H飞由千线粒体内膜的不通透性,导致内膜两侧的W浓度和电荷的差异。因此,呼吸链蛋白质复合体的质子泵功能形成线粒体内膜两侧的质子梯度,储存了电子传递过程释放的部分能量。 二、氧化磷酸化偶联机制是产生跨线粒体内膜的质子梯度1961年,英国科学家MitchellP提出的化学渗透假说(chemiosmotic hypothesis)阐明了氧化磷酸化的偶联机制。其基本要点是:CD电子经呼吸链传递时释放的能量,通过复合体的质子泵功能,转运H+从线粒体基质到内膜的胞质侧;@由于质子不能自由穿过线粒体内膜返回基质,从而形成跨线粒体内膜的质子电化学梯度(W浓度梯度和跨膜电位差),储存电子传递释放的能橄;@质子的电化学梯度转变为质子驱动力,促使质子从膜间隙侧顺浓度梯度回流至基质、释放储存的势能,用于驱动ADP与Pi结合生成ATP。如一对电子自NADH传递至氧可释放约-220kJ/mol的能量,同时将10个H十从基质转移至膜间隙侧,形成的W梯度储存约-200kJ/mol,当质子顺浓度梯度回流至基质时用于驱动ATP合成。图6-11归纳了呼吸链电子传递和氧化磷酸化的过程3。 化学渗透假说已经得到广泛的实验支待:O氧化磷酸化依赖于完整封闭的线粒体内膜;@线粒体内膜对H+,OH-、K+,Cl一离子是不通透的;@电子传递链可驱动质子移出线粒体,形成可测定的跨内膜电化学梯度;@增加线粒体内膜外侧酸性可增加ATP合成,而阻止质子从线粒体基质泵出,可降低内膜两侧的质子梯度,虽然电子仍可以传递,但ATP生成却减少。 胞质侧 三、质子顺浓度梯度回流释放能量用于合成ATP 跨线粒体内膜的订梯度驱动质子顺浓度梯度回流至基质时,储存的能量被ATP合酶(ATP synthase)充分利用,催化ADP与Pi生成ATP。线粒体内膜上的复合体V,即为ATP合酶。ATP合酶是多蛋白组成的蘑菇样结构,含F1(亲水部分,凡表示第一个被鉴定的与氧化磷酸化相关的因子)和F。(疏水部分,凡表示寡霉素敏感)两个功能结构域。E为线粒体基质侧的蘑菇头状突起,其功能是催化ATP合成;而凡的大部分结构嵌入线粒体内膜中,组成离子通道,用于质子的回流(动画6-1"ATP合酶一质子通道”)。 动物细胞中,ATP合酶的F1部分主要由邑队-y8e亚基复合体和寡霉素敏感蛋白(oligomycin sensitive coru·e1Ting protein, OSCP,易与功霉素结合而失去活性)组成。3个a、B亚基间隔排列,形成哗功能单元,像橘子瓣样围绕丫亚基形成六聚体(图6-12)。凡嵌于线粒体内膜中,由疏水的a、比、c沪12亚基组成,形成跨内膜质子通道。c亚基由短环连接的2个反向跨膜a-螺旋组成,9~12个c亚基围成环状结构;a亚基紧靠c亚基环外侧,由5个跨膜a-螺旋形成2个半穿透线粒体内膜的、不连通的亲水质子半通道,两个开口分别位于线粒体的基质侧和内膜的细胞质侧,两个半通道分别与1个c亚基相对应(图6-12)。 目前认为,ATP合酶由凡和E组装成可旋转的发动机样结构,完成质子回流并驱动ATP合成。F。起支撑作用的2个b亚基通过长的亲水端铀定F1的a亚基,并通过8亚基与Ci.3队稳固结合;嵌入内膜的b\Imt§F部分质子半通道@-;'a亚基细胞质侧 细胞质侧a亚基 c亚基苞) 图6-12ATP合酶结构和质子的跨内膜流动机制模式图伈)F。孔复合体组成可旋转的发动机样结构,E的Cl.小队和8亚基以及凡的a、b2亚基共同组成定子部分,而F1的丫、e亚基及凡的c亚基环组成转子部分;(b)凡的a亚基有2个质子半通道,分别开口内膜两侧,质子顺梯度从细胞质侧进入,结合c亚基,旋转到另一半通道从基质侧排出亚基的疏水端与F0中的a亚基结合,使a、b2和E中的a3队、8亚基组成稳定的“定子”部分。凡部分丫和e亚基共同形成中心轴,上端穿过邑队的六聚体,丫可与B亚基疏松结合(相互作用),影响B亚基活性中心构象;下端与嵌入内膜的c亚基环紧密结合,使c亚基环、丫和e亚基组成“转子”部分(图6-12)。 当质子顺梯度穿内膜向基质回流时,转子部分围绕定子部分进行旋转,使E中的叶}功能单元利用释放的能量结合ADP和Pi并生成ATP。质子梯度强大势能驱动质子从a亚基的细胞质侧进入半通道,当通道口对应的1个c亚基的第61位关键Asp残基所带负电荷被甘中和后,c亚基能与疏水内膜相互接触而发生转动,当其转到能接触另一半通道口时,甘梯度的势能迫使Asp结合的H十从半通道出口释放进入线粒体基质(图6-12)。各c亚基可依次进行上述循环,导致c环和丫、8亚基相对气队转动。因此,跨内膜质子形成的电化学梯度势能是ATP合酶转动的驱动力。 BoyerP提出了ATP合成的结合变构机制(binding change mechanism),13亚基有3种构象:开放型(0)无活性,与ATP亲和力低;疏松型(L)无活性,可与ADP和Pi底物疏松结合;紧密型(T)有催化ATP合成的活性,可紧密结合ATP。1亚基转动时,会依次接触3组哗单元中的B亚基,其相互作用导致B亚基的构象发生周期性循环变化,ADP和Pi底物结合千L型的B亚基,质子流能量驱动合酶的转子部分进行转动,使该B亚基变构为T型,用于合成ATP;再次转动使B亚基变构为0型,释放出ATP(图6-13)。质子流能掀用于驱动B亚基构象按顺序改变,分别结合ADP和Pi,合成的ATP可从活性中心释放。(动画6-2"ATP合酶变构机制”)ATP合酶转子循环一周生成3分子ATP。实验数据表明,合成1分子ATP需要4个H十,其中3个打通过ATP合酶穿线粒体内膜回流入基质,另l个W用于转运ADP、片和ATP(动画6-3“电子传递—质子泵出一ATP合成“)。每分子NADH经呼吸链传递泵出lOH十,生成约2.5(10/4)分子ATP;而唬珀酸呼吸链每传递2个电子泵出6H+,生成l.5(6/4)分子ATP。 四、ATP在能量代谢中起核心作用 生物体内能址代谢有自己的特点:其一,细胞内生物大分子体系多通过弱键能的非共价键维系,图6-13ATP合酶的工作机制B亚基的3种构象:0开放型;L疏松型;T紧密结合型。质子回流驱动丫亚基旋转及B亚基构象发生协调的周期性转换不能承受能量的大增或大噩释放的化学过程,故代谢反应都是依序进行、能量逐步得失;其二,生物体不直接利用营养物质的化学能,需要使之转变为细胞可以利用的能量形式,如ATP的化学能。ATP属千高能磷酸化合物,可直接为细胞的各种生理活动提供能量。所谓高能磷酸化合物是指那些水解时能释放较大自由能的含有磷酸基的化合物,通常其释放的标准自由能AG'大于25kJ/mol,并将水解时释放能量较多的磷酸酷键,称之为高能磷酸键,用“~P”符号表示。如水解ATP末端的磷酸酷键,AG'为-30.5kJ/mol,是高能化合物;水解葡糖-6-磷酸的磷酸酷键,其AG'为-13.8kJ/mol,即为普通的磷酸化合物。事实上,共价键的断裂是需要提供能量的,而具有高能磷酸键的化合物作为底物进行水解时,其产物比底物具有更低的自由能,因而释放的能噩较多。此外,生物体内还有其他含高能磷酸键、高能硫醋键的化合物(表6-4)。 化合物呱,一--一' 磷酸烯醇式丙酮酸-61.9 (- , 14.8)氨基甲酰磷酸·--...-51.4(-12.3)1,3-二磷酸甘油酸-49.3(-11.8)磷酸肌酸-43.1(-10.3)乙酰CoA-31.5(-7.5)ADP----,.AMP+Pi-27.6(-6.6)焦磷酸-27.6(-6.6)葡糖-I-磷酸-20.9(-5.0)(-)ATP是能量捕获和释放利用的重要分子ATP是体内最重要的高能磷酸化合物,是细胞可直接利用的能量形式。营养物分解产生的能量大约40%用于产生ATP。在标准状态下,ATP水解释放的自由能为30.5kJ/mol。但在活细胞中,ATP、ADP和无机磷浓度比标准状态低得多,而pH比标准状态的pH7.0高,ATP和ADP的全部磷酸基都处于解离状态,显示携带4个或3个负电荷的阴离子形式,并与细胞内M矿形成复合物。考虑到浓度等各种影响因素,细胞内ATP水解释放自由能可能达到52.3kJ/mol,可用于驱动与之偶联反应的进行。因此,ATP最重要的意义是通过其水解释放大楹自由能,当与需要供能的反应偶联时,能促进 这些反应在生理条件下完成。如ATP直接参与各种代谢物的活化反应、合成生物大分子的反应;通过ATP使分解代谢与合成代谢紧密相连;ATP通过水解反应为耗能的跨膜转运、骨骼肌收缩、蛋白质 \构象的改变提供能量。 132第二篇物质代谢及其调节 (二)ATP是能量转移和核昔酸相互转变的核心 细胞中存在的腺昔酸激酶(adenylate kinase)可催化ATP、ADP、AMP间互变。当体内ATP消耗过多(例如骨骼肌剧烈收缩)时,ADP累积,在腺背酸激酶催化下由ADP转变成ATP。当ATP的需求量降低时,AMP从ATP中获得~P生成ADP。 UTP、CTP、GTP可为糖原、磷脂、蛋白质等合成反应提供能晕,但它们一般不能从物质氧化过程中直接生成,而是在核昔二磷酸激酶的催化下,从ATP中获得~P产生。反应如下:ATP+UDP一ADP+UTP ATP+CDP一ADP+CTP ATP+GDP一ADP+GTP生物体内能量的生成、转移和利用都以ATP为中心。ATP分子性质稳定,但寿命仅数分钟,不在细胞中储存,而是不断进行ATP/ADP的再循环,其相互转变的量十分可观,转变过程中伴随自由能的释放和获得,在各种生理活动中完成能量的穿梭转换,因此称为“能量货币”。(三)ATP通过转移自身基团提供能量因为ATP分子中的高能磷酸键水解释放能量多,并产生Pi、PPi基团,很多酶促反应由ATP通过共价键与底物或蛋白质等相连,将ATP分子中的(四)磷酸肌酸也是储存能量的高能化合物图6-14高能磷酸键在ATP和磷酸肌酸间的转移ATP充足时,通过转移末端~P给肌酸,生成磷酸肌酸(creatine phosphate, CP),储存千需能较多的骨骼肌、心肌和脑组织中。当迅速消耗ATP时,磷酸肌酸可将~P转移给ADP,生成ATP,补充ATP的不足(图6-14)。所以ATP在体内能量捕获、转移、储存和利用过程中处于中心位置(图6-15)。 氧化磷酸化 机械能(肌收缩等)~P。渗透能(物质主动转运)化学能(合成代谢) 底物水平磷酸化}恋 磷酸电能(生物电) 肌酸ADP 热能(维持体温) 第三节氧化磷酸化的影响因素 ATP作为机体最主要的能量载体,其生成量主要取决于氧化磷酸化的速率。机体根据自身能量需求通过调节氧化磷酸化的速率来调节ATP的合成。因此,能够影响NADH、FADH2的产生、影响呼吸链组分和ATP合酶功能的因素,都会影响氧化磷酸化进而影响ATP的生成。 —、体内能量状态调节氧化磷酸化速率 机体根据能量需求调节氧化磷酸化速率,从而调节ATP的生成量。电子的氧化和ADP的磷酸化是氧化磷酸化的根本,通常线粒体中氧的消耗量是被严格调控的,其消耗量取决于ADP的含量,因此,ADP是调节机体氧化磷酸化速率的主要因素,只有ADP和Pi充足时电子传递的速率和耗氧量才会提高。 细胞内ADP的浓度以及ATP/ADP的比值能够迅速感应机体能量状态的变化。当机体蛋白质合成等耗能代谢反应活跃时,对能量的需求大为增加,ATP分解为ADP和R的速率增加,使ATP/ADP的比值降低、ADP的浓度增加,ADP进入线粒体后迅速用于磷酸化,氧化磷酸化随之加速,合成的ATP用于满足需求,直到ATP/ADP的比值回升至正常水平后,氧化磷酸化速率也随之放缓。通过这种方式使ATP的合成速率适应机体的生理需要。另外,ATP和ADP的相对浓度也同时调节糖酵解、三狻酸循环途径,满足氧化磷酸化对NADH和FAD凡的需求。另外ATP的浓度较高时,氧化磷酸化速率会降低,是因为ATP通过别构调节的方式抑制糖酵解、降低三狻酸循环的速率,协调调节产能的相关途径。 二、抑制剂阻断氧化磷酸化过程 抑制剂通过阻断电子传递链的任何环节,或者抑制ADP的磷酸化过程,都可导致ATP的合成减少,同时线粒体对氧的需求也减少,细胞的呼吸作用降低,细胞的各种生命活动都会受到影响。 (一)呼吸链抑制剂阻断电子传递过程 此类抑制剂能在特异部位阻断线粒体呼吸链中的电子传递、降低线粒体的耗氧量,阻断ATP的产生已。例如,鱼藤酮(rotenone汃粉蝶霉素A(piericidin A)及异戊巴比妥(amobarbital)等可抑制复合体I,从而阻断电子从铁硫中心到泛酣的传递。萎锈灵(carboxin)是复合体11的抑制剂。抗霉素A(antimycin A)阻断电子从Cyt b到QN的传递,是复合体皿的抑制剂。 CN\N;能够紧密结合复合体W中氧化型Cyt a3,阻断电子由Cyt a到Cu8-Cyt a3的传递。co与还原型Cyt a3结合,阻断电子传递给02。许多室内的火灾事故,由于装饰材料中的化学物质经高温处理后形成HCN,造成人员的co、CN中毒,能量代谢受阻,细胞的呼吸作用停止,直接威胁生命(见图611)。 (二)解偶联剂阻断ADP的磷酸化过程 解偶联剂(uncoupler)可使氧化与磷酸化的偶联分离,电子可沿呼吸链正常传递,但建立的质子电化学梯度被破坏,不能驱动ATP合酶来合成ATP。如二硝基苯酚(dinitrophenol, DNP)为脂溶性物质,在线粒体内膜中可自由移动,进入基质时释出H+,返回细胞质侧时结合H+,从而破坏了W的电化学梯度,无法驱动ATP的合成。 机体也存在内源性解偶联剂,使H十不通过ATP合酶、而是通过其他途径回流至线粒体基质,因而ATP的生成受到抑制。如人(尤其是新生儿)、哺乳类动物中存在棕色脂肪组织,该组织中含有大量的线粒体,因而细胞色素蛋白明显增多,大量血红素的强吸光能力而使其带有颜色。棕色脂肪组织的线粒体内膜中富含一种特别的蛋白质,称解偶联蛋白1(uncoupling protein1, UCPl)。它是由2个32kD亚基组成的二聚体,在线粒体内膜上形成质子通道,内膜细胞质侧的H十可经此通道返回线粒体基质,使氧化磷酸化解偶联不生成ATP,但质子梯度储存的能量以热能形式释放,因此棕色脂肪组织是产热御寒组织。新生儿硬肿症是因为缺乏棕色脂肪组织,不能维待正常体温而使皮下脂肪凝固所致。现已发现在骨骼肌等组织的线粒体中存在UCPl的同源蛋白质UCP2、UCP3,但无解偶联作用,它们在禁食条件下表达增加,可能有其他的功能。另外,体内游离脂肪酸也可促进H十经解偶联蛋白回\Iif`流至线粒体基质中而减少ATP的生成。(三)ATP合酶抑制剂同时抑制电子传递和ATP的生成ATP合酶的抑制剂对电子传递及ADP磷酸化均有抑制作用。例如寡霉素(oligomycin)、二环已基碳二亚胺(如yclohexyl carbodiimide, DCCD)均可结合F.,阻断I-I+从F0质子半通道回流,抑制ATP合酶活性。由于线粒体内膜两侧质子电化学梯度增高能够影响呼吸链组分的质子泵功能,因此也会抑制电子的传递过程。另外,抑制氧化磷酸化会降低线粒体对氧的需求,氧的消耗会减少。 三、甲状腺激素促进氧化磷酸化和产热 机体的甲状腺激素促进细胞膜上Na+, K+-ATP酶的表达,使ATP加速分解为ADP和Pi,ADP浓度增加而促进氧化磷酸化。另外甲状腺激素(th yroid hormoneT3)可诱导解偶联蛋白基因表达,使氧化释能和产热比率均增加,ATP合成减少,导致机体耗氧谜和产热同时增加,所以甲状腺功能亢进症病人基础代谢率增高。 四、线粒体DNA突变影响氧化磷酸化功能 线粒体DNA(mtDNA)呈裸露的环状双螺旋结构,缺乏蛋白质保护和损伤修复系统,容易受到损伤而发生突变,其突变率远高于核内的基因组DNA。 线粒体的功能蛋白质主要由细胞核的基因编码,人的mtDNA含37个编码基因,用于表达呼吸链复合体I中的7个亚基、复合体III中的Cyt b、复合体W中的3个亚基、ATP合酶的2个亚基,以及22个tRNA和2个rRNA。因此mtDNA突变可直接影响电子的传递过程或ADP的磷酸化,使ATP生成减少而致能量代谢紊乱、引起疾病。mtDNA突变造成的功能障碍易出现在耗能较多的组织,如骨骼肌、脑等。随着年龄的增长,如果mtDNA突变严重累积,可导致帕金森病、阿尔茨海默病、糖尿病等疾病的发生。 遗传性mtDNA疾病以母系遗传居多,因每个卵细胞中有几十万个mtDNA分子,每个精子中只有几百个mtDNA分子,受精卵mtDNA主要来自卵细胞,因此卵细胞mtDNA突变产生疾病的概率更高。 五、线粒体内膜选择性协调转运氧化磷酸化相关代谢物线粒体的基质与细胞质之间有线粒体内、外膜相隔,外膜对物质的通透性高、选择性低,线粒体内膜含有与代谢物转运相关的转运蛋白质体系,对各种物质进行选择性转运,维持组分间的平衡,以保证生物氧化和基质内旺盛的物质代谢过程能够顺利进行(表6-5)。 转运蛋白质进入线粒体出线粒体ATP-ADP转位酶ADP3-ATP七磷酸盐转运蛋白H2P04-+H•二狻酸转运蛋白HPO42-苹果酸a-酮戊二酸转运蛋白苹果酸a-酮戊二酸天冬氨酸-谷氨酸转运蛋白谷氨酸天冬氨酸单狻酸转运蛋白丙酮酸OH三狻酸转运蛋白苹果酸拧檬酸碱性氨基酸转运蛋白鸟氨酸瓜氨酸肉碱转运蛋白脂酰肉碱肉碱(-)细胞质中的NADH通过穿梭机制进入线粒体呼吸链在线粒体内生成的NADH可直接进入氧化呼吸链进行电子传递。但NADH不能自由穿过线粒体内膜,在细胞质中经糖酵解等生成的NADH需通过穿梭机制进入线粒体的呼吸链才能进行氧化。 1.0:-磷酸甘油穿梭脑和骨骼肌细胞的细胞质NADH主要通过此穿梭机制进入线粒体呼吸链进行氧化。细胞质中的NADH+甘在磷酸甘油脱氢酶催化下,将2H传递给磷酸二胫丙酮,使其还原成a-磷酸甘油,后者通过线粒体外膜到达线粒体内膜的膜间隙侧。在线粒体内膜的膜间隙侧结合着磷酸甘油脱氢酶的同工酶,此酶含FAD辅基,接受a-磷酸甘油的2H生成FADH2和磷酸二胫丙酮。FAD凡直接将2H传递给泛酰进入氧化呼吸链(图6-16)。由于FADH2将NADH携带的一对电子从内膜的膜间隙侧直接传递给Q进行氧化磷酸化,因此1分子的NADH经此穿梭能产生1.5分子ATP。 磷酸二轻丙酮I I I I a-磷酸甘油, I I I`,`I\\I\ 细胞胞质线粒体膜间隙线粒体线粒体外膜内膜基质2.苹果酸-天冬氨酸穿梭肝、肾及心肌细胞中主要采用此机制将细胞质NADH转运至线粒体呼吸链。该穿梭需要2种内膜转运蛋白质和2种酶协同参与。细胞质中的NADH+W使草酰乙酸还原生成苹果酸,苹果酸经过线粒体内膜上的苹果酸-a-酮戊二酸转运蛋白进入线粒体基质后重新生成草酰乙酸,释放NADH+H十。基质中的草酰乙酸转变为天冬氨酸后经线粒体内膜上的天冬氨酸-谷氨酸转运蛋白重新回到细胞质。进入基质的NADH+W则通过NADH呼吸链进行氧化,生成2.5分子ATP(图6-17)。 线粒体胞质侧内膜基质侧 酮~比 二戊酮 二戊 比尤 比冬 酸氨 谷氨酸 CD苹果酸脱氢酶;@谷草转氨酶;@a-酮戊二酸转运蛋白;@天冬氨酸-谷氨酸转运蛋白(二)ATP-ADP转位酶协调转运ATP和ADP出入线粒体呼吸链产生的质子电化学梯度主要用于驱动ATP的合成,同时也驱动内膜上的跨膜蛋白质转运氧化磷酸化的相关组分,包括腺昔酸转运蛋白、磷酸盐转运蛋白等。 线粒体内膜富含腺昔酸转运蛋白,也称ATP-ADP转位酶(ATP-ADP translocase),可占内膜蛋白质总量的14%。它是由2个亚基组成的二聚体,形成跨膜蛋白通道,将膜间隙的ADP3-(在细胞pH中,ADP呈解离状态)转运至线粒体基质中,同时从基质转运出ATP4-,使经过线粒体内膜的ADP3一进入和ATP4一移出紧密偶联,维持线粒体内外腺昔酸水平基本平衡。每分子ATP4-和ADP3一反向转运时,实际向膜间隙净转移l个负电荷,而膜间隙的高正电性有利于ATP的泵出。此时,跨膜质子梯度的能量也驱动膜间隙侧的H十和H2P04一经磷酸盐转运蛋白同向转运到线粒体基质中(图6-18)。因此每分子ATP在线粒体基质中生成并转运到细胞质共需4个W回流进入线粒体基质中。 心肌、骨骼肌等耗能多的组织中线粒体膜间隙存在一种肌酸激酶同工酶,它催化经ATP-ADP转位酶运到膜间隙中ATP与肌酸之间~P的转移,生成的磷酸肌酸经线粒体外膜中的孔蛋白进入细胞质中,由相应的肌酸激酶同工酶催化,将~P转移给ADP生成ATP。因此线粒体内膜的选择性协调转运,对于氧化磷酸化的正常运转至关重要。 第四节其他氧化与抗氧化体系 除了线粒体氧化体系外,细胞内也存在其他的氧化体系,主要参与物质的生物氧化。另外,线粒体呼吸链存在单电子传递过程,单电子也有机会"漏出“直接传递给氧而生成活性氧组分,而不是通过呼吸链传递给氧生成水。因此呼吸链也是产生活性氧、引起细胞氧化损伤的原因之一,机体也有相应的保护防御机制。 一、微粒体细胞色素P450单加氧酶催化底物分子轻基化人微粒体细胞色素P450单加氧酶(cytochrome P450monooxygenase)催化氧分子中的一个氧原子加到底物分子上(轻化),另一个氧原子被NADPH+甘还原成水,故又称混合功能氧化酶(mixed function oxidase)或轻化酶(hydroxylas e),参与类固醇激素等的生成以及药物、毒物的生物转化过程(见第十九章),其反应式如下:单加氧酶类在肝和肾上腺的微粒体中含量最多,是反应最复杂的酶。此酶含细胞色素P450(Cyt P450),通过血红素中的Fe离子进行单电子传递。Cyt P450在生物中广泛分布,人C yt P450有几百种同工酶,识别各自特异性底物。 单加氧酶催化反应过程如下:NADPH首先将电子交给黄素蛋白;黄素蛋白将电子传递给以Fe-S为辅基的铁氧还蛋白;与底物结合的氧化型Cy t P450接受铁氧还蛋白的1个e一后,转变成还原型Cyt P450,与02结合形成RH·P450·Fe2•·02; Cyt P450血红素中Fe2+将电子交给02形成RH·P450·Fe3•·02一;再接受铁氧还蛋白的第2个e一,使氧活化(O22-)。此时1个氧原子使底物(RH)轻化(ROH),另1个氧原子与来自NADPH的质子结合生成H20(图6-19)。 丫入 二、线粒体呼吸链也可产生活性氧。2得到单电子产生超氧阴离子(O;.),再逐步接受电子而生成过氧化氢H202、轻自由基(·OH)。这些未被完全还原的含氧分子,氧化性远远大千02,合称为反应活性氧类(reacti ve oxygen species, ROS)。 。2一02.一比02关·OH-比0 线粒体的呼吸链是产生ROS的主要部位,呼吸链在传递电子的过程中,由于将涌出的电子直接交给氧,产生部分被还原的氧,所以得到ROS这样的"副产物”,特别是0;.的产生主要源自呼吸链。灼t岔复合体皿中通过Q循环传递电子,接受单电子的QH'在内膜中自由移动,通过非酶促反应直接将单电子泄漏给02而生成o;.。呼吸链末端的细胞色素c氧化酶从金属离子每次转移l个电子、通过4步单电子转移将氧彻底还原生成水,也会有少量氧接受单电子或双电子而生成0;.和H2020除呼吸链外,细胞质中的黄嗦呤氧化酶、微粒体中的Cyt P450氧化还原酶等催化的反应,需要氧为底物,也可产生o;.。但这些酶产生的ROS远低于线粒体呼吸链。另外,细菌感染、组织缺氧等病理过程,电离辐射、吸烟、药物等外源因素也可导致细胞产生大量的ROS。 RO S通过不同的方式释放到线粒体基质、膜间隙及细胞质等部位,对细胞的功能产生广泛的影响。少量的ROS能够促进细胞增殖等,但ROS的大量累积会损伤细胞功能、甚至会导致细胞死亡。例如,线粒体基质中的顺乌头酸酶,其Fe-S易被0;.氧化而丧失功能,直接影响三狻酸循环的功能。 o;.可迅速氧化一氧化氮(NO)产生过氧亚硝酸盐(ONOO_,也属于ROS),后者能使脂质氧化、蛋白质硝基化而损伤细胞膜和膜蛋白。胫自由基等可直接氧化蛋白质、核酸,进而破坏细胞的正常结构和功能。线粒体一方面通过消耗氧用千产生ATP供能,另一方面也会产生ROS而损伤自身及细胞等。因此,生物进化已使机体发展了有效的抗氧化体系及时清除ROS,防止其累积产生有害影响。 三、抗氧化酶体系有清除反应活性氧的功能 体内存在的各种抗氧化酶、小分子抗氧化剂等,形成了重要的防御体系以对抗ROS的副作用。广泛分布的超氧化物歧化酶(superoxide dismutase, SOD),可催化1分子0;.氧化生成02,另一分子o;.还原生成H202,2个相同的底物歧化产生了2个不同的产物:哺乳动物细胞有3种SOD同工酶,在细胞质中的SOD,其活性中心含Cu/Zn离子,称Cu/ZnSOD;线粒体中的SOD活性中心含Mn2+,称Mn-SOD。SOD是人体防御内、外环境中超氧离子损伤的重要酶。Cu/Zn-SOD基因缺陷使0;.不能及时清除而损伤神经元,可引起肌萎缩性侧索硬化症等疾病。 生成的H202可被过氧化氢酶(catalase)分解为H20和02。过氧化氢酶主要存在于过氧化酶体、细胞质及微粒体中,含有4个血红素辅基,催化活性强,每秒种可催化超过40000底物分子转变为产物。其催化反应如下:H息有一定的生理作用,如在粒细胞和吞噬细胞中,H202可氧化杀死入侵的细菌;甲状腺细胞中产生的H202可使21一氧化为12,进而使酪氨酸殡化生成甲状腺激素。 谷胱甘肤过氧化物酶(glutathione peroxidase,GPx)也是体内防止ROS损伤不可缺少的酶,可去除H息和其他过氧化物类(ROOH)。在细胞胞质、线粒体以及过氧化酶体中,GPx通过还原型的谷胱甘肤将H202还原为H20,将ROOH转变为醇,同时产生氧化型的谷胱甘肤。它催化的反应如下:H202+2GSH-------+-2H20+GS-SG2GSH+ROOH-GS-SG+H20+ROH氧化型GS-SC经谷胱甘肤还原酶催化,由NADPH+H•提供2H,再转变为还原型的GSH。还原型的GSH也发挥抗氧化作用,抵抗活性氧对蛋白质中琉基的氧化。体内其他小分子自由基清除剂有维生素C、维生素E、B-胡萝卜素等,它们与体内的抗氧化酶共同«>;;,组成人体抗氧化体系。 第六章生物氧化 生物氧化是指化学物质在生物体内的氧化分解过程。其中营养物质在线粒体内氧化分解生成CO2和H20的过程中释放能量,用于驱动ADP磷酸化生成ATP。ATP是机体储存能量的主要形式,是能被体内各种代谢反应直接利用的主要能量形式,是能量代谢的核心。微粒体等部位发生的生物氧化反应主要对底物进行氧化修饰等,不产生ATP。 线粒体氧化体系主要用于生成CO2和H20并产生能量。其氧化过程通过呼吸链完成,即营养物质氧化分解产生CO2的同时,将产生的NADH和FADH2通过呼吸链进行电子传递给氧,生成水和ATP。呼吸链由4种蛋白质复合体与泛酰和细胞色素c按序组成。NADH、FAD凡是线粒体呼吸链的电子供体,因而线粒体有两条呼吸链。NADH呼吸链的组成及电子传递顺序是:NADH-复合体I一Q一复合体皿-Cyt c-复合体W一02,传递一对电子可生成2.5分子ATP。FADH2呼吸链的组成及电子传递顺序是:珑珀酸一复合体rr-Q一复合体皿-Cyt C一复合体W一02,传递一对电子可生成1.5分子ATP。细胞质中生成的NADH须通过a-磷酸甘油穿梭或苹果酸-天冬氨酸穿梭机制进入线粒体呼吸链被氧化释能。 呼吸链建立跨线粒体内膜的质子电化学梯度,驱动质子回流释放能量用于产生ATP。呼吸链的复合体I、ill和W有质子泵功能,在进行电子传递时,分别向膜间隙侧泵出4H\4H十和2W,形成跨线粒体内膜的质子电化学梯度(电荷和浓度梯度),储存电子传递释放的能量。由此产生的质子驱动力,促使质子回流返回至线粒体基质,激活ATP合酶的功能。 氧化磷酸化是线粒体产生ATP的机制。其过程是将NADH和FADH2的氧化过程与ADP的磷酸化过程相偶联,产生ATP。氧化过程由线粒体呼吸链完成,将NADH、FADH2的电子传递给氧生成水,并通过质子泵作用产生跨线拉体内膜的质子电化学梯度储存能量;磷酸化过程是质子顺梯度的释放势能时促使质子返回基质,驱动ATP合酶结合ADP和Pi、使ADP磷酸化产生ATP。 多种因素可以影响氧化磷酸化作用。ADP的浓度高可促进氧化磷酸化;而氛化物等呼吸链抑制剂、ATP合酶抑制剂以及解偶联剂等都可通过不同的机制抑制氧化磷酸化,阻断ATP的生成。呼吸链也是体内ROS的主要来原。ROS产生过多会对机体产生危害,体内的抗氧化酶类及抗氧化物体系能及时清除ROS,维护机体的正常功能。 1.何谓氧化磷酸化作用?糖酵解和三狻酸循环如何影响氧化磷酸化的速率? 2.线粒体是重要的能量代谢细胞器,如何理解线粒体在神经退行性病变、肿瘤发生发展中的作用?3呼吸链中哪些复合体容易产生ROS?ROS有哪些作用?如何定量分析细胞内ROS的含量? 4.根据呼吸链的结构和作用特点,哪些方法可以分析其功能的变化? 5.解偶联剂与白色脂肪、棕色脂肪的关系是什么?解偶联剂有助于减肥吗?(苑辉卿) 第七章脂质代谢 脂质(lipids)种类多、结构复杂,决定了其在生命体内功能的多样性和复杂性。脂质分子不由基因编码,独立于从基因到蛋白质的遗传信息系统之外,不易溶于水是其最基本的特性,决定了脂质在以基因到蛋白质为遗传信息系统、以水为基础环境的生命体内的特殊性,也决定了其在生命活动或疾病发生发展中的特别重要性。一些原来认为与脂质关系不大甚至不相关的生命现象和疾病,可能与脂质及其代谢关系十分密切。近年来种种迹象表明,在分子生物学取得重大进展基础上,脂质及其代谢研究将再次成为生命科学、医学和药学等的前沿领域。 第一节脂质的构成、功能及分析—、脂质是种类繁多、结构复杂的一类大分子物质脂质是脂肪和类脂的总称。脂肪即甘油三酣(triglyceride),也称三脂肪酰基甘油(triacylglycerol)。 类脂包括固醇及其酷、磷脂和糖脂等。 (—)甘泊三酷是甘油的脂肪酸酷 甘油三酷为甘油的三个经基分别被相同或不同的脂肪酸酷化形成的酷,其脂肪酰链组成复杂,长度和饱和度多种多样已。体内还存在少量甘油一酷(monoacylglycerol)和甘油二酷(小acylglycero l)。 (二)脂肪酸是脂肪泾的狻酸脂肪酸(fat ty acid)的结构通式为CH3(CH2)"COOH。高等动植物脂肪酸碳链长度一般在14~20之间、为偶数碳(表7-1)。脂肪酸系统命名法根据脂肪酸的碳链长度命名;碳链含双键,则标示其位置。A编码体系从狻基碳原子起计双键位置,Q或n编码体系从甲基碳起计双键位置。不含双键的脂肪酸为饱和脂肪酸(saturated fatty acid),不饱和脂肪酸(unsaturated fatty acid)含一个或以上双键。含一个双键的脂肪酸称为单不饱和脂肪酸(monounsaturated fatty acid);含两个及以上双键的脂肪酸称为多不饱和脂肪酸(polyunsatu rated fatty aci d)。根据双键位置,多不饱和脂肪酸分属千w-3、w-6、w-7和w-9四簇(表7-2)。高等动物体内的多不饱和脂肪酸由相应的母体脂肪酸衍生而来,但w-3、w-6和w-9簇多不饱和脂肪酸不能在体内相互转化。 (三)磷脂分子含磷酸 磷脂(phospholipids)由甘油或鞘氨醇、脂肪酸、磷酸和含氮化合物组成已。含甘油的磷脂称为甘油磷脂(glycerophospholipids),结构通式如下。因取代基团-X不同,形成不同的甘油磷脂(表7-3)。 第七章脂质代谢141 碳原子习惯名系统名数和双簇分子式键数 饱和脂肪酸月桂酸(lauricacid)几-十二烧酸12:0CH3(CH2)10COOR豆范酸(myristic acid)几-十四烧酸14:0CH3(CH2)12COOR软脂肪酸(palm山c acid)几-十六烧酸16:0CH3(CH2)14COOR硬脂肪酸(stearic acid)n-十八烧酸18:Q CH3(C H2)16COOR花生酸(釭achidic acid)n-二十烧酸20:Q CH3(C H2)18COOR山箭酸(behenic acid)n-二十二烧酸22:0CH3(CH2)20COOR拘焦油酸(lignoce ric n-二十四烧酸24:O CH3(CH2)22COOR acid)单不饱和脂肪酸棕桐(软)油酸(palmito-9-十六碳一烯酸16:1w-7CH/CH2)5CH=CH(CH2)7COOHleic acid)油酸(ole ic acid)9-十八碳一烯酸18:1(I)-9CH3(CH2)1CH=CH(CH2LCOOH异油酸(vaccenic acid)反式11-十八碳一烯18:1w-7CH3(C H2)5CH=C H(CH2)9COOR酸神经酸(nervonic acid)15-二十四碳单烯酸24:1w-9CH3(CH2)1CH=CH(CH2儿COOH多不饱和脂肪酸亚油酸(linoleic acid)9,12-十八碳二烯酸18:2w-6CH3(C比),(CH=CHCH山(C比)6COOH a亚麻酸(a-linolenic9,12,15-十八碳三烯18:3w-3CH3CH2(CH=CHCH山(CH山COOH acid)酸1亚麻酸(-y-linolenic6,9,12-十八碳三烯18:3w-6CH3(C比)4(CH=CHC比)3(CH山COOH acid)酸花生四烯酸(arachidonic5,8,11,14-二十碳四20:4w-6CH3(C比)4(CH=CHC比)4(C比)2COOH acid)烯酸timnodonic acid(EPA)5,8,11,14,17-二十20:5w-3CH3CH2(CH=CHCH山(C H山COOH碳五烯酸clupanodonic acid(DPA)7,10,13,16,19-二十22:5w-3CH3CH2(CH=CHCH山(CH山COOH二碳五烯酸cervonic acid(DHA)4,7,10,13,16,19-二22:6w-3CH3CH2(CH=CHCH山CH2COOH十二碳六烯酸油酸 w-9w-6 亚油酸 9-18:19,12-18:2 @w-3胆碱—CH2CH2+N(CH3)J磷脂酰胆碱(卵磷脂) 乙醇胺-CH2CH2NH3磷脂酰乙醇胺(脑磷脂) 丝氨酸沁I I3磷脂酰丝氨酸 肌醇磷脂酰肌醇 言甘 甘油—CH2CHOHCH20H磷脂酰甘油CH20COR1 磷脂酰甘油?i I二磷脂酰甘油(心磷脂)—CH2CHOHCH20-P—OCH2含鞘氨醇(sphingosine)或二氢鞘氨醇(dihydrosphingosine)的磷脂称为鞘磷脂(sphingophospholipid)。鞘氨醇的氨基以酰胺键与1分子脂肪酸结合成神经酰胺(ceramide),为鞘脂的母体结构。鞘脂的结构通式如下,因取代基-X不同,可分为鞘磷脂和鞘糖脂(glycosphingolipid)两类。鞘磷脂的取代基为磷酸胆碱或磷酸乙醇胺,鞘糖脂的取代基为葡萄糖、半乳糖或唾液酸等。 鞘氨醇鞘氨醇 CH3一(CH加一CH=CH-CHOH脂肪酸CH3—(CH止一CH=CH-CH-OH脂肪酸I,__----、I,,.-一^一一、(四)胆固醇以环戊炕多氢菲为基本结构胆固醇属类固醇(steroid)化合物,由环戊烧多氢菲(perhydrocylopentanophenanthrene)母体结构衍生形成。因C3胫基氢是否被取代或乌侧链(一般为8~l0个碳原子)不同而衍生出不同的类固醇。动物体内最丰富的类固醇化合物是胆固醇(cholesterol),植物不含胆固醇而含植物固醇,以B-谷固醇(B姐tosterol)最多,酵母含麦角固醇(ergosterol)。 环戊烧多氢菲胆固醇 P-谷固醇麦角固醇 二、脂质具有多种复杂的生物学功能 (一)甘油三酷是机体重要的能源物质 由千独特的性质,甘油三酣是机体重要供能和储能物质。首先,甘油三酣富含高度还原碳,氧化分解产能多。lg甘油三酷彻底氧化可产生38kJ能量,lg蛋白质或lg碳水化合物只产生17kJ能量。其次,甘油三醋疏水,储存时不带水分子,占体积小。再次,机体有专门的储存组织—一脂肪组织卤。甘油三酷是脂肪酸的重要储存库。甘油二醋还是重要的细胞信号分子。 (二)脂肪酸具有多种重要生理功能脂肪酸是脂肪、胆固醇酷和磷脂的重要组成成分。一些不饱和脂肪酸具有更多、更复杂的生理功能。 1.提供必需脂肪酸人体自身不能合成、必须由食物提供的脂肪酸称为必需脂肪酸(essential fatty acid)。人体缺乏A9及以上去饱和酶,不能合成亚油酸(18:2,/19,12)、a-亚麻酸(18:3,/19,12'15),必须从含有A9及以上去饱和酶的植物食物中获得,为必需脂肪酸。花生四烯酸(20:4'/15,8,11,14)虽能在人体以亚油酸为原料合成,但消耗必需脂肪酸,一般也归为必需脂肪酸。 2.合成不饱和脂肪酸衍生物前列腺素、血栓噫烧、白三烯是二十碳多不饱和脂肪酸衍生物。前列腺素(prostaglandin, PG)以前列腺酸(prostanoic acid)为基本骨架,有一个五碳环和两条侧链(RI及凡)。 花生四烯酸前列腺酸 根据五碳环上取代基团和双键位置不同,前列腺素分为PGA-PGI等9型。体内PGA、PGE及PGF较多;PGC2和PG凡是PG合成的中间产物。PGI2带双环,除五碳环外,还有一个含氧的五碳环,又称为前列环素(pros tacyclin)。 [`比丿__`R2COOH 144第二篇物质代谢及其调节根据凡及凡侧链双键数目,前列腺素又分为1、2、3类,在字母右下角标示。 PGF心PGF也 血栓嗯烧(thromboxane A2,TXA2)有前列腺酸样骨架但又不同,五碳环被含氧噫烧取代。 血栓嗯烧A2 白三烯(leukotriene, LT)不含前列腺酸骨架,有4个双键,所以在LT右下角标以4。白三烯合成的初级产物为LTA4,在5、6位上有一氧环。如在12位加水引入轻基,并将5、6位环氧键断裂,则为LTB4。如LTA4的5、6位环氧键打开,6位与谷胱甘肤反应则可生成LTC4、LTD4及LT凡等衍生物。 14151719白三烯A4(LTA4) 前列腺素、血栓噫烧和白三烯具有很强生物活性。PG凡能诱发炎症,促进局部血管扩张,使毛细血管通透性增加,引起红、肿、痛、热等症状。PGE2、PGA2能使动脉平滑肌舒张,有降血压作用。PGE2及PGl2能抑制胃酸分泌,促进胃肠平滑肌蠕动。卵泡产生的PGE2、PGF2"在排卵过程中起重要作用。PGF2"可使卵巢平滑肌收缩,引起排卵。子宫释放的PGF2"能使黄体溶解。分挽时子宫内膜释出的PG凡能使子宫收缩加强,促进分挽。 血小板产生的TXA2、PG氐能促进血小板聚集和血管收缩,促进凝血及血栓形成。血管内皮细胞释放的PGI2有很强舒血管及抗血小板聚集作用,抑制凝血及血栓形成。可见PGI2有抗TXA2作用。北极地区因纽特人摄食富含二十碳五烯酸的海水鱼类食物,能在体内合成PGE3、PGl3及TXA3。PGl3能抑制花生四烯酸从膜磷脂释放,抑制PGI2及TXA2合成。由千PGl3活性与PGI2相同,而TXA3活性较TXA2弱得多,因此因纽特人抗血小板聚集/抗凝血作用较强,被认为是他们不易患心肌梗死的重要原因之一。 过敏反应慢反应物质(slow reacting substances of anaphylatoxis, SRS-A)是LTC4、LTD4及LT凡混合物,其支气管平滑肌收缩作用较组胺、PGF压强l00~1000倍,作用缓慢而持久。LT凡能调节白细胞功能,促进其游走及趋化作用,刺激腺昔酸环化酶,诱发多形核白细胞脱颗粒,使溶酶体释放水解酶类,促进炎症及过敏反应发展。lgE与肥大细胞表面受体结合后,可引起肥大细胞释放LTC4、LT队及。 LTE4。这3种物质能引起支气管及胃肠平滑肌剧烈收缩,LT队还能使毛细血管通透性增加。(三)磷脂是重要的结构成分和信号分子1.磷脂是构成生物膜的重要成分磷脂分子具有亲水端和疏水端,在水溶液中可聚集成脂质双层,是生物膜的基础结构包。细胞膜中能发现几乎所有的磷脂,甘油磷脂中以磷脂酰胆碱(phosphatidylcholine, PC)、磷脂酰乙醇胺(phosphatidylethanolamine, PE)、磷脂酰丝氨酸(phosphatidylserine)含量最高,鞘磷脂中以神经鞘磷脂为主。各种磷脂在不同生物膜中所占比例不同。磷脂酰胆碱也称卵磷脂(lecithin)存在于细胞膜中。心磷脂(c职liolipin)是线粒体膜的主要脂质。 2磷脂酰肌醇是第二信使的前体磷脂酰肌醇(phosphatidylinositol)4、5位被磷酸化生成的磷脂酰肌醇-4,5-二磷酸(phosphatidylinositol4,5-bisphosphate, PIP2)是细胞膜磷脂的重要组成成分,主要存在于细胞膜的内层。在激素等刺激下可分解为甘油二酷和肌醇三磷酸(inositol triphosph ate, IP3),均能在细胞内传递细胞信号。 (四)胆固醇是生物膜的重要成分和具有重要生物学功能固醇类物质的前体1.胆固醇是细胞膜的基本结构成分胆固醇C3经基亲水,能在细胞膜中以该羚基存在于磷脂的极性端之间,疏水的环戊烧多氢菲和乌侧链与磷脂的疏水端共存于细胞膜。胆固醇是动物细胞膜的另一基本结构成分,但亚细胞器膜含量较少。环戊烧多氢菲环使胆固醇比细胞膜其他脂质更强直,是决定细胞膜性质的重要分子。 2.胆固醇可转化为一些具有重要生物学功能的固醇化合物体内一些内分泌腺,如肾上腺皮质睾丸、卵巢等能以胆固醇(酷)为原料合成类固醇激素;胆固醇在肝可转变为胆汁酸,在皮肤可转化为维生素D3o三、脂质组分的复杂性决定了脂质分析技术的复杂性脂质是不溶于水的大分子有机化合物,加之组成多样、结构复杂,很难用常规方法分析。通常需先提取,分离,还可能需要进行酸、碱或酶处理,然后再根据其特点、性质和分析目的,选择不同方法进行分析。 (一)用有机溶剂提取脂质 通常根据脂质的性质,采用不同的有机溶剂抽提不同的脂质,中性脂用乙酰、氯仿、苯等极性较小的有机溶剂,膜脂用乙醇、甲醇等极性较大的有机溶剂。血浆脂质的常规临床定量分析通常不需要抽提、分离,直接采用酶法测定。抽提获得的脂质为粗纯物,需进一步分离后分析。 (二)用层析分离脂质 层析(chromatography)也称色谱,是脂质分离最常用和最基本方法,有柱层析和薄层层析(thin layer chromato驴·aphy, TCL)两种形式。通常采用硅胶为固定相,氯仿等有机溶剂为流动相。由于极性较高脂质(如磷脂)与硅胶的结合比极性较低、非极脂质(如甘油三酣)紧密,所以硅胶对不同极性脂质的吸附能力不同。抽提获得的混合脂质通过层析系统时,非极性脂质移动速度较极性脂质快,从而将不同极性脂质分离,用于下一步分析。 (三)根据分析目的和脂质性质选择分析方法 脂质分离后,常常需要进行定量或定性分析。层析后用碱性蕊香红、罗丹明或碳等染料显色,然后扫描显色的斑点进行定量分析。也可通过显色斑点对比样品与已知脂质的迁移率进行定性分析。还可以洗脱、收集层析分离的脂质,采用适当的化学方法(如滴定、比色等)测定含量。更精细的定量定性分析,可根据分析目的和脂质性质,选用质谱法、红外分光光度法、荧光法、核磁共振法、气-液色谱法(gas-liquid chromatography)等分析。 (四)复杂的脂质分析还需特殊的处理 脂质的组成及结构复杂,对其分析常常需要特殊处理。如甘油三酉扒胆固醇酷、磷脂中的脂肪酸多种多样、结构差异大。对其分析需经特殊处理,使其释放,再结合前述方法分析。甘油三酷、磷脂、\IITt胆固醇酷可用稀酸和碱处理使脂肪酸释放,鞘脂则需强酸处理才能释放脂肪酸。采用特定的磷脂酶还可特异释放磷脂特定分子部位的脂肪酸。 第二节脂质的消化与吸收—、胆汁酸盐协助消化酶消化脂质脂质(lipid)不溶于水,不能与消化酶充分接触。胆汁酸盐有较强乳化作用,能降低脂-水相间的界面张力,将脂质乳化成细小微团(micelles),使脂质消化酶吸附在乳化微团的脂-水界面,极大地增加消化酶与脂质接触面积,促进脂质消化。含胆汁酸盐的胆汁、含脂质消化酶的胰液分泌后进入十二指肠,所以小肠上段是脂质消化的主要场所。 胰腺分泌的脂质消化酶包括胰脂酶(pancreatic lipase汃辅脂酶(colipase)、磷脂酶A2(phospholipase A2, PLA2)和胆固醇酣酶(cholesterol esterase)(动画7-1“消化酶的作用”)。胰脂酶特异水解甘油三酷l、3位酷键,生成2-甘油一酷(2-monoglyceride)及2分子脂肪酸。辅脂酶(M,,lOkD)在胰腺泡以酶原形式存在,分泌入十二指肠腔后被胰蛋白酶从N-端水解,移去五肤而激活。辅脂酶本身不具脂酶活性,但可通过疏水键与甘油三酷结合(Kd,1xl0-7moVL汃通过氢键与胰脂酶结合(分子比为1:1;凡值为5xl0-7moVL),将胰脂酶铀定在乳化微团的脂-水界面,使胰脂酶与脂肪充分接触,发挥水解脂肪的功能。辅脂酶还可防止胰脂酶在脂-水界面上变性、失活。可见,辅脂酶是胰脂酶发挥脂肪消化作用必不可少的辅因子。胰磷脂酶A2催化磷脂2位酷键水解,生成脂肪酸(fat ty acid)和溶血磷脂(lysophosphatide)。胆固醇酷酶水解胆固醇酷(cholesterol ester, CE),生成胆固醇(cholesterol)和脂肪酸。溶血磷脂、胆固醇可协助胆汁酸盐将食物脂质乳化成更小的混合微团(mixed micelles)。这种微团体积更小(直径约20nm),极性更大,易穿过小肠黏膜细胞表面的水屏障被黏膜细胞吸收。 二、吸收的脂质经再合成进入血液循环 脂质及其消化产物主要在十二指肠下段及空肠上段吸收。食入脂质含少量由中(6~10C)、短(2~4C)链脂肪酸构成的甘油三酷,它们经胆汁酸盐乳化后可直接被肠黏膜细胞摄取,继而在细胞内脂肪酶作用下,水解成脂肪酸及甘油(glycerol),通过门静脉进入血液循环。脂质消化产生的长链(l2~26C)脂肪酸、2-甘油一酉扒胆固醇和溶血磷脂等,在小肠进入肠黏膜细胞。长链脂肪酸在小肠黏膜细胞首先被转化成脂酰CoA(acyl CoA),再在滑面内质网脂酰CoA转移酶(acyl CoA tran sferase)催化下,由ATP供能,被转移至2-甘油一酷轻基上,重新合成甘油三酣。再与粗面内质网上合成的载脂蛋白(apolipoprotein, apo)B48、C、AI、AIV等及磷脂、胆固醇共同组装成乳糜微粒(chylomicron, CM),被肠黏膜细胞分泌、经淋巴系统进入血液循环。 三、脂质消化吸收在维持机体脂质平衡中具有重要作用体内脂质过多,尤其是饱和脂肪酸、胆固醇过多,在肥胖(obesity汃高脂血症(hyperlipidemia)、动脉粥样硬化(atherosclerosis)、2型糖尿病(type2diabetes mellitus, TIDM)、高血压(hype rten sion)和癌(cancer)等发生中具有重要作用。小肠被认为是介于机体内、外脂质间的选择性屏障。脂质通过该屏障过多会导致其在体内堆积,促进上述疾病发生。小肠的脂质消化、吸收能力具有很大可塑性。脂质本身可刺激小肠、增强脂质消化吸收能力。这不仅能促进摄入增多时脂质的消化吸收,保障体内能量、必需脂肪酸(essential fatty acid)、脂溶性维生素供应,也能增强机体对食物缺乏环境的适应能力。小肠脂质消化吸收能力调节的分子机制可能涉及小肠特殊的分泌物质或特异的基因表达产物,可能是预防体脂过多、治疗相关疾病、开发新药物、采用膳食干预措施的新靶标。 第七章脂质代谢 第三节甘油三醋代谢 —、甘油三酷氧化分解产生大量ATP (一)甘油三酷分解代谢从脂肪动员开始 脂肪动员(fat mob山zation)指储存在白色脂肪细胞内的脂肪在脂肪酶作用下,逐步水解,释放游离脂肪酸和甘油供其他组织细胞氧化利用的过程(图7-1)~。 归转 脂解激素 细胞膜 门`"口, 脂、产` 清蛋白 存储 胞细 心、骨骼肌细胞 血液运送 曾经认为,脂肪动员由激素敏感性甘油三酣脂肪酶(hormone-sensitive triglyceride lipase, HSL)、也称激素敏感性脂肪酶(hormon e sensitive lipase, HSL)调控。HSL催化甘油三酷水解的第一步,是脂肪动员的关键酶。随后发现催化甘油三酷水解第一步并不是HSL的主要作用,而是下面所描述的第二步反应。脂肪动员也还需多种酶和蛋白质参与,如脂肪组织甘油三酷脂肪酶(ad ipose triglyceride lipase, ATGL)和Perilipin-1。 脂肪动员由多种内外刺激通过激素触发。当禁食、饥饿或交感神经兴奋时,肾上腺素、去甲肾上腺素、胰高血糖素等分泌增加,作用千白色脂肪细胞膜受体,激活腺昔酸环化酶,使腺昔酸环化成cAMP,激活cAMP依赖蛋白激酶,使细胞质内脂滴包被蛋白-1(Peri lipin-1)和HSL磷酸化。磷酸化的Perilipin-1一方面激活ATGL,另一方面使因磷酸化而激活的HSL从细胞质转移至脂滴表面。脂肪在脂肪细胞内分解的第一步主要由ATGL催化,生成甘油二酷和脂肪酸。第二步主要由HSL催化,主要水解甘油二酣sn-3位酷键,生成甘油一酷和脂肪酸。最后,在甘油一酷脂肪酶(monoacylglycerol@lipa se, MGL)的催化下,生成甘油和脂肪酸。所以,上述激素能够启动脂肪动员、促进脂肪水解为游离脂肪酸和甘油,称为脂解激素。而胰岛素、前列腺素E2等能对抗脂解激素的作用,抑制脂肪动员,称为抗脂解激素。 游离脂肪酸不溶于水,不能直接在血浆中运输。血浆清蛋白具有结合游离脂肪酸的能力(每分子清蛋白可结合10分子游离脂肪酸),能将脂肪酸运送至全身,主要由心、肝、骨骼肌等摄取利用。 (二)甘油转变为3-磷酸甘油后被利用 甘油可直接经血液运输至肝、肾、肠等组织利用。在甘油激酶(glycerokinase)作用下,甘油转变为3-磷酸甘油;然后脱氢生成磷酸二胫丙酮,循糖代谢途径分解,或转变为葡萄糖。肝的甘油激酶活性最高,脂肪动员产生的甘油主要被肝摄取利用,而脂肪及骨骼肌因甘油激酶活性很低,对甘油的摄取利用很有限。 CH20H百丽蔷酶CH心一也甘油3-磷酸甘油 磷酸甘油脱氢酶I呱、糖酵解途径CH心—@ 磷酸二轻丙酮 (三)B-氧化是脂肪酸分解的核心过程 除脑外,机体大多数组织均能氧化脂肪酸,以肝、心肌、骨骼肌能力最强。在02供充足时,脂肪酸可经脂肪酸活化、转移至线粒体、B-氧化((3-oxidation)生成乙酰CoA及乙酰CoA进入三狻酸循环彻底氧化4个阶段,释放大量ATP。 1.脂肪酸活化为脂酰CoA脂肪酸被氧化前必须先活化,由内质网、线粒体外膜上的脂酰CoA合成酶(acyl-CoA synthetase)催化生成脂酰CoA,需ATP、CoA-SH及M忙参与。 脂酰CoA合成酶脂肪酸+CoA-SH飞2~、-脂酰CoA+PP, 脂酰CoA含高能硫酷键,不仅可提高反应活性,还可增加脂肪酸的水溶性,因而提高脂肪酸代谢活性。活化反应生成的焦磷酸(PPi)立即被细胞内焦磷酸酶水解,可阻止逆向反应进行,故l分子脂肪酸活化实际上消耗2个高能磷酸键。 2.脂酰CoA进入线粒体催化脂肪酸氧化的酶系存在于线粒体基质,活化的脂酰CoA必须进入线粒体才能被氧化。长链脂酰CoA不能直接透过线粒体内膜,需要肉碱(cru·nitine,或称L-~胫--y三甲氨基丁酸)协助转运。存在于线粒体外膜的肉碱脂酰转移酶I(cru·nitin e acyl transfera se I)催化长链脂酰CoA与肉碱合成脂酰肉碱(acyl carni tine),后者在线粒体内膜肉碱-脂酰肉碱转位酶(carnitine-acylcarni tin e translocase)作用下,通过内膜进入线粒体基质,同时将等分子肉碱转运出线粒体。进入线粒体的脂酰肉碱,在线粒体内膜内侧肉碱脂酰转移酶II作用下,转变为脂酰CoA并释出肉碱(图7-2)。 脂酰CoA进入线粒体是脂肪酸B-氧化的限速步骤,肉碱脂酰转移酶I是脂肪酸B-氧化的关键ATP AMP+PP;酶。当饥饿、高脂低糖膳食或糖尿病时,机体没有充足的FFA C沁糖供应,或不能有效利用糖,需脂肪酸供能,肉碱脂酰转移酶I活性增加,脂肪酸氧化增强。相反,饱食后脂肪酸线粒体外膜合成加强,丙二酸单酰CoA含量增加,抑制肉碱脂酰转移酶I活性,使脂肪酸的氧化被抑制。 3.脂酰CoA分解产生乙酰CoA、FAD比和CoA NADH线粒体基质中存在由多个酶结合在一起形成的肉碱脂酰肉碱脂肪酸B-氧化酶系,在该酶系多个酶顺序催化下,从脂酰基B-碳原子开始,进行脱氢、加水、再脱氢及硫解四步反应(图7-3),完成一次B-氧化。 经过上述四步反应,脂酰CoA的碳链被缩短2个碳原子。脱氢、加水、再脱氢及硫解反复进行,最终完成脂肪酸B-氧化。生成的FADH2、NADH经呼吸链氧化,与ADP磷酸化偶联,产生ATP。生成的乙酰CoA主要在线粒体通过三狻酸循环彻底氧化;在肝,部分乙酰CoA转变成酮体,通过血液运送至肝外组织氧化利用。 4.脂肪酸氧化是机体ATP的重要来源脂肪酸彻底氧化生成大量ATP。以软脂肪酸为例,1分子软脂酸彻底氧化需进行7次B-氧化,生成7分子FADH2、7分子NADH及8分子乙酰CoA。在pH7.0,25°C的标准条件下氧化磷酸化,每分子FADH2产生1.5分子ATP,每分子NADH产生2.5分子ATP;每分子乙酰CoA经三狻酸循环彻底氧化产生10分子ATP。因此1分子软脂酸彻底氧化共生成(7X1.5)+(7X2.5)+(8X10)=108分子ATP。因为脂肪酸活化消耗2个高能磷酸键,相当于2分子ATP,所以1分子软脂肪酸彻底氧化净生成106分子ATP。 (四)不同的脂肪酸还有不同的氧化方式 1.不饱和脂肪酸6-氧化需转变构型不饱和脂肪酸也在线粒体进行B-氧化。不同的是,饱和脂肪酸B-氧化产生的烯脂酰CoA是反式A2烯脂酰CoA,而天然不饱和脂肪酸中的双键为顺式。因双键位置不同,不饱和脂肪酸B-氧化产生的顺式A3烯脂酰CoA或顺式A2烯脂酰CoA不能继续B-氧化。顺式A3烯脂酰CoA在线粒体特异A订顶-+A2反烯脂酰CoA异构酶(A3-cis--+A2-trans enoyl-CoA isomerase)催化下转变为B-氧化酶系能识别的A2反式构型,继续B-氧化。顺式A2烯脂酰CoA虽然也能水化,但形成的D(-)-~轻脂酰CoA不能被线粒体B-氧化酶系识别。在D(-)-B-胫脂酰CoA表异构酶(epimerase,又称差向异构酶)催化下,右旋异构体[D(-)型]转变为B氧化酶系能识别的左旋异构体[L(+)型],继续B氧化。 2超长碳链脂肪酸需先在过氧化酶体氧化成较短碳链脂肪酸过氧化酶体(peroxisomes)存在\.“f礼。 @脱氢 烯水 eH纽虹 @加水 @再脱氢 p-酮脂酰CoA RC oc @硫解 p-酮脂酰CoA r 硫解酶 脂酰CoA RC-SCoA +CH3CO-SCoA乙酰CoA 脂肪酸的B-氧化 脂肪酸仕氧化的同工酶系,能将超长碳链脂肪酸(如C2O、丘)氧化成较短碳链脂肪酸。氧化第一步反应在以FAD为辅基的脂肪酸氧化酶作用下脱氢,脱下的氢与02结合成H202,而不是进行氧化磷酸化;进一步反应释出较短链脂肪酸,在线粒体内B-氧化。 Q-氧化酶系由狻化酶、脱氢酶、NADP+,NA矿及细胞色素P450(cytochrome P450, cyt P450)等组成。脂肪酸o-甲基碳原子在脂肪酸Q-氧化酶系作用下,经研笋圣基脂肪酸、Q-醋基脂肪酸等中间产物,形成a,w-二狻酸。这样,脂肪酸就能从任一端活化并进行B-氧化。 (五)脂肪酸在肝分解可产生酮体脂肪酸在肝内B氧化产生的大量乙酰CoA,部分被转变成酮体(ketone bodies),向肝外输出卤。酮体包括乙酰乙酸(acetoacetate)(30%)、B-轻丁酸(!3-hydroxy-butyrate)(70%)和丙酮(acetone)(微"3-量)。 1.酮体在肝生成酮体生成以脂肪酸B-氧化生成的乙酰CoA为原料,在肝线粒体由酮体合成酶系催化完成(图7-4)。 (1)2分子乙酰C oA缩合成乙酰乙酰CoA:由乙酰乙酰CoA硫解酶(thiolase)催化,释放1分子CoASH。 (2)乙酰乙酰C oA与乙酰CoA缩合成胫基甲基戊二酸单酰CoA(3-hydroxy-3-methylglutai-yl CoA, HMG-CoA):由HMG-CoA合酶(HMG-CoA synthase)催化,生成HMG-CoA,释放出1分子CoASH。 2酮体在肝外组织氧化利用肝组织有活性较强的酮体合成酶系,但缺乏利用酮体的酶系。肝外许多组织具有活性很强的酮体利用酶,能将酮体重新裂解成乙酰CoA,通过三狻酸循环彻底氧化。所以肝内生成的酮体需经血液运输至肝外组织氧化利用。 (1)乙酰乙酸的利用需先活化:有两条途径。在心、一一一一一一一一一一一一一一一一一一一一一一一一一一一一一一一一,'----------------------丙酮, : l 肾、脑及骨骼肌线粒体,由唬珀酰CoA转硫酶(succinyl CoA thiophorase)催化生成乙酰乙酰CoA。 I+1骈珀酰CoA转硫酶 乙酰乙酸眺珀酰CoA 础11严芦 眺珀酸 在肾、心和脑线粒体,由乙酰乙酸硫激酶(acetoacetate thiok inase)催化,直接活化生成乙酰乙酰CoA。 (2)乙酰乙酰CoA硫解生成乙酰CoA:由乙酰乙酰CoA硫解酶(acetoacet yl CoA thiolase)催化。 乙酰乙酰CoA硫解酶 B轻基丁酸的利用是先在B轻丁酸脱氢酶催化下,脱氢生成乙酰乙酸,再转变成乙酰CoA被氧化。正常情况下,丙酮生成量很少,可经肺呼出。 3酮体是肝向肝外组织输出能量的重要形式酮体分子小,溶于水,能在血液中运输,还能通过血脑屏障、肌组织的毛细血管壁,很容易被运输到肝外组织利用。心肌和肾皮质利用酮体能力大千利用葡萄糖能力。脑组织虽然不能氧化分解脂肪酸,却能有效利用酮体。当葡萄糖供应充足时,脑组织优先利用葡萄糖氧化供能;但在葡萄糖供应不足或利用障碍时,酮体是脑组织的主要能源物质。 正常情况下,血中仅含少量酮体,为0.03~0. Smmol/L(O.3~Smg/dl)。在饥饿或糖尿病时,由于脂肪动员加强,酮体生成增加。严重糖尿病病人血中酮体含量可高出正常人数十倍,导致酮症酸中毒咄91}(ketoacidosis)。血酮体超过肾阙值,便可随尿排出,引起酮尿(ketonuria)。此时,血丙酮含量也大大增加,通过呼吸道排出,产生特殊的"烂苹果气味”。4.酮体生成受多种因素调节(1)餐食状态影响酮体生成:饱食后胰岛素分泌增加,脂解作用受抑制、脂肪动员减少,酮体生成减少。饥饿时,胰高血糖素等脂解激素分泌增多,脂肪动员加强,脂肪酸B-氧化及酮体生成增多。 (2)糖代谢影响酮体生成:餐后或糖供给充分时,糖分解代谢旺盛、供能充分,肝内脂肪酸氧化分解减少,酮体生成被抑制。相反,饥饿或糖利用障碍时,脂肪酸氧化分解增强,生成乙酰CoA增加;同时因糖来源不足或糖代谢障碍,草酰乙酸减少,乙酰CoA进入三狻酸循环受阻,导致乙酰CoA大量堆积,酮体生成增多。 (3)丙二酸单酰CoA抑制酮体生成:糖代谢旺盛时,乙酰CoA及拧檬酸增多,别构激活乙酰CoA狻化酶,促进丙二酸单酰CoA合成,后者竞争性抑制肉碱脂酰转移酶I,阻止脂酰CoA进入线粒体进行B氧化,从而抑制酮体生成。 二、不同来源脂肪酸在不同器官以不同的途径合成甘油三酷(—)肝、脂肪组织及小肠是甘油三酷合成的主要场所甘油三酷(triglyceride, TG)合成在细胞质中完成,以肝合成能力最强。但肝细胞不能储存甘油三酷,需与载脂蛋白B100、C等载脂蛋白及磷脂、胆固醇组装成极低密度脂蛋白(very low density lipoproLein,VLDL),分泌入血运输至肝外组织3。营养不良、中毒,以及必需脂肪酸(essential fatty acid汃胆碱或蛋白质缺乏等可引起肝细胞VLDL生成障碍,导致甘油三酷在肝细胞蓄积,发生脂肪肝3。脂肪细胞可大佩储存甘油三酷,是机体储存甘油三酷的"脂库”包。 (二)甘泊和脂肪酸是合成甘油三酷的基本原料 机体能分解葡萄糖产生3-磷酸甘油,也能利用葡萄糖分解代谢中间产物乙酰CoA(acetyl CoA)合成脂肪酸,入和动物即使完全不摄取,亦可由糖转化合成大量甘油三酷。小肠黏膜细胞主要利用摄取的甘油三酷消化产物重新合成甘油三酣,当其以乳糜微粒形式运送至脂肪组织、肝等组织/器官后,脂肪酸亦可作为这些组织细胞合成甘油三酷的原料。脂肪组织还可水解极低密度脂蛋白甘油三酷,释放脂肪酸用于合成甘油三酷。 (三)甘油三酷合成有甘油—酷和甘油二酷两条途径1脂肪酸活化成脂酰CoA脂肪酸作为甘油三酷合成的基本原料,必须活化成脂酰CoA(acyl CoA)才能参与甘油三酣合成。 脂酰CoA合成酶脂肪酸+CoA-SH~+\\-脂酰CoA+PP; 2小肠黏膜细胞以甘油一酷途径合成甘油三酷由脂酰CoA转移酶催化、ATP供能,将脂酰CoA的脂酰基转移至2-甘油一酷胫基上合成甘油三酷。3肝和脂肪组织细胞以甘油二酷途径合成甘油三酷以葡萄糖酵解途径生成的3-磷酸甘油为起始物,先合成1,2-甘油二酷,最后通过酣化甘油二酷轻基生成甘油三酣。 |脂酰CoA转移酶I葡萄糖►HO-CH HO—CH |I CH2—0-@R1COCoA CoA CH心一也 3-磷酸甘油1-脂酰-3-磷酸甘油 0CH20CR111I磷脂酸磷酸酶脂酰CoA转移酶R2COCH 磷脂酸 II I『脂酰CoA转移酶11I f 1,2-甘油二酷甘油三酣 合成甘油三酷的三分子脂肪酸可为同一种脂肪酸,也可是3种不同脂肪酸。肝、肾等组织含有甘油激酶,可催化游离甘油磷酸化生成3-磷酸甘油,供甘油三酷合成。脂肪细胞缺乏甘油激酶因而不能直接利用甘油合成甘油三酷。 CH20H肝、肾甘油激酶CH20H|/|HO—C—H ATP ADP HO-C—H内源性脂肪酸的合成需先合成软脂酸(一)软脂酸由乙酰CoA在脂肪酸合酶复合体催化下合成1软脂酸在细胞质中合成脂肪酸合成由多个酶催化完成,这些酶组成了脂肪酸合成的酶体系,即脂肪酸合酶复合体(fatty acid synthase complex),存在于肝、背脑、肺、乳腺及脂肪等多种组织的细胞质,肝的脂肪酸合酶复合体活性最高(合成能力较脂肪组织大8~9倍),是人体合成脂肪酸的主要场所。虽然脂肪组织能以葡萄糖代谢的中间产物为原料合成脂肪酸,但脂肪组织的脂肪酸来源主要是小肠消化吸收的外源性脂肪酸和肝合成的内源性脂肪酸。 2.乙酰CoA是软脂酸合成的基本原料用于软脂酸(pal miti c acid)合成的乙酰CoA(acety l CoA)主要由葡萄糖分解供给,在线粒体内产生,不能自由透过线粒体内膜,需通过拧檬酸-丙酮酸循环(c山ate pyruvate cycle)(图7-5)进入细胞质。在此循环中,乙酰CoA首先在线粒体内拧檬酸合酶催化下,与草酰乙酸缩合生成拧檬酸;后者通过线粒体内膜载体转运进入细胞质,被ATP-拧檬酸裂解酶裂解,重新生成乙酰CoA及草酰乙酸。进入细胞质的草酰乙酸在苹果酸脱氢酶作用下,由NADH供氢,还原成苹果酸,再经线粒体内膜载体转运至线粒体内。苹果酸也可在苹果酸酶作用下氧化脱狻、产生CO2和丙酮酸,脱下的氢将NADP十还原成NADPH;丙酮酸可通过线粒体内膜上载体转运至线粒体内,重新生成线粒体内草酰乙酸,可继续与乙酰CoA缩合,将乙酰CoA运转至细胞质,用于软脂酸合成。 软脂酸合成还需ATP、NADPH、HC03-c CO2)及M n2+等原料。NADPH主要来自磷酸戊糖途径(pentose phosphate pathway),在上述乙酰CoA转运过程中,细胞质苹果酸酶催化苹果酸氧化脱狻也可提供少量NADPH。 3一分子软脂酸由1分子乙酰CoA与7分子丙二酸单酰CoA缩合而成(1)乙酰CoA转化成丙二酸单酰CoA:这是软脂酸合成的第一步反应,催化此反应的乙酰CoA狻化酶(acetyl CoA carboxylase)是脂肪酸合成的关键酶,以Mn”为激活剂,含生物素辅基,起转移狻基作154第二篇物质代谢及其调节乙酰CoA草酰乙酸没草酰乙酸乙酰CoA图7-5拧檬酸丙酮酸循环乙酰CoA首先在线粒体内与草酰乙酸缩合生成拧檬酸,通过线粒体内膜上的载体转运进入细胞质;细胞质中ATP拧檬酸裂解酶使拧檬酸裂解释出乙酰CoA及草酰乙酸。进入细胞质的乙酰CoA可用以合成脂肪酸,而草酰乙酸则在苹果酸脱氢酶的作用下,还原成苹果酸。苹果酸也可在苹果酸酶的作用下分解为丙酮酸,再转运入线粒体,最终均形成线粒体内的草酰乙酸,再参与转运乙酰CoA用。该狻化反应为不可逆反应,过程如下:酶生物素+HCO厂+ATP-酶生物素CO2+ADP+Pi酶生物素CO2+乙酰CoA-酶生物素+丙二酸单酰CoA总反应:ATP+HC03-+乙酰CoA---+丙二酸单酰CoA+ADP+Pi乙酰CoA狻化酶活性受别构调节及化学修饰调节。该酶有两种存在形式,即无活性原聚体和有活性多聚体。拧檬酸、异拧檬酸可使此酶发生别构激活——由原聚体聚合成多聚体;软脂酰CoA及其他长链脂酰CoA可使多聚体解聚成原聚体,别构抑制该酶活性。乙酰CoA狻化酶还可在一种AMP激活的蛋白激酶(AMP-activated protein kinase, AMPK)催化下发生酶蛋白(79、1200及1215位丝氨酸残基)磷酸化而失活。胰高血糖素能激活该蛋白激酶,抑制乙酰C oA狻化酶活性;胰岛素能通过蛋白磷酸酶的去磷酸化作用,使磷酸化的乙酰CoA狻化酶脱磷酸恢复活性。高糖膳食可促进乙酰CoA狻化酶蛋白合成,增加酶活性。 (2)软脂酸经7次缩合-还原-脱水-再还原基本反应循环合成:各种脂肪酸生物合成过程基本相似,均以丙二酸单酰CoA为基本原料,从乙酰CoA开始,经反复加成反应完成,每次(缩合-还原-脱水再还原)循环延长2个碳原子。16碳软脂酸合成需经7次循环反应。 大肠杆菌脂肪酸合酶复合体的核心由7种独立的酶/多肤组成;这7种多肤包括酰基载体蛋白(acy l carrier protein, ACP)、乙酰CoA-ACP转酰基酶(acetyl-CoA-ACP transacy lase, AT;以下简称乙酰基转移酶)、B-酮脂酰-ACP合酶(!3-ke toacy l-ACP synthase, KS;13-酮脂酰合酶)、丙二酸单酰CoA-ACP转酰基酶(malonyl-CoA-ACP transacylase, MT;丙二酸单酰转移酶)、B-酮脂酰-ACP还原酶(!3-ketoacylACP reductase, KR;13-酮脂酰还原酶)、B轻脂酰-ACP脱水酶(!3-hydroxyacyl-ACP dehydra tase, HD;脱水酶)及烯脂酰-ACP还原酶(enoyl-ACP reductase, ER;烯脂酰还原酶)。细菌酰基载体蛋白是一种小分子蛋白质,以4'-磷酸泛酰硫基乙胺(4'-phosphopantotheine)为辅基,是脂酰基载体。此外,细菌脂肪酸合酶体系还有至少另外3种成分。 哺乳动物脂肪酸合酶是由两个相同亚基(M『,240kD)首尾相连形成的二聚体(M,,480kD)包。每个亚基含有3个结构域(domain)。结构域1含有乙酰基转移酶(AT汃丙二酸单酰转移酶(MT)及B酮脂酰合酶(KS),与底物的”进入"、缩合反应相关。结构域2含有B-酮脂酰还原酶(KR)、B-轻脂酰脱水酶(HD)及烯脂酰还原酶(ER),催化还原反应;该结构域还含有一个肤段-~酰基载体蛋白(ACP)。结构域3含有硫酷酶(thioes terase, TE),与脂肪酸的释放有关。3个结构域之间由柔性的区域连接,使结构域可以移动,利千几个酶之间的协调、连续作用。 细菌、动物脂肪酸合成过程类似。细菌软脂酸合成步骤(图7-6)包括:O乙酰CoA在乙酰转移酶作用下被转移至ACP的琉基(—SH),再从ACP转移至B-酮脂酰合酶的半胱氨酸琉基上。@丙二酸单酰CoA在丙二酸单酰转移酶作用下,先脱去HSCoA,再与ACP的—SH缩合、连接。@缩合:B-酮脂忑-半胱一SH cn由<艺)转移至CD1乙酰转移酶I C-泛—SH伞-半胱一S—『C-CH3(C2或Cn)霆-泛一S一 上 。 -CH2COOH。-酮脂酰酶(乙酰乙酸酶) NADPH+:A二二勹」[p-酮脂酰还原酶 @)加氢 忑-半胱一SH 佥-泛—s—C-CH2CH—CH3 NADPH产生机制@脱水 压一了」三 磷酸戊糖途径苹果酸酶异拧檬酸脱氢酶心-半胱一SH。 心-泛一S-C II—CH=CH-CH3(l,p-烯脂酰酶 NADPH+H勹)[(l,o-烯脂酰还原酶 @加氢NADP•◄ 1硫酣酶1比0心-半胱一SH。 软脂酸连续O~@步骤丁酰-E II7次循环后心-泛—S-C—CH2—CH2-CH3图7-6软脂酸的生物合成经过第一轮反应,即酰基转移、缩合、还原、脱水、再还原等步骤,碳原子由2个增加至4个,形成脂肪酸合酶催化合成的第一轮产物丁酰-E。此时,丁酰连接在酶的ACP琉基(E2-泛SH)上,随后被转移至B-酮脂酰合酶的半胱氨酸琉基(E,-半胱-SH),ACP琉基(E2-泛-SH)继续接受丙二酰基,进行缩合、还原、脱水、再还原等步骤的第二轮反应。经过7次循环之后,生成16个碳原子的软脂酰-E2,然后经硫酷酶的水解,即生成终产物游离的软脂酸花岔酰合酶上连接的乙酰基与ACP上的丙二酸单酰基缩合、生成B-酮丁酰ACP,释放C020@加氢:由NADPH供氢,B-酮丁酰ACP在B-酮脂酰还原酶作用下加氢、还原成D-(-)-仕轻丁酰ACP。@脱水:D-(-)-r,轻丁酰ACP在脱水酶作用下,脱水生成反式A2烯丁酰ACP。@再加氢:NADPH供氢,反式A谨丁酰ACP在烯酰还原酶作用下,再加氢生成丁酰ACP。 丁酰-ACP是脂肪酸合酶复合体催化合成的第一轮产物。通过这一轮反应,即酰基转移、缩合、还原、脱水、再还原等步骤,产物碳原子由2个增加至4个。然后,丁酰由E l-泛-SH(即ACP的-SH)转移至E2-半胱-SH,EI-泛-SH又可与另一丙二酸单酰基结合,进行缩合、还原、脱水、再还原等步骤的第二轮循环。经7次循环后,生成16碳软脂酰-E2;由硫酣酶水解,软脂酸从脂肪酸合酶复合体释放。软脂酸合成的总反应式为:CH3COSCoA+7HOOCCH2COSC0A CH3(CH2)14COOH+14NADPH+14H+-+7C02+6H20+8HSCoA+14NADP+(二)软脂酸延长在内质网和线粒体内进行脂肪酸合酶复合体催化合成软脂酸,更长碳链脂肪酸的合成通过对软脂酸加工、延长完成。 1.内质网脂肪酸延长途径以丙二酸单酰CoA为二碳单位供体该途径由脂肪酸延长酶体系催化,NADPH供氢,每通过缩合、加氢、脱水及再加氢等反应延长2个碳原子。过程与软脂酸合成相似,但脂酰基不是以ACP为载体,而是连接在CoASH上进行。该酶体系可将脂肪酸延长至24碳,但以18碳硬脂酸为主。 2线粒体脂肪酸延长途径以乙酰CoA为二碳单位供体该途径在脂肪酸延长酶体系作用下,软脂酰CoA与乙酰CoA缩合,生成B-酮硬脂酰CoA;再由NADPH供氢,还原为B-胫硬脂酰CoA;接着脱水生成a,B-烯硬脂酰CoA。最后,烯硬脂酰CoA由NADPH供氢,还原为硬脂酰CoA。通过缩合、加氢、脱水和再加氢等反应,每轮循环延长2个碳原子;一般可延长至24或26个碳原子,但仍以18碳硬脂酸为最多。 (三)不饱和脂肪酸的合成需多种去饱和酶催化 上述脂肪酸合成途径合成的均为饱和脂肪酸(satura ted fatty acid),人体含不饱和脂肪酸(unsaturated fatty acid),主要有软油酸(16:l, D..9)、油酸(18:l,D..9)、亚油酸(18=2,D..9'12),a-亚麻酸(18:3,D,.9.12.15)及花生四烯酸(20:4, D..5,8,11,14)等。由于只含A4,A5,A8及A9去饱和酶(desaturase),缺乏A9以上去饱和酶,人体只能合成软油酸和油酸等单不饱和脂肪酸(monoun saturated fatty acids),不能合成亚油酸、a-亚麻酸及花生四烯酸等多不饱和脂肪酸(polyunsaturated fatty acid)尽。植物因含有D,.9'D,_12及D,_15去饱和酶,能合成A9以上多不饱和脂肪酸。人体所需多不饱和脂肪酸必须从食物(主要是植物油脂)中摄取。 (四)脂肪酸合成受代谢物和激素调节 1.代谢物通过改变原料供应量和乙酰CoA狻化酶活性调节脂肪酸合成ATP、NADPH及乙酰CoA是脂肪酸合成原料,可促进脂肪酸合成;脂酰CoA是乙酰CoA狻化酶的别构抑制剂,抑制脂肪酸合成。凡能引起这些代谢物水平有效改变的因素均可调节脂肪酸合成。例如,高脂膳食和脂肪动员可使细胞内脂酰CoA增多,别构抑制乙酰CoA狻化酶活性,抑制脂肪酸合成。进食糖类食物后,糖代谢加强,NADPH、乙酰CoA供应增多,有利于脂肪酸合成;糖代谢加强还使细胞内ATP增多,抑制异拧檬酸脱氢酶,导致拧檬酸和异拧檬酸蓄积并从线粒体渗至细胞质,别构激活乙酰CoA狻化酶,促进脂肪酸合成。 2.胰岛素是调节脂肪酸合成的主要激素胰岛素(insulin)可通过刺激一种蛋白磷酸酶活性,使乙酰CoA狻化酶脱磷酸而激活,促进脂肪酸合成。此外,胰岛素可促进脂肪酸合成磷脂酸,增加脂肪合成。胰岛素还能增加脂肪组织脂蛋白脂肪酶活性,增加脂肪组织对血液甘油三酣脂肪酸摄取,促使脂肪组织合成脂肪贮存。该过程长期持续,与脂肪动员之间失去平衡,会导致肥胖3。 胰高血糖素(glucagon)能增加蛋白激酶活性,使乙酰CoA狻化酶磷酸化而降低活性,抑制脂肪酸合成。胰高血糖素也能抑制甘油三酷合成,甚至减少肝细胞向血液释放脂肪。肾上腺素、生长素能抑制乙酰CoA狻化酶,调节脂肪酸合成。 3脂肪酸合酶可作为药物治疗的靶点脂肪酸合酶(复合体组分)在很多肿瘤高表达(overexpression)。动物研究证明,脂肪酸合酶抑制剂可明显减缓肿瘤生长,减轻体重,是极有潜力的抗肿瘤和抗肥胖的候选药物。 第四节磷脂代谢一、磷脂酸是甘油磷脂合成的重要中间产物(—)甘油磷脂合成的原料来自糖、脂和氨基酸代谢人体各组织细胞内质网均含有甘油磷脂合成酶系,以肝、肾及肠等活性最高。甘油磷脂合成的基本原料包括甘油、脂肪酸、磷酸盐、胆碱(choline)、丝氨酸(serine汃肌醇(inositol)等。甘油和脂肪酸主要由葡萄糖转化而来,甘油2位的多不饱和脂肪酸为必需脂肪酸(essential fatty acid),只能从食物(植物油)摄取。胆碱可由食物供给,亦可由丝氨酸及甲硫氨酸合成。丝氨酸是合成磷脂酰丝氨酸的原料,脱狻后生成乙醇胺又是合成磷脂酰乙醇胺的原料。乙醇胺从S-腺背甲硫氨酸获得3个甲基生成胆碱。甘油磷脂合成还需ATP、CTP。ATP供能,CTP参与乙醇胺、胆碱、甘油二酣活化,形成CDP-乙醇胺、CDP-胆碱、CDP-甘油二酷等活化中间物。 HOCH卉~COOH飞~HOCH2CH2NH23S-腺昔甲硫氨酸刁HOCH2CH2N'(CH3h NH2 丝氨酸乙醇胺胆碱 严TDPP霖尸 磷酸乙醇胺磷酸胆碱 气阜厂气阜Tlp CDP-乙醇胺CDP-胆碱 。上。 O ot)。1二 CDP-胆碱CDP-甘油二酣 158第二篇物质代谢及其调节 (二)甘油磷脂合成有两条途径 1磷脂酰胆碱和磷脂酰乙醇胺通过甘油二酷途径合成甘油二酷是该途径的重要中间物,胆碱(choline)和乙醇胺(ethanolamine)被活化成CDP-胆碱(CDP-choline)和CDP-乙醇胺(CDPethanolamine)后,分别与甘油二酷缩合,生成磷脂酰胆碱(phosphatidylcholine, PC)和磷脂酰乙醇胺(phosphat idylethanolamin e, PE)。这两类磷脂占组织及血液磷脂75%以上。 葡萄糖 3-磷酸}甘油 转酰酶臣。CAOCoA 磷脂酸 磷酸酶卜 1,2-甘油二酷 转移酶 ,言pp气已面巨?CoA 磷脂酰乙醇胺磷脂酰胆碱甘油三酣(脑磷脂)(卵磷脂) 磷脂酰乙醇胺 磷脂酰胆碱 PC是真核生物细胞膜含量最丰富的磷脂,在细胞增殖和分化过程中具有重要作用,对维持正常细胞周期具有重要意义。一些疾病如癌(cancer)、阿尔茨海默病(Alzheimer disease)和脑卒中(stroke)等的发生与PC代谢异常密切相关。国内外科学家们正在努力探讨PC代谢在细胞增殖、分化和细胞周期中,在如癌、阿尔茨海默病和脑卒中等疾病发生中的作用及其机制。一旦取得突破,将为相关疾病的预防、诊断和治疗提供新靶点。 尽管PC也可由S-腺昔甲硫氨酸提供甲基,使PE甲基化生成,但这种方式合成量仅占人PC合成总量10%-15%。哺乳动物细胞PC的合成主要通过甘油二酣途径完成。该途径中,胆碱需先活化成CDP-胆碱,所以也被称为CDP-胆碱途径(CDP-choline pathway), CTP:磷酸胆碱胞昔转移酶(CTP:phosphocholin e cytidylyltran sferase, CCT)是关键酶,它催化磷酸胆碱(phosphocholine)与CTP缩合成CDP-胆碱。后者向甘油二酷提供磷酸胆碱,合成PC。 人CCT有a和B两种亚型,分别由PCYTla和PCYTlb编码。CCTl3又有但和B2两种剪接变异体。CCTcx、阳和缸分别由367、330和372个氨基酸残基组成,含4个结构域,氨基酸残基73-323是高度同源序列,B剪接变异体之间的差异仅在323位氨基酸残基之后的C末端(图7-7)。氨基酸残基l~72为N-端结构域,CCTa在该结构域中含有一个核靶向作用区。氨基酸残基73~235为催化结构域,其中HXGH和RTEGISTS两个CTP结合模体(motif)是胞昔转移酶家族的特征序列,能与CTP结合;两个CTP结合基序之间的赖氨酸残基高度保守,能结合磷酸胆碱。氨基酸残基236-299称为膜结合结构域(membrane-binding domain)或结构域M(do main M),为双性a-螺旋(amphipathic a helix)结构区,能与中性脂质和阴离子脂质结合。C末端是磷酸化结构域(phosphorylation domain),也称结构域P(domain P),含多个丝氨酸残基,能够被磷酸化。 核靶向作用区催化结构域结构域M结构域P 卜嘈幡t惶H',比外732361,300I367I CCTa i西岫虾沾谥衄13]3CCT~1 l f诣伈七盲水孔,I]CCT~2 图7-7CTP:磷酸胆碱胞苦转移酶(CCT)氨基酸序列结构示意图CCT活性通过游离形式与膜结合形式之间的转换进行调节。游离形式CCT无活性,当其与膜(包括内质网膜和核膜)结合后,转变为有活性。CCT通过膜结合结构域感应膜双分子层的弯曲弹性张力(CUiv'ature elastic s tress),使游离酶蛋白与膜结合或使膜结合酶蛋白解离,从而调节酶活性。PC含量是膜双分子层弯曲弹性张力的主要决定因素之一,PC缺乏的膜,能促进CCT与其结合,使CCT转变为活性形式,促进PC合成。CCT活性还受转录水平调节。CCTa活性的调节主要与细胞增殖、分化和细胞周期有关。 磷脂酰丝氨酸也可由磷脂酰乙醇胺狻化或乙醇胺与丝氨酸交换生成。 2.肌醇磷脂、丝氨酸磷脂及心磷脂通过CDP-甘油二酷途径合成肌醇、丝氨酸无需活化,CDP甘油二酷是该途径重要中间物,与丝氨酸、肌醇或磷脂酰甘油缩合,生成肌醇磷脂(phosphatidyl inositol)、丝氨酸磷脂(phosphatidyl serine)及心磷脂(cardiolipin)。 葡萄糖 3磷酸甘油 转酰酶k2RCOCoA 磷脂酸 胞昔酰转移酶[CTP CDP-甘油二酣 合成酶 肌醇丝氨酸磷脂酰甘油 磷脂酰肌醇磷脂酰丝氨酸二磷脂酰甘油 160第二篇物质代谢及其调节 。一心 二磷脂酰甘油 心一一~ 磷脂酰肌醇 磷脂酰丝氨酸 甘油磷脂合成在内质网膜外侧面进行。细胞质存在一类促进磷脂在细胞内膜之间交换的蛋白质,称磷脂交换蛋白(phospholipid exchange protein),催化不同种类磷脂在膜之间交换,使新合成的磷脂转移至不同细胞器膜上,更新膜磷脂。例如在内质网合成的心磷脂可通过这种方式转至线粒体内膜,构成线粒体内膜特征性磷脂。 Il型肺泡上皮细胞可合成由2分子软脂酸构成的特殊磷脂酰胆碱,生成的二软脂酰胆碱是较强乳化剂,能降低肺泡表面张力,有利于肺泡伸张。新生儿肺泡上皮细胞合成二软脂酰胆碱障碍,会引起肺不张。 二、甘油磷脂由磷脂酶催化降解 生物体内存在多种降解甘油磷脂的磷脂酶(phospholipase),包括磷脂酶Ai、A2、B1、队、C及D,它们分别作用于甘油磷脂分子中不同的酷键(图7-8),降解甘油磷脂。溶血磷脂1具较强表面活性,能使红细胞膜或其他细胞膜破坏引起溶血或细胞坏死。溶血磷脂还可进一步水解,如溶血磷脂1在溶血磷脂酶1(即磷脂酶Bl)作用下,水解与甘油1位—OH缩合的酷键,生成不含脂肪酸的甘油磷酸胆碱,溶血磷脂就失去对细胞膜结构的溶解作用。 三、鞘磷脂是神经鞘磷脂合成的重要中间产物 神经鞘磷脂(sphingomyelin)是入体含量最多的鞘磷脂,由鞘氨醇、脂肪酸及磷酸胆碱构成。人体各组织细胞内质网均存在合成鞘氨醇酶系,以脑组织活性最高。合成鞘氨醇的基本原料是软脂酰CoA、丝氨酸和胆碱,还需磷酸咄哆酸、NADPH及FAD等辅酶参加。在磷酸咄哆酘参与下,由内质网3-酮基二氢鞘氨醇合成酶催化,软脂酰CoA与L-丝氨酸缩合并脱狻生成3-酮基二氢鞘氨醇(3-ketodi一hydrosphingosine),再由NADPH供氢、还原酶催化,加氢生成二氢鞘氨醇,然后在脱氢酶催化下,脱氢生成鞘氨醇。 R2-CII-O-CH肛11才脂磷脂酸R2-C-0-CH O CH2-0-P-OH X-0—厂。气卢°f比一0—工°_二三OH|心II R2-C-II O—CH O甘油忙脂 R2—[_。』HH2OH厂:[/了:心月甘广飞比一0-` 在脂酰转移酶催化下,鞘氨醇的氨基与脂酰CoA进行酰胺缩合,生成N-脂酰鞘氨醇,最后由CDP胆碱提供磷酸胆碱生成神经鞘磷脂。 神经鞘磷脂 四、神经鞘磷脂由神经鞘磷脂酶催化降解 神经鞘磷脂酶(sphingomyelinase)存在于脑、肝、脾、肾等组织细胞溶酶体,属磷脂酶C类,能使磷酸酷键水解,产生磷酸胆碱及N-脂酰鞘氨醇。如先天性缺乏此酶,则鞘磷脂不能降解,在细胞内积存,引起肝脾大及痴呆等鞘磷脂沉积病状。 第五节胆固醇代谢一、体内胆固醇来自食物和内源性合成胆固醇有游离胆固醇(free cholesterol, FC;亦称非酷化胆固醇,unesterified cholesterol)和胆固醇酷(c holesterol ester, CE)两种形式,广泛分布于各组织,约1/4分布在脑及神经组织,约占脑组织2%。肾上腺、卵巢等类固醇激素分泌腺,胆固醇含量达1%~5%。肝、肾、肠等内脏及皮肤、脂肪组织,胆固醇含量约为每100g组织200-500mg,以肝最多。肌组织含量约为每100g组织l00~200mg。 162第二篇物质代谢及其调节(一)体内胆固醇合成的主要场所是肝除成年动物脑组织及成熟红细胞外,几乎全身各组织均可合成胆固醇,每天合成量为lg左右。肝是主要合成器官,占自身合成胆固醇的70%-80%,其次是小肠,合成10%。胆固醇合成酶系存在于细胞质及光面内质网膜。 (二)乙酰CoA和NADPH是胆固醇合成基本原料 14c及13c标记乙酸甲基碳及狻基碳,与肝切片孵育证明:乙酸分子中的2个碳原子均参与构成胆固醇,是合成胆固醇唯一碳源。乙酰CoA是葡萄糖、氨基酸及脂肪酸在线粒体的分解产物,不能通过线粒体内膜,需在线粒体内与草酰乙酸缩合生成拧檬酸,通过线粒体内膜载体进入细胞质,裂解成乙酰CoA,作为胆固醇合成原料。每转运1分子乙酰CoA,由拧檬酸裂解成乙酰CoA时消耗l分子ATP。胆固醇合成还需NADPH供氢、ATP供能。合成1分子胆固醇需18分子乙酰CoA、36分子ATP及16分子NADPH。 (三)胆固醇合成由以HMG-CoA还原酶为关键酶的一系列酶促反应完成胆固醇合成过程复杂,有近30步酶促反应,大致可划分为三个阶段。 1由乙酰CoA合成甲轻戊酸2分子乙酰CoA在乙酰乙酰CoA硫解酶作用下,缩合成乙酰乙酰CoA;再在胫基甲基戊二酸单酰CoA合酶(3-hydroxy-3-methylglutaryl CoA synthase, HMG-CoA synthase)作用下,与1分子乙酰CoA缩合成经基甲基戊二酸单酰CoA(3-hydroxy-3-methy lglutaryl CoA, HMG-CoA)。在线粒体中,HMG-CoA被裂解生成酮体;而细胞质生成的HMG-CoA,则在内质网HMGCoA还原酶(HMG-CoA reductase)作用下,由NADPH供氢,还原生成甲轻戊酸(mevalonic acid, MVA)。HMG-CoA还原酶是合成胆固醇的关键酶(动画7-2"HMG-CoA还原酶的催化作用”)。 硫解酶HMG-CoA合酶2CH3COCoA~声CH3COCH2COCoA 妞I- COOH HMG-CoA还原酶-HO— 如CI— COOH CH3HO-r=--CH3~<::H22NADPH+2H+2NADP+HSCoA妯轻基甲基戊二酸单酰CoA甲轻戊酸(MVA)2.甲轻戊酸经15碳化合物转变成30碳鲨烯MVA经脱狻、磷酸化生成活泼的异戊烯焦磷酸(A勹sopentenyl pyrophosphate, IPP)和二甲基丙烯焦磷酸(3,3-dimethylallyl pyrophosphate, DPP)。3分子5碳焦磷酸化合物(IPP及DPP)缩合成15碳焦磷酸法尼酣(farnesyl pyrophosphate, FPP)。在内质网鲨烯合酶(squalene synthase)催化下,2分子15碳焦磷酸法尼酣经再缩合、还原生成30碳多烯胫——鲨烯(squalene)。 3.鲨烯环化为羊毛固醇后转变为胆固醇30碳鲨烯结合在细胞质固醇载体蛋白(sterol carrier protein, SCP)上,经内质网单加氧酶、环化酶等催化,环化成羊毛固醇,再经氧化、脱狻、还原等反应,脱去3个甲基,生成27碳胆固醇(图7-9)。在脂酰-CoA:胆固醇脂酰转移酶(acyl-CoA:cholesterol acyltransferas e, ACAT)作用下,细胞内游离胆固醇能与脂酰CoA缩合,生成胆固醇酣储存。 (四)胆固醇合成受HMG-CoA还原酶调节 1. HMG-CoA还原酶活性具有与胆固醇合成相同的昼夜节律性动物实验发现,大鼠肝胆固醇合成有昼夜节律性,午夜最高,中午最低。进一步研究发现,肝HMG-CoA还原酶活性也有昼夜节律性,午夜最高,中午最低。可见,胆固醇合成的周期节律性是HMG-CoA还原酶活性周期性改变的结果。 第七章脂质代谢163 胫从甲基戊二酸单戙辅酌A NACD:二习 CH3甲羚戊酸(MVA) 5狄磷酸甲羚戊酸HO(-七固醉 P,+盖ADP个CO2 」|t H3异戊烯焦磷酸` (3x)i[H3二甲丙烯焦磷臣 @-@)一O4头焦磷酸法尼,1胆固的 4.餐食状态影响胆固醇合成饥饿或禁食可抑制肝合成胆固醇。研究发现,大鼠禁食48小时,胆固醇合成减少11倍,禁食96小时减少17倍,但肝外组织的合成减少不多。禁食除使HMGCoA还原酶活性降低外,乙酰CoA、ATP、NADPH不足也是胆固醇合成减少的重要原因。相反,摄取高糖、高饱和脂肪膳食,肝HMG-CoA还原酶活性增加,乙酰CoA、ATP、NADPH充足,胆固醇合成增加。 5.胆固醇合成受激素调节胰岛素及甲状腺素能诱导肝细胞HMG-CoA还原酶合成,增加胆固醇合成。甲状腺素还能促进胆固醇在肝转变为胆汁酸,所以甲状腺功能亢进病人血清胆固醇含量降低。胰高血糖素能通过化学修饰调节使HMG-CoA还原酶磷酸化失活,抑制胆固醇合成。皮质醇能抑制HMG-CoA还原酶活性,减少胆固醇合成。 164第二篇物质代谢及其调节 二、胆固醇的主要去路是转化为胆汁酸 胆固醇的母核-环戊烧多氢菲在体内不能被降解,所以胆固醇不能像糖、脂肪那样在体内被彻底分解;但其侧链可被氧化、还原或降解转变为其他具有环戊烧多氢菲母核的产物,或参与代谢调节,或排出体外。 在肝被转化成胆汁酸(bile acid)是胆固醇在体内代谢的主要去路。正常人每天约合成1-1.5g胆固醇,其中2/5(0.4-0.6g)在肝被转化为胆汁酸,随胆汁排出。游离胆固醇也可随胆汁排出。胆固醇是肾上腺皮质、睾丸、卵巢等合成类固醇激素的原料。肾上腺皮质细胞储存大量胆固醇醋,含量可达2%-5%,90%来自血液,10%自身合成。肾上腺皮质球状带、束状带及网状带细胞以胆固醇为原料分别合成醒固酮、皮质醇及雄激素。睾丸间质细胞以胆固醇为原料合成睾酮,卵泡内膜细胞及黄体以胆固醇为原料合成雌二醇及孕酮。胆固醇可在皮肤被氧化为7-脱氢胆固醇,经紫外线照射转变为维生素D30~第六节血浆脂蛋白及其代谢—、血脂是血浆所含脂质的统称血浆脂质包括甘油三酉趴磷脂、胆固醇及其酣,以及游离脂肪酸等。磷脂主要有卵磷脂(约70%)、神经鞘磷脂(约20%)及脑磷脂(约10%)。血脂有两种来源,外源性脂质从食物摄取入血,内源性脂质由肝细胞、脂肪细胞及其他组织细胞合成后释放入血。血脂不如血糖恒定,受膳食、年龄、性别、职业以及代谢等影响,波动范围较大(表7-4)。已组成mg/di mmol/L空腹时主要来源总脂400-700(500)•甘油三酷10-150(100)0.11~1.69(1.13)肝总胆固醇100-250(200)2.59-6.47(5.17)肝胆固醇酷70-200(145)1.81~5.17(3.75)游离胆固醇40~70(55)I.03-1.81(1.42)总磷脂150-250(200)48.44~80.73(64.58)肝卵磷脂50~200(100)16.1~64.6(32.3)肝神经磷脂50~130(70)16.1~42.0(22.6)肝脑磷脂15~35(20)4.8~13.0(6.4)肝游离脂肪酸5-20(15)脂肪组织二、血浆脂蛋白是血脂的运输形式及代谢形式(一)血浆脂蛋白可用电泳法和超速离心法分类不同脂蛋白所含脂质和蛋白质不一样,其理化性质如密度、颗粒大小、表面电荷、电泳行为,免疫学性质及生理功能均有不同(表7-5)包(动画7-3"脂蛋白的结构”),据此可将脂蛋白分为不同种类。 1.电泳法按电场中的迁移率对血浆脂蛋白分类不同脂蛋白的质量和表面电荷不同,在同一电场中移动的快慢不一样。a-脂蛋白(a-lipoprotein)泳动最快,相当于a!-球蛋白位置;B-脂蛋白([3-lipoprotein)相当千B球蛋白位置;前B-脂蛋白(pre-[3-lipoprotein)位千B-脂蛋白之前,相当于气-球蛋白位置;乳糜微粒(ch ylomicron, CM)不泳动,留在原点(点样处)(图7-10)。 密度法极低密度脂蛋白低密度脂蛋白高密度脂蛋白分类电泳法乳糜微粒前住脂蛋白仓脂蛋白a-脂蛋白性质密度<0.950.95-1.006I.006-I.0631.063-1.210s1值>40020~4000~20沉降电泳位置原点伍-球蛋白B球蛋白Ci1-球蛋白颗粒直径(nm)80~50025~8020~255~17组成(%)蛋白质0.5-25~1020~2550脂质98~9990~9575~8050甘油三酷80~9550~70105磷脂5~7152025胆固醇1~41545~5020游离胆固醇1~25~785酷化胆固醇310~1240~4215~17载脂蛋白组apo A I7l.21转运胆固醇酣0.19土0.05~PTP69.0?HDL,d>l.21转运磷酷?.四川大学华西基础医学与法医学院生物化学与分子生物学教研室、载脂蛋白研究室对625例成都地区正常成人的测定结果4国外报道参考值CETP:胆固醇酷转运蛋白;LPL:脂蛋白脂肪酶;PTP:磷脂转运蛋白;HL:肝脂肪酶2.不同脂蛋白具有相似基本结构大多数载脂蛋白如apo A I、All、C I、C lI、cm及E等均具双性a-螺旋(amp hipathic a helix)结构,不带电荷的疏水氨基酸残基构成a-螺旋非极性面,带电荷的亲水氨基酸残基构成a-螺旋极性面。在脂蛋白表面,非极性面借其非极性疏水氨基酸残基与脂蛋白内核疏水性较强的甘油三酷(triglycerides, TG)及胆固醇酣(cholesterol ester, CE)以疏水键相连,极性面则朝外,与血浆的水相接触。磷脂及游离胆固醇具有极性及非极性基团,可以借非极性疏水基团与脂蛋白内核疏水性较强的TG及CE以疏水键相连,极性基团朝外,与血浆的水相接触。所以,脂蛋白是以TG及CE为内核,载脂蛋白、磷脂及游离胆固醇单分子层覆盖于表面的复合体,保证不溶于水的脂质能在水相的血浆中正常运输。脂蛋白一般呈球状,CM及VLDL主要以TG为内核,LDL及HDL则主要以CE为内核。 三、不同来源脂蛋白具有不同功能和不同代谢途径(-)乳糜微粒主要转运外源性甘油三酷及胆固醇乳糜微粒(chylomicron, CM)代谢途径又称外源性脂质转运途径或外源性脂质代谢途径(图7lla)(动画7-5"乳糜微粒代谢过程”)。食物脂肪消化后,小肠黏膜细胞用摄取的中长链脂肪酸再合成甘油三酣(triglyceride, TG),并与合成及吸收的磷脂和胆固醇,加上apo B48、apo A I、apo All、apo A W等组装成新生CM,经淋巴道入血,从高密度脂蛋白(high density lipoprotein, HDL)获得apo C及apo E,并将部分apo A I、apo All、apo AN转移给HDL,形成成熟CM。apo C lI激活骨骼肌、心肌及脂肪等组织毛细血管内皮细胞表面脂蛋白脂肪酶(lipoprotein lipas e, LPL),使CM中TG及磷脂逐步水解,产生甘油、脂肪酸及溶血磷脂。随着CM内核TG不断被水解,释出大量脂肪酸被心肌、骨骼肌、脂肪组织及肝组织摄取利用,CM颗粒不断变小,表面过多的apo A I、apo All、apo AN、apo C、磷脂及胆固醇离开CM颗粒,形成新生HDL。CM最后转变成富含胆固醇酷(cholesterol ester, CE)、apo B48及apo E的CM残粒(remnant),被细胞膜LDL受体相关蛋白(LDL receptor related protein, LRP)识别、结合并被肝细胞摄取后彻底降解。apo C II是LPL不可缺少的激活剂,无apo C II时,LPL活性很低;加入apo CII后,LPL活性可增加10~50倍。正常人CM在血浆中代谢迅速,半寿期为5~15分钟,因此正常人空腹l2~14小时血浆中不含CM。 乳糜微粒 U 肠 -/``一产 肝_尸个—亘、 归三三 巨噬细胞内皮细胞 /7三尸哥二: 勹一:-t 肝外细胞 (二)极低密度脂蛋白主要转运内源性甘油三酷 极低密度脂蛋白(very low density lipoprotein, VLDL)是运输内源性TG的主要形式,其血浆代谢产物低密度脂蛋白(low density lipoprotein, LDL)是运输内源性胆固醇的主要形式,VLDL及LDL代谢途叽qi样,VLDL中TG在LPL作用下,水解释出脂肪酸和甘油供肝外组织利用。同时,VLDL表面的apo C、磷脂及胆固醇向HDL转移,而HDL胆固醇酷又转移到VLDL。该过程不断进行,VLDL中TG不断减径又称内源性脂质转运途径或内源性脂质代谢途径(图7-1lb)(动画7-6“极低密度脂蛋白代谢过程”)。肝细胞以葡萄糖分解代谢中间产物为原料合成TG,也可利用食物来源的脂肪酸和机体脂肪酸库中的脂肪酸合成TG,再与BlOO、E以及磷脂、胆固醇等组装成VLDL。此外,小肠黏膜细胞亦可apo合成少量VLDL。VLDL分泌入血后,从高密度脂蛋白(highHDL)获得C,其中density lipoprotein, apo II激活肝外组织毛细血管内皮细胞表面的脂蛋白脂肪酶(lipoproteinLPL)。和CM代谢一apo C lipase,少,CE逐渐增加,B100及E相对增加,颗粒逐渐变小,密度逐渐增加,转变为中密度脂蛋白(interapo mediate density lipoprotein, IDL)。IDL胆固醇及TG含量大致相等,载脂蛋白则主要是B100及apoapo E。肝细胞膜LRP可识别和结合IDL,因此部分IDL被肝细胞摄取、降解。未被肝细胞摄取的IDL(在人约占总IDL50%,在大鼠约占10%),其TG被LPL及肝脂肪酶(hepaticHL)进一步水解,表lipase,面E转移至HDL。这样,IDL中剩下的脂质主要是CE,剩下的载脂蛋白只有B100,转变为apoapo人体多种组织器官能摄取、降解低密度脂蛋白(lowLDL),肝是主要器官,约density lipoprotein,50%的LDL在肝降解。肾上腺皮质、卵巢,睾丸等组织摄取及降解LDL能力亦较强。血浆LDL降解既可通过LDL受体(LDLreceptor)途径(图7-12)完成,也可通过单核-吞噬细胞系统完成(动画7-7“低密度脂蛋白代谢过程”)。正常人血浆LDL,每天约45%被清除,其中2/3经LDL受体途径,1/3经单核吞噬细胞系统。血浆LDL半寿期为2~4天。酶个胆LDL。VLDL在血液中的半寿期为6~12小时。 (三)低密度脂蛋白主要转运内源性胆固醇 游睢 细胞膜 LDL-结合一-尸内吞一溶酶体水解--游离胆固醇一千HMG-CoA还原酶i1974年,M. S. Brown及J. L. Goldstein首先在人成纤维细胞膜表面发现了能特异结合LDL的LDL受体。他们纯化了该受体,证明它是839个氨基酸残基构成的糖蛋白,分子质量160000。后来发现,LDL受体广泛分布于全身,特别是肝、肾上腺皮质、卵巢、睾丸、动脉壁等组织的细胞膜表面,能特异识别、结合含apo B100或apo E的脂蛋白,故又称apo B/E受体(apo B/E receptor)。当血浆LDL与LDL受体结合后,形成受体-配体复合物在细胞膜表面聚集成簇,经内吞作用进入细胞,与溶酶体融合。在溶酶体蛋白水解酶作用下,apo B100被水解成氨基酸;胆固醇酷则被胆固醇酷酶水解成游离胆固醇和脂肪酸。游离胆固醇在调节细胞胆固醇代谢上具有重要作用:心抑制内质网HMG-CoA还原酶@红(HMG-CoA reductase),从而抑制细胞自身胆固醇合成;@从转录水平抑制LDL受体基因表达,抑制受体蛋白合成,减少细胞对LDL进一步摄取;@激活内质网脂酰-CoA:胆固醇脂酰转移酶(acyl-CoA:cholesterol acyl transferase, ACAT),将游离胆固醇酷化成胆固醇酷在细胞质贮存。同时,游离胆固醇还有重要生理功能:心被细胞膜摄取,构成重要的膜成分;@在肾上腺、卵巢及睾丸等固醇激素合成细胞,可作为类固醇激素合成原料。LDL被该途径摄取、代谢多少,取决于细胞膜上受体多少。肝、肾上腺皮质、性腺等组织LDL受体数目较多,故摄取LDL亦较多。 血浆LDL还可被修饰成如氧化修饰LDL(OX吐zed LDL,Ox-LDL),被清除细胞即单核-吞噬细胞系统中的巨噬细胞及血管内皮细胞清除。这两类细胞膜表面有清道夫受体(scavenger receptor, SR),可与修饰LDL结合而清除血浆修饰LDL。 (四)高密度脂蛋白主要逆向转运胆固醇 新生高密度脂蛋白(high density lipoprotein, HDL)主要由肝合成,小肠可合成部分。在CM及VLDL代谢过程中,其表面apo A I、apo A IT、apo AN、apo C以及磷脂、胆固醇等脱离亦可形成。HDL可按密度分为HDL!、HDL2及HDL3。HDLI也称作HDLC,仅存在于摄取高胆固醇膳食后血浆,正常人血浆主要含HDL2及HDL3。新生HDL的代谢过程实际上就是胆固醇逆向转运(reverse cholesteroltransp01t,RCT)过程,它将肝外组织细胞胆固醇,通过血液循环转运到肝,转化为胆汁酸排出,部分胆固醇也可直接随胆汁排入肠腔(见图7-llC)。 RCT第一步是胆固醇自肝外细胞包括动脉平滑肌细胞及巨噬细胞等移出至HDL。大量研究证明,HDL是细胞胆固醇移出不可缺少的接受体(acceptor)。存在千细胞间液中富含磷脂及apo A I、含较少游离胆固醇(free cholesterol,FC)的新生HDL,呈盘状,根据电泳位置将其称为前[31-HDL,能作为FC接受体,促进细胞胆固醇外流。 巨噬细胞、脑、肾、肠及胎盘等组织细胞膜存在ATP结合盒转运蛋白Al(ATP-binding cassette transporter Al, ABCAl),又称为胆固醇流出调节蛋白(cholesterol-efflux regulatory protein, CERP),可介导细胞内胆固醇及磷脂转运至细胞外,在RCT中发挥重要作用。ABCAl为ABC转运蛋白超家族成员,是2261个氨基酸残基组成的跨膜蛋白。ABCAl有4个结构域,其中2个为跨膜结构域,含由12个疏水模体(motif)构成的疏水区,胆固醇可能通过该疏水区从细胞内流出至细胞外;另2个结构域为伸向细胞质的ATP结合部位,能为胆固醇跨膜转运提供能量。 RCT第二步是HDL所运载的胆固醇的醋化及胆固醇酷的转运。新生HDL从肝外细胞接受的FC,分布在HDL表面。在血浆卵磷脂:胆固醇脂肪酰基转移酶(lecithin:cholesterol acyl transferase, LCAT)作用下,HDL表面卵磷脂的2位脂酰基转移至胆固醇3位胫基生成溶血卵磷脂及胆固醇酷(cholesterol ester, CE)。CE在生成后即转入HDL内核,表面则可继续接受肝外细胞FC,消耗的卵磷脂也可从肝外细胞补充。该过程反复进行,HDL内核CE不断增加,双脂层盘状HDL逐步膨胀为单脂层球状并最终转变为成熟HDL。LCAT由肝实质细胞合成和分泌,在血浆中发挥作用,HDL表面的apo A I是LCAT激活剂。 实际上,HDL成熟过程是多种酶及蛋白质参与的逐渐演变过程。新生HDL接受FC后,在LCAT作用下将FC醋化成CE。HDL中的apo D是一种转脂蛋白,能将CE由HDL表面转移至内核。随着该过程的不断进行,新生HDL先转变为密度较大、颗粒较小的HDL3。血浆胆固醇醋转运蛋白(cholesterol ester transfer protein, CETP)能促成HDL和VLDL之间的CE和TG交换,迅速将CE由HDL转移至VLDL,将TG由VLDL转移至HDL。血浆中还存在磷脂转运蛋白(phospholipid transfer protein, PTP),能促进磷脂由HDL向VLDL转移。HDL在血浆LCAT、apo A、apo D及CETP和PTP共同作用下,将从肝外细胞接受的FC不断酷化,酷化的胆固醇醋约80%转移至VLDL和LDL,20%进入HDL内核。同时,HDL表面的apo E及C转移到VLDL,而TG又由VLDL转移至HDL。由于HDL内核的CE及TG不断增加,使HDL颗粒进一步增大、密度逐步降低,由HDL3转变为密度更小、颗粒更大的HDL2。在高胆固醇膳食后血浆中,HD匕还可大量地进一步转变为HDL10RCT最后一步在肝进行。机体不能将胆固醇彻底分解,只能在肝转化成胆汁酸排出或直接以FC~(叩所i形式通过胆汁排出。肝细胞膜存在HDL受体(HDL recepter)、LDL受体及特异的apo E受体。研究表明,血浆CE的90%以上来自HDL,其中约70%在CETP作用下由HDL转移至VLDL,后者再转变成LDL通过LDL受体途径在肝被清除;20%通过HDL受体在肝被清除;10%由特异的apo E受体在肝被清除。机体通过这种机制,还可将外周组织衰老细胞膜中的胆固醇转运至肝代谢并排出。HDL的血浆半寿期为3~5天。除参与RCT外,HDL还是apo C II贮存库。CM及VLDL进入血液后,需从HDL获得apo C II才能激活LPL,水解其TG。CM及VLDL中TG水解完成后,apo C II又回到HDL。 四、血浆脂蛋白代谢紊乱导致脂蛋白异常血症 (-)不同脂蛋白的异常改变引起不同类型高脂血症血浆脂质水平异常升高,超过正常范围上限称为高脂血症(hyperlipidemia)。在目前临床实践中,高脂血症指血浆胆固醇或(和)甘油三酷超过正常范围上限,一般以成人空腹l2~14小时血浆甘油三酷超过2.26mmoVL(200mg/dl),胆固醇超过6.2lmmoVL(240mg/dl),儿童胆固醇超过4.14mmoVL(160mg/dl)为高脂血症诊断标准。事实上,在高脂血症血浆中,一些脂蛋白脂质含量升高,而另外脂蛋白脂质含量可能降低。因此,有人认为将高脂血症称为脂蛋白异常血症(dyslipoproteinemia)更为合理。传统的分类方法将脂蛋白异常血症分为六型(表7-7)。 分型血浆脂蛋白变化血脂变化I乳糜微粒升高甘油三百旨r r r胆固醇t I[a低密度脂蛋白升高胆固醇f f IIb低密度及极低密度脂蛋白同时升高胆固醇T T甘油三酣T T III中间密度脂蛋白升高(电泳出现宽B带)胆固醇t t甘油三酣f T w极低密度脂蛋白升高甘油三百甘f f V极低密度脂蛋白及乳糜微粒同时升高甘油三酣t t t胆固醇T脂蛋白异常血症还可分为原发性和继发性两大类。原发性脂蛋白异常血症发病原因不明,已证明有些是遗传性缺陷。继发性脂蛋白异常血症是继发于其他疾病如糖尿病、肾病和甲状腺功能减退等。 (二)血浆脂蛋白代谢相关基因遗传性缺陷引起脂蛋白异常血症现已发现,参与脂蛋白代谢的关键酶如LPL及LCAT,载脂蛋白如apoA I、apo B、apo C II、apo C皿和apo E,以及脂蛋白受体如LDL受体等的遗传性缺陷,都能导致血浆脂蛋白代谢异常,引起脂蛋白异常血症。在这些已经阐明发病分子机制的遗传性缺陷中,Brown MS及Goldstein JL对LDL受体研究取得的成就最为重大,他们不仅阐明了LDL受体的结构和功能,而且证明了LDL受体缺陷是引起家族性高胆固醇血症的重要原因。LDL受体缺陷是常染色体显性遗传,纯合子携带者细胞膜LDL受体完全缺乏,杂合子携带者LDL受体数目减少一半,其LDL都不能正常代谢,血浆胆固醇分别高达15.6~20.8mmoVL(600-800mg/dl)及7.8-10.4mmoVL(300-400mg/dl)携带者在20岁前就发生典型的冠心病症状。 脂质能溶于有机溶剂但不溶于水,分子中含脂酰基或能与脂肪酸起酣化反应。脂肪(甘油三醋)是机体重要的能量物质,胆固醇、磷脂及糖脂是生物膜的重要组分,参与细胞识别及信号传递,还是多种生物活性物质的前体。多不饱和脂肪酸衍生物具有重要生理功能。 肝、脂肪组织及小肠是合成甘油三酣的主要场所,肝合成能力最强;基本原料为甘油和脂肪酸,主要分别由糖代谢提供和糖转化形成。小肠黏膜细胞以脂酰CoA酣化甘油一酣合成甘油三酣,肝细胞及脂肪细胞以脂酰CoA先后酣化3-磷酸甘油及甘油二酣合成甘油三酣。 甘油三酣水解生成甘油和脂肪酸。甘油经活化、脱氢、转化成磷酸二径丙酮后,循糖代谢途径代谢。脂肪酸活化后进入线粒体,经脱氢、加水、再脱氢及硫解4步反应的重复循环完成B-氧化,生成乙酰CoA,并最终彻底氧化,释放大量能量。肝B-氧化生成的乙酰CoA还能转化成酮体,经血液运输至肝外组织利用。 人体脂肪酸合成的主要场所是肝,基本原料乙酰CoA需先狻化为丙二酸单酰CoA。在细胞质脂肪酸合酶体系催化下,由NADPH供氢,通过缩合、还原、脱水、再还原4步反应的7次循环合成16碳软脂酸。更长碳链脂肪酸的合成在肝细胞内质网和线粒体中通过对软脂酸加工、延长完成。脂肪酸脱氢可生成不饱和脂肪酸,但人体不能合成多不饱和脂肪酸,只能从食物摄取。 甘油磷脂合成以磷脂酸为重要中间产物,需CTP参与。甘油磷脂的降解由磷脂酶A、B、C和D催化完成。神经鞘磷脂的合成以软脂酰CoA、丝氨酸和胆碱为基本原料,先合成鞘氨醇,再与脂酰CoA、CDP-胆碱合成神经鞘磷脂。 胆固醇合成以乙酰CoA为基本原料,先合成HMG-CoA,再逐步合成胆固醇。HMG-CoA还原酶是胆固醇合成的关键酶。细胞内胆固醇含量是胆固醇合成的重要调节因素,无论是外源性还是自身合成,只要升高了细胞胆固醇含量,都能抑制胆固醇合成。胆固醇在体内可转化成胆汁酸、类固醇激素和维生素D3o脂质以脂蛋白形式在血中运输和代谢。超速离心法将血浆脂蛋白分为乳糜微粒、极低密度脂蛋白、低密度脂蛋白和高密度脂蛋白。CM主要转运外源性甘油三醋及胆固醇,VLDL主要转运内源性甘油三醋,LDL主要转运内源性胆固醇,HDL主要逆向转运胆固醇。 1.血浆甘油三酣异常升高的病人是否需要控制淀粉类食物的摄入?为什么? 第八章蛋白质消化吸收和氨基酸代谢 氨基酸是蛋白质的基本组成单位,其重要生理功能之一是作为原料参与细胞内蛋白质的合成。体内的蛋白质处于不断合成与分解的动态平衡。组织蛋白质首先分解成为氨基酸,然后再进一步代谢,所以氨基酸代谢是蛋白质分解代谢的中心内容。氨基酸代谢包括合成代谢和分解代谢两方面,本章重点论述分解代谢。体内蛋白质的更新与氨基酸的分解均需要食物蛋白质来补充。为此,在讨论氨基酸代谢之前,首先叙述蛋白质的营养价值及蛋白质的消化、吸收问题。 第一节蛋白质的营养价值与消化、吸收一、体内蛋白质的代谢状况可用氮平衡描述氮平衡(nitrogen balance)是指每日氮的摄入量与排出量之间的关系。摄入氮基本上来源于食物中的蛋白质,经机体消化吸收后主要用千体内蛋白质的合成己;排出氮主要来自粪便和尿液中的含氮化合物,绝大部分是蛋白质在体内分解代谢的终产物。由千蛋白质的平均含氮量为16%,通过测定摄入食物中的含氮量和排泄物中的含氮量可以间接了解体内蛋白质合成与分解代谢的状况。人体氮平衡有三种情况,即氮的总平衡、氮的正平衡及氮的负平衡。 氮的总平衡,即摄入氮量等于排出氮量,反映体内蛋白质的合成与分解处千动态平衡,即氮的“收支“平衡通常见于正常成人;氮的正平衡,即摄入氮量大于排出氮量,反映体内蛋白质的合成大于分解,儿童、孕妇及恢复期的病人属于此种情况;氮的负平衡,即摄入氮量小千排出氮量,反映体内蛋白质的合成小千分解,见于饥饿、严重烧伤、出血及消耗性疾病的病人。 根据氮平衡实验计算,当正常成人食用不含蛋白质膳食约8天后,每天的排出氮量逐渐趋千恒定。此时,每公斤体重每日排出的氮量约为53mg,故一位60kg体重的正常成人每日蛋白质的最低分解量约为20g。由于食物蛋白质与人体蛋白质组成的差异,消化吸收后不可能全部被利用,因此,为了维持氮的总平衡,正常成人每日蛋白质的最低生理需要佩为30~50g。要长期保持氮的总平衡,我国营养学会推荐正常成人每日蛋白质的需要量为80g。 二、营养必需氨基酸决定蛋白质的营养价值 氮平衡实验证明,人体内有9种氨基酸不能合成。这些体内需要而不能自身合成,必须由食物提供的氨基酸,在营养学上称为必需氨基酸(essential amino acid),包括亮氨酸、异亮氨酸、苏氨酸、细氨酸、赖氨酸、甲硫氨酸、苯丙氨酸、色氨酸和组氨酸包。其余11种氨基酸体内可以合成,不必由食物供给,在营养学上称为非必需氨基酸(non-esse ntial amino acid)。精氨酸虽然能够在入体内合成,但合成量不多,若长期供应不足或需要量增加也可造成负氮平衡。因此,有人将精氨酸也归为营养必需氨基酸。 蛋白质的营养价值(nutrition value)是指食物蛋白质在体内的利用率。蛋白质营养价值的高低主要取决于食物蛋白质中必需氨基酸的种类和比例。一般来说,含必需氨基酸种类多、比例高的蛋白质,其营养价值高;反之营养价值低。由于动物性蛋白质所含必需氨基酸的种类和比例与人体需要相近,故营养价值相对较高。多种营养价值较低的蛋白质混合食用,彼此间必需氨基酸可以得到互相补充,从而提高蛋白质的营养价值,这种作用称为食物蛋白质的互补作用。例如谷类蛋白质含赖氨酸较少含色氨酸较多,而豆类蛋白质含赖氨酸较多含色氨酸较少,将两者混合食用即可提高蛋白质的营养价值。在某些疾病情况下,为保证病人氨基酸的需要,可输入氨基酸混合液,以防止病情恶化。 三、外源性蛋白质消化成寡肤和氨基酸后被吸收 (-)蛋白质在胃和小肠被消化成寡肤和氨基酸食物蛋白质的消化、吸收是体内氨基酸的主要来源。同时,消化过程还可消除食物蛋白质的抗原性,避免引起机体的过敏和毒性反应。食物蛋白质的消化由胃开始,但主要在小肠进行。 小肠内发挥作用的蛋白酶基本上分为两大类,即内肤酶(endopeptidase)和外肤酶(exopeptidase)。内肤酶可以特异地水解蛋白质内部的一些肤键,而外肤酶则特异地水解蛋白质或多肤末端的肤键。内肤酶包括胰蛋白酶(trypsin汃胰凝乳蛋白酶(chymotrypsin)和弹性蛋白酶(elastase),这些酶对不同氨基酸残基组成的肤键有一定的专一性。胰蛋白酶水解由碱性氨基酸残基组成的肤键,胰凝乳蛋白酶水解由芳香族氨基酸残基组成的肤键,而弹性蛋白酶主要水解由脂肪族氨基酸残基组成的肤键。外肤酶主要包括狻肤酶和氨肤酶。胰液中的外肤酶主要是狻肤酶,又可分为狻肤酶A(carboxyl pepti一dase A)和狻肤酶B(carboxyl peptidase B),它们自肤链的狻基末端开始,每次水解脱去一个氨基酸。狻肤酶A和狻肤酶B对不同氨基酸残基组成的肤键也有一定的专一性,前者主要水解除脯氨酸、精氨酸、赖氨酸以外的多种氨基酸残基组成的末端肤键,而后者主要水解由碱性氨基酸残基组成的末端肤键(图8-1)。 氨肤酶内肤酶狻肤酶 订礼li-.~! i凡凡上5上}二肤酶 氨基酸+H2N-CH-C..'..NH-CH-COOH 氨基酸 174第二篇物质代谢及其调节 内肤酶和狻肤酶都是以酶原的形式由胰腺细胞分泌,进入十二指肠后被激活。胰蛋白酶原由肠激酶(enterokinase)激活。肠激酶是十二指肠黏膜细胞分泌的一种蛋白水解酶,能特异地作用于胰蛋白酶原,从其氨基末端水解掉1分子的六肤,生成有活性的胰蛋白酶。然后胰蛋白酶又将胰凝乳蛋白酶原(又称为糜蛋白酶原)、弹性蛋白酶原和狻肤酶原激活。胰蛋白酶的自身激活作用较弱(图8-2)。由于胰液中各种蛋白酶均以酶原的形式存在,同时胰液中又存在胰蛋白酶抑制剂,可以保护胰腺组织免受蛋白酶的自身消化。 胰蛋白酶原 肠激酶了 胰蛋白酶 糜蛋白酶原声糜蛋白酶弹性蛋白酶原亘弹性蛋白酶狻肤酶原狻肤酶(A或B)(A或B)蛋白质经胃液和胰液中蛋白酶的消化,产物中约有1/3为氨基酸,其余2/3为寡肤。寡肤的水解主要在小肠黏膜细胞内进行。小肠黏膜细胞内存在两种寡肤酶(oligopeptidase),即氨肤酶(aminopep tidase)和二肤酶(di peptidase)。氨肤酶从氨基末端逐步水解寡肤获得氨基酸,直至生成二肤,二肤再经二肤酶水解,最终生成氨基酸。 (二)氨基酸和寡肤通过主动转运机制被吸收 食物蛋白质被消化成氨基酸和寡肤后,主要在小肠通过主动转运机制被吸收。小肠黏膜细胞膜上存在转运氨基酸和寡肤的载体蛋白(cru-rier protein),能与氨基酸或寡肤以及Na十形成三联体,将氨基酸或寡肤和N旷转运入细胞,之后Na十借助钠泵被排出细胞外,此过程需要消耗ATP。由于氨基酸结构的差异,转运氨基酸或寡肤的载体蛋白也不相同。目前已知体内至少有7种载体蛋白参与氨基酸和寡肤的吸收。这些载体蛋白又被称为转运蛋白(transporter),包括中性氨基酸转运蛋白、酸性氨基酸转运蛋白、碱性氨基酸转运蛋白、亚氨基酸转运蛋白、B-氨基酸转运蛋白、二肤转运蛋白及三肤转运蛋白。当某些氨基酸共用同一载体时,由于在结构上有一定的相似性,这些氨基酸在吸收过程中将彼此竞争。氨基酸通过转运蛋白的吸收过程不仅存在于小肠黏膜细胞,也存在于肾小管细胞和肌细胞等细胞膜上。 四、未消化吸收的蛋白质在结肠下段发生腐败 食物中的蛋白质绝大部分都被彻底消化并吸收。未被消化的蛋白质及未被吸收的消化产物在结肠下部受到肠道细菌的分解,称为蛋白质的腐败作用(putrefac tion)。实际上,腐败作用是肠道细菌本身的代谢过程,以无氧分解为主。腐败作用的某些产物对人体具有一定的营养作用,如维生素及脂肪酸等。但大多数产物对人体是有害的,例如胺类(amine汃氨(ammonia汃酚类(phenol)、时1啋(indole)及硫化氢等。生成的腐败产物主要随粪便排出体外,也有少量经门静脉吸收进入体内,大多在肝经过生物转化作用后排出体外。 (一)肠道细菌通过脱狻基作用产生胺类 未被消化的蛋白质经肠道细菌蛋白酶的作用可水解生成氨基酸,然后在细菌氨基酸脱狻酶的作用下氨基酸脱去狻基生成胺类物质。例如组氨酸、赖氨酸、色氨酸、酪氨酸及苯丙氨酸通过脱狻基作用分别生成组胺、尸胺、色胺、酪胺及苯乙胺。这些腐败产物大多具有毒性,如组胺和尸胺具有降低血压的作用,酪胺具有升高血压的作用。这些毒性物质如果经门静脉进入体内,通常经肝代谢转化为无毒形式排出体外。但在肝功能受损时,酪胺和苯乙胺不能在肝内及时转化,极易进入脑组织,经B-轻化酶作用,分别转化为仕轻酪胺和苯乙醇胺。因其结构类似于儿茶酚胺,故被称为假神经递质(false neurotransmitter)。假神经递质增多时,可竞争性地干扰儿茶酚胺的正常功能,阻碍神经冲动传递,使大脑发生异常抑制,这可能是肝性脑病发生的原因之一。 `二如妞 勹吼妞妞 去甲肾上腺素 未被吸收的氨基酸在肠道细菌的作用下,通过脱氨基作用可以生成氨,这是肠道氨的重要来源之一。另一来源是血液中的尿素渗入肠道,经肠菌尿素酶的水解而生成氨。这些氨均可被吸收进入血液最终在肝中合成尿素。降低肠道的pH,可减少氨的吸收。 (三)腐败作用产生其他有害物质除了胺类和氨以外,蛋白质的腐败作用还可产生其他有害物质,例如苯酚、I弛朵甲基时1啋及硫化氢等。正常情况下,上述有害物质大部分随粪便排出,只有小部分被吸收,并经肝的代谢转变消除毒性,故不会发生中毒现象。 第二节氨基酸的一般代谢—、体内蛋白质分解生成氨基酸成人体内的蛋白质每天约有1%~2%被降解,其中主要是骨骼肌中的蛋白质。蛋白质降解所产生的氨基酸,大约70%-80%又被重新利用合成新的蛋白质。(一)蛋白质以不同的速率进行降解不同蛋白质的降解速率不同。蛋白质的降解速率是随生理需要而不断变化的,若以高的平均速率降解,标志着该组织正在进行主要结构的重建,例如妊娠中的子宫组织或严重饥饿造成的骨骼肌蛋白质的降解。蛋白质降解的速率用半寿期(half-life, t112)表示,半寿期是指将其浓度减少到开始值s o%所需要的时间。肝中蛋白质的tI/2短的低于30分钟,长的超过150小时,但肝中大部分蛋白质的l112为1~8天。人血浆蛋白质的l112约为10天,结缔组织中一些蛋白质的tl/2可达180天以上,眼晶体蛋白质的ll/2更长。体内许多关键酶的l112都很短,例如胆固醇合成关键酶HMG-CoA还原酶的l112为0.5~2小时。为了满足生理需要,关键酶的降解既可加速亦可滞后,从而改变酶的含量,进一步改变代谢产物的流量和浓度。 (二)真核细胞内蛋白质的降解有两条重要途径细胞内蛋白质的降解也是通过一系列蛋白酶和肤酶催化完成的。蛋白质首先被蛋白酶水解成肤,然后肤被肤酶降解成游离氨基酸。 1蛋白质在溶酶体通过ATP非依赖途径被降解溶酶体的主要功能是消化作用,是细胞内的,,1n:q-il。。 勹了 P-轻酪胺多巴胺 假神经递质儿茶酚胺(二)肠道细菌通过脱氨基作用产生氨消化器官。溶酶体含有多种蛋白酶,称为组织蛋白酶(cathepsin)。这些蛋白酶能够降解进入溶酶体的蛋白质,但对蛋白质的选择性较差,主要降解细胞外来的蛋白质、膜蛋白和胞内长寿命蛋白质。蛋白质通过此途径降解,不需要消耗ATP。 2.蛋白质在蛋白酶体通过AT P依赖途径被降解蛋白质通过此途径降解需泛素(ubiqui tin)的参与(动画8-1"泛素-蛋白酶体途径")。泛素是一种由76个氨基酸组成的小分子蛋白质,因其广泛存在于真核细胞而得名。泛素介导的蛋白质降解过程是一个复杂的过程。首先泛素与被选择降解的蛋白质形成共价连接,使后者得以标记,然后蛋白酶体(proteasome)将其降解。泛素的这种标记作用称为泛素化(ubiquitination),是由三种酶参与的催化反应完成的,同时需消耗ATP(图8-3)。一种蛋白质的降解需多次泛素化反应,形成泛素链(ubiquitin chain)。然后,泛素化的蛋白质在蛋白酶体降解,产生一些约7~9个氨基酸残基组成的肤链,肤链进一步经寡肤酶水解生成氨基酸。 图8-3蛋臼质降解的泛素化过程UB:泛素;E!:泛素激活酶;凡:泛素结合酶;比:泛素蛋白连接酶;Pr:被降解蛋白质蛋白酶体存在于细胞核和胞质内,主要降解异常蛋白质和短寿命蛋白质。蛋白酶体是一个26S的蛋白质复合物(图8-4),由20S的核心颗粒(core particle, CP)和19S的调节颗粒(regulatory particle, RP)组成。CP是由2个a环和2个B环组成的圆柱体,2个a环分别位于圆柱体的上下两端,而2个B环则夹在2个a环之间。每个a环由7个a亚基组成,而每个B环由7个B亚基组成,CP中心形成空腔。CP是蛋白酶体的水解核心,活性位点位于2个B环上,每个B环的7个B亚基中有3个亚基具有蛋白酶活性,可催化不同的蛋白质降解。2个19S的RP分别位于柱形核心颗粒的两端,形成空心圆柱的盖子。每个RP都由18个亚基组成,其中某些亚基能够识别、结合待降解的泛素化蛋白质,有6个亚基具有ATP酶活性,与蛋白质的去折叠以及使蛋白质定位于CP有关。 二、外源性氨基酸与内源性氨基酸组成氨基酸代谢库体内组织蛋白质降解产生的氨基酸及体内合成的非必需氨基酸属于内源性氨基酸,与食物蛋白质经消化吸收的氨基酸(外源性氨基酸)共同分布千体内各处,参与代谢,称为氨基酸代谢库(aminoacid metabolic pool)。氨基酸代谢库通常以游离氨基酸总量计算。由于氨基酸不能自由通过细胞膜,所以在体内的分布是不均一的。骨骼肌中的氨基酸占总代谢库的50%以上,肝约占10%,肾约占4%,血浆占1%~6%。消化吸收的大多数氨基酸,例如丙氨酸和芳香族氨基酸等主要在肝中分解,而支链氨基酸的分解代谢主要在骨骼肌中进行。 体内氨基酸的主要功能是合成多肤和蛋白质,也可转变成其他含氮化合物。正常人尿中排出的氨基酸极少。由于各种氨基酸具有共同的基本结构,因此分解代谢途径有相同之处;但各种氨基酸在侧链结构上存在一定的差异,又导致了各自独特的代谢方式。体内氨基酸代谢的概况见图8-5。 消化吸收 分解 脱狻基作用c 合成 代谢转变 骠呤、瞪唗、肌酸等含氮化合物 三、氨基酸分解代谢首先脱氨基 氨基酸分解代谢的主要反应是脱氨基作用,可以通过多种方式如转氨基、氧化脱氨基及非氧化脱氨基等方式脱去氨基。(—)氨基酸通过转氨基作用脱去氨基1转氨基作用由转氨酶催化完成转氨基作用(transarnination)是在氨基转移酶(arni notransferase)的催化下,可逆地将a氨基酸的氨基转移给a-酮酸,结果是氨基酸脱去氨基生成相应的a-酮酸,而原来的a酮酸则转变成另一种氨基酸。 质物酸基 胺氮酰含 素氨他。尿谷其 脱氨基作用 匕日 必或卡糖 类胺 组织氨基酸 组织蛋白质 血液 氨基酸代谢库 氨基酸 食物蛋白质 178第二篇物质代谢及其调节 I转氨酶I-I 氨基转移酶也称转氨酶(transaminase),广泛分布千体内各组织中,其中以肝及心肌中的含翟最为丰富。转氨基作用的平衡常数接近1.0,反应是完全可逆的。因此,转氨基作用既是氨基酸的分解代谢过程,也是体内某些氨基酸合成的重要途径。除赖氨酸、苏氨酸、脯氨酸及轻脯氨酸外,大多数氨基酸都能进行转氨基作用。除了a-氨基外,氨基酸侧链末端的氨基,如鸟氨酸的8-氨基也可通过转氨基作用脱去。 体内存在着多种氨基转移酶,不同氨基酸与a-酮酸之间的转氨基作用只能由专一的氨基转移酶催化。在各种氨基转移酶中,以L-谷氨酸和a-酮酸的氨基转移酶最为重要。例如谷丙转氨酶(glutamic-pyruvic transaminase, GPT)和谷草转氨酶(glutamic-oxaloacetic transaminase, GOT)在体内广泛存在,但各组织中的含量不同(表8-1)。 谷氨酸丙酮酸a-酮戊二酸丙氨酸 (C』OOH C|OOH C|OOH C如OO2H|H加+CH2AST(C|H2)2+||C|HNH2CI=O C=O CI HNH2谷氨酸草酰乙酸(l-酮戊二酸天冬氨酸表8-1正常人各组织中ALT及AST活性(U/g组织) 组织ALT AST组织ALT AST肝44000142000胰腺200028000肾1900091000脾120014000正常时,氨基转移酶主要存在千细胞内,血清中的活性很低。肝组织中ALT的活性最高,心肌组织中AST的活性最高。当某种原因使细胞膜通透性增高或细胞破裂时,氨基转移酶可大量释放入血,使血清中氨基转移酶活性明显升高。例如急性肝炎病人血清ALT活性显著升高;心肌梗死病人血清AST明显上升。临床上可以此作为疾病诊断和预后的参考指标之一。 2氨基转移酶具有相同的辅酶和作用机制氨基转移酶的辅基是维生素凡的磷酸酷,即磷酸咄哆醒,结合于转氨酶活性中心赖氨酸的c-氨基上。在反应过程中,磷酸咄哆醒先从氨基酸接受氨基转变成磷酸咄哆胺,氨基酸则转变成a-酮酸;继而磷酸咄哆胺进一步将氨基转移给另一种a-酮酸而生成相应的氨基酸,同时磷酸咄哆胺又转变为磷酸咄哆睦。在氨基转移酶的催化下,磷酸咄哆醋与磷酸咄哆胺的这种相互转变,起着传递氨基的作用,下式说明了磷酸咄哆酸和磷酸咄哆胺参与的转氨基反应过程。 第八章蛋白质消化吸收和氨基酸代谢179 HOOC—!/NH2+0=`+H心HOOC—I~N=勹:N 氨基酸磷酸咄哆醒Schiff碱 CH20PO扎CH20PO扎 HOOC一i厂O+H,N—CH2勹三HOOC飞~N—CH勹II a-酮酸磷酸毗哆胺Schiff碱异构体 (二)L谷氨酸脱氢酶催化L谷氨酸氧化脱氨基 L-谷氨酸脱氢酶1|+H20『 妇2—COOH之/\一!-比0I NAD+NADH+H+(CH加一COOR(CH2)2-COOH谷氨酸Q-酮戊二酸L-谷氨酸是哺乳类动物组织中唯一能以相当高的速率进行氧化脱氨反应的氨基酸,脱下的氨进一步代谢后排出体外。L-谷氨酸的氧化脱氨反应由L-谷氨酸脱氢酶(£-glutamate dehydrogenase)催化完成,此酶广泛存在于肝、肾和脑等组织中,属于一种不需氧脱氢酶。在L-谷氨酸脱氢酶的催化下,L-谷氨酸氧化脱氨生成a-酮戊二酸和氨。 L谷氨酸脱氢酶是一种别构酶,由6个相同的亚基聚合而成。ATP与GTP是此酶的别构抑制剂,而ADP和GDP是别构激活剂。因此,当体内能量不足时能加速氨基酸的氧化,对机体的能量代谢起重要的调节作用。L-谷氨酸脱氢酶还是唯一既能利用NA订又能利用NADP十接受还原当量的酶。 转氨基作用只是把氨基酸分子中的氨基转移给a-酮戊二酸或其他a-酮酸,并没有真正实现脱氨基。若氨基转移酶与L-谷氨酸脱氢酶协同作用,首先通过转氨基作用使其他氨基酸的氨基转移至a-酮戊二酸生成L-谷氨酸,然后L谷氨酸再脱氨基,就可以使氨基酸脱氨生成NH3。这种方式需要氨基转移酶与L-谷氨酸脱氢酶联合作用,即转氨基作用与L-谷氨酸的氧化脱氨基作用偶联进行,被称作转氨脱氨作用(transdeamination),又称联合脱氨作用(图8-6)。 (三)氨基酸通过氨基酸氧化酶催化脱去氨基 大多数从L-a氨基酸中释放的氨反映了氨基转移酶和L-谷氨酸脱氢酶的联合作用。在肝、肾组织中还存在一种L-氨基酸氧化酶,属黄素酶类,其辅基是FMN或FAD。这些能够自动氧化的黄素蛋白将氨基酸氧化为a-亚氨基酸,然后再加水分解成相应的a-酮酸,并释放按离子。分子氧可进一步直接氧化还原型黄素蛋白形成过氧化氢(H202),H202被过氧化氢酶裂解成氧和H20。过氧化氢酶存在于大多数组织中,尤其是肝。 HOOC Y c—NH2~HOOC-<;:=NH主立-HOOC-C=O+NH; 氨基酸a-酮酸 180第二篇物质代谢及其调节 o氨基酸a-酮戊二酸 V L-谷氨酸脱氢酶 a-酮酸谷氨酸 四、氨基酸碳链骨架可进行转换或分解 氨基酸脱氨基后生成的a-酮酸(a-keto acid)可以进一步代谢,主要有以下三方面的代谢途径。(-)(X-酮酸可彻底氧化分解并提供能量a-酮酸在体内可通过三狻酸循环与生物氧化体系彻底氧化生成CO2和H20,同时释放能量以供机体生理活动需要。可见,氨基酸也是一类能源物质。(二)c:x-酮酸经氨基化生成营养非必需氨基酸体内的一些营养非必需氨基酸可通过相应的a-酮酸经氨基化而生成。例如,丙酮酸、草酰乙酸、Q-酮戊二酸经氨基化后分别转变成丙氨酸、天冬氨酸和谷氨酸。这些a-酮酸也可以是来自糖代谢和三狻酸循环的产物。(三)c:x-酮酸可转变成糖和脂质在人体内a-酮酸可以转变成糖和脂质。实验发现,分别用不同氨基酸饲养人工造成糖尿病的犬时,大多数氨基酸可使尿中排出的葡萄糖增加,少数几种则可使葡萄糖及酮体的排出同时增加,而亮氨酸和赖氨酸只能使酮体的排出增加。由此,将在体内可以转变成糖的氨基酸称为生糖氨基酸(glucogenic amino acid);能转变成酮体的氨基酸称为生酮氨基酸(ketogenic amino acid);既能转变成糖又能转变成酮体的氨基酸称为生糖兼生酮氨基酸(glu coge ni c and ketogenic amino acid)(表8-2)。 类别氨基酸 生糖氨基酸甘氨酸、丝氨酸、细氨酸、组氨酸、精氨酸、半胱氨酸、脯氨酸、丙氨酸、谷氨酸、谷氨酰胺、天冬氨酸、天冬酰胺、甲硫氨酸@ 生酮氨基酸亮氨酸、赖氨酸生糖兼生酮氨基酸异亮氨酸、苯丙氨酸、酪氨酸、苏氨酸、色氨酸 利用核素标记氨基酸的示踪实验证明,上述营养学研究的结果是正确的。各种氨基酸脱氨基后产生的a-酮酸结构差异很大,其代谢途径也不尽相同,转变过程的中间产物包括乙酰CoA(生酮氨基酸)和丙酮酸及三狻酸循环的中间物,例如a-酮戊二酸、草酰乙酸、延胡索酸及唬珀酰CoA等(生糖氨基酸)。 综上所述,氨基酸的代谢与糖和脂质的代谢密切相关。氨基酸可转变成糖与脂质;糖也可以转变成脂质和一些非必需氨基酸的碳架部分。由此可知,三狻酸循环是物质代谢的总枢纽,通过它可以使糖、脂肪酸及氨基酸完全氧化,也可使彼此相互转变,构成一个完整的代谢体系。 第三节氨的代谢 体内代谢产生的氨及消化道吸收的氨进入血液,形成血氨。正常生理情况下,血氨水平在47~65µ,mol/L。氨具有毒性,特别是脑组织对氨的作用尤为敏感。 —、血氨有三个重要来源 (一)氨基酸脱氨基作用和胺类分解均可产生氨 氨基酸脱氨基作用产生的氨是体内氨的主要来源。胺类的分解也可以产生氨。其反应如下:蛋白质和氨基酸在肠道细菌腐败作用下可产生氨,肠道内尿素经细菌尿素酶水解也可产生氨。肠道产氨量较多,每天约为4g。当腐败作用增强时,氨的产生量增多。肠道内产生的氨主要在结肠吸收入血。在碱性环境中,NH4十易转变成NH3,而NH3比NH4十易于穿过细胞膜而被吸收。因此肠道偏碱时,氨的吸收增强。临床上对高血氨病人采用弱酸性透析液作结肠透析,而禁止用碱性的肥皂水灌肠,就是为了减少氨的吸收。 (三)肾小管上皮细胞分泌的氨主要来自谷氨酰胺谷氨酰胺在谷氨酰胺酶的催化下水解成谷氨酸和氨,这部分氨分泌到肾小管管腔中与尿中的W结合成NH4+,以按盐的形式由尿排出体外,这对调节机体的酸碱平衡起着重要作用。酸性尿有利于肾小管细胞中的氨扩散入尿,而碱性尿则妨碍肾小管细胞中N儿的分泌,此时氨被吸收入血,成为血氨的另一个来源。因此,临床上对因肝硬化而产生腹水的病人,不宜使用碱性利尿药,以免血氨升高。 二、氨在血液中以丙氨酸和谷氨酰胺的形式转运 氨在人体内是有毒物质,各组织中产生的氨必须以无毒的方式经血液运输到肝合成尿素,或运输到肾以按盐的形式排出体外。现已知,氨在血液中主要是以丙氨酸和谷氨酰胺两种形式进行转运。 (—)氨通过丙氨酸-葡萄糖循环从骨骼肌运往肝骨骼肌主要以丙酮酸作为氨基受体,经转氨基作用生成丙氨酸,丙氨酸进入血液后被运往肝。在肝中,丙氨酸通过联合脱氨基作用生成丙酮酸,并释放氨。氨用于合成尿素,丙酮酸经糖异生途径生成葡萄糖。葡萄糖经血液运往肌肉,沿糖酵解转变成丙酮酸,后者再接受氨基生成丙氨酸。丙氨酸和葡萄糖周而复始的转变,完成骨骼肌和肝之间氨的转运,这一途径称为丙氨酸~葡萄糖循环(alanine glucose cycle)(图8-7)。通过这个循环,骨骼肌组织中氨基酸的氨基("氨")以丙氨酸形式运往肝,同时,肝又为骨骼肌提供了生成丙酮酸的葡萄糖。\'I I,f?(二)氨通过谷氨酰胺从脑和骨骼肌等组织运往肝或肾谷氨酰胺是另一种转运氨的形式,它主要从脑和骨骼肌等组织向肝或肾运氨。在脑和骨骼肌等组织氨与谷氨酸在谷氨酰胺合成酶(glutamine synthetase)的催化下合成谷氨酰胺,并经血液运往肝或肾再经谷氨酰胺酶(glutaminase)的催化水解成谷氨酸及氨。谷氨酰胺的合成与分解是由不同酶催化的不可逆反应,其合成需消耗ATP。 l NH3+ATPADP+Pi|(CH2)2\谷氨酰胺合成鹿入(CH加 {HNH2工/谷氨酰胺酶\¢HNH2NH3比0| L-谷氨酸谷氨酰胺 可以认为,谷氨酰胺既是氨的解毒产物,又是氨的储存及运输形式。尤其是谷氨酰胺在脑中固定和转运氨的过程中起着重要作用。临床上对氨中毒的病人可服用或输入谷氨酸盐,以降低氨的浓度。 谷氨酰胺还可以提供氨基使天冬氨酸转变成天冬酰胺。正常细胞能合成足量的天冬酰胺供蛋白质的合成需要。但白血病细胞却不能或很少能合成天冬酰胺,必须依靠血液从其他器官运输而来。因此临床上应用天冬酰胺酶(asparaginase)使天冬酰胺水解成天冬氨酸,从而减少血中天冬酰胺,达到治疗白血病的目的。 ||CH2天冬酰胺酶CH2 天冬酰胺天冬氨酸 三、氨的主要代谢去路是在肝合成尿素 正常情况下体内的氨主要在肝合成尿素,只有少部分氨在肾以按盐形式随尿排出。正常成人尿素占排氮总量的80%-90%,可见肝在氨的解毒中起着重要作用。(一)尿素是通过鸟氨酸循环合成的肝是如何合成尿素的?早在1932年,德国学者Hans Krebs和Kurt Henseleit根据一系列实验,首第八章蛋白质消化吸收和氨基酸代谢183次提出了鸟氨酸循环(ornithine cycle)学说,又称尿素循环(urea cycle),用来解释尿素的合成过程。两位科学家根据什么线索提出了这个学说?此学说又是如何被证实的?20世纪30年代,组织切片技术巳普遍应用千中间代谢的研究,这为研究尿素的合成机制提供了有利条件。用大鼠肝的薄切片和多种可能有关的代谢物以及较盐共同保温,发现鸟氨酸(ornithine)和瓜氨酸(citrulline)都有催化较盐合成尿素的作用。赖氨酸与鸟氨酸的结构非常相似,却无这种作用。所以较合理的解释是,在尿素合成的一系列反应中,应当包括NH3、CO2和鸟氨酸共同合成一种中间化合物,这个中间化合物在肝中能以合理的速度生成尿素,同时再生成鸟氨酸。精氨酸符合作为这个中间化合物的要求,下式表示这种关系:比N—(:H+2NH3+CO2)J严一比N-加+O=C-NH2素的作用。用大量鸟氨酸和按盐及大鼠肝切片共同保温,可观察到瓜氨酸的积存。总结以上,提出了肝中合成尿素的鸟氨酸循环学说(图8-8)书。 严如|如| (CH2)3(CH心(CH加 鸟氨酸瓜氨酸精氨酸 (二)肝中鸟氨酸循环的反应步骤 鸟氨酸循环的具体过程比较复杂,大体可分为以下五步。 1. NH3、co并□ATP缩合生成氨基甲酰磷酸(carbamoyl phosphate)尿素的生物合成始于氨基甲酰磷酸。在Mg气ATP及N-乙酰谷氨酸(N-acetyl glutamic acid, AGA)存在时,NH3与CO2可由氨基甲酰磷酸合成酶I(ca rbamo yl phosph ate synthetase I, CPS-I)催化生成氨基甲酰磷酸。 184第二篇物质代谢及其调节 氨基甲酰磷酸合成酶I。II NH3+CO2+H20+2ATP~N-乙酰谷氨酸,Mg2+H2N-C—0-PO/-+2ADP+Pi此反应消耗2分子ATP,为酰胺键和酸酐键的合成提供驱动力。CPS-I是鸟氨酸循环过程中的关键酶,催化不可逆反应。此酶只有在别构激活剂N-乙酰谷氨酸存在时才能被激活,N-乙酰谷氨酸可诱导CPS-I的构象发生改变,进而增加酶对ATP的亲和力。CPS-I和AGA都存在千肝细胞线粒体中。 2.氨基甲酰磷酸与鸟氨酸反应生成瓜氨酸在鸟氨酸氨基甲酰转移酶(ornithine carbamoyl transferase,OCT)催化下,氨基甲酰磷酸上的氨基甲酰部分转移到鸟氨酸上,生成瓜氨酸和磷酸。此反应不可逆,OCT也存在于肝细胞线粒体中。 砰皿如I (CH2)3鸟氨酸氨基甲酰转移酶(CH2)3 COOH鸟氨酸 COOH 氨基甲酰磷酸瓜氨酸 3.瓜氨酸与天冬氨酸反应生成精氨酸代唬珀酸瓜氨酸在线粒体合成后,即被转运到线粒体外,在胞质中经精氨酸代唬珀酸合成酶(argininosuccinate synthetase)催化,与天冬氨酸反应生成精氨酸代珧珀酸。此反应由ATP供能,天冬氨酸提供了尿素分子中的第二个氮原子。精氨酸代唬珀酸合成酶也是鸟氨酸循环过程中的关键酶。 如|COOH沪严 1精氨酸代姚珀酸合成酶 如—NH2恤八八-加-NH2 瓜氨酸天冬氨酸精氨酸代骁珀酸 4.精氨酸代唬珀酸裂解生成精氨酸与延胡索酸精氨酸代唬珀酸在精氨酸代唬珀酸裂解酶的催化下,裂解生成精氨酸与延胡索酸。反应产物精氨酸分子中保留了来自游离N儿和天冬氨酸分子中的氮。 I I精氨酸代眺珀酸裂解酶|(<;:H2h COOH(CH加+精氨酸代姚珀酸精氨酸延胡索酸上述反应裂解生成的延胡索酸可经拧檬酸循环的中间步骤转变成草酰乙酸,后者与谷氨酸在AST催化下进行转氨基反应,又可重新生成天冬氨酸,而谷氨酸的氨基可来自体内的多种氨基酸。由此可见,体内多种氨基酸的氨基可通过天冬氨酸的形式参与尿素的合成。 @?-,I.,5.精氨酸水解释放尿素并再生成鸟氨酸在胞质中,精氨酸由精氨酸酶催化,水解生成尿素和鸟氨酸。鸟氨酸通过线粒体内膜上载体的转运再进入线粒体,参与瓜氨酸的合成。如此反复,完成鸟氨酸循环。尿素则作为代谢终产物排出体外。 C=NH(CH砰加 如I砰c=o+CH I—NH2 (CH加| 精氨酸酶H心 如COOH 如I-NH2鸟氨酸 COOH尿素 精氨酸 综上所述,尿素合成的总反应为: 尿素合成的中间步骤及其在细胞中的定位总结千图8-9。 线粒体 胞液 2A二习0 鸟氨酸 了天冬氨酸a-酮戊二酸氨基酸 精氨酸@AMP十三@草酰乙酸x合氨酸x~酮酸 了/苹果酸/ 延胡索酸 图8-9尿素生成的中间步骤和细胞定位O氨基甲酰磷酸合成酶I;@鸟氨酸氨基甲酰转移酶;@精氨酸代骁珀酸合成酶;@精氨酸代唬珀酸裂解酶;@精氨酸酶(三)尿素合成受膳食蛋白质和两种关键酶的洞节1.高蛋白质膳食增加尿素生成尿素合成受食物蛋白质的影响。进食高蛋白质膳食时,蛋白质分解增多,尿素合成速度加快,尿素可占排出氮的90%;反之,摄取低蛋白质膳食时,尿素合成速度减慢,尿素约占排出氮的60%。 2. AGA激活CPS-I启动尿素合成CPS-I是鸟氨酸循环启动的关键酶。如前所述,AGA是CPS-I的别构激活剂,它是由乙酰CoA与谷氨酸通过AGA合酶催化生成的。精氨酸是AGA合酶的激活剂,精氨酸浓度增高时,尿素合成增加。 3.精氨酸代唬珀酸合成酶促进尿素合成参与尿素合成的酶系中,精氨酸代唬珀酸合成酶的活性最低,是尿素合成启动以后的关键酶,可调节尿素的合成速度。(四)尿素生成障碍可引起高血氨症或氨中毒在正常生理情况下,血氨的来源与去路保持动态平衡,而氨在肝中合成尿素是维持这种平衡的关键。当某种原因,例如肝功能严重损伤或尿素合成相关酶遗传性缺陷时,都可导致尿素合成发生障碍,血氨浓度升高,称为高血氨症(hyperammonemia)。常见的临床症状包括呕吐、厌食、间歇性共济失调嗜睡甚至昏迷等。高血氨的毒性作用机制尚不完全清楚。一般认为,氨进入脑组织,可与脑中的a-酮戊二酸结合生成谷氨酸,氨也可与脑中的谷氨酸进一步结合生成谷氨酰胺。高血氨时,脑中氨的增加可使脑细胞中的a-酮戊二酸减少,导致三狻酸循环减弱,ATP生成减少,引起大脑功能障碍,严重时可发生昏迷(称为肝性脑病)。另一种可能性是谷氨酸、谷氨酰胺增多,渗透压增大引起脑水肿所致。 第四节个别氨基酸的代谢 氨基酸的分解代谢除共有代谢途径外,因其侧链不同,有些氨基酸还存在特殊的代谢途径,并具有重要的生理意义。本节仅对几种重要的氨基酸代谢途径进行描述。 一、氨基酸脱狻基作用需要脱狻酶催化 有些氨基酸可通过脱狻基作用(decarboxylation)生成相应的胺类。催化脱狻基反应的酶称为脱狻酶(decarboxylase),氨基酸脱狻酶的辅酶是磷酸咙哆醋。体内胺类含量虽然不高,但具有重要的生理功能。细胞内广泛存在的胺氧化酶(amine oxidase)能将胺氧化成相应的酸、N凡和H2020睦类可继续氧化成狻酸,狻酸再氧化成CO2和H20或随尿排出,从而避免胺类的蓄积。胺氧化酶属千黄素蛋白,在肝中活性最高。包HOOC-CH—NH2二旦_.R—CH2-NH2~RCHO二竺=---RCOOH氨基酸脱狻酶胺单胺氧化酶陛狻酸(一)谷氨酸脱狻生成丫-氨基丁酸谷氨酸由L-谷氨酸脱狻酶催化脱去狻基生成丫-氨基丁酸(-y-aminobutyric acid, GABA)。L-谷氨酸脱狻酶在脑及肾组织中活性很高,因而丫-氨基丁酸在脑组织中的浓度较高。GABA是抑制性神经递质,对中枢神经有抑制作用。 (CH加L-谷氨酸脱狻酶| |\工(CH出 谷氨酸'Y-氨基丁酸 (二)组氨酸脱狻生成组胺组氨酸由组氨酸脱狻酶催化脱去狻基生成组胺(histamine)。组胺在体内分布广泛,乳腺、肺、肝、肌及胃黏膜中含量较高,主要存在于肥大细胞中。组胺是一种强烈的血管扩张剂,并能增加毛细血管的通透性。组胺可使平滑肌收缩,引起支气管@扣L痉挛导致哮喘。组胺还能促进胃黏膜细胞分泌胃蛋白酶原及胃酸。 产气-CH29HCOOH三CH2CH2NH2 I组氨酸脱狻酶 组氨酸组胺 (三)色氨酸经过轻化后脱狻生成5-轻色胺 色氨酸首先经色氨酸胫化酶催化生成5-轻色氨酸(5-hydroxytryptophan),然后由5-轻色氨酸脱狻酶催化生成5-轻色胺。 5轻色胺广泛分布于体内各组织,除神经组织外,还存在于胃、肠、血小板及乳腺细胞中。脑组织中的5轻色胺是一种神经递质,具有抑制作用,直接影响神经传导。在外周组织,5-胫色胺具有强烈的血管收缩作用。5-胫色胺经单胺氧化酶催化生成5-轻色睦,进一步氧化生成5-轻时隙乙酸随尿排出。 色氨酸轻化酶 勹CH2已。OH HO亡勹-CH甚HCOOH 色氨酸5-轻色氨酸 5-泾色氨酸脱狻酶 -HO勹CH2CH2NH2大CO2 5-泾色胺 (四)某些氨基酸脱狻基可产生多胺类物质 多胺是指含有多个氨基的化合物。在体内,某些氨基酸经脱狻基作用可以产生多胺类物质。例如鸟氨酸经脱狻基作用生成腐胺(putrescine),然后腐胺又可转变成亚精胺(spermidine)及精胺(spermine)。 鸟氨酸脱狻酶L鸟氨酸、►H2N—(CH2)4-NH2(腐胺) SAM脱狻酶+S-腺昔甲硫氨酸(SAM)、汀泉节—S一(CH出一NH2(脱狻基SAM)丙胺转移酶腐胺+脱狻基SAM、卫比N一(CH2)4-NH一(CH2h-NH2(亚精胺) 腺昔—S-CH3 丙胺转移酶亚精胺+脱狻基SAM、~H2N一(CH2)3-NH一(CH心—NH一(CH心—NH2(精胺) 腺昔一S—CH3 鸟氨酸脱狻酶(ornithine decru·boxylase)是多胺(polyamine)合成的关键酶。精胺与亚精胺是调节细胞生长的重要物质。凡生长旺盛的组织,如胚胎、再生肝、肿瘤组织等,鸟氨酸脱狻酶的活性和多胺的含批都有所增加。多胺促进细胞增殖的机制可能与其稳定细胞结构、与核酸分子结合及促进核酸和蛋白质的生物合成有关。在体内多胺大部分与乙酰基结合随尿排出,小部分氧化成CO2和NH3o目前临床上常测定病人血或尿中多胺的水平作为肿瘤辅助诊断及病情变化的生化指标之一。 二、某些氨基酸在分解代谢中产生一碳单位 (一)四氢叶酸作为一碳单位的载体参与一碳单位代谢一碳单位(one carbon unit)是指某些氨基酸在分解代谢过程中产生的含有一个碳原子的有机基团,包括甲基(-CH3)、亚甲基(—CH2—汃次甲基(=CH—汃甲酰基(—CHO)及亚氨甲基(—CH=NH)等。一碳单位不能游离存在,常与四氢叶酸(tetrahydrofolic acid, FH4)结合被转运并参与代谢,四氢叶酸是一碳单位的运载体。在体内,四氢叶酸是由叶酸经过二氢叶酸还原酶(dihydrofolatereductase)催化,分两步还原反应生成的。 H2N-C夕广c/8;CH2H O H COOH 5积CHCH2NC CN-CH-CH2-CH2-COOH N、4---c/9\N丝氨酸N5,Nl0-亚甲四氢叶酸甘氨酸F凡/\►N5,N10CH2F凡+CO2H2N-C H2-COOH NH3++-—NAO+NADH+H•甘氨酸NS,NIO-亚甲四氢叶酸比OH H5,6,7,8-四氢叶酸(FH4)二氢叶酸还原酶二氢叶酸还原酶叶酸/\-二氢叶酸/\-四氢叶酸(二)由氨基酸产生的—碳单位可相互转变一碳单位主要来自丝氨酸、甘氨酸、组氨酸及色氨酸的分解代谢,苏氨酸通过间接转变成为甘氨酸也可以产生一碳单位。一碳单位由氨基酸生成的同时即结合在四氢叶酸的N5、N”位上。四氢叶酸的N5结合甲基或亚氨甲基,N5和NIO结合亚甲基或次甲基,N5或NlO结合甲酰基。例如:HO—CH2-CH-COOH+Flii~W,N'"-CH2-Flii+H2N CH2—COOH|=-.-CH|2CHCOOH-一一>. HN、/NHN5,NIO=CH—F比千N5-CH=NH—F二二亚氨甲基转移酶NS,N IO-次甲四氢叶酸NH3N5-亚氨甲基四氢叶酸HOOC-CH如—(CH2h一COOH各种不同形式的一碳单位中,碳原子的氧化状态不同。在适当条件下,它们可以通过氧化还原反应而彼此转变(图8-10)。但是在这些反应中,N5-甲基四氢叶酸的生成是不可逆的。 N5-CH3-F比(三)一碳单位的主要功能是参与漂呤和晚唗(N5-甲基四氢叶酸)的合成氨基酸分解代谢过程中产生的一碳单位可作N\N10-}CH2-F比为嗦呤和啼唗的合成原料。例如,N10-CHO-FH4与(N5,NIO-亚甲四氢叶酸)N5, N10=CH-FH4分别为嗦呤碱基的合成提供C2与C8, N5, N10-CH2-F比为脱氧胸腺啥唗核昔酸的合成提供甲基。故一碳单位在核酸的生物合成中具有N5,N10=CH-F比-N5-CH=NH-F比重要作用,一碳单位将氨基酸代谢与核昔酸代谢密(N5,N10-次甲四氢叶酸)(N5-亚氨甲基四氢叶酸)切联系起来。一碳单位代谢障碍或FH4不足时,可引起巨幼细胞贫血等疾病。应用磺胺类药物可抑N10-CHO—F凡制某些细菌合成二氢叶酸,进而抑制细菌繁殖,但(NlO_甲酰四氢叶酸)对人体影响不大。应用叶酸类似物如甲氨蝶呤等图8-10各种不同形式—碳单位的转换可抑制F比的生成,从而抑制核酸的合成,起到抗肿瘤作用。 三、含硫氨基酸代谢可产生多种生物活性物质 含硫氨基酸包括甲硫氨酸、半胱氨酸和胱氨酸。甲硫氨酸可以转变为半胱氨酸和胱氨酸,半胱氨酸和胱氨酸又可以互相转变,但后两种都不能转变为甲硫氨酸,所以甲硫氨酸是营养必需氨基酸包。(一)甲硫氨酸参与甲基转移反应1.甲硫氨酸转甲基作用与甲硫氨酸循环有关甲硫氨酸分子中含有S-甲基,通过各种转甲基作用可生成多种含甲基的生理活性物质,如肾上腺素、肉碱、胆碱及肌酸等。但在转甲基反应前,甲硫氨酸必须经腺昔转移酶(adenosyl transferase)的催化与ATP反应,生成S-腺昔甲硫氨酸(S-adenosyl methionine, SAM)。SAM中的甲基称为活性甲基,故SAM称为活性甲硫氨酸。SAM是体内最重要的甲基直接供体。据统计,体内约有50余种物质需要SAM提供甲基,生成相应的甲基化合物。 腺昔转移酶| 甲硫氨酸 S~腺昔甲硫氨酸 S-腺昔甲硫氨酸经甲基转移酶(methyl transferase)催化,将甲基转移至另一种物质,使其发生甲基化(methylation)反应,而S-腺昔甲硫氨酸失去甲基后生成S-腺昔同型半胱氨酸,后者脱去腺昔生成同型半胱氨酸(homocysteine)。同型半胱氨酸若再接受N5-CH3-F凡提供的甲基,则可重新生成甲硫氨酸。由此形成一个循环过程,称为甲硫氨酸循环(methionine cycle)(图8-11)。此循环的生理意义是由N5-CH3-F儿提供甲基生成甲硫氨酸,再通过SAM提供甲基,以进行体内广泛存在的甲基化反应,由此,N5-CH3-FH4可看成是体内甲基的间接供体。 在甲硫氨酸循环反应中,虽然同型半胱氨酸接受甲基后可以生成甲硫氨酸,但体内不能合成同型半胱氨酸,它只能由甲硫氨酸转变而来,故甲硫氨酸必须由食物提供,不能在体内合成。 190第二篇物质代谢及其调节 甲硫氨酸 N5-CH3-F比N5-CH3-F凡转甲基酶 S-腺昔甲硫氨酸 同型半胱氨酸. H20S-腺昔同型半胱氨酸 N5-CH3-F凡提供甲基使同型半胱氨酸转变成甲硫氨酸的反应由N5-甲基四氢叶酸转甲基酶催化,此酶又称甲硫氨酸合成酶,其辅酶是维生素B12,参与甲基的转移。当维生素B12缺乏时,N5-CH3-FH4上的甲基不能转移给同型半胱氨酸。这不仅影响甲硫氨酸的合成,同时也影响四氢叶酸的再生,使组织中游离的四氢叶酸含量减少,一碳单位参与碱基合成受到影响,可导致核酸合成障碍,影响细胞分裂。因此,维生素B12不足时可引起巨幼细胞贫血。另外,同型半胱氨酸在血中浓度升高,可能是动脉粥样硬化和冠心病发生的独立危险因素3。2甲硫氨酸为肌酸合成提供甲基肌酸(creatine)和磷酸肌酸(creatine phosphate)是能量储存与利用的重要化合物。肌酸是以甘氨酸为骨架,由精氨酸提供脉基,S-腺昔甲硫氨酸提供甲基合成的,肝是合成肌酸的主要器官。在肌酸激酶(creatine kinase, CK)催化下,肌酸接受ATP的高能磷酸基形成磷酸肌酸。磷酸肌酸作为能量的储存形式,在心肌、骨骼肌及脑组织中含量丰富。 肌酸激酶由两种亚基组成,即M亚基(肌型)与B亚基(脑型),构成3种同工酶:MM、MB和BB。它们在体内各组织中的分布不同,MM主要在骨骼肌,MB主要在心肌,而BB主要在脑。当心肌梗死时,血中MB型肌酸激酶的活性增高,因此可作为心肌梗死的辅助诊断指标之一。 _,,,NH2眯基转移酶严+叩 HN=C\严+CH2NH2严3C=NH COOH CHNH, 砰比)3| COOH CHNH2鸟氨酸| I甘氨酸COOH COOH肌乙酸 精氨酸肌酸激酶,,,,NH2/NH~@ 妞I=t—CH/占 COOH J;:H腺昔同型半胱氨酸 磷酸肌酸 肌酐 肌酸和磷酸肌酸的终末代谢产物是肌酐(creati nine)。肌酐主要在骨骼肌中通过磷酸肌酸的非酶促反应生成。肌酸、磷酸肌酸和肌酐的代谢见图8-12。肌酐随尿排出,正常入每日尿中肌酐的排出量恒定。当肾功能障碍时,肌酐排出受阻,血中浓度升高。因此,血中肌酐的测定有助于肾功能不全的诊断。 (二)半胱氨酸与多种生理活性物质的生成有关 1.半胱氨酸与胱氨酸可以互变半胱氨酸含有琉基(—SH),胱氨酸含有二硫键(—S一S—),两者可以相互转变。 半胱氨酸胱氨酸 在许多蛋白质分子中,两个半胱氨酸残基间形成的二硫键对于维待蛋白质空间构象的稳定及其功能具有重要作用。如胰岛素的A、B链就是以二硫键连接的,若二硫键断裂,胰岛素即失去其生物活性。体内有许多重要的酶,如唬珀酸脱氢酶、乳酸脱氢酶等,其活性与半胱氨酸的琉基直接有关,故有琉基酶之称。某些毒物,如芬子气、重金属盐等,能与酶分子中的琉基结合而抑制该酶的活性。体内存在的还原型谷胱甘肤能保护酶分子上的琉基,因而有重要的生理功能。 2半胱氨酸可转变成牛磺酸半胱氨酸首先氧化成磺基丙氨酸,再经磺基丙氨酸脱狻酶催化,脱去狻基生成牛磺酸。牛磺酸是结合胆汁酸的组成成分之一。 CH2SH CH2S03H|3(O)|磺基丙氨酸脱狻酶CH2S03H L半胱氨酸磺基丙氨酸牛磺酸 3半胱氨酸可生成活性硫酸根含硫氨基酸氧化分解均可产生硫酸根,但半胱氨酸是体内硫酸根的主要来源。半胱氨酸可以直接脱去琉基和氨基,生成丙酮酸、氨和H2S。H2S经氧化生成H2S04。体内的硫酸根,一部分以无机盐的形式随尿排出,另一部分由ATP活化生成活性硫酸根,即3'-磷酸腺昔-5'-磷酸硫酸(3'-ph ospho-adenosine-5'-phospho-sulfate, PAPS),反应过程如下:ATP+so~-~AMP—so;-~3'-P03H2-AMP—so;-+ADP腺昔-5'-磷酰硫酸PAPSPAPS化学性质活泼,在肝生物转化中可提供硫酸根使某些物质生成硫酸酷。例如,类固醇激素可形成硫酸酷而被灭活,一些外源性酚类化合物也可以形成硫酸酷而排出体外。此外,PAPS还可参与硫酸角质素及硫酸软骨素等分子中硫酸化氨基糖的合成。 四、芳香族氨基酸代谢需要加氧酶催化 芳香族氨基酸包括苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸。酪氨酸可由苯丙氨酸轻化生成。,氨酸为营养必需氨基酸。(一)苯丙氨酸和酪氨酸代谢既有联系又有区别1.苯丙氨酸轻化生成酪氨酸正常情况下,苯丙氨酸的主要代谢途径是经轻化作用生成酪氨酸,反应由苯丙氨酸胫化酶(phenylalanine h ydroxylase)催化。苯丙氨酸轻化酶主要存在于肝等组织,属一种单加氧酶,辅酶是四氢生物蝶呤,催化的反应不可逆,故酪氨酸不能转变为苯丙氨酸。 I苯丙氨酸轻化酶 勹2四氢生N气:蝶+呤w 苯丙氨酸 苯丙氨酸除转变为酪氨酸外,少量可经转氨基作用生成苯丙酮酸。先天性苯丙氨酸胫化酶缺陷病人,不能将苯丙氨酸轻化为酪氨酸。因此,苯丙氨酸经转氨基作用生成苯丙酮酸。大量的苯丙酮酸及其部分代谢产物(苯乳酸及苯乙酸等)由尿排出,称为苯丙酮尿症(phenylketonuria, PKU)。苯丙酮酸的堆积对中枢神经系统有毒性,导致脑发育障碍,患儿智力低下。治疗原则是早期发现,并适当控制膳食中苯丙氨酸的含量。 2.酪氨酸转变为儿茶酚胺和黑色素或彻底氧化分解酪氨酸的进一步代谢与合成某些神经递质、激素及黑色素有关。酪氨酸在肾上腺髓质和神经组织经酪氨酸轻化酶(tyrosine hydrox ylase)催化生成3,4-二轻苯丙氨酸(3,4-dihydrox yphen ylalani ne, DOPA),又称多巴。与苯丙氨酸胫化酶相似,酪氨酸胫化酶也是以四氢生物蝶呤为辅酶的单加氧酶。多巴在多巴脱狻酶的作用下,脱去狻基生成多巴胺(dopamine)。多巴胺是一种神经递质。帕金森病(Parkin son disease)病人脑内多巴胺生成减少。在肾上腺髓质,多巴胺侧链的B-碳原子再被胫化,生成去甲肾上腺素(norepinephrine),后者甲基化生成肾上腺素(epinephrine)。多巴胺、去甲肾上腺素及肾上腺素统称为儿茶酚胺(catecholamine)。酪氨酸轻化酶是合成儿茶酚胺的关键酶,受终产物的反馈调节。 酪氨酸代谢的另一条途径是合成黑色素(melanin)。在黑色素细胞中,酪氨酸经酪氨酸酶(tyrosi nase)作用轻化生成多巴,后者经氧化、脱狻等反应转变成时1啋酰,最后时1啋酣聚合为黑色素。先天性酪氨酸酶缺乏的病人,因不能合成黑色素,皮肤毛发等发白,称为白化病(albinism)。病人对阳光敏感易患皮肤癌。 除上述代谢途径外,酪氨酸还可在转氨酶的催化下,生成对经苯丙酮酸,后者经尿黑酸等中间产物进一步转变成延胡索酸和乙酰乙酸,然后两者分别沿糖和脂质代谢途径进行代谢。因此,苯丙氨酸和酪氨酸是生糖兼生酮氨基酸。当体内尿黑酸分解代谢的酶先天性缺陷时,尿黑酸的分解受阻,可出现尿黑酸尿症(alkaptonuria)。 苯丙氨酸和酪氨酸的代谢过程总结如下: 苯丙氨酸转氨酶 苯丙酮酸 苯乙酸 苯丙氨酸 :酸三/。NHH/`腺:素勹:::H 50OH勹NH/4NH/NH工黑色 轻苯丙酮酸多巴多巴酣时1啋酿 勹I CH2COOH--加II+Hi__ 尿黑酸延胡索酸乙酰乙酸 (二)色氨酸分解代谢可产生丙酮酸和乙酰乙酰CoA色氨酸除生成5-胫色胺外,还可在肝经色氨酸加氧酶(t ryptophan oxygenase)催化,生成一碳单位和多种酸性中间代谢产物。 相相 色氨酸经分解可产生丙酮酸和乙酰乙酰CoA,故色氨酸为生糖兼生酮氨基酸。少部分色氨酸还可转变成烟酸,但合成量很少,不五、支链氨基酸的分解有相似的代谢过程支链氨基酸包括缎氨酸、亮氨酸和异亮氨酸,它们都是营养必需氨基酸,在体内的分解有相似的代谢过程,大致分为三个阶段心通过转氨基作用生成相应的a-酮酸;@通过氧化脱狻生成相应的脂酰CoA;@通过B-氧化过程生成不同的中间产物参与三狻酸循环,其中细氨酸分解产生唬珀酰CoA,亮氨酸产生乙酰CoA和乙酰乙酰CoA,异亮氨酸产生骁珀酰CoA和乙酰CoA。所以,这三种氨基酸分别是生糖氨基酸、生酮氨基酸和生糖兼生酮氨基酸。支链氨基酸的分解代谢主要在骨骼肌中进行(图8-13)。包综上所述,氨基酸除了作为合成蛋白质的原料外,还可以转变为神经递质、激素及其他重要的含氮生理活性物质(表8-3)。值得指出的是,其中一氧化氮(NO)的细胞信号转导功能研究近年来受到高度关注,而体内NO正是由精氨酸在一氧化氮合酶(nitric oxide synthase, NOS)催化下生成的,反应如下:氨基酸衍生的化合物天冬氨酸、谷氨酰胺、甘氨酸骠呤碱(含氮碱基、核酸成分)天冬氨酸啥唗碱(含氮碱基、核酸成分)甘氨酸卧啾化合物(细胞色素、血红素成分)苯丙氨酸、酪氨酸儿茶酚胺、甲状腺素(神经递质、激素)色氨酸5-轻色胺、烟酸(神经递质、维生素) 谷氨酸丫-氨基丁酸(神经递质)甲硫氨酸、鸟氨酸亚精胺、精胺(细胞增殖促进剂) 组氨酸组胺(血管舒张剂)半胱氨酸牛磺酸(结合胆汁酸成分)苯丙氨酸、酪氨酸黑色素(皮肤色素) 甘氨酸、精氨酸、甲硫氨酸肌酸、磷酸肌酸(能量储存)精氨酸一氧化氮(NO)(细胞信息转导分子) 氨基酸除作为合成蛋白质的原料外,还可转变成某些激素、神经递质及核芬酸等含氮物质。人体内氨基酸的来源有:食物蛋白质的消化吸收、组织蛋白质的分解和体内合成。外源性与内源性的氨基酸共同构成氨基酸代谢库,参与体内代谢已。 氨基酸的分解代谢包括一般代谢和个别代谢。氨基酸的一般分解代谢途径是针对氨基酸的a-氨基和a-酮酸共性结构的分解。氨基酸通过转氨基作用、氧化脱氨基作用等方式脱去氨基,生成a-酮酸。有毒的氨以丙氨酸和谷氨酰胺的形式运往肝或肾,在肝经乌氨酸循环合成尿素。脱去氨基生成的a-酮酸,可转变成糖或脂质,可经氨基化生成营养非必需氨基酸,也可彻底氧化分解并提供能量。 氨基酸代谢除共有的一般代谢途径外,因其侧链不同,有些氨基酸还有其特殊的代谢途径。氨基酸脱狻基作用产生的胺类化合物具有重要的生理功能;某些氨基酸分解代谢过程中产生的一碳单住可用于噤呤和啥唗核菩酸的合成;含硫氨基酸代谢产生的活性甲基,参与体内重要含甲基化合物的合成;芳香族氨基酸代谢产生重要的神经递质、激素及黑色素。 思考题 1.简述体内氨基酸的来源和主要代谢去路。2.何谓一碳单位?哪些氨基酸在代谢过程中可产生一碳单位?有何生物学意义?3.请分析谷氨酸和精氨酸治疗肝性脑病的生化机制。 4.体内重要的转氨酶有哪几种?测定血清中这些转氨酶的活性有何意义?(解军) 第九章核昔酸代谢 核昔酸是核酸的基本结构单位。核昔酸在体内分布广泛,发挥多种重要的生物学功能。人体内的核节酸主要由自身合成,因此不属于营养必需物质。核昔酸可由核酸酶水解产生或通过利用体内原料合成。本章主要从代谢角度介绍人体细胞利用各种原料合成嗦呤和啼唗核昔酸的过程,以及噤呤和啥唗核昔酸的分解代谢过程。其分解及合成过程异常与某些疾病的发生及治疗密切相关,一些嗦呤、晚唗、氨基酸或叶酸类似物可通过竞争性机制抑制核昔酸的合成,称为抗代谢物,在肿瘤的治疗中发挥重要作用。 第一节核昔酸代谢概述 核昔酸在细胞中主要以5'-核昔酸形式存在,其中5'-ATP含量最多。通常情况下,细胞中核昔酸的浓度远远超过脱氧核昔酸,前者约在毫摩尔(mmol)范围,而后者只在微摩尔(µmol)水平。在细胞分裂周期中,细胞内脱氧核昔酸含量波动范围较大,核昔酸浓度则相对稳定。不同类型细胞中各种核昔酸含量差异很大。而在同一种细胞中,各种核昔酸含量虽也有差异,但核背酸总含量变化不大。 —、核昔酸具有多种生物学功能 核昔酸具有多种生物学功用:心作为核酸合成的原料,这是核昔酸最主要的功能。@作为体内能量的利用形式。ATP是细胞的主要能量形式。此外GTP等也可以提供能量。@参与代谢和生理调节。某些核昔酸或其衍生物是重要的调节分子。例如cAMP是多种细胞膜受体激素作用的第二信使;cGMP也与代谢调节有关。@组成辅酶包。例如腺昔酸可作为多种辅酶(NAD+,FAD、CoA等)的组成成分。@活化中间代谢物。核昔酸可以作为多种活化中间代谢物的载体。例如UDP-葡糖是合成糖原、糖蛋白的活性原料,CDP-甘油二酷是合成磷脂的活性原料,S-腺昔甲硫氨酸是活性甲基的载体等。ATP还可作为蛋白激酶反应中磷酸基团的供体。 二、核昔酸经核酸酶水解后可被吸收 (一)核酸酶 核酸酶是所有可以水解核酸的酶。依据核酸酶作用的底物不同可以将其分为DNA酶(deoxyribonucl ease, DNase)和RNA酶(ribonuclease, RNase)两类。DNA酶能够专一性地催化脱氧核糖核酸的水解,而RNA酶能够专一性地催化核糖核酸的水解。按照对底物二级结构的专一性,核酸酶还有单链酶和双链酶之分。 依据对底物的作用方式可将核酸酶分为核酸外切酶(exonuclease)和核酸内切酶(endonuclease)。核酸外切酶仅能水解位千核酸分子链末端的磷酸二酷键。根据其作用的方向性,又有5'--+3'核酸外切酶和3'一5'核酸外切酶之分。从5'端切除核昔酸的称为5'一3'核酸外切酶;从3'端切除核昔酸的称为3'一5核酸外切酶。而核酸内切酶只可以在DNA或RNA分子内部切断磷酸二酷键。有些核酸内切酶的酶切位点具有核酸序列特异性,称为限制性内切核酸酶(restriction endonuclease)。一般而言,限制性内切核酸酶的酶切位点的核酸序列具有回文结构,识别长度为4~8bp(见第二十三章)。有些核酸内切酶则没有序列特异性的要求。 第九章核昔酸代谢 细胞内的核酸酶一方面参与DNA的合成与修复及RNA合成后的剪接等重要的基因复制和基因表达过程;另一方面负责清除多余的、结构和功能异常的核酸,同时也可以清除侵入细胞的外源性核酸,这些作用对千维待细胞的正常活动具有重要意义。核酸酶可以分泌到细胞外,例如在人体消化液中的核酸酶可以降解食物中的核酸以利吸收。特别是限制性内切核酸酶,由于它能够特异性地识别酶切位点,已经成为了分子生物学中的重要工具酶。目前已发现的有3000余种。 有些核酸酶属于多功能酶。例如,有些DNA聚合酶同时具有核酸外切酶活性,在DNA复制过程中可以切除错配的碱基,保证DNA生物合成的精确性。 (二)核酸的消化与吸收 食物中的核酸多以核蛋白的形式存在。核蛋白在胃中受胃酸的作用,分解成核酸与蛋白质。核酸进入小肠后,受胰液和肠液中各种水解酶的作用逐步水解(图9-1)。在小肠内,胰腺分泌的DNA酶和RNA酶可水解食物核蛋白DNA和RNA生成寡核昔酸和部分单核昔酸。小肠黏膜细胞可蛋白质工1胃酸工核酸佃砐DNA)t胰核酸酶分泌对底物有一定特异性的二酷酶和核昔酸酶。二酷酶水解核酸寡核昔酸生成单核昔酸,核昔酸酶则可水解核昔酸生成核昔和核昔-巳古酸酶磷酸。核昔可通过被动扩散方式吸收。但啥唗核昔可被肠黏膜细胞内生成的啥唗核昔酶水解生成啼唗碱基,可以通过扩散碱基-匣巴榄糖方式吸收。因此,核昔酸及其水解产物均可被细胞吸收,并且图9-1核酸的消化绝大部分在肠黏膜细胞中被进一步分解。分解产生的戊糖被吸收而参加体内的戊糖代谢;嗦呤和啥唗碱则主要被分解而排出体外。所以食物来源的嗦呤和瞪唗碱很少被机体利用。 三、核昔酸代谢包括合成和分解代谢 核昔酸根据碱基组成不同分为嗦呤核昔酸和密唗核昔酸两大类。这两种核昔酸的代谢均包括合成和分解代谢。核昔酸合成代谢根据方式的不同均包括从头合成和补救合成两种途径。从头合成的碱基来源是利用氨基酸、一碳单位及CO2等新合成含N的杂环;补救合成碱基的来源于体内游离碱基。在分解代谢中,嗦呤核昔酸的分解产物主要是水溶性较差的尿酸;i密唗核昔酸的分解产物是易溶于水的NH3、CO2及B-丙氨酸。 第二节噤呤核昔酸的合成与分解代谢 一、噤呤核苦酸的合成存在从头合成和补救合成两条途径生物体内细胞利用磷酸核糖、氨基酸、一碳单位和CO2等简单物质为原料,经过一系列酶促反应,合成嗦呤核昔酸,称为从头合成途径(de nova synthesi s)(动画9-1"嗦呤核背酸合成过程中的元素来源”);利用体内游离的嗦呤或嗦呤核昔,经过简单的反应过程,合成嗦呤核昔酸,称为补救合成途径(sa lvage pathway),或称重新利用途径。两种途径在人体内不同组织中的重要性不同,从头合成嗦呤核昔酸的主要器官是肝,其次是小肠黏膜和胸腺;补救合成的主要器官是脑和骨髓等。一般情况下,前者是合成的主要途径。 (—)噤呤核昔酸的从头合成 1.从头合成途径除某些细菌外,几乎所有生物体都能合成嗦呤碱。放射性核素示踪实验证明,合成噤呤碱的前身物均为简单物质,合成噤呤环的各元素来源包括氨基酸、CO2及甲酰基(来自四氢叶酸)等(图9-2)。噤呤核昔酸的从头合成在细胞质中进行,其过程是从核糖-5'-磷酸起始逐步合成嗦呤环。反应步骤比较复杂,可分为两个阶段:首先合成次黄嗦呤核昔酸(i nosine monophosphate,IMP),然后IMP再转变成腺嗦呤核昔酸(AMP)与鸟嗦呤核昔酸(GMP)。 198第二篇物质代谢及其涸节 应完成(图9-3)。心核糖-5'-磷酸(磷酸戊糖途径中产生)经过磷酸核糖焦磷酸合成酶作用,将谷氨酰胺谷氨酸甘氨酸 R—5'—P 已 AMP ATP ,_,,_R一5'—P芩贮1'-R-5'—-pH2C-NH2PRPP合成酶酰胺转移酶5'-磷酸核糖胺R—5'—P R-5'— 0P FH4 (1)过11步反IMP的合成经IMP的合成:02CJ'一一大冬氨酸CL5'-磷酸的ATP转移到核糖-1分子焦磷酸从>(5'-phosl'-焦磷酸生成5'磷酸核糖-上,活化-(寸谈单位)~甲酰Jlg-(碳单位)sphate,)。@谷氨酰syl-1'-pyropho PRPPphoribo成5'上的焦磷酸,形取代PRPP/胺提供酰胺基\胺转应由磷酸核糖酰(PRA),此反磷酸核糖胺分?从欣胺(颅胺从)不稳定,催化。PRA极se)移酶(amidotransfera噤呤碱合成的元素来源图9-27.嗦呤秒。该反应是5条件下为30其ti/2在pH酸(glcinamide氨酰胺核昔PRA加合,生成甘酸与ri。@由ATP供能,甘氨核昔酸从头合成的关键步骤y(formyl氨酰胺核昔酸GAR甲酰化,生成甲酰甘IO甲酰四氢叶酸供给甲酰基,使GAR)。@Nbonucleotide,-酸氨脉核昔生成甲酰甘胺氮,使FGAR酰胺提供酰。@谷氨FGAR)ribonucleotidglycinamide e,5'-磷酸核糖-1'-焦磷酸5'-磷酸核糖(PRA)NH\NH甲酰FH4谷氨酸谷氨酰胺N1°-/\<[严H拉C=0H2人二|上|| HN=q_H-ATP,Mg+\NH \转甲酰基酶|严I—— PR5' 0 酸甘氨酰胺核昔甲酰甘氨酰胺核节酸甲酰甘氨眯核昔酸(GAR)(FGAR)(FGAM)H6.-c|一好-·-,~,,l』/N呼。、CH勹/N n—、C\比_」NHCII II II天冬氨酸,CHC\P玉妇贮\—5'\————PR5'P5'--4-甲酰N-骁珀酰-5-氨基咪陛酸5-氨基咪嗤核昔狻酸核昔酸5-氨基咪嗤-4-)胺核昔酸(SAICAR(AIR))(CAIRH2N/C\N/CH co2H2N/N/:Q沉_H2N/c\f/。 cH邸寇~II/1\,CH 玑NIO-甲酰FH4 10三C飞 酸索胡 IMP合酶 AICAR转甲酰基酶Hz 5-氨基咪陛-4-甲酰胺核昔酸 5-甲酰胺基咪陛-4-甲酰胺核昔酸 次黄骠呤核昔酸 (formylglycinamidine ribonucleotide, FGAM),此反应消耗1分子ATP。@FGAM脱水环化形成5氨基咪嗤核昔酸(5-aminoimidazole ribonucleotide, AIR),此反应也需要ATP参与。至此,合成了嗦呤环中的咪挫环部分。(J)C02连接到咪嗤环上,作为嗦呤碱中c6的来源,生成5-氨基咪嗤-4狻酸核昔酸(carboxyaminoimidazole ribonucleotide, CAIR)。@在ATP存在下,天冬氨酸与CAIR缩合,生成N-唬珀酰-5-氨基咪陛-4-甲酰胺核昔酸(N-succinyl-5-aminoimidazo le-4-carboxamide ribonucleotide, SAICAR)。@SAICAR脱去1分子延胡索酸,裂解为5-氨基咪嗤-4-甲酰胺核昔酸(5-aminoimidazole-4-carboxamide ribonucleotide, AICAR)。面NIO_甲酰四氢叶酸提供甲酰基(一碳单位),使AICAR甲酰化,生成5-甲酰胺基咪嗤-4-甲酰胺核昔酸(N-formylaminoimidazole-4-carboxamide ribonucleotide, FAICAR)。@FAICAR脱水环化,生成IMP。嗦呤核昔酸从头合成的酶在细胞质中多以酶复合体形式存在。 (2)IMP转变生成AMP和GMP:IMP虽然不是核酸分子的主要组成单位,但它是嗦呤核昔酸合成的前体或重要中间产物,IMP可以分别转变成AMP和GMP(图9-4)。 腺昔酸代骁珀酸AMP 5`“卢丫/ 酸氨冬夭 勹二:\勹pl HN O I N> :比0坚三三 O腺昔酸代琉珀酸合成酶@IMP脱氢酶@腺昔酸代骁珀酸裂解酶@GMP合成酶(3)ATP和GTP的生成:AMP和GMP在激酶作用下,经过两步磷酸化反应,进一步分别生成ATP和GTP~。 由上述反应过程可以清楚地看到,嗦呤核昔酸是在磷酸核糖分子上逐步合成膘呤环的,而不是首先单独合成嗦呤碱然后再与磷酸核糖结合。这是与啼唗核昔酸合成过程的明显差别,也是嗦呤核昔酸从头合成的一个重要特点。肝是体内从头合成嗦呤核昔酸的主要器官,其次是小肠黏膜及胸腺。现已证明,并不是所有的细胞都具有从头合成嗦呤核昔酸的能力。 200第二篇物质代谢及其调节 2.从头合成的调节嗦呤核昔酸的从头合成是体内核背酸的主要来源,但这个过程需要消耗氨基酸等原料及大量ATP。机体对其合成速度进行着精确的调节,一方面为满足合成核酸而对嗦呤类核昔酸的需要,同时又不会”供过于求",以节省底物及能量的消耗。此反应以反馈调节为主(图9-5)(动画9-2"嗦呤核昔酸从头合成的调节”)。 ...,-.”“心心心心心.·.·:::::.·.::•.·.••.....••-;................. R-5'-P}PRP;合成酶十酰;;移酶腺玻昔珀 酸 . ;一AMP-ADP-ATP. PRPP、声PRA--lMP ATP J•••_····•:-:...........·..、·....,,,::.. XMP-GMP.-GDP.-GTP·...-······.................................._....;.. ...·....参,心...···...•:;:::::::::::::::::::::: :::::::::::::::: :::::. · · . . · ....... f腺昔酸代_-AMP—--ADP-ATP--夕会骁珀酸+.•·... IMP GTP•·.......................·.·.···················夕夕..心..:::::....... 嗦呤核昔酸从头合成途径中,主要调控环节是第一步生成PRPP和第二步生成5'-磷酸核糖胺(PRA)的反应。催化这两阶段反应的PRPP合成酶和PRPP酰胺转移酶是被调控的关键酶,均可被合成的产物IMP、AMP及GMP等抑制。反之,PRPP增加可以促进酰胺转移酶活性,加速PRA生成。PRPP酰胺转移酶是一类别构酶,其单体形式有活性,二聚体形式无活性。IMP、AMP及GMP能使活性形式转变成无活性形式,而PRPP则相反。在嗦呤核昔酸合成调节中,PRPP合成酶可能比酰胺转移酶起着更大的作用,所以对PRPP合成酶的调控更为重要。 此外,在形成AMP和GMP过程中,IMP转化为AMP时需要GTP,转化为GMP时需要ATP。GTP可以促进AMP的生成,ATP也可以促进GMP的生成。过量的AMP控制AMP的生成,而不影响GMP的合成;同样,过量的GMP控制GMP的生成,而不影响AMP的合成。这种交叉调节作用对维持ATP与GTP浓度的平衡具有重要意义。(二)噤呤核苦酸的补救合成有两种方式其一,细胞利用现成嗦呤碱或嗦呤核昔重新合成嗦呤核昔酸。补救合成过程比较简单,消耗能量也少。有两种酶参与噤呤核昔酸的补救合成:腺嗦呤磷酸核糖转移酶(adenine phosphoribosyl transferase,APRT)和次黄嗦呤-鸟嗦呤磷酸核糖转移酶(hypoxanthine-guanine phosphoribosyl transferase, HGPRT)。PRPP提供磷酸核糖,它们分别催化AMP、IMP和GMP的补救合成。 腺噤呤+PRPP APRT)IAMP+PPi 次黄嗓呤+PRPP HCPIlT)IIMP+PPi 鸟啋呤+PRPP~GMP+PPi APRT受AMP的反馈抑制,HGPRT受IMP与GMP的反馈抑制。 其二,人体内嗦呤核背的重新利用通过腺昔激酶催化的磷酸化反应,使腺嗦呤核甘生成腺嗦呤核昔酸。 腺有激酶腺嗓呤核昔/、`►AMP 生物体内除腺昔激酶外,不存在作用其他嗦呤核昔的激酶。嗦呤核昔酸补救合成途径中主要以磷酸核糖转移酶催化的反应为主。嗦呤核昔酸补救合成的生理意义一方面在千可以节省从头合成时能量和一些氨基酸的消耗;另一方面,体内某些组织器官,例如脑、骨髓等由于缺乏从头合成嗦呤核昔酸的酶体系,它们只能进行嗦呤核昔酸的补救合成。因此,对这些组织器官来说,补救合成途径具有更重要的意义。例如,由于基因缺陷而导致HGPRT完全缺失的患儿,表现为莱施-奈恩综合征或称Lesch-Nyhan综合征,这是一种遗传代谢病。 (三)体内噤呤核昔酸可以相互转变体内嗦呤核昔酸可以相互转变,以保待彼此平衡。前已述及,IMP可以转变成XMP、AMP及GMP。此外,AMP、GMP也可以转变成IMP。由此,AMP和GMP之间也是可以相互转变的。(四)脱氧核昔酸的生成在二磷酸核昔水平进行DNA由各种脱氧核昔酸组成。细胞分裂旺盛时,脱氧核昔酸含量明显增加,以适应合成DNA的需要。脱氧核昔酸,包括嗦呤脱氧核昔酸和啥唗脱氧核昔酸从何而来?现已证明,体内脱氧核昔酸中所含的脱氧核糖并非先形成后再连接上碱基和磷酸,而是通过相应的核昔酸的直接还原作用,以氢元素取代其核糖分子中乌上的胫基而生成的。除dTMP是从dUMP转变而来以外,其他脱氧核甘酸都是在二磷酸核昔(NDP)水平上进行(N代表A、G、u,c等碱基),由核昔酸还原酶(ribonucleotide reductase)催化,反应如下。 NADPH+H'NA DP++H20HO—P—O—P—0-C比碱基核昔酸还原酶其实这一反应的过程比较复杂(图9-6)。白(如oredoxin)作为电子载体。硫氧还蛋白的分子量约为12kD,其所含的琉基在核昔酸还原酶作用下氧化为二硫键。后者再经称为硫氧还蛋白还原酶(thioredoxin reductase, Trx)的催化,重新生成还原由此构成一个复杂的酶体系。个亚基结合并有M忙存在时才具有酶活性。在DNA合成旺盛、分裂速度较快的细胞中,二磷酸核昔\\\/磷酸脱氧核昔细胞除了控制核昔酸还原酶的活性以调。 核背酸还原酶从NADPH获得电子时,需要硫氧还蛋 型的硫氧还蛋白, 核昔酸还原酶是一种别构酶,包括两个亚基,只有两核昔酸还原酶体系活性较强。 还原型硫氧氧化型硫氧 还蛋白-(SH)2还蛋白丿附昙屈t-赞笠次黄嗓;R,'IMP-:芦昙霍千'}氨基酸类似物有氮杂丝氨酸(azaserine)及6-重氮-5-氧正亮氨酸(diazonorleucine)等。它们的结构与谷氨酰胺相似,可干扰谷氨酰胺在嗦呤核昔酸合成中的作用,从而抑制嗦呤核昔酸的合成。 氨蝶呤(aminopterin)及氨甲蝶呤(methotrexate,MTX)都是叶酸的类似物,能竞争性抑制二氢叶酸还原酶,使叶酸不能还原成二氢叶酸及四氢叶酸。因此嗦呤分子中来自一碳单位的C8及乌均得不到供应,从而抑制了嗦呤核昔酸的合成。MTX在临床上用于白血病等的治疗。 应该指出的是,上述药物缺乏对肿瘤细胞的特异性,故对增殖速度较旺盛的某些正常组织亦有杀伤性,因而具较大的毒副作用。“Y¥嗦呤核昔酸抗代谢物的作用部位可归纳如图9-7。 二、嗦呤核昔酸的分解代谢终产物是尿酸 细胞内核昔酸的分解代谢类似于食物中核昔酸的消化过程。首先,细胞中的核昔酸在核昔酸酶的作用下水解成核昔。核昔经核昔磷酸化酶作用,磷酸解成自由的碱基及核糖-l-磷酸。嗦呤碱基可以参加核昔酸的补救合成,也可以进一步水解。人体内,嗦呤碱基最终分解生成尿酸(uric acid),随尿排出体外。反应过程简化(图9-8)。AMP生成次黄噤呤,后者在黄嗦呤氧化酶(xanthine oxidase)作用下氧化成黄嗦呤,最后生成尿酸。GMP生成鸟嗦呤,后者转变成黄嗦呤,最后也生成尿酸。嗦呤脱氧。 核昔也经过相同的途径进行分解代谢。体内嗦呤核昔酸的分解代谢主要在肝、小肠及肾中进行,黄嗦呤氧化酶在这些组织中活性较强。 AMP-潭次黄骠呤1如嫖呤氧化酶 鸟卿呤-----/了H N 图9-8噤呤核苦酸的分解代谢尿酸是人体嗦呤分解代谢的终产物,水溶性较差。 黄骠呤 黄嗦呤氧化酶 当进食高嗦呤饮食、体内核酸大量分解(如白 血病、恶性肿瘤等)或肾疾病而使尿酸排泄障碍时,均可导致血中尿酸升高。临床上常用别嗦呤醇(allop urinol)治疗痛风症。别嗦呤醇与次黄嗦呤结构类似,只是分子中凡与乌互换了位置,故可抑制黄嗦呤氧化酶,从而抑制尿酸的生成(图9-9)。黄嗦呤、次黄嗦呤的水溶性较尿酸大得多,不会沉积形成结晶。同时,别嗦呤与PRPP反应生成别嗦呤核昔酸,这样一方面消耗PRPP而使其含量减少,另一方面别嗦呤核昔酸与IMP结构相似,又可反馈抑制嗦呤核昔酸从头合成的酶。这两方面的作用均可使嗦呤核昔酸的合成减少。 次黄嗦呤别骠呤醇 鸟嗦呤————--~黄嗦呤氧化酶 姨萨擘婕黄骠呤l|X尿酸 次黄嗓呤//衣二、别嗦呤醇/ 第三节皖唗核苦酸的合成与分解代谢—、晚唗核昔酸的合成也有从头合成与补救合成两条途径与嗦呤核昔酸一样,体内1密唗核昔酸的合成也有两条途径,即从头合成与补救合成。(-)晚哫核昔酸的从头合成比嗦呤核苦酸简单1.从头合成途径放射性核素示踪实验证明,晚唗核昔酸中1密唗碱合成的原料来自谷氨酰胺、CO2和天冬氨酸等(图9-lO)。啼唗核昔酸的合成主要在肝中进行,反应过程在细胞质和线粒体进行。\,平?\l与噤呤核昔酸的从头合成途径不同,啼唗核昔酸的合成是:,c_:先合成含有啥唗环的乳清酸,然后再与磷酸核糖相连。啼唗核昔酸合成的过程如下岱:氨基甲酰磷酸订尸二天冬氨酸C~~_l_/气:(1)尿啼唗核昔酸的合成:啥唗环的合成开始于氨基甲酰汛:~-----~磷酸的生成。正如氨基酸代谢一章所讨论的,氨基甲酰磷酸也图9-10i密唗碱合成的元素来源是尿素合成的原料。但是,尿素合成中所需的氨基甲酰磷酸是在肝线粒体中由氨基甲酰磷酸合成酶I催化生成的,而啥唗合成所用的氨基甲酰磷酸则是在细胞质中用谷氨酰胺为氮源,由氨基甲酰磷酸合成酶II催化生成的。这两种合成酶的性质不同。上述生成的氨基甲酰磷酸在胞质中的天冬氨酸氨基甲酰转移酶(aspartate transcarbamoylase)催化下,与天冬氨酸化合生成氨甲酰天冬氨酸。后者经二氢乳清酸酶催化脱水,形成具有啼唗环的二氢乳清酸,再经二氢乳清酸脱氢酶作用,脱氢成为乳清酸(orotic acid, OA)。乳清酸不是构成核酸的瞪唗碱,但它在乳清酸磷酸核糖转移酶催化下可与PRPP结合,生成乳清酸核昔酸(orotidine5'-monophosphate, OMP),后者再由乳清酸核昔酸脱狻酶催化脱去狻基,即生成尿啼唗核昔酸(uridine monophosphate, UMP)。胞瞪唗核昔酸和胸腺啥唗核昔酸均可由UMP转变而来(图911)国。 胺丛谷丛 旺尸 氨磷酶 酰成 甲合基酸 酸+氨 H c\C|C天冬氨酸氨『基甲酰基转移酶HO—C、 比艾氨 氨基甲酰磷酸 氨甲酰天冬氨酸 冬夭酶酸 乳清 清皿 二/\二 磷酸核糖 亡三卢 脱氢酶 乳氢 酸昔核酸0 R一5'-P乳清酸 HONl|-尿瞪唗核昔酸 清(乳 了下 啼唗核苦酸的合成代谢 在真核细胞中啼唗核昔酸合成的前三个酶,即氨基甲酰磷酸合成酶II、天冬氨酸氨基甲酰转移酶和二氢乳清酸酶,位于分子量约为200kD的同一条多肤链上,因此是一种多功能酶;后两个酶也是位于同一条多肤链上的多功能酶。因此更有利于以均匀的速度参与啥唗核节酸的合成。 N5,N10亚甲四氢叶酸提供甲基后生成的二氢叶酸又可在二氢叶酸还原酶的作用下,重新生成四氢叶酸。dUMP可来自两个途径:一是dUDP的水解脱磷酸,另一个是dCMP的脱氨基,以后一种为主。胸昔酸合成酶与二氢叶酸还原酶可被用于肿瘤化疗的靶点。 2.从头合成的调节在细菌中,天冬氨酸氨基甲酰ATP+CO2+Gln 转移酶是啼唗核昔酸从头合成的主要调节酶。但是,哺乳类动物细胞中,晚唗核昔酸合成的调节酶则主要是氨 :氨基甲酰磷酸基甲酰磷酸合成酶II,它受UMP抑制。这两种酶均受反:i<巠___________________7馈机制的调节。此外,哺乳类动物细胞中,上述UMP合氨基甲酰天冬氨酸/嗦呤核昔酸l v吩成起始和终末的两种多功能酶还可受到阻遏或去阻遏的厂PRPP8'ATP+R-5'-P调节。核素掺入实验表明,晚唗与嗦呤的合成有着协调L.---UMPi忒'啼唗核昔酸控制关系,两者的合成速度通常是平行的。UTP-----CTP---------------由于PRPP合成酶是啥唗与嗦呤两类核昔酸合成过程中共同需要的酶,所以它可同时接受瞪唗核昔酸及嗦图9-12晓唗核昔酸合成的调节部位呤核昔酸的反馈抑制。啥唗核昔酸合成的调节如图所示(图9-12)。 (二)晇唗核昔酸的补救合成途径与噤呤核昔酸类似瞪唗磷酸核糖转移酶是啼唗核甘酸补救合成的主要酶,催化反应的通式如下:啼唗+PRPP啥唗磷酸核糖转移酶)o磷酸瞪唗核昔+PPi瞪唗磷酸核糖转移酶已经从人红细胞中被纯化,它能利用尿啥唗、胸腺啥唗及乳清酸作为底物(实际上与前述的乳清酸磷酸核糖转移酶是同一种酶),但对胞瞪唗不起作用。 尿昔激酶也是一种补救合成酶,催化尿昔生成尿昔酸。 脱氧胸昔可通过胸昔激酶催化生成dTMP。此酶在正常肝中活性很低,而再生肝中酶活性升高,在恶性肿瘤中该酶活性也明显升高并与恶性程度有关。 (三)晇哫核昔酸的抗代谢物也是晚哫、氨基酸或叶酸等的类似物与嗦呤核昔酸一样,瞪唗核昔酸的抗代谢物也是一些啼唗、氨基酸或叶酸等的类似物。它们对代谢的影响及抗肿瘤作用与嗦呤抗代谢物相似。 啥唗的类似物主要有5-娠尿啥唗(5-fluorouracil,5-FU),它的结构与胸腺啼唗相似。5-FU本身并无生物学活性,必须在体内转变成一磷酸脱氧氮尿瞪唗核昔(FdUMP)及三磷酸氛尿啼唗核昔(FUTP)后,才能发挥作用。FdUMP与dUMP有相似的结构,是胸背酸合酶的抑制剂,可以阻断dTMP的合成。FUTP可以FUMP的形式掺入RNA分子,异常核昔酸的掺入破坏了RNA的结构与功能。 氨基酸类似物、叶酸类似物已在嗦呤抗代谢物中介绍。例如,由于氮杂丝氨酸类似谷氨酰胺,可以抑制CTP的生成;甲氨蝶呤干扰叶酸代谢,使dUMP不能利用一碳单位甲基化而生成dTMP,进而影响DNA合成。另外,某些改变了核糖结构的核昔类似物,例如阿糖胞甘和环胞昔也是重要的抗癌药物。阿糖胞昔能抑制CDP还原成dCDP,也能影响DNA的合成。 第二篇物质代谢及其调节 三古因 5-氪尿啼唗(5-FU)阿糖胞昔环胞昔瞪唗核昔酸类似物的作用环节可归纳如下(图9-13)。 出或进一步分解。摄入DNA丰富的食物的人以及经放射线治疗或化学治疗后的肿瘤病入,其尿液中B氨基异丁酸排出量增多。啼唗碱的分解代谢主要在肝进行。与嗦呤碱的分解产生尿酸不同,啥唗碱的分解产物均易溶于水。 出,"刁石1<:, ,不飞,.." }B-脉基异丁酸二氢尿啼唗 o-丙氨酸`j肝凡N-CH2-『一心骂酸 丙二酸单酰CoA甲基丙二酸单酰CoA }尿素乙酰CoA 骁珀酰CoA 三狻酸循环三狻酸循环糖异生 小结 核苍酸是核酸的基本组成单位,具有多种重要的生理功能,其中最主要的是作为合成核酸分子的原料。除此,还参与能量代谢、代谢调节等过程。体内的核芬酸的来源主要由机体细胞自身合成。食物来源的噤呤和啥唗极少被机体利用。食物中或机体细胞中的核酸可被核酸酶降解。核酸酶是能够水解核酸的酶,根据作用底物的不同分为DNA酶及RNA酶。根据作用位点的不同分为核酸外切酶及核酸内切酶。食物中的DNA和RNA在小肠袚核酸酶水解为寡核符酸和部分单核芬酸。核廿酸被核菩酸酶进一步水解生成核芬和磷酸。核芬及碱基可通过扩散等方式被吸收。核符酸在体内的代谢主要包括合成代谢和分解代谢。 体内嗦呤核符酸的合成有两条途径:从头合成和补救合成途径。从头合成途径的原料是磷酸核树氨基酸、一碳单位和CO2等简单物质,在PRPP的基础上经过一系列酶促反应,逐步形成噤呤环。首先生成IMP,然后再分别转变成AMP和GMP。从头合成过程受着精确的反馈调节。补救合成途径实际上是现成嗦呤或嗦呤核书的重新利用,虽然合成含量极少,但也有重要的生理意义。 机体也可以从头合成喀唗核菩酸,但不同的是先合成喀唗环,再磷酸核糖化而生成核符酸。"密唗核苍酸的从头合成途径也受反馈调控。体内脱氧核菩酸由各自相应的核符酸在二磷酸水平上还原生成。核芬酸还原酶催化此反应。四氢叶酸携带的一碳单位是合成胸芬酸过程中甲基的必要来源。根据噤呤核芬酸和,密唗核符酸的合成过程,可以设计多种抗代谢物,包括噤呤、喀唗类似物,叶酸类似物及氨基酸类似物等。这些抗代谢物在抗肿瘤治疗中有重要作用。 嗦呤在人体内分解代谢的终产物是尿酸,黄噤呤氧化酶是这个代谢过程的重要酶。痛风症主要是由于噤呤代谢异常,尿酸生成过多而引起的。啥哫分解后产生的B-氨基酸可随尿排出或进一步代谢。 1.什么是从头合成?核芬酸从头合成的原料有哪些? 2.什么是核酸酶?根据对底物的作用方式不同核酸酶有哪些分类? 3.补救合成的意义是什么? 4.核芬酸抗代谢物有哪些?举例说明。 5.噤呤及啥唗核符酸分解代谢产物是什么?痛风和哪种产物相关?为什么? (高旭) 第十章代谢的整合与调节 代谢(metabolism)是指机体活细胞内的全部化学变化,其反应几乎全部是酶促反应。代谢是生命活动的物质基础。经消化、吸收获得的营养物质(如糖类、脂质和蛋白质等)在体内进行各种代谢过程,一方面将营养物质分解氧化、释出能量以满足生命活动的需求,另一方面机体进行各种合成代谢以提供自身所需的结构成分。因此,代谢分为分解代谢和合成代谢,由许多代谢途径组成,每一条代谢途径又包含一系列前后有关的酶促反应。有些不同的代谢途径会分享某些共同的酶促化学反应,所以,各种代谢途径相互联系、相互作用、相互协调和相互制约,形成一个网状的整体,即代谢具有整体性包。 为了适应不断变化的内、外环境,机体需要不断调节各种物质的代谢方向、流量和速率,从而使体内物质的代谢有条不紊地进行,即代谢具有可调节性。机体各组织、器官除了具有一般的基本代谢外,还具有各自不同的代谢特点,以适应相应的功能需要。这是由于这些组织、器官的细胞中形成了特定的酶谱,即不同的酶系种类和含量。 第一节代谢的整体性 —、体内代谢过程互相联系形成一个整体 (一)代谢的整体性 在体内进行代谢的物质各种各样,不仅有糖、脂质、蛋白质这样的大分子营养物质,也有维生素这样的小分子物质,还有无机盐、甚至水。它们的代谢不是孤立进行的,同一时间机体有多种物质的代谢在进行,需要彼此间相互协调,以确保细胞乃至机体的正常功能。事实上,人类摄取的食物,无论动物性或植物性食物均同时含有蛋白质、脂质、糖类、水、无机盐及维生素等。从消化吸收开始、经过中间代谢、到代谢废物排出体外,这些物质的代谢都是同时进行的,且互有联系、相互依存,各种物质的代谢之间相互联系构成统一的整体。如糖、脂肪在体内氧化释出的能量可用于核酸、蛋白质等的生物合成,各种酶蛋白合成后又催化糖、脂质、蛋白质等物质代谢按机体的需要顺利进行。 (二)体内各种代谢物都具有各自共同的代谢池 人体主要营养物质如糖、脂质、蛋白质,既可以从食物中摄取,多数也可以在体内自身合成。在进行中间代谢时,机体不分彼此,无论自身合成的内源性营养物质和食物中摄取的外源性营养物质,均组成为共同的代谢池(metabolic pool),根据机体的营养状态和需要,同样地进入各种代谢途径进行代谢。如血液中的葡萄糖,无论是从食物中消化吸收的、肝糖原分解产生的、氨基酸转变产生的或是由甘油转化生成的,都参与组成血糖,在机体需要能量时,均可在各组织进行有氧氧化或无氧氧化,释放出能量供机体利用,机会均等。 (三)体内代谢处千动态平衡 体内各种营养物质的代谢总是处千一种动态的平衡之中。在正常生理状态下,体内糖、脂质、蛋白质等物质面临多条代谢途径,或合成或分解,有获取则随之被转变(消耗),有消耗则适时获得补充,使其中间代谢物不会出现堆积或匮乏的现象。如血糖浓度虽然维持一定浓度范围,但其成分每分钟都在不断更新。体内其他物质也均如此处千动态平衡之中。我国著名的生物化学家刘思职院士曾将代谢的动态平衡高度哲理性地概括为:“生者化,化又生,生化即化生;新必陈,陈乃谢,新陈恒代谢”。 (四)氧化分解产生的NADPH为合成代谢提供所需的还原当量体内许多生物合成反应是还原性合成,需要还原当量,这些生物合成反应才能顺利进行。体内合成代谢所需的还原当量的主要提供者是NADPH,它主要来源于葡萄糖的磷酸戊糖途径包。所以,NADPH能将氧化反应和还原反应联系起来,将物质的氧化分解与还原性合成联系起来,将不同的还原性合成联系起来。如葡萄糖经磷酸戊糖途径分解生成的NADPH,既可为乙酰辅酶A合成脂肪酸,也可为乙酰辅酶A合成胆固醇提供还原当量。 二、物质代谢与能量代谢相互关联 糖、脂肪及蛋白质是人体的主要能量物质,虽然这三大营养物质在体内分解氧化的代谢途径各不相同,但都有共同的中间代谢物乙酰辅酶A卤。三狻酸循环和氧化磷酸化是糖、脂肪、蛋白质最后分解的共同代谢途径,释出的能盘均以ATP形式储存包。 机体的各种生命活动如生长、发育、繁殖、修复、运动,包括各种生命物质的合成等均需要能量。人体能批的来源是营养物质,但糖、脂肪、蛋白质中的化学能不能直接用于各种生命活动,机体需氧化分解营养物质,释放出化学能,并将其大部分储存在可供各种生命活动直接利用的ATP中。ATP作为机体可直接利用的能量载体,将产能的营养物质分解代谢与耗能的物质合成代谢联系在一起、将代谢与其他生命活动联系在一起包。 从能量供应角度看,三大营养物质可以互相替代、互相补充,但也互相制约。一般情况下,供能以糖及脂肪为主,并尽量减少蛋白质的消耗。这不仅因为动物及人摄取的食物中以糖类最多,占总热量的50%-70%;脂肪摄入撮虽然不是最多,占总热量的10%~40%,但它是机体储能的主要形式,可达体重的20%或更多(肥胖者可达30%-40%);还因为蛋白质是机体最重要的组成成分,通常无多余储存。在因疾病不能进食或无食物供给时,为保证血糖恒定,肝糖异生增强,蛋白质分解加强。如饥饿持续(一周以上),长期糖异生增强使蛋白质大量分解,势必威胁生命,故机体通过调节作用转向以保存蛋白质为主,体内各组织包括脑组织以脂肪酸及酮体为主要能源,蛋白质的分解明显降低。 糖、脂肪、蛋白质都通过三狻酸循环和氧化磷酸化彻底氧化供能,任一供能物质的分解代谢占优势,常能抑制其他供能物质的氧化分解。如脂肪分解增强,生成ATP增多,ATP/ADP比值增高,可别构抑制糖分解代谢关键酶-~磷酸果糖激酶-1的活性,可减缓葡萄糖的分解代谢。另一方面,上述物质又可激活果糖二磷酸酶-1,促进糖异生,将非糖物质转化为糖,使富裕的能源物质部分以糖原的形式储存起来。若葡萄糖氧化分解增强使ATP增多时,可抑制异拧檬酸脱氢酶活性,导致拧檬酸堆积;后者透出线粒体,激活乙酰辅酶A狻化酶,促进脂肪酸合成、抑制脂肪酸分解。 三、糖、脂质和蛋白质代谢通过中间代谢物而相互联系体内糖、脂质、蛋白质和核酸等的代谢不是彼此孤立的,而是通过共同的中间代谢物、三狻酸循环和生物氧化等彼此联系、相互转变(图10-1)已。一种物质的代谢障碍可引起其他物质的代谢紊乱,如糖尿病时糖代谢的障碍,可引起脂质代谢、蛋白质代谢甚至水盐代谢紊乱。 (一)葡萄糖可转变为脂肪酸 当摄入的葡萄糖超过体内需要时,除合成少量糖原储存在肝及肌外,葡萄糖氧化分解过程中生成的拧檬酸及最终产生的ATP增多,可别构激活乙酰辅酶A狻化酶,使葡萄糖分解产生的乙酰辅酶A狻化成丙二酸单酰辅酶A,进而合成脂肪酸及脂肪。这样,可将葡萄糖转变成脂肪储存千脂肪组织。所以,摄取不含脂肪的高糖膳食过多,也能使人血浆甘油三酷升高,并导致肥胖。但是,脂肪分解产生的脂肪酸不能在体内转变为葡萄糖,因为脂肪酸分解生成的乙酰辅酶A不能逆行转变为丙酮酸。尽,I)吓管脂肪分解产生的甘油可以在肝、肾、肠等组织甘油激酶的作用下转变成磷酸甘油,进而转变成糖,但与脂肪中大最脂肪酸分解生成的乙酰辅酶A相比,其量极少。此外,脂肪酸分解代谢能否顺利进行及其强度,还依赖于糖代谢状况。当饥饿、糖供给不足或糖代谢障碍时,尽管脂肪可以大量动员,并在肝经仕氧化生成大量酮体,但由千糖代谢不能满足相应的需要,草酰乙酸生成相对或绝对不足,导致大量酮体不能进入三狻酸循环氧化,在血中蓄积,造成高酮血症。区三==[3-磷酸甘油醒=二之6磷酸葡糖酸甘油ti I磷酸烯醇式丙酮酸脂肪酸`/,[三二三苏氨酸、半胱氨酸胆固醇-三二五;三尸酮体嘉酪氨酸--贮延胡索酸苯丙氨酸、固10-1糖、脂质、氨基酸代谢途径的相互联系仁二]为枢纽性中间代谢物(二)葡萄糖与大部分氨基酸可以相互转变组成人体蛋白质的20种氨基酸中,除生酮氨基酸(亮氨酸、赖氨酸)外,都可通过脱氨作用,生成相应的a-酮酸。这些a-酮酸可转变成某些能进入糖异生途径的中间代谢物,循糖异生途径转变为葡萄糖。如丙氨酸经脱氨基作用生成的丙酮酸,可异生为葡萄糖。精氨酸、组氨酸、脯氨酸可先转变成谷氨酸,进一步脱氨生成a-酮戊二酸,再经草酰乙酸、磷酸烯醇式丙酮酸异生为葡萄糖。葡萄糖代谢的一些中间代谢物,如丙酮酸、a-酮戊二酸、草酰乙酸等也可氨基化生成某些非必需氨基酸。但苏氨酸甲硫氨酸、赖氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、缅氨酸、组氨酸、苯丙氨酸及色氨酸等9种氨基酸不能由糖代谢中间物转变而来。总之,20种氨基酸除亮氨酸及赖氨酸外均可转变为糖,而糖代谢中间代谢物仅能在体内转变成11种非必需氨基酸。国(三)氨基酸可转变为多种脂质但脂质几乎不能转变为氨基酸体内的氨基酸,无论是生糖氨基酸、生酮氨基酸(亮氨酸、赖氨酸),还是生酮兼生糖氨基酸(异亮氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、酪氨酸、苏氨酸),均能分解生成乙酰辅酶A,经还原缩合反应可合成脂肪酸,进而合成脂肪。氨基酸分解产生的乙酰辅酶A也可用于合成胆固醇。氨基酸还可作为合成磷脂的原料,如丝氨酸脱狻可变为乙醇胺,乙醇胺经甲基化可变为胆碱。丝氨酸、乙醇胺及胆碱分别是合成丝氨酸磷脂、脑磷脂及卵磷脂的原料。所以,氨基酸能转变为多种脂质。但脂肪酸、胆固醇等脂质不能转变为氨基酸,仅脂肪中的甘油可异生成葡萄糖,转变为某些非必需氨基酸,但量很少。区(四)一些氨基酸、磷酸戊糖是合成核昔酸的原料嗦呤碱从头合成需要甘氨酸、天冬氨酸、谷氨酰胺和一碳单位为原料;瞪唗碱从头合成需要天冬氨酸、谷氨酰胺和一碳单位为原料。一碳单位是一些氨基酸在分解过程中产生的。这些氨基酸可直接作为核昔酸合成的原料、也可转化成核昔酸合成的原料。核昔酸中的另一成分磷酸戊糖是葡萄糖经磷酸戊糖途径分解的重要产物。所以,葡萄糖和一些氨基酸可在体内转化为核酸分子的组成成要保证机体的正常功能,就必须确保糖、脂质、蛋白质、水、无机盐、维生素这些营养物质在体内的代谢,能够根据机体的代谢状态和执行功能的需要有条不紊地进行。这就需要对这些物质的代谢方向、速率和流量进行精细调节。正是有了这种精细的调节,使各种物质的代谢井然有序,相互协调进行,机体才能适应各种内外环境的变化,顺利完成各种生命活动。这是生物体的基本特征,是在生物进化过程中形成的一种适应能力。代谢调节的复杂程度随进化程度增加而增高。单细胞生物主要通过细胞内代谢物浓度的变化,对酶的活性及含量进行调节,即所谓原始调节或细胞水平代谢调节。高等生物不仅细胞水平代谢调节更为精细复杂,还出现了内分泌细胞及内分泌器官,形成了通过激素发挥代谢调节作用的激素水平代谢调节。高等动物的代谢调节还涉及复杂的神经系统,形成了在中枢神经系统控制下,多种激素相互协调,对机体代谢进行综合调节的所谓整体水平代谢调节。上述三级代谢调节中,细胞水平代谢调节是基础,激素及神经对代谢的调节需通过细胞水平代谢调节实现。这种调节一旦不足以协调各种物质的代谢之间的平衡、不能适应机体内外环境改变的需要,就会使细胞、机体的功能失常,导致入体疾病发生。 一、细胞内物质代谢主要通过对关键酶活性的调节来实现(一)各种代谢酶在细胞内区隔分布是物质代谢及其调节的亚细胞结构基础在同一时间,细胞内有多种物质的代谢发生。参与同一代谢途径的酶,相对独立地分布千细胞特定区域或亚细胞结构(表10-1),形成所谓区隔分布,有的甚至结合在一起,形成多酶复合体心。酶的这种区隔分布,能避免不同代谢途径之间彼此干扰,使同一代谢途径中的系列酶促反应能够更顺利地连续进行,既提高了代谢途径的进行速度,也有利于调控心。心oij多酶体系分布多酶体系分布DNA、RNA合成细胞核糖酵解细胞质蛋白质合成内质网、细胞质戊糖磷酸途径细胞质糖原合成细胞质糖异生细胞质、线粒体脂肪酸合成细胞质脂肪酸氧化细胞质、线粒体胆固醇合成内质网、细胞质多种水解酶溶酶体磷脂合成内质网三狻酸循环线粒体血红素合成细胞质、线粒体氧化磷酸化线粒体(二)关键调节酶活性决定整个代谢途径的速度和方向每条代谢途径由一系列酶促反应组成,其反应速率和方向由其中一个或几个具有调节作用的关键酶活性决定。这些关键酶的特点包括:CD常常催化一条代谢途径的第一步反应或分支点上的反应,速度最慢,其活性能决定整个代谢途径的总速度;@常催化单向反应或非平衡反应,其活性能决定整个代谢途径的方向;@酶活性除受底物控制外,还受多种代谢物或效应剂调节。改变关键酶活性是细胞水平代谢调节的基本方式,也是激素水平代谢调节和整体代谢调节的重要环节。表10-2列出一些重要代谢途径的关键酶。 代谢途径关键调节酶 糖酵解已糖激酶磷酸果糖激酶-l丙酮酸激酶 丙酮酸氧化脱狻丙酮酸脱氢酶复合体三狻酸循环异拧檬酸脱氢酶a-酮戊二酸脱氢酶复合体拧檬酸合酶糖原分解糖原磷酸化酶糖原合成糖原合酶糖异生丙酮酸狻化酶脂肪酸合成乙酰辅酶A狻化酶脂肪酸分解肉碱脂酰转移酶I胆固醇合成HMG-CoA还原酶代谢调节可按速度分为快速调节和迟缓调节。前者通过改变酶的分子结构改变酶活性,进而改变酶促反应速度,在数秒或数分钟内发挥调节作用。快速调节又分为别构调节和化学修饰调节(动画10-1"抑制关键酶活性的两种方式”)。迟缓调节通过改变酶蛋白分子的合成或降解速度改变细胞内酶的含量,进而改变酶促反应速度,一般需数小时甚至数天才能发挥调节作用。 (三)别构调节通过别构效应改变关键酶活性 1.别构调节是生物界普遍存在的代谢调节方式一些小分子化合物能与酶蛋白分子活性中心外的特定部位特异结合,改变酶蛋白分子构象、从而改变酶活性。别构调节在生物界普遍存在,表103是一些代谢途径中的别构酶及其别构效应剂。 代谢途径别构酶别构激活剂别构抑制剂 糖酵解磷酸果糖激酶-1F-2,6-BP、AMP、ADP、F-1,拧檬酸、ATP丙酮酸激酶F-1,6-BP、ADP、AMP ATP、丙氨酸丙酮酸氧化脱狻丙酮酸脱氢酶复合体AMP、CoA、NAD+,ADP、AMP ATP、乙酰CoA、NADH三狻酸循环拧檬酸合酶乙酰CoA、草酰乙酸、ADP拧檬酸、NADH、ATPa-酮戊二酸脱氢酶复合体骁珀酰CoA、NADH糖原分解糖原磷酸化酶(肌)AMP ATP、G-6-P糖原磷酸化酶(肝)葡萄糖、F-1,6-BP、F-1-P糖异生丙酮酸狻化酶乙酰CoA AMP脂肪酸合成乙酰辅酶A狻化酶乙酰CoA、拧檬酸、异拧檬酸软脂酰CoA、长链脂酰CoA氨基酸代谢谷氨酸脱氢酶ADP、GDP ATP、GTP嗓呤合成PRPP酰胺转移酶PRPP IMP、AMP、GMP啥唗合成氨基甲酰磷酸合成酶II UMP2.别构效应剂通过改变酶分子构象改变酶活性别构效应剂能与别构酶的调节位点或调节亚基非共价键结合,引起酶活性中心构象变化,改变酶活性,从而调节代谢。别构效应的机制有两种。其一,酶的调节亚基含有一个“假底物”(pseudo substrate)序列,当其结合催化亚基的活性位点时能阻止底物的结合,抑制酶活性;当效应剂分子结合调节亚基后,“假底物”序列构象变化,释放催化亚基,使其发挥催化作用。cAMP激活cAMP依赖的蛋白激酶通过这种机制实现。其二,别构效应剂与调节亚基结合,能引起酶分子三级和(或)四级结构在“T”构象(紧密态、无活性/低活性)与“R”构象(松弛态、有活性/高活性)之间互变,从而影响酶活性。氧对脱氧血红蛋白构象变化的影响通过该机制实现。 3.别构调节使一种物质的代谢与相应的代谢需求和相关物质的代谢协调别构调节具有重要的生理意义。别构效应剂可能是酶的底物,也可能是酶促反应的终产物,或其他小分子代谢物。它们在细胞内浓度的改变能灵敏地反映相关代谢途径的强度和相应的代谢需求,并使关键酶构象改变影响酶活性,从而调节相应代谢的强度、方向,以协调相关代谢、满足相应代谢需求。 代谢终产物堆积表明其代谢过强,超过了需求,常可使其代谢途径的关键酶受到别构抑制,即反馈抑制(feedback inh伽tion),从而降低整个代谢途径的强度,避免产生超过需要的产物。如长链脂酰辅酶A可反馈抑制乙酰辅酶A狻化酶,使代谢物的生成不致过多。别构调节可使机体根据需求生产能址,避免生产过多造成浪费。如ATP可别构抑制磷酸果糖激酶、丙酮酸激酶及拧檬酸合酶,从而抑制糖酵解、有氧氧化及三狻酸循环,使ATP的生成不致过多,以免造成浪费。 一些代谢中间产物可别构调节相关的多条代谢途径的关键酶,使这些代谢途径之间能协调进行。如在能量供应充足时,葡糖-6-磷酸抑制肝糖原磷酸化酶,阻断糖原分解以抑制糖酵解及有氧氧化,避免ATP产生过多;同时葡糖-6-磷酸激活糖原合酶,使过剩的磷酸葡萄糖合成糖原储存。再如,三狻酸循环活跃时,异拧檬酸增多,ATP/ADP比例增加,ATP可别构抑制异拧檬酸脱氢酶、异拧檬酸别构激活乙酰辅酶A狻化酶,从而抑制三狻酸循环,增强脂肪酸合成。 (四)化学修饰调节通过酶促共价修饰调节酶活性1酶促共价修饰有多种形式酶蛋白肤链上某些氨基酸残基侧链可在另一酶的催化下发生可逆的共价修饰,从而改变酶活性。酶的化学修饰主要有磷酸化与去磷酸化、乙酰化与去乙酰化、甲基化与去甲基化、腺昔化与去腺昔化及—SH与—S—S一互变等,其中磷酸化与去磷酸化最多见(表10-\i门fi4)。酶蛋白分子中丝氨酸、苏氨酸及酪氨酸的经基是磷酸化修饰的位点,在蛋白激酶(pro tein kinase)催化下,由ATP提供磷酸基及能量完成磷酸化;去磷酸化是磷酸酶(phosphatase)催化的水解反应。酶的磷酸化与去磷酸化反应是不可逆的,分别由蛋白激酶及磷酸酶催化(图10-2)。 酶化学修饰类型酶活性改变 糖原磷酸化酶磷酸化/去磷酸化激活/抑制磷酸化酶b激酶磷酸化/去磷酸化激活/抑制糖原合酶磷酸化/去磷酸化抑制/激活丙酮酸脱氢酶磷酸化/去磷酸化抑制/激活磷酸果糖激酶磷酸化/去磷酸化抑制/激活丙酮酸脱氢酶磷酸化/去磷酸化抑制/激活HMG-CoA还原酶磷酸化/去磷酸化抑制/激活HMG-CoA还原酶激酶磷酸化/去磷酸化激活/抑制乙酰CoA狻化酶磷酸化/去磷酸化抑制/激活激素敏感性甘油三酷脂肪酶磷酸化/去磷酸化激活/抑制2.酶的化学修饰调节具有级联放大效应化学修饰调节具有如下特点:CD绝大多数受化学修饰调节的关键酶都具无活性(或低活性)和有活性(或高活性)两种形式,它们可分别在两种不同酶的催化下发生共价修饰,互相转变。催化互变的酶在体内受上游调节因素如激素控制。@酶的化学修饰是另一酶催化的酶促反应,一分子催化酶可催化多个底物酶分子发生共价修饰,特异性强,有放大效应。@磷酸化与去磷酸化是最常见的酶促化学修饰反应。酶的1分子亚基发生磷酸化常需要消耗l分子ATP,与合成酶蛋白所消耗的ATP要少得多,且作用迅速,又有放大效应,是调节酶活性经济有效的方式。@催化共价修饰的酶自身也常受别构调节、化学修饰调节,并与激素调节偶联,形成由信号分子(激素等)、信号转导分子和效应分子(受化学修饰调节的关键酶)组成的级联反应,使细胞内酶活性调节更精细协调。通过级联酶促反应,形成级联放大效应,只需少量激素释放即可产生迅速而强大的生理效应,满足机体的需要。 (五)通过改变细胞内酶含量调节酶活性除改变酶分子结构外,改变酶含量也能改变酶活性,是重要的代谢调节方式。酶含量调节通过改变其合成或(和)降解速率实现,消耗ATP较多,所需时间较长,通常要数小时甚至数日,属迟缓调节。 1.诱导或阻遏酶蛋白编码基因表达调节酶含量酶的底物、产物、激素或药物可诱导或阻遏酶蛋白编码基因的表达。诱导剂或阻遏剂在酶蛋白生物合成的转录或翻译过程中发挥作用,影响转录较常见。体内也有一些酶,其浓度在任何时间、任何条件下基本不变,几乎恒定。这类酶称为组成(型)酶(constitutive enzyme),如甘油醒-3-磷酸脱氢酶(glyceraldehyde3-phosphate dehydrogenase, GAPDH),常作为基因表达变化研究的内参照(internal control)。 酶的诱导剂经常是底物或类似物,如蛋白质摄入增多时,氨基酸分解代谢加强,鸟昔酸循环底物增加,可诱导参与鸟昔酸循环的酶合成增加。鼠饲料中蛋白质含量从8%增加至70%,鼠肝精氨酸酶活性可增加2~3倍。酶的阻遏剂经常是代谢产物,如HMG-CoA还原酶是胆固醇合成的关键酶,在肝内的合成可被胆固醇阻遏。但肠黏膜细胞中胆固醇的合成不受胆固醇的影响,摄取高胆固醇膳食,血胆固醇仍有升高的危险。很多药物和毒物可促进肝细胞微粒体单加氧酶(或混合功能氧化酶)或其他一些药物代谢酶的诱导合成,虽然能使一些毒物解毒,但也能使药物失活,产生耐药。 酶的诱导和阻遏普遍存在千生物界,但高等动物和入体内,由千蛋白质合成变化与激素调节、细胞信号传递偶联在一起,形成复杂的基因表达调控网络,单纯的代谢物水平诱导或阻遏不如微生物体内重要。 2.改变酶蛋白降解速度调节酶含量改变酶蛋白分子的降解速度是调节酶含量的重要途径。细胞内酶蛋白的降解与许多非酶蛋白质的降解一样,有两条途径。溶酶体(lysosome)蛋白水解酶可非特异降解酶蛋白质,酶蛋白质的特异性降解通过ATP依赖的泛素-蛋白酶体(proteasomes)途径完成。凡能改变或影响这两种蛋白质降解机制的因素均可主动调节酶蛋白的降解速度,进而调节酶含量。 二、激素通过特异性受体调节靶细胞的代谢 激素能与特定组织或细胞(即靶组织或靶细胞)的受体(receptor)特异结合,通过一系列细胞信号转导反应,引起代谢改变,发挥代谢调节作用。由于受体存在的细胞部位和特性不同,激素信号的转导途径和生物学效应也有所不同。 (一)膜受体激素通过跨膜信号转导调节代谢 膜受体是存在于细胞膜上的跨膜蛋白质,与膜受体特异结合发挥作用的激素包括胰岛素、生长激素、促性腺激素、促甲状腺激素、甲状旁腺素、生长因子等蛋白质、肤类激素,及肾上腺素等儿茶酚胺类激素。这些激素亲水,不能透过脂双层构成的细胞膜,而是作为第一信使分子与相应的靶细胞膜受体结合后,通过跨膜传递将所携带的信息传递到细胞内,由第二信使将信号逐级放大,产生代谢调节效应。 (二)胞内受体激素通过激素-胞内受体复合物改变基因表达、调节代谢胞内受体激素包括类固醇激素、甲状腺素、1,25(OH)2-维生素趴及视黄酸等,为疏水激素,可透过脂双层的细胞质膜进入细胞,与相应的胞内受体结合。大多数胞内受体位于细胞核内,与相应激素特异结合形成激素受体复合物后,作用千DNA的特定序列即激素反应元件(hormon e response elemen t, HRE),改变相应基因的转录,促进(或阻遏)蛋白质或酶的合成,调节细胞内酶含量,从而调节细胞代谢。存在于细胞质的胞内受体与激素结合后,形成的激素受体复合物进入核内,同样作用于激素反应元件,通过改变相应基因的表达发挥代谢调节作用。 三、机体通过神经系统及神经-体液途径协调整体的代谢高等动物包括人的各组织器官高度分化,具有各自的功能和代谢特点。维持机体的正常功能、适应机体各种内外环境的改变,不仅需要在各组织器官的细胞内各种物质代谢彼此协调,在细胞水平上保持代谢平衡,还必须协调各组织器官之间的各种物质代谢。这就需要在神经系统主导下,调节激素释放,并通过激素整合不同组织器官的各种代谢,实现整体调节,以适应饱食、空腹、饥饿、营养过剩、应激等状态,维待整体代谢平衡。\”所ii(一)饱食状态下机体三大物质代谢与膳食组成有关通常情况下,人体摄入的膳食为混合膳食,经消化吸收后的主要营养物质以葡萄糖、氨基酸和CM形式进入血液,体内胰岛素水平中度升高。饱食状态下机体主要分解葡萄糖,为机体各组织器官供能。未被分解的葡萄糖,部分在胰岛素作用下,在肝合成肝糖原、在骨骼肌合成肌糖原贮存;部分在肝内转换为丙酮酸、乙酰辅酶A,合成甘油三酷,以VLDL形式输送至脂肪等组织。吸收的葡萄糖超过机体糖原贮存能力时,主要在肝大量转化成甘油三酷,由VLDL运输至脂肪组织贮存。吸收的甘油三酷部分经肝转换成内源性甘油三酷,大部分输送到脂肪组织、骨骼肌等转换、储存或利用。(动画10-2"饱食状态下重要组织器官代谢路径”)入体摄入高糖膳食后,特别是总热量的摄入又较高时,体内胰岛素水平明显升高,胰高血糖素降低。在胰岛素作用下,小肠吸收的葡萄糖部分在骨骼肌合成肌糖原、在肝合成肝糖原和甘油三酷,后者输送至脂肪等组织储存;大部分葡萄糖直接被输送到脂肪组织、骨骼肌、脑等组织转换成甘油三酷等非糖物质储存或利用。 进食高蛋白膳食后,体内胰岛素水平中度升高,胰高血糖素水平升高。在两者协同作用下,肝糖原分解补充血糖、供应脑组织等。由小肠吸收的氨基酸主要在肝通过丙酮酸异生为葡萄糖,供应脑组织及其他肝外组织;部分氨基酸转化为乙酰辅酶A,合成甘油三酷,供应脂肪组织等肝外组织国;还有部分氨基酸直接输送到骨骼肌。 进食高脂膳食后,体内胰岛素水平降低,胰高血糖素水平升高。在胰高血糖素作用下,肝糖原分解补充血糖、供给脑组织等。肌组织氨基酸分解,转化为丙酮酸,输送至肝异生为葡萄糖,供应血糖及肝外组织。由小肠吸收的甘油三酷主要输送到脂肪、肌组织等。脂肪组织在接受吸收的甘油三酷同时,也部分分解脂肪成脂肪酸,输送到其他组织。肝氧化脂肪酸,产生酮体,供应脑等肝外组织。 (二)空腹机体代谢以糖原分解、糖异生和中度脂肪动员为特征空腹通常指餐后12小时以后。此时体内胰岛素水平降低,胰高血糖素升高。事实上,在胰高血糖素作用下,餐后6~8小时肝糖原即开始分解补充血糖,主要供给脑,兼顾其他组织需要。餐后l2~18小时,尽管肝糖原分解仍可持续进行,但由千肝糖原即将耗尽,能用千分解的糖原已经很少,所以肝糖原分解水平较低,主要靠糖异生补充血糖。同时,脂肪动员中度增加,释放脂肪酸供应肝、肌等组织利用。肝氧化脂肪酸,产生酮体,主要供应肌组织。骨骼肌在接受脂肪组织输出的脂肪酸同时,部分氨基酸分解,补充肝糖异生的原料。(动画10-3“空腹状态下重要组织器官代谢路径”)(三)饥饿时机体主要氧化分解脂肪供能1.短期饥饿后糖氧化供能减少而脂肪动员加强短期饥饿通常指l~3天未进食。由于进食18小时后肝糖原基本耗尽,短期饥饿使血糖趋于降低,血中甘油和游离脂肪酸明显增加,氨基酸增加;胰岛素分泌极少,胰高血糖素分泌增加(动画10-4"饥饿l~3天重要组织器官代谢路径")。机体的代谢呈现如下特点。 (1)机体从葡萄糖氧化供能为主转变为脂肪氧化供能为主:除脑组织细胞和红细胞仍主要利用糖异生产生的葡萄糖,其他大多组织细胞减少对葡萄糖的摄取利用,对脂肪动员释放的脂肪酸及脂肪酸分解的中间代谢物-酮体摄取利用增加,脂肪酸和酮体成为机体的基本能源。 (2)脂肪动员加强且肝酮体生成增多:糖原耗尽后,脂肪是最早被动员的能量储存物质,被水解动员,释放脂肪酸。脂肪酸可在肝内氧化,其中脂肪动员释放的脂肪酸约25%在肝氧化生成酮体。短期饥饿时,脂肪酸和酮体成为心肌、骨骼肌和肾皮质的重要供能物质,部分酮体可被大脑利用包。 (3)肝糖异生作用明显增强:饥饿使体内糖异生作用增加,以饥饿16~36小时增加最多,糖异生生成的葡萄糖约为150g/d,主要来自氨基酸,部分来自乳酸及甘油。肝是饥饿初期糖异生的主要场所,小部分在肾皮质。 (4)骨骼肌蛋白质分解加强:蛋白质分解增强略迟于脂肪动员加强。蛋白质分解加强,释放入血的氨基酸增加。骨骼肌蛋白质分解的氨基酸大部分转变为丙氨酸和谷氨酰胺释放入血。 2长期饥饿可造成器官损害甚至危及生命长期饥饿指未进食3天以上,通常在饥饿4~7天后,机体就发生与短期饥饿不同的改变。(1)脂肪动员进一步加强:释放的脂肪酸在肝内氧化生成大量酮体。脑利用酮体增加,超过葡萄糖,占总耗氧量的60%。脂肪酸成为肌组织的主要能源,以保证酮体优先供应脑。(2)蛋白质分解减少:机体储存的蛋白质大量被消耗,继续分解就只能分解结构蛋白质,这将危及生命。所以机体蛋白质分解下降,释出氨基酸减少,负氮平衡有所改善。 (3)糖异生明显减少:与短期饥饿相比,机体糖异生作用明显减少。乳酸和甘油成为肝糖异生的主要原料。饥饿晚期肾糖异生作用明显增强,每天生成约40g葡萄糖,占饥饿晚期糖异生总量一半,几乎与肝相等。 按理论计算,正常人脂肪储备可维持饥饿长达3个月的基本能量需要。但由于长期饥饿使脂肪动员加强,大量产生酮体,可导致酸中毒。加之蛋白质的分解,缺乏维生素、微量元素和蛋白质的补充等,长期饥饿可造成器官损害甚至危及生命。(四)应激使机体分解代谢加强应激(stress)是机体或细胞为应对内、外环境刺激作出一系列非特异性反应。这些刺激包括中毒、感染、发热、创伤、疼痛、大剂量运动或恐惧等。应激反应可以是"一过性”的,也可以是持续性的。应激状态下,交感神经兴奋,肾上腺髓质、皮质激素分泌增多,血浆胰高血糖素、生长激素水平增加,而胰岛素分泌减少,引起一系列代谢改变。 1.应激使血糖升高应激状态下肾上腺素、胰高血糖素分泌增加,激活糖原磷酸化酶,促进肝糖原分解。同时,肾上腺皮质激素、胰高血糖素又可使糖异生加强;肾上腺皮质激素、生长激素使外周组织对糖的利用降低。这些激素的分泌改变均可使血糖升高,对保证大脑、红细胞的供能有重要意义。 2.应激使脂肪动员增强血浆游离脂肪酸升高,成为心肌、骨骼肌及肾脏等组织主要能量来源。3.应激使蛋白质分解加强骨骼肌释出丙氨酸等增加,氨基酸分解增强,尿素生成及尿氮排出增加,机体呈负氮平衡。总之,应激时糖、脂质、蛋白质/氨基酸分解代谢增强,合成代谢受到抑制,血中分解代谢中间产物,如葡萄糖、氨基酸、脂肪酸、甘油、乳酸、尿素等含量增加(表10-5)。 218第二篇物质代谢及其调节 (五)肥胖是多因素引起代谢失衡的结果 1.肥胖是多种重大慢性疾病的危险因素肥胖人群动脉粥样硬化、冠心病、卒中、糖尿病、高血压等疾病的风险显著高于正常人群,是这些疾病的主要危险因素之一。不仅如此,肥胖还与痴呆、脂肪肝病、呼吸道疾病和某些肿瘤的发生相关。代谢综合征(metabolic syndrome)是指一组以肥胖、高血糖(糖调节受损或糖尿病)、高血压以及血脂异常[高TG(甘油三酣)血症和(或)低HDL-C(高密度脂蛋白胆固醇)血症]集结发病的临床综合征,特点是机体代谢上相互关联的危险因素在同一个体的组合。其表现为体脂(尤其是腹部脂肪)过剩、高血压、胰岛素耐受、血浆胆固醇水平升高以及血浆脂蛋白异常等。这些危险因素的聚集,会大幅度增加心脏病、卒中和糖尿病等的发病风险。 2较长时间的能量摄入大千消耗导致肥胖过剩能量以脂肪形式储存是肥胖的基本原因,它源千神经内分泌改变引起的异常摄食行为和运动减少,涉及遗传、环境、膳食、运动等多种因素及复杂的分子机制。正常情况下,当能量摄入大于消耗、机体将过剩的能量以脂肪形式储存于脂肪细胞过多时,脂肪组织就会产生反馈信号作用于摄食中枢,调节摄食行为和能量代谢,不会产生持续性的能噩摄入大千消耗。一旦这个神经内分泌机制失调,就会引起摄食行为、物质和能量代谢障碍,导致肥胖。 (l)抑制食欲的激素功能障碍引起肥胖:食欲受一些激素调节。脂肪组织体积增加刺激瘦蛋白(leptin)分泌,通过血液循环输送至下丘脑弓状核,与瘦蛋白受体结合,抑制食欲和脂肪合成,同时刺激脂肪酸氧化,增加耗能,减少储脂。瘦蛋白还能增加线粒体解偶联蛋白表达,使氧化与磷酸化解偶联,增加产热。此外,瘦蛋白还有间接降低基础代谢率,影响性器官发育及生殖等作用。胆艇收缩素(cholecystok inin, CCK)是小肠上段细胞在进食时分泌的肤类激素,可引起饱胀感,从而抑制食欲。能抑制食欲的激素还有a-促黑(细胞激)素(a-melanocyte-stimulating hormone, a-MSH)等。抑制食欲激素的功能障碍都可能引起肥胖。 (2)刺激食欲的激素功能异常增强引起肥胖:胃黏膜细胞分泌的生长激素释放肤,通过血液循环运送至脑垂体,与其受体结合,促进生长激素的分泌。在食欲调节方面,它能作用千下丘脑神经元,增强食欲。能增强食欲的激素还有神经肤Y(neuropeptide Y, NPY)。增强食欲激素功能异常增强,导致肥胖。如Prader-W汕综合征病人血生长激素释放肤极度升高,引起不可控制的强烈食欲,导致极度肥胖。 总之,肥胖源于代谢失衡,它一旦形成,又反过来加重代谢紊乱,导致脂蛋白异常血症、冠心病、卒中等严重后果。如在肥胖形成期,靶细胞对胰岛素敏感,血糖降低,耐糖能力正常。在肥胖稳定期则表现出高胰岛素血症,组织对胰岛素抵抗,耐糖能力降低,血糖正常或升高。越肥胖或胰岛素抵抗,血糖浓度越高,糖代谢的紊乱程度越重。同时还引起脂代谢异常,表现为血浆总胆固醇及低密度脂蛋白-胆固醇(low-density lipoprotein cholesterol, LDL-C)升高、高密度脂蛋白胆固醇(high-density lipoprotein cholesterol, HDL-C)降低、甘油三酕升高等。 第三节体内重要组织和器官的代谢特点 满足机体各组织、器官基本细胞功能需要的代谢基本相同,但入体各组织、器官高度分化,功能各异,这些组织、器官的代谢具有各自的特点包。在这些组织、器官的细胞中形成了特定的酶谱,即不同的酶系种类和含量,使这些组织、器官除了具有一般的基本代谢外,还具有特点鲜明的代谢途径,以适应相应的功能需要(表10-6)。 器官或 主要代谢途径主要代谢物主要代谢产物特定的酶主要功能肝糖异生、脂肪酸住乳酸、甘油、氨基葡萄糖、VLDL、葡糖激酶、葡糖-6-磷物质代谢氧化、脂肪合成、酮酸、脂肪酸、葡萄糖HDL、酮体酸酶、甘油激酶、磷酸的枢纽体合成、糖有氧氧化烯醇式丙酮酸狻激酶脑糖有氧氧化、糖酵葡萄糖、氨基酸、乳酸、CO心比O神经中枢解、氨基酸代谢酮体心肌有氧氧化乳酸、脂肪酸、酮co心H20脂蛋白脂肪酶泵出血液体、葡萄糖骨骼肌糖酵解、有氧氧化葡萄糖、脂肪酸、乳酸、CO心H20脂蛋白脂肪酶肌肉收缩酮体脂肪组织酣化脂肪酸、脂肪动VLDL、CM游离脂肪酸、甘油脂蛋白脂肪酶、激素储存脂肪员、合成脂肪敏感性脂肪酶糖异生、糖酵解脂肪酸、葡萄糖、乳葡萄糖甘油激酶、磷酸烯醇泌尿酸、甘油式丙酮酸狻激酶肝是人体代谢的中枢器官,在糖、脂质、蛋白质代谢中均具有重要的特殊作用。脂肪组织的重要功能是将能量以脂肪形式储存,所以脂肪组织含有脂蛋白脂肪酶及特有的激素敏感甘油三酷脂肪酶,既能将血液循环中的脂肪水解,用千合成脂肪细胞内的脂肪而储存;也能在机体需要时进行脂肪动员,释放脂肪酸供其他组织利用(图10-3)。 肠氨基酸葡萄糖 脂肪 肌组织 淋巴管 220第二筒物质代谢及其调节 一、肝是人体物质代谢中心和枢纽 肝具有特殊的组织结构和组织化学构成,是机体物质代谢的枢纽,是人体的中心生化工厂。在糖、脂质、蛋白质、水、无机盐和维生素代谢中均具有独特而重要的作用(见第十九章)。肝的耗氧量占全身耗氧量的20%,可以消耗葡萄糖、脂肪酸、甘油和氨基酸等以供能,但不能利用酮体。肝合成和储存糖原可达肝重的5%,约75~l00g,而肌糖原仅占肌重的1%。肝还具有糖异生、酮体生成等独特的代谢方式。肝虽可大量合成脂肪,但不能储存脂肪,肝细胞合成的脂肪随即合成VLDL释放入血。 二、脑主要利用葡萄糖供能且耗氧量大 (一)葡萄糖和酮体是脑的主要能量物质 脑没有糖原,也没有作为能量储存的脂肪及蛋白质用于分解代谢,葡萄糖是脑主要的供能物质,每天消耗葡萄糖约100g,主要由血糖供应。脑组织具有很高的已糖激酶活性,即使在血糖水平较低时也能有效利用葡萄糖。长期饥饿血糖供应不足时,脑主要利用由肝生成的酮体供能。饥饿3~4天时,脑每天耗用约50g酮体。饥饿2周后,脑每天消耗的酮体可达100g。 (二)脑耗氧量高达全身耗氧总量的四分之一 脑功能复杂,活动频繁,能量消耗多且连续,是人体静息状态下消耗氧很大的器官。人脑重量仅占体重2%,但其耗氧量占静息时全身耗氧总量的20%~25%,是静息状态下单位重量组织耗氧量最大的器官。 (三)脑具有特异的氨基酸及其代谢调节机制 血液与脑组织之间可迅速进行氨基酸交换,但氨基酸在脑内富集量有限。脑中游离氨基酸大约75%为天冬氨酸、谷氨酸、谷氨酰胺、N-乙酰天冬氨酸和'Y-氨基丁酸,以谷氨酸含量最多。脑通过特异的氨基酸及其代谢调节机制,维持脑内特有游离氨基酸含量谱。 脑中氨基酸脱氨基作用主要由腺背脱氨酶催化。氨基酸的氨基经氨基移换作用生成谷氨酸、天冬氨酸,再转移生成腺昔酸,最后由ADA催化脱去氨基,生成氨。 三、心肌可利用多种能源物质 (一)心肌可利用多种营养物质及其代谢中间产物为能源心肌细胞含有多种硫激酶(th iokinase),可催化不同长度碳链脂肪酸转变成脂酰辅酶A,所以心肌优先利用脂肪酸氧化分解供能。心肌细胞含有丰富的酮体利用酶,也能彻底氧化脂肪酸分解的中间产物-酮体供能。正是由于心肌细胞优先利用脂肪酸,使其分解产生大量乙酰辅酶A,强烈抑制酵解途径的调节酶-磷酸果糖激酶-l,继而抑制葡萄糖酵解。心肌细胞既富含细胞色素及线粒体,也富含LDHl,有利千乳酸氧化供能。所以,心肌主要通过有氧氧化脂肪酸、酮体和乳酸获得能量,极少进行糖酵解。心肌从血液摄取各种营养物有一定域值限制,血液营养物水平超过域值越高,摄取越多。因此,心肌在饱食状态下不排斥利用葡萄糖,餐后数小时或饥饿时利用脂肪酸和酮体,运动中或运动后则利用乳酸。 (二)心肌细胞分解营养物质供能方式以有氧氧化为主心肌细胞富含肌红蛋白、细胞色素及线粒体,前者能储氧,以保证心肌有节律、持续舒缩运动所需氧的供应;后两者利于利用氧进行有氧氧化,所以心肌分解代谢以有氧氧化为主。即使氧消耗增加,如运动加剧,也极少发生“负氧债"(oxygen deb t repayment)。 心肌富含乳酸脱氢酶,以LDHl为主,与乳酸亲和力强,能催化乳酸氧化成丙酮酸,后者可狻化为@;14草酰乙酸,有利于有氧氧化。 第十章代谢的整合与调节 四、骨骼肌以肌糖原和脂肪酸为主要能量来源 (一)不同类型骨骼肌产能方式不同 不同类型骨骼肌具有的糖酵解、氧化磷酸化能力不同。红肌(如长骨肌)耗能多,富含肌红蛋白及细胞色素体系,具有较强氧化磷酸化能力,适合通过氧化磷酸化获能。白肌(如胸肌)则相反,耗能少主要靠酵解供能。 (二)骨骼肌适应不同耗能状态选择不同能源 骨骼肌收缩所需能量的直接来源是ATP,但其ATP含量有限,不足以维持持续、剧烈的收缩活动。短暂的骨骼肌收缩活动后,储存于肌内的高能物质-—-磷酸肌酸在肌酸激酶催化下开始分解,将能量和~P转移给ADP,生成ATP。骨骼肌有一定糖原储备,静息状态下肌组织获取能量通常以有氧氧化肌糖原、脂肪酸、酮体为主;剧烈运动时糖无氧氧化供能大大增加。肌糖原分解不能直接补充血糖,乳酸循环是整合糖异生与肌糖酵解途径的重要机制。 五、脂肪组织是储存和动员甘油三酷的重要组织 (一)机体将从膳食中摄取的能量主要储存于脂肪组织机体从膳食摄取的能量物质主要是脂肪和糖。生理情况下,餐后吸收的脂肪和糖除部分氧化供能外,其余部分主要以脂肪形式储存于脂肪组织,供饥饿时利用。膳食脂肪以乳糜微粒形式运输至脂肪组织,在脂蛋白脂肪酶作用下被水解摄取,用于合成脂肪细胞内脂肪储存。膳食糖主要运输至肝转化成脂肪,以VLDL形式运输至脂肪组织,同样在LPL作用下被水解摄取,合成脂肪储存于脂肪细胞。脂肪细胞也能将糖转化为脂肪储存。一些氨基酸也能转化为脂肪。 (二)饥饿时主要靠分解储存千脂肪组织的脂肪供能饥饿时抗脂解激素胰岛素水平降低、脂解激素胰高血糖素等分泌增强,激活激素敏感性脂肪酶,将储存于脂肪组织的能量以脂肪酸和甘油的形式释放入血,经血循环运输至机体其他组织,作为能源利用。肝还能将脂肪酸分解为酮体,经血液运输至肝外组织利用。所以,饥饿时血中游离脂肪酸水平升高,酮体水平也随之升高。 六、肾可进行糖异生和酮体生成 肾是可进行糖异生和生成酮体两种代谢的器官。肾髓质无线粒体,主要靠糖酵解供能;肾皮质主要靠脂肪酸及酮体有氧氧化供能。一般情况下,肾糖异生产生的葡萄糖较少,只有肝糖异生葡萄糖量的10%。但长期饥饿(5~6周)后,肾糖异生的葡萄糖大量增加,可达每天40g,与肝糖异生的量几乎相等。 代谢是生命活动的物质基础。代谢分为分解代谢和合成代谢,由许多代谢途径组成。有些不同的代谢途径会分享某些共同的酶促化学反应,所以,各种代谢途径相互联系、相互作用、相互协调和相互制约,形成一个网状的整体。体内代谢的物质均组成为各自共同的代谢池。体内各种营养物质的代谢总是处于一种动态的平衡之中。 细胞内多种物质的代谢同时进行,需要彼此间相互协调;高等动物包括人的各组织器官高度分化、具有各自的功能和代谢特点,各组织器官之间的各种物质的代谢也需要彼此协调,才能维持细胞、机体的正常功能、适应机体各种内外环境的改变。所以,机体内的各种物质的代谢虽然各不相同,但它们通过共同的中间代谢物、三狻酸循环和生物氧化等形成彼此相互联系、相互转变、相互依存的统一的整体。糖、脂肪、蛋白质等营养物质在供应能量上可互相代替,并互相制约,但不能完全互相转变,因为有些代谢反应是不可逆的。 222第二篇物质代谢及其调节 机体为了适应各种内外环境的变化,需要对各种物质代谢的方向、速率和流量进行精细调节,使各种物质的代谢井然有序,相互协调进行,以顺利完成各种生命活动。高等生物形成了三级代谢调节。代谢的细胞水平调节主要通过改变关键酶活性实现。其中,通过改变酶分子结构调节关键酶活性见效快,方式包括别构调节和化学修饰调节。化学修饰调节以磷酸化为主;化学修饰调节具有放大效应。别构调节与化学修饰调节相辅相成。酶含量调节通过改变其合成或(和)降解速率实现,作用缓慢但持久。激素水平代谢调节是激素通过与靶细胞受体特异结合及后续的一系列细胞信号转导反应,最终引起代谢改变。在神经系统主导下,机体通过调节激素释放,整合不同组织细胞内代谢途径,实现整体调节,以适应饱食、空腹、饥饿、营养过剩、应激等状态,维持整体代谢平衡。 各组织、器官除基本代谢外,具有某些特点酶系的表达,因此各组织、器官在能量代谢上各有其主导的和独特的代谢方式。 1.哪些化合物是糖、脂质、氨基酸代谢的枢纽物质? 的存活?(孙军) 人夕 第三篇 遗传信息的传递 本篇讨论遗传信息的传递及其调节过程,包括真核基因与基因组,DNA、RNA和蛋白质的合成,DNA损伤和损伤修复基因表达调控和细胞信号转导的分子机制,共七章。 不同生物的基因及基因组的大小和复杂程度各不相同,但生物体内的遗传信息传递均遵循中心法则。DNA以半保留复制的方式将亲代细胞的遗传信息高度忠实地传递给子代;DNA序列中的遗传信息以合成RNA的方式被“转录”出来,其中携带蛋白质一级结构信息的信使RNA(mRNA)通过“翻译“过程合成蛋白质。 DNA、RNA、蛋白质的合成过程均由细胞内复杂的大分子复合体负责完成。本篇对于这些过程的叙述主要包括:基本规律和特点;模板、酶及其他因子;何处如何起始;链的延长方向和机制;何处如何终止;以及合成后的加工修饰等。 DNA的合成是通过精密的机制控制的基因组复制过程,是一个生命体内全部遗传信息的忠实复制和传递,是细胞增殖和个体延续(繁衍)的基础。生命体的全部遗传信息都贮存于基因组中,基因组的复杂结构不仅有利千遗传信息的贮存,也是控制遗传信息复制、传递和表达的基础。 生物体内虽有精细的体系保证DNA复制过程的正确性,但在复制过程中和复制结束后,DNA仍会由于多种因素的影响而发生结构变化(即损伤和变异),细胞的DNA损伤修复系统则可修复这些损伤,将结构变异控制在最低的程度。 RNA和蛋白质的生物合成是遗传信息表达的过程,被称为基因表达。对千RNA编码基因而言,转录过程即为基因表达;而蛋白质编码基因的表达则包括转录和翻译两个过程。 基因表达在体内(细胞内)受到精确调控。细胞内有多种蛋白质和RNA参与基因表达过程的调控,蛋白质与DN八蛋白质与RNA、蛋白质与蛋白质之间的相互作用是这些调控的结构基础。基因表达的调控可发生在染色质结构调整、转录起始、转录后加工、翻译起始、翻译后加工等多个层次、多个环节。 基因表达调控也是细胞对微环境产生应答的一个重要方面。细胞所处微环境中的信号分子可结合特异性受体将信号传入细胞内。一系列细胞内信号转导分子有序相互作用,构成了信号转导通路。除控制细胞运动、调节细胞代谢外,各信号转导通路可激活不同的转录因子,调控不同的基因表达。 在学习本篇内容时,要重视对名词概念的理解,理解基因信息传递各过程的基本规律和特点;把握起始、延长和终止过程中大分子复合体的动态变化;认识信息传递的复杂性和网络特点。本篇的各章内容之间有着密切关联,因此学习时要善于对比联系。此外,细胞信号转导不仅是调控基因表达的重要机制,也是调节细胞代谢的重要机制,需要与第二篇的内容联系起来融会贯通。 (高国全) 第十一章真核基因与基因组 随着人们对遗传学和基因组学复杂性的深入了解,似乎越来越难以对基因做一个精确的定义。简而言之,基因(gene)是能够编码蛋白质或RNA等具有特定功能产物的、负载遗传信息的基本单位。除了某些以RNA为基因组的RNA病毒外,基因通常是指染色体或基因组的一段DNA序列,其包括编码序列(外显子)和单个编码序列间的间隔序列(内含子)。 基因组(genome)是指一个生物体内所有遗传信息的总和。1920年德国科学家Winkles H首先使用基因组一词来描述生物的全部基因和染色体。基因组(GENOME)从“基因(GENe)”和"染色体(chromosOME)”两个词组合而成。人类基因组包含了细胞核染色体DNA(常染色体和性染色体)及线粒体DNA所携带的所有遗传物质。 不同生物的基因及基因组的大小和复杂程度各不相同,所贮存的遗传信息量有着巨大的差别,其结构与组织形式上也各有特点。原核生物的基因组结构相对简单,其结构特点如下:心通常仅由一条环状双链DNA组成;@基因组中只有一个复制起点,具有操纵子结构(见第十六章);@基因通常是连续的,没有内含子;@基因组中重复序列很少,编码蛋白质的结构基因多为单拷贝基因;@基因组中具有多种功能的识别区域,如复制起始区、复制终止区、转录启动区和终止区等;@基因组中存在可移动的DNA序列,包括插入序列和转座子等。 真核生物基因组较复杂,其结构基因的数量远多于原核生物基因组中的数量,但编码区在基因组中所占的比例远小于原核生物基因组中的比例。本章重点讨论真核基因与基因组的结构和功能。 第一节真核基因的结构与功能 DNA是基因的物质基础,基因的功能实际上是DNA的功能。基因的功能包括:心利用4种碱基的不同排列荷载遗传信息;@通过复制将所有的遗传信息稳定、忠实地遗传给子代细胞,在这一过程中,体内外环境均可导致随机发生的基因突变,这些突变是生物进化的基础;@作为基因表达(gene expression)的模板,使其所携带的遗传信息通过各种RNA和蛋白质在细胞内有序合成而表现出来。基因的功能通过两个相关部分信息而完成:一是可以在细胞内表达为蛋白质或功能RNA的编码区(coding region)序列;二是为表达这些基因(即合成RNA)所需要的启动子(promoter)、增强子(enhancer)等调控区(regulatory region)序列。单个基因的组成结构及一个完整的生物体内基因的组织排列方式统称为基因组构(gene organization)。 —、真核基因的基本结构 基因的基本结构包含编码蛋白质或RNA的编码序列(coding sequen ce)及相关的非编码序列,后者包括单个编码序列间的间隔序列以及转录起始点后的基因5'-端非翻译区、3'-端非翻译区。与原核生物相比较,真核基因结构最突出的特点是其不连续性,被称为断裂基因(split gene)或割裂基因(interrupted gene)。 如图11-1所示,如果将成熟的mRNA分子序列与其基因序列(即DNA序列)比较,可以发现并不是全部的基因序列都保留在成熟的mRNA分子中,有一些区段经过剪接(splicing)被去除。在基外显子(编码序列)上游下游增强子上游/I\\终止密码下游启动子『;始密码二二l\聚A信号mR NA结构亡]亡] 因序列中,出现在成熟mRNA分子上的序列称为外显子(exon);位千外显子之间、与mRNA剪接过程中被删除部分相对应的间隔序列则称为内含子(intron)。每个基因的内含子数目比外显子要少l个。内含子和外显子同时出现在最初合成的mRNA前体中,在合成后被剪接加工为成熟mRNA(见第十四章)。如全长为7.7kb的鸡卵清蛋白基因有8个外显子和7个内含子,最初合成的mRNA前体与相应的基因是等长的,内含子序列被切除后的成熟mRNA分子的长度仅为1.2kb。不同的基因中外显子的数蜇不同,少则数个,多则数十个。外显子的数量是描述基因结构的重要特征之一。 原核细胞的基因基本没有内含子。高等真核生物绝大部分编码蛋白质的基因都有内含子,但组蛋白编码基因例外。此外,编码rRNA和一些tRNA的基因也都有内含子。内含子的数量和大小在很大程度上决定了高等真核生物基因的大小。低等真核生物的内含子分布差别很大,有的酵母的结构基因较少有内含子,有的则较常见。在不同种属中,外显子序列通常比较保守,而内含子序列则变异较大。外显子与内含子接头处有一段高度保守的序列,即内含子5'-末端大多数以GT开始,3'-末端大多数以AG结束,这一共有序列(co nsensus sequence)是真核基因中RNA剪接的识别信号。 为方便叙述基因编码序列和其调节序列的关系,人们约定将一个基因的5'-端称之为上游,3'-端称为下游;为标定DNA信息的具体位置,将基因序列中开始RNA链合成的第一个核背酸所对应的碱基记为+1,在此碱基上游的序列记为负数,向5'-端依次为-l、-2等;在此碱基下游的序列记为正数,向3'-端依次为+2、+3等。零不用千标记碱基位置。 二、基因编码区编码多肤链和特定的RNA分子 基因编码区中的DNA碱基序列决定一个特定的成熟RNA分子的序列,换言之,DNA的一级结构决定着其转录产物RNA分子的一级结构。有的基因仅编码一些有特定功能的RNA,如rRNA、tRNA及其他小分子RNA等;而大多数基因则通过mRNA进一步编码蛋白质多肤链。无论是编码RNA还是编码蛋白质,基本原则是基因的编码序列决定了其编码产物的序列和功能。因此,编码序列中一个碱基的改变或突变,都有可能使基因功能发生重要的变化。这些变化可能是原有功能的丧失,或是新功能的获得。当然,也有的碱基突变不会影响编码产物的序列或功能。 需要指出的是,有些相同的DNA序列由千其起始位点的变化或mRNA不同的剪接产物可以编码不同的蛋白质多肤链。 三、调控序列参与真核基因表达调控 位千基因转录区前后并与其紧邻的DNA序列通常是基因的调控区,又称为旁侧序列(flanking se--;,吓quence)。真核基因的调控序列远较原核生物复杂,迄今了解仍很有限。这些调控序列又被称为顺式作用元件(cis-acting el ement),包括启动子、上游调控元件、增强子、绝缘子、加尾信号和一些细胞信号反应元件等(图11-2)。 上游启动子元件修饰点(人,+I}剪接加尾1启动子提供转录起始信号启动子是DNA分子上能够介导RNA聚合酶结合并形成转录起始复合体的序列。大部分真核基因的启动子位于基因转录起点的上游,启动子本身通常不被转录;但有一些启动子(如编码tRNA基因的启动子)的DNA序列可以位千转录起始点的下游,这些DNA序列可以被转录。真核生物主要有3类启动子(图11-3),分别对应于细胞内存在的三种不同的RNA聚合酶和相关蛋白质(见第十四章)。 L二二二二二二二二二:::二二二二二二二二二二二二二二二二二二二二』I•... 二厂 ! I 图11-3真核基因三类启动子UPE:上游启动子元件(upstream promoter element); Core element:核心元件;Im:起始元件(initiator element); DPE:下游启动子元件(downstream promoter element); Oct:八聚体霖核背酸结合序列(8-base-pair binding sequence); PSE:近侧序列元件(proximal(1)I类启动子富含GC碱基对:具有I类启动子的基因主要是编码rRNA的基因。I类启动子包括核心启动子(core promoter)和上游启动子元件(upstream promoter element, UPE)两部分,能增强转录的起始。两部分序列都富含GC碱基对。 (2)II类启动子具有TATA盒特征结构:具有II类启动子的基因主要是能转录出mRNA且编码蛋白质的基因和一些snRNA基因。Il类启动子通常是由TATA盒(TATA box)、上游调控元件如增强子和起始元件(i nitiator element, Inr)组成。TATA盒的核心序列是TATA(A/T)A(A/T),决定着RNA合成的起始位点。有的Il类启动子在TATA盒的上游还可存在CAAT盒、GC盒等特征序列,共同组成启动子。 4绝缘子阻碍增强子的作用绝缘子(insulator)是基因组上对转录调控起重要作用的一种元件,可以阻碍增强子对启动子的作用,或者保护基因不受附近染色质环境(如异染色质)的影响。特异的转录因子如酵母RAPI蛋白和脊椎动物细胞中CTCF(CCCTC-binding factor)蛋白结合于绝缘子而发挥调控作用。绝缘子阻碍增强子对启动子的作用可能通过影响染色质的三维结构如DNA发生弯曲或形成环状结构。 第二节真核基因组的结构与功能 病毒、原核生物以及真核生物所贮存的遗传信息量有着巨大的差别,其基因组的结构与组织形式上也各有特点,包括基因组中基因的组织排列方式以及基因的种类、数目和分布等。人类基因组包含了细胞核染色体DNA(常染色体和性染色体)及线粒体DNA所携带的所有遗传物质,其组成如图11-4所示。 人类基因组 细胞核基因组线粒体基因组 约27.4%I约72.6% 编码蛋白基因序列 外显子内含子基因间序列中度至高度重复序列 —、真核基因组具有独特的结构 真核生物的基因组庞大,具有以下结构特点。首先,真核基因组中基因的编码序列所占比例远小于非编码序列。人的基因组中,编码序列仅占全基因组的1%;在一个基因的全部序列中,编码序列仅占5%。其次,高等真核生物基因组含有大量的重复序列,可以占到全基因组的80%以上,在入的基因组中重复序列达到50%以上。第三,真核基因组中存在多基因家族和假基因。人的染色体基因组DNA长约3. Oxl~bp,编码约2万个基因,存在着15万个基因家族。一个基因家族中,并非所有\'"i且i成员都具有功能,不具备正常功能的家族成员被称为假基因。第四,大约60%的人基因转录后发生可变剪接,80%的可变剪接会使蛋白质的序列发生改变。第五,真核基因组DNA与蛋白质结合形成染色体,储存于细胞核内,除配子细胞外,体细胞的基因组为二倍体(diploid),即有两份同源的基因组。 真核生物基因组DNA与蛋白质结合,以染色体的方式存在于细胞核内。不同的真核生物具有不同的染色体数目(表11-1)。人类基因组的染色体DNA包括22条常染色体及2条性染色体的DNA,不同染色体的大小在47Mb-250Mb之间(图11-5)。其中,最长的染色体是第1号染色体,约248.96Mb,含有5078个基因;最小的是第21号染色体,约46.71Mb,含有756个基因(资料来源:htLps:II www. ncbi. nlm. nih. govI genomel?term=human[organism],截至2018.02.14)。一些遗传性疾病相关的基因,如阿尔茨海默病、肌萎缩性侧索硬化症和唐氏综合征等,均位于第21号染色体。人基因在染色体上分布也并不是均匀的。其中基因密度最大的是第19号染色体,平均每百万碱基有23个基因;密度最小的是第13号和Y染色体,平均每百万碱基只有5个基因。即便在基因密度最大的染色体上,也存在无基因的“沙漠区”,即在500kb区域内,没有任何基因的编码序列。这种基因分布是如何形成的、有何意义,目前尚不清楚。 物种基因组大小(Mb)基因数染色体数. 支原体M. genitalium0.58487无流感嗜血杆菌H. injluenzae1.851726无枯草芽胞杅菌B. subtilis4.134049无大肠杆菌E. coli5.144996无酿酒酵母S. cer或siae12.12540916裂殖酵母S. pombe12.59513216燕麦0. sativa374.423637621果蝇D. melanogaster143.92147004秀丽隐杆线虫C. elegans101.17200006小鼠rrwuse2671.822200020人H. sap砌瓜2996.432000023.指单倍体细胞内的染色体数目;资料来源:http:/I叭VIV. ncbi. nlm. nih. gov I genom e,截至2018.01.25||l ii l i i i Il i. 二、真核基因组中存在大量重复序列 真核细胞基因组存在着大量重复序列,人基因组中,重复序列占基因组长度的50%以上。重复序列的长度不等,短的仅含两个碱基,长的多达数百乃至上千个碱基。重复序列的重复频率也不尽相同,可以分为高度重复序列(highly repetitive sequence)、中度重复序列(moderately repetitive sequence)和单拷贝序列(single copy seq uence)或低度重复序列等3种。 (一)高度重复序列 高度重复序列是真核基因组中存在的有数千到几百万个拷贝的DNA重复序列。这些重复序列的长度为6-200bp,不编码蛋白质或RNA。在人基因组中,高度重复序列约占基因组长度的20%。 高度重复序列按其结构特点分为反向重复序列(inverted repeat sequence)和卫星DNA(satellite DNA)。 前者由两个相同顺序的互补拷贝在同一DNA链上反向排列而成,反向重复的单位长度约为300bp或略短,其总长度约占人基因组的5%,多数是散在,而非群集于基因组中。卫星DNA是真核细胞染色体具有的高度重复核昔酸序列,主要存在于染色体的着丝粒区,通常不被转录,在人基因组中可占10%以上。由千其碱基组成中GC含量少,具有不同的浮力密度,在氯化绝密度梯度离心后呈现出与大多数DNA有差别的"卫星”条带而得名。 高度重复序列的功能主要是:心参与复制水平的调节。反向重复序列常存在于DNA复制起点区的附近,是一些蛋白质(包括酶)的结合位点。@参与基因表达的调控。高度重复序列可以转录到核内不均-RNA分子中,而有些反向重复序列可以形成发夹结构,有助于稳定RNA分子。@参与染色体配对。如a卫星DNA成簇样分布在染色体着丝粒附近,可能与染色体减数分裂时染色体配对有关。 (二)中度重复序列 中度重复序列指在真核基因组中重复数十至数千次的核昔酸序列,通常占整个单倍体基因组的1%-30%。少数在基因组中成串排列在一个区域,大多数与单拷贝基因间隔排列。依据重复序列的长度,中度重复序列可分为以下两种类型。 1.短散在核元件短散在核元件(short interspersed nuclear elements, SINEs)又称为短散在重复序列(short interspersed repeat sequence),是以散在方式分布于基因组中的较短重复序列,平均长度约为300-500bp,与平均长度约为lOOObp的单拷贝序列间隔排列。拷贝数可达数十万。如Alu家族,Kpn1家族和H叫家族等属于这种类型的中度重复序列。 Alu家族是哺乳类动物,包括人基因组中含量最丰富的一种短分散片段中度重复序列,平均每6kb DNA就有一个Alu序列,在单倍体人基因组中重复达30万~50万次,约占人基因组的3%~6%。Alu家族每个成员的长度约300bp,由于每个单位长度中有一个限制性核酸内切酶Alu的切点(AG!CT),将其切成长130bp和170bp的两段,因而命名为Alu序列(或Alu家族)。 Kpn I家族是中度重复序列中仅次于Alu家族的第二大家族,因其重复序列中含有限制性内切酶Kpn I的位点、可被水解为4个不同长度的片段而命名。Kpn I家族成员呈散在分布,拷贝数约为3000-4800个,占人类基因组的1%。 Hi对家族以319bp长度的串联重复存在于人基因组中,因其重复序列中含有限制性核酸内切酶Hi可I的位点而命名。 2.长散在核元件长散在核元件(long interspersed nuclear elements, LINEs)又称为长散在重复序列(long int erspersed repeat sequence),以散在方式分布于基因组中的较长的重复序列,重复序列长度在lOOObp以上,常具有转座活性。 中度重复序列在基因组中所占比例在不同种属之间差异很大,一般约占10o/o~40%,在人约为12%。这些序列大多不编码蛋白质,其功能可能类似于高度重复序列。真核生物基因组中的rRNA基因也属于中度重复序列。与其他中度重复序列不同,各重复单位\中的rRNA基因都是相同的。rRNA基因通常集中成簇存在,而不是分散于基因组中,这样的区域称为rDNA区,如染色体的核仁组织区(nucleolus organizer region)即为rDNA区。人类的rRNA基因位于13、14、15、21和22号染色体的核仁组织区,每个核仁组织区平均含有50个rRNA基因的重复单位;5S rRNA基因似乎全部位于1号染色体(lq42-43)上,每个单倍体基因组约有1000个5SrRNA基因。 (三)单拷贝序列(低度重复序列) 单拷贝序列在单倍体基因组中只出现一次或数次,大多数编码蛋白质的基因属千这一类。在基因组中,单拷贝序列的两侧往往为散在分布的重复序列。单拷贝序列编码的蛋白质在很大程度上体现了生物的各种功能,因此针对这些序列的研究对医学实践有特别重要的意义。 三、真核基因组中存在大量的多基因家族与假基因基因组中存在的许多来源于同一个祖先,结构和功能均相似的一组基因。这一组基因就构成了一个基因家族。同一家族的这些基因的外显子具有相关性。多基因家族(multigene family)是真核基因组的另一结构特点,是指由某一祖先基因经过重复和变异所产生的一组在结构上相似、功能相关的基因。在细菌或病毒基因组中,80%以上的基因是具有独特结构或功能的基因,但在人的基因组中,这类基因不足20%。 多基因家族大致可分为两类:一类是基因家族成簇地分布在某一条染色体上,它们可同时发挥作用,合成某些蛋白质,如组蛋白基因家族就成簇地集中在第7号染色体长臂3区2带到3区6带区域内。另一类是一个基因家族的不同成员成簇地分布于不同染色体上,这些不同成员编码尸组功能上紧密相关的蛋白质,如人类珠蛋白基因家族分为a珠蛋白和B珠蛋白两个基因簇,a珠蛋白基因簇、B珠蛋白基因簇分别位于第16号和第11号染色体。一些DNA序列相似,但功能不一定相关的若干个单拷贝基因或若干组基因家族可以被归为基因超家族(superfamily gene),例如免疫球蛋白基因超家族、ras基因超家族。一个多基因家族中可有多个基因,根据结构与功能的不同又可以分为亚家族(subfamily),例如G蛋白中属ras超家族约有50多个成员,根据其序列同源性程度又可进一步分为Ras、Rho和Rab三个主要的亚家族。 入的基因组中存在假基因(pseudogene),以申来表示。假基因是基因组中存在的一段与正常基因非常相似但一般不能表达的DNA序列。假基因根据其来源分为经过加工的假基因和未经过加工的假基因2种类型,前者没有内含子,后者含有内含子。这类基因可能曾经有过功能,但在进化中获得一个或几个突变,造成了序列上的细微改变从而阻碍了正常的转录和翻译功能,使它们不能再编码RNA和蛋白质产物。人们推测,经过加工的假基因的来源可能是基因转录生成的成熟mRNA经逆转录产生cDNA,再整合到染色体DNA中去,便有可能成为假基因。经过加工的假基因通常缺少正常基因表达所需的调节序列、没有内含子、可能有poly(A)尾。未经过加工的假基因来源于多拷贝或单拷贝基因的突变或者基因的不完全复制。人基因组中大约有2万个假基因,其中约2000个为核糖体蛋白的假基因。近些年发现,假基因也表达有功能的非编码RNA(non-coding RNA, ncRNA)。 四、线粒体DNA的结构 线粒体是细胞内的一种重要细胞器,是生物氧化的场所,一个细胞可拥有数百至上千个线粒体。线粒体DNA(mitochondrial DNA, mtDNA)可以独立编码线粒体中的一些蛋白质,因此mtDNA是核外遗传物质。mtDNA的结构与原核生物的DNA类似,是环状分子。线粒体基因的结构特点也与原核生物基因的结构特点相似。人的线粒体基因组全长16569bp,共编码37个基因(图11-6),包括13个编码构成呼吸链多酶体系的一些多肤的基因、22个编码mt-tRNA的基因、2个编码mt-rRNA(16S和12S)的基因。 五、人基因组约有两万个蛋白质编码基因 通过基因组测序,人们对数种生物的基因组大小和所含有的基因数量已有所了解。表11-1列出了从原核生物到真核生物有代表性的生物体基因组的大小和基因的数量。总体上来讲,在进化过程中随着生物个体复杂性的增加,基因组的总趋势是由小变大、基因数也是由16S rRNA少变多。但是决定生物复杂性的因素较多,除基因组大小和基因数以外,还有基因密度人mtDNA tRNA11~(gene density)等因素。例如,人的基因组最16569hp-tRNAGin大,复杂程度也最高,但所含的基因数量并不12是最多。尽管不同机构公布的基因数目有所tRNA'I\-tRNA不同,但根据人类基因组计划的数据推测,人RNAA邑的基因数目为2万个左右,仅为果蝇基因数量的l.4倍左右,与线虫基因数量大致相当。 tRNA扣人类基因组基因密度较低,因为基因组中转座子、内含子和调控序列较多,这些序列在进图11-6人的线粒体基因组化过程对遗传多样性的产生至关重要。 基因是能够编码蛋白质或RNA等具有特定功能产物的、负栽遗传信息的基本单位,除了某些以RNA为基因组的RNA病毒外,通常是指朵色体或基因组的一段DNA序列。基因的基本结构包含编码蛋白质或RNA的编码序列及其与之相关的非编码序列。真核基因结构最突出的特点是其不连续性,被称为断裂基因。 基因组是指一个生物体内所有遗传信息的总和。真核基因组具有基因编码序列在基因组中所占比例小于非编码序列、高等真核生物基因组含有大量的重复序列、存在多基因家族和假基因、具有可变剪接,以及真核基因组DNA与蛋白质结合形成染色体,储存于细胞核内等特点。 线粒体DNA是核外遗传物质,可以独立编码线粒体中的一些蛋白质。人的线粒体基因组全长16569bp,共编码37个基因。人基因组中约有两万个基因,分布在22条常染色体及2条性染色体上,但并不是均匀分布。 -思考题... 1.如何理解断裂基因及其意义?2.何谓启动子、增强子、沉默子、绝缘子?3.真核基因组的结构特点是什么?4.举例说明是否可以根据基因组大小或基因数量判断生物体的复杂程度? (汤立军) 第十二章DNA的合成 生物体内或细胞内进行的DNA合成主要包括DNA复制、DNA修复合成和逆转录合成DNA等过程。 DNA复制(replication)是以DNA为模板的DNA合成,是基因组的复制过程。在这个过程中,亲代DNA作为合成模板,按照碱基配对原则合成子代分子,其化学本质是酶促脱氧核昔酸聚合反应。DNA的忠实复制以碱基配对规律为分子基础,酶促修复系统可以校正复制中可能出现的错误(动画12-1“复制发生的化学反应”)。原核生物和真核生物DNA复制的规律和过程相似,但在具体细节上有许多差别,真核生物DNA复制过程和参与的分子更为复杂和精致。本章主要讨论DNA复制和DNA逆转录合成,DNA修复合成将在下一章叙述。 第一节DNA复制的基本规律 DNA复制特征主要包括:半保留复制(semi-conservative replication)、双向复制(b心rectional replication和半不连续复制(semi-discontinuous replication)。DNA的复制具有高保真性(high fidelity)。 —、DNA以半保留方式进行复制 DNA生物合成的半保留复制规律是遗传信息传递机制的重要发现之一。在复制时,亲代双链DNA解开为两股单链,各自作为模板,依据碱基配对规律,合成序列互补的子链DNA双链。亲代DNA模板在子代DNA中的存留有3种可能性,全保留式、半保留式或混合式(图12-la)。 子代DNA亲代DNA, 全保留式半保留式混合式 含15N-DNA的细菌 /II l培养千普w"N-DNA 通培养液 第一代勹杂交DNA /11/1l继续培养千 普通培养液 第二代杂交DNA (a)DNA复制方式的3种可能性;(b)15N标记DNA实验证明半保留复制假设1958年,MeselsonM和StahlFW用实验证实自然界的DNA复制方式是半保留式的。他们利用细菌能够以NH4Cl为氮源合成DNA的特性,将细菌在含15NH4Cl的培养液中培养若干代(每一代约20分钟),此时细菌DNA全部是含15N的“重“DNA;再将细菌放回普通的14NH4Cl培养液中培养,新合成的DNA则有14N的掺入;提取不同培养代数的细菌DNA做密度梯度离心分析,因15N-DNA和14N-DNA的密度不同,DNA因此形成不同的致密带。结果表明,细菌在重培养基中生长繁殖时合成的15N-DNA是1条高密度带;转入普通培养基培养l代后得到1条中密度带,提示其为15N-DNA链与14N-DNA链的杂交分子;在第二代时可见中密度和低密度2条带,表明它们分别为15N-DNA链/14N-DNA链、14NDNA链/14N-DNA链组成的分子(图12-lb)。随着在普通培养基中培养代数的增加,低密度带增强,而中密度带保持不变。这一实验结果证明,亲代DNA复制后,是以半保留形式存在千子代DNA分子中的。 半保留复制规律的阐明,对于理解DNA的功能和物种的延续性有重大意义。依据半保留复制的方式,子代DNA中保留了亲代的全部遗传信息,亲代与子代DNA之间碱基序列高度一致(图122)。 (a)母链DNA;(b)复制过程打开的复制叉;(c)两个子代细胞的双链DNA,实线链来自母链,虚线链是新合成的子链遗传的保守性是相对而不是绝对的,自然界还存在着普遍的变异现象。遗传信息的相对稳定是物种稳定的分子基础,但并不意味着同一物种个体与个体之间没有区别。例如病毒是简单的生物,流感病毒就有很多不同的毒株,不同毒株的感染方式、毒性差别可能很大,在预防上有相当大的难度。又如,地球上曾有过的人口和现有的几十亿入,除了单卵双胞胎之外,两个人之间不可能有完全一样的DNA分子组成(基因型)。因此,在强调遗传保守性的同时,不应忽视其变异性。 二、DNA复制从起点双向进行 细胞的增殖有赖千基因组复制而使子代得到完整的遗传信息。原核生物基因组是环状DNA,只有一个复制起点(origin)。复制从起点开始,向两个方向进行解链,进行的是单点起始双向复制(图12-3a)。复制中的模板DNA形成2个延伸方向相反的开链区,称为复制叉(replication fork)。复制叉指的是正在进行复制的双链DNA分子所形成的Y形区域,其中,已解旋的两条模板单链以及正在进行合成的新链构成了Y形的头部,尚未解旋的DNA模板双链构成了Y形的尾部。 234第三篇遗传信息的传递 复制起点双向复制形成2个复制叉I (a)原核生物环状DNA的单点起始双向复制 复制起点o复制起点o复制起点复制起点。。 (b)真核生物DNA的多点起始双向复制 真核生物基因组庞大而复杂,由多个染色体组成,全部染色体均需复制,每个染色体又有多个起点,呈多起点双向复制特征(图12-3b)。每个起点产生两个移动方向相反的复制叉,复制完成时,复制叉相遇并汇合连接。从一个DNA复制起点起始的DNA复制区域称为复制子(replicon)。复制子是含有一个复制起点的独立完成复制的功能单位。高等生物有数以万计的复制子,复制子间长度差别很大,约在13~900kb之间。 三、DNA复制以半不连续方式进行 DNA双螺旋结构的特征之一是两条链的反向平行,一条链为5'至3'方向,其互补链是3'至5'方向。DNA聚合酶只能催化DNA链从5'至3'方向的合成,故子链沿着模板复制时,只能从5'至3'方向延伸。在同一个复制叉上,解链方向只有一个,此时一条子链的合成方向与解链方向相同,可以边解链,边合成新链。然而,另一条链的复制方向则与解链方向相反,只能等待DNA全部解链,方可开始合成这样的等待在细胞内显然是不现实的。 1968年,冈崎(OkazakiR)用电子显微镜结合放射自显影技术观察到,复制过程中会出现一些较短的新DNA片段,后人证实这些片段只出现千同一复制叉的一股链上。由此提出,子代DNA合成是以半不连续的方式完成的,从而克服DNA空间结构对DNA新链合成的制约。 目前认为,在DNA复制过程中,沿着解链方向生成的子链DNA的合成是连续进行的,这股链称为前导链(leading strand);另一股链因为复制方向与解链方向相反,不能连续延长,只能随着模板链的解开,逐段地从5'-+3'生成引物并复制子链。夕3'模板被打开一段,起始合成一段子链;再打开一~~5前导链段,再起始合成另一段子链,这一不连续复制的////多〉链称为后随链(lagging strand)。前导链连续复乡制而后随链不连续复制的方式称为半不连续复5'.气购I句制(图12-4)。在引物生成和子链延长上,后随链都比前导链迟一些,因此,两条互补链的合成后随链是不对称的。、\\1沿着后随链的模板链合成的新DNA片段被命名为冈崎片段(Okazaki fragment)。真核冈匡12-4DNA的半不连续复制崎片段长度100~200核昔酸残基,而原核是1000~2000核昔酸残基。复制完成后,这些不连续片段经过去除引物,填补引物留下的空隙,连接成完整的DNA长链。 四、DNA复制具有高保真性 DNA复制具有高度保真性,其错配概率约为10-IO。“半保留复制“确保亲代和子代DNA分子之间信息传递的绝对保真性。高保真DNA聚合酶利用严格的碱基配对原则是保证复制保真性的机制之一。另外,体内复制叉的复杂结构提高了复制的准确性;DNA聚合酶的核酸外切酶活性和校读功能以及复制后修复系统(光复活修复、剪切修复、重组修复、SOS,详见第十三章)对错配加以纠正,四种机制协同进一步提高了复制的保真性。 细菌复制酶有多个错误修复系统。真核细胞有许多DNA聚合酶,复制酶以高保真度运作。复制酶有复杂的结构,不同亚基具有不同功能(表12-1)。除了B酶,修复酶都有低保真度,修复酶的结构相对简单。 DNA聚合酶功能结构 高保真复制 O!核DNA复制350kD四聚体 8后随链合成250kD四聚体 e前导链合成350kD四聚体 丫线粒体DNA复制200kD二聚体 高保真修复 B碱基切除修复39kD单体 低保真修复 g碱基损伤旁路异聚体 n胸腺啥唗二聚体旁路单体 减数分裂相关单体 K碱基替换与缺失单体 第二节DNA复制的酶学和拓扑学 DNA复制是酶促核昔酸聚合反应,底物是dATP、dGTP、dCTP和dTIP,总称dNTP。dNTP底物有3个磷酸基团,最靠近核糖的称为a-P,向外依次为~-P和-y-P。在聚合反应中,a-P与子链末端核糖的3'-0H连接。 模板是指解开成单链的DNA母链,遵照碱基互补规律,按模板指引合成子链,子链延长有方向性。引物提供3'-0H末端使dNTP可以依次聚合。由于底物的5'-P是加合到延长中的子链(或引物)3'-端核糖的3'-0H基上生成磷酸二酷键的,因此新链的延长只可沿5'向3'方向进行。核昔酸和核昔酸之间生成3',5'-磷酸二酷键而逐一聚合,是复制的基本化学反应(图12-5)。图12-5的反应可简示为:(dNMP)n+dNTP--+(dNMP)n+I+PPi。N代表4种碱基的任何一种。 一、DNA聚合酶催化脱氧核糖核苦酸间的聚合 DNA聚合酶全称是依赖DNA的DNA聚合酶(DNA-dependent DNA polymerase, DNA pol)。DNA pol是1958年由Kornberg A在E. coli中首先发现的。他从细菌沉渣中提取得到纯酶,在试管内加入模板DNA、dNTP和引物,该酶可催化新链DNA生成。这一结果直接证明了DNA是可以复制的,是继236第三篇遗传信息的传递A5'~RNA引物(}贮扣炉气:1,物Il()4P-PI)DNA双螺旋模型确立后的又一重大发现。当时将此酶称为复制酶(replicase)。在发现其他种类的DNA pol后,Kornberg A发现的DNA聚合酶被称为DNA pol I。(一)原核生物至少有5种DNA聚合酶大肠杆菌经人工处理和筛选,可培育出基因变异菌株。DNA pol I基因缺陷的菌株,经实验证明照样可进行DNA复制。DNA pol I由polA编码,主要在DNA损伤修复中发挥作用,在半保留复制中起到辅助作用。从变异菌株中相继提取到的其他DNA pol被分别称为DNA pol II和DNA pol ID。DNA pol II由polB编码,当复制过程被损伤的DNA阻碍时重新启动复制叉。这三种聚合酶都有5'-,3'延长脱氧核昔酸链的聚合活性及3'一5核酸外切酶活性。DNA polN和DNA pol V分别由clinB和umu'2C编码,属于跨损伤合成DNA聚合酶。 DNA pol皿由polC编码,聚合反应比活性远高于pol I,每分钟可催化多至105次聚合反应,因此DNA pol皿是原核生物复制延长中真正起催化作用的酶。DNA pol皿是由10种(17个)亚基组成的前导链的合成不对称异聚合体(图12-6),由2个核心酶(core en zyme)通过1对B亚基构成的滑动夹(sliding clamp)与丫复合物("{-compl ex)、即夹子加载复合体(clamp-load ing complex)连接组成。核心酶由a、e、0亚基共同组成,主要作用是合成DNA,有5'-+3'聚合活性;e亚基是复制的保真性所必需;B亚基发挥夹稳DNA模板链,并使酶沿模板滑动的作用;图12-6E. Coli DNA pol旧全酶的分子结构其余的7个亚基统称'Y-复合物,包括"{、8、8'、叭x和两个T,有促进滑动夹加载、全酶组装至模板上及增强核心酶活性的作用。DNA pol I的二级结构以a-螺旋为主,只能催化延长约20个核昔酸左右,说明它不是复制延长过程中起主要作用的酶。DNA pol I在活细胞内的功能主要是对复制中的错误进行校对,对复制和修复中出现的空隙进行填补。用特异的蛋白酶可以将DNA pol I水解为2个片段,小片段共323个氨基酸残基,有5'->-3'核酸外切酶活性。大片段共604个氨基酸残基,被称为Klenow片段,具有DNA聚合酶活性和3'一5'核酸外切酶活性。Klenow片段是实验室合成DNA和进行分子生物学研究常用的工具酶。DNA pol II基因发生突变,细菌依然能存活,推想它是在pol I和pol III缺失情况下暂时起作用的酶。DNA pol II对模板的特异性不高,即使在已发生损伤的DNA模板上,它也能催化核昔酸聚合。因此认为,它参与DNA损伤的应急状态修复。 @ (二)常见的真核细胞DNA聚合酶有5种真核细胞的DNA聚合酶至少15种,常见的有5种,它们在功能上与原核细胞的比较见表 12-2。 E. coli真核细胞功上月匕I 去除RNA引物,填补复制中的DNA空隙,DNA修复和重组DNA pola合成引物,然后迅速被具有连续合成能力的DNA polo和DNA pole所替换,这一过程称为聚合酶转换(polymerase switching)。DNA polo负责合成后随链,DNA pole负责合成前导链。至千高等生物中是否还有独立的解旋酶和引物酶,目前还未能确定。但是,在病毒感染培养细胞(HeLa/SV40)的复制体系中,发现SV40病毒的T抗原有解旋酶活性。DNA pol a催化新链延长的长度有限,但它能催化RNA链的合成,因此认为它具有引物酶活性。DNA pol f3复制的保真度低,可能是参与应急修复复制的酶。DNA pol-y是线粒体DNA复制的酶,见本章第四节。 二、DNA聚合酶的碱基选择和校读功能 DNA复制的保真性是遗传信息稳定传代的保证。生物体至少有3种机制实现保真性:O遵守严格的碱基配对规律;@聚合酶在复制延长中对碱基的选择功能;@复制出错时有即时的校对功能。 (一)复制的保真性依赖正确的碱基选择 DNA复制保真的关键是正确的碱基配对,而碱基配对的关键又在于氢键的形成。G和C以3个氢键、A和T以2个氢键维持配对,错配碱基之间难以形成氢键。除化学结构限制外,DNA聚合酶对配对碱基具有选择作用。 DNA pol是在DNA链延长中起催化作用的酶。利用“错配“实验发现,DNA pol皿对核昔酸的掺入(incorporation)具有选择功能。例如,用21聚腺昔酸poly(dA)21作模板,用poly(dT)20作复制引物,观察引物的3'-0H端连上的是否为胸昔酸(T)。尽管反应体系中4种核昔酸都存在,第21位也只会出现T。若仅仅加入单一种类的dNTP作底物,就会"迫使”引物在第21位延长中出现错配。用柱层析技术可以把DNA pol皿各个亚基组分分离,然后再重新组合。如果重新组合的DNA pol皿不含e亚基,复制错配频率出现较高,说明e亚基是执行碱基选择功能的。 DNA中脱氧核糖以糖甘键与碱基连接,此键有顺式(syn)和反式(a叩)两种构象(conformation)。在B-DNA(右手双螺旋)中,如果碱基是噤呤,DNA糖昔键总是反式,与相应的啼唗形成氢键配对。而要形成嗦呤嗦呤配对,则其中一个嗦呤必须旋转180°, DNA pol ill对不同构型糖昔键表现不同亲和力,因此实现其选择功能。 前已述及,DNA pol皿的l0个亚基中,以me和0作为核心酶并组成较大的不对称二聚体。核心酶中,a亚基有5'—►3聚合酶活性,e有3'一5'核酸外切酶活性以及碱基选择功能。0亚基未发现有催化活性,可能起维系二聚体的作用。对各亚基功能的深入研究认为,在核昔酸聚合之前或在聚合当时,酶就可以控制碱基的正确选择。 (二)聚合酶中的核酸外切酶活性在复制中辨认切除错配碱基并加以校正原核生物的DNA pol I、真核生物的DNA pol o和DNA pole的3'一5'核酸外切酶活性都很强,可以在复制过程中辨认并切除错配的碱基,对复制错误进行校正,此过程又称错配修复(mismatch repair)。 以DNA pol I为例(图12-7)。图中的模板链是G,新链错配成A而不是C。DNA pol I的31一5'\`'外切酶活性将错配的A水解下来,同时利用5'一3'聚合叭A polJ 酶活性补回正确配对的C,复制可以继续下去,这种功能称为校对(proofreading)。实验也证明:如果是正确的 外.1•;17,r,/l\\忖聚合活fl配对,3'一5'外切酶活性是不表现的。DNA pol I还有5'-+3'外切酶活性,实施切除引物、切除突变片段的`A/)I(TI)功能。3'G三、复制中DNA分子拓扑学变化九沽PjDNA分子的碱基埋在双螺旋内部,只有解成单链,、亡千一G3'才能发挥模板作用。WatsonJ和CrickF在建立DNA双(b)螺旋结构模型时曾指出,生物细胞如何解开DNA双链图12-7DNA pol I的校对功能是理解复制机制的关键。目前已知,多种酶和蛋白质分(a)DNA pol I的外切酶活性切除错配碱基,子共同完成DNA的解链。并用其聚合活性掺入正确配对的底物;(b)碱(一)多种酶参与DNA解链和稳定单链状态基配对正确,DNA pol I并不表现外切酶活性复制起始时,需多种酶和辅助的蛋白质因子(表12-3),共同解开并理顺DNA双链,且维持DNA分子在一段时间内处于单链状态。 蛋白质(基因)通用名功能 DnaA(dnaA)辨认复制起点DnaB(dnaB)解旋酶解开DNA双链DnaC(dnaC)运送和协同DnaBDnaG(dnaG)引物酶催化RNA引物生成SSB单链结合蛋白/DNA结合蛋白稳定已解开的单链DNA拓扑异构酶拓扑异构酶II又称促旋酶解开超螺旋大肠杆菌(Escherichia coli, E. coli)结构简单,繁殖速度快,是较早用于分子遗传学研究的模式生物。对大肠杆菌变异株进行分析,可以阐明各种基因的功能。早期发现的与DNA复制相关的基因曾被命名为dnaA、dnaB、…、dnaX等,分别编码DnaA、DnaB等蛋白质分子。 DnaB作用是利用ATP供能来解开DNA双链,为解旋酶(helicase)。E. coli DNA复制起始的解链是由DnaA、DnaB和DnaC共同起作用而发生的。 DNA分子只要碱基配对,就会有形成双链的倾向。单链结合蛋白(single stranded binding protein, SSB)具有结合单链DNA的能力,维持模板的单链稳定状态并使其免受细胞内广泛存在的核酸酶的降解。SSB作用时表现协同效应,保证SSB在下游区段的继续结合。可见,它不像聚合酶那样沿着复制方向向前移动,而是不断地结合、脱离。(二)DNA拓扑异构酶改变DNA超螺旋状态DNA拓扑异构酶(DNA topoisomerase)简称拓扑酶,广泛存在于原核及真核生物,分为I型和II型两种最近还发现了拓扑酶皿。原核生物拓扑异构酶II又称促旋酶(gyrase),真核生物的拓扑酶II还有几种不同亚型。拓扑一词,在物理学上是指物体或图像作弹性移位而保持物体原有的性质。DNA双螺旋沿轴旋绕,复制解链也沿同一轴反向旋转,复制速度快,旋转达100次/秒,会造成复制叉前方的DNA分子打结、缠绕、连环现象。DNA在复制解链过程形成超螺旋结构的形态见图12-8。这种超螺旋及局部松弛等过渡状态,需要拓扑酶作用以改变DNA分子的拓扑构象,理顺DNA链结构来配合复制进程。 DNA只固定一端DNA两端固定 卜啤勺壶萝笠、`、、总、、硒 I解开l旰碱基对j解开1旰碱基对 (一个螺旋)(一个螺旋) 区交公入欢汹咚怜~>姿妥言、辜 DNA将会DNA形成旋转一圈一个超螺旋 _忒二必4二二:郊~~邓硒叶 咖畴 尸$言产4 复-钰/奴乙t l,言霓刁 负超螺旋正超螺旋开口易化开口受阻 (a)代表螺旋一端固定,通过自由旋转不形成超螺旋结构;(b)代表两端固定,螺旋局部解开后,形成一个超螺旋;(c)蛋白质分子参与DNA复制过程,在其前方形成正超螺旋,在其后方形成负超螺旋拓扑酶既能水解,又能连接DNA分子中磷酸二酷键(图夕,'12-9),可在将要打结或已打结处切口,下游的DNA穿越切口并作一定程度旋转,把结打开或解松,然后旋转复位连接。主要有两类拓扑酶在复制中用于松解超螺旋结构(动画12-2“解螺旋酶")。拓扑酶I可以切断DNA双链中一股,使DNA解链旋转中不致打结,适当时候又把切口封闭,使DNA变为松弛状态,这一反应无需ATP。拓扑酶II可在一定位置上,切断处千正超螺旋状态的DNA双链,使超螺旋松弛;然后利(a)(b)'\,用ATP供能,松弛状态DNA的断端在同一个酶的催化下连接恢复。这些作用均可使复制中的DNA解开螺旋、连环或图12-9拓扑酶的作用方式(b)是(a)的局部放大图,经拓扑酶I作解连环,达到适度盘绕。母链DNA与新合成链也会互相缠用,两个环变为一个环绕,形成打结或连环,也需拓扑异构酶II的作用。DNA分子一边解链,一边复制,所以复制全过程都需要拓扑酶。 四、DNA连接酶连接复制中产生的单链缺口 DNA连接酶(DNA ligase)连接DNA链3'-0H末端和另一DNA链的5'-P末端,两者间生成磷酸二酷键,从而将两段相邻的DNA链连接成完整的链(动画12-3"DNA连接酶")。连接酶的催化作用需要消耗ATP。实验证明:连接酶只能连接双链中的单链缺口,它并没有连接单独存在的DNA单链...或RNA单链的作用。复制中的后随链是分段合成的,产生的冈崎片段之间的缺口,要靠连接酶接合。图12-10显示连接酶的催化作用。图的上部说明其作用于互补双链上的一股不连续的DNA链;图的下部显示DNA连接酶的催化作用。 DNA连接酶不但在复制中起最后接合缺口的作用,在DNA修复、重组中也起接合缺口作用。如r". E(a)5,-l,_上3'3'-—PHO连接荫5'(b)''一()-P一()P5'(I)尸Al`I ' HO 灶接酌卜贮A])1J(a)连接酶连接双链DNA上单链的缺口;(b)被连接的缺口放大图,是连果DNA两股都有单链缺口,只要缺口前后的碱基互补,连接酶也可连接。因此它也是基因工程的重要工具酶之一。 第三节原核生物DNA复制过程 原核生物染色体DNA和质粒等都是共价环状闭合的DNA分子,复制过程具有共同的特点,但并非绝对相同,下面以大肠杆菌DNA复制为例,介绍原核生物DNA复制的过程和特点。 一、复制的起始 起始是复制中较为复杂的环节,在此过程中,各种酶和蛋白质因子在复制起点处装配引发体,形成复制叉并合成RNA引物。(-)DNA的解链1.复制有固定起点复制不是在基因组上的任何部位随机起始。E.coli上有一个固定的复制起点,称为ori C,跨度为245bp,碱基序列分析发现这段DNA上有5组由9个碱基对组成的串联重复序列,形成Dna A结合位点,和3组由13个碱基对组成的串联重复序列的富含AT(AT rich)区(图1211)。DNA双链中,AT间的配对只有2个氢键维系,故富含AT的部位容易发生解链。(动画12-42. DNA解链需多种蛋白质参与DNA的解链过程由DnaA、DnaB、DnaC三种蛋白质共同参与完成。DnaA蛋白是一同源四聚体,负责辨认并结合于oriC的串联重复序列(AT区)上。然后,几个DnaA蛋白互相靠近,形成DNA-蛋白质复合体结构,促使AT区的DNA解链。DnaB蛋白(解旋酶)在DnaC蛋白的协同下,结合并沿解链方向移动,使双链解开足够用千复制的长度,并且逐步置换出DnaA蛋白。此时,复制叉已初步形成。SSB(单链结合蛋白)此时结合到DNA单链上,在一定时间内使复制叉保持适当的长度,有利于核昔酸依模板掺入。 3.解链过程中需要DNA拓扑异构酶解链是一种高速的反向旋转,其下游势必发生打结现象。拓扑异构酶Il通过切断、旋转和再连接的作用,实现DNA超螺旋的转型,即把正超螺旋变为负超螺旋。实验证明:负超螺旋DNA比正超螺旋有更好的模板作用。从道理上也是可以理解的:扭得不那么紧的超螺旋当然比过度扭紧的更容易解开成单链。 (二)引物合成和起始复合物的形成复制起始过程需要先合成引物(primer),引物是由引物酶(primase)催化合成的短链RNA分子。 一旋螺超负 起始 复合物 预引发复合物图12-11原核生物的复制起始部位及解链母链DNA解成单链后,不会立即按照模板序列将dNTP聚合为DNA子链。这是因为DNA pol不具备催化两个游离dNTP之间形成磷酸二酷键的能力,只能催化核酸片段的3'-0H末端与dNTP间的聚合。但RNA聚合酶不需要3'-0H便可催化NTP的聚合,而引物酶属于RNA聚合酶,故复制起始部位合成的短链引物RNA为DNA的合成提供3'-0H末端,在DNA pol催化下逐一加入dNTP而形成DNA子链。 引物酶是复制起始时催化RNA引物合成的酶。它不同于催化转录的RNA聚合酶(见第十四章)。利福平(rifampicin)是转录用RNA pol的特异性抑制剂,而引物酶对利福平不敏感。 在DNA双链解链基础上,形成了DnaB、DnaC蛋白与DNA复制起点相结合的复合体,此时引物酶进入。此时形成含有解旋酶DnaB、D naC、引物酶和DNA的复制起始区域共同构成的起始复合物结构,该结构在噬菌体中X系统也称为引发体(primosome)(动画12-5“引发体的生成")。起始复合物蛋白质组分在DNA链上的移动需由ATP供给能量。在适当位置上,引物酶解旋酶DnaB5'-3'依据模板的碱基序列,从5'~3'方向催化NTP(不是3'dNTP)的聚合,生成短链的RNA引物(图12-12)(动画12-6“引物合成复制起始”)。引物长度约为5~l0个核昔酸不等。引物合成的方5'向也是自5'端至3'端。已合成的引物必然留有3'-0H末SSB单链结合蛋白(~60/复制叉) 3又;三三三言::三五:量 DnaG引物酶催化RNA引物生成二、DNA链的延长 复制中DNA链的延长在DNA pol催化下进行。原核生物催化延长反应的酶是DNA pol皿。底物dNTP的a-磷酸基团与引物或延长中的子链上3'-0H反应后,dNMP的DNA复制的启动需要多种酶参与,包括解旋酶、3'-0H又成为链的末端,使下一个底物可以掺入。复制沿单链结合蛋白和引物酶5'一3'延长,指的是子链合成的方向。前导链沿着5'一3'图12--12起始复合物和复制叉的生成方向连续延长,而后随链沿着5'一3'方向呈不连续延长。 242第三篇遗传信息的传递 (动画12-8“复制的延长”)在同一个复制叉上,前导链的复制先千后随链,但两链是在同一个DNA pol llI催化下进行延长的。这是因为后随链的模板DNA可以折叠或绕成环状,进而与前导链正在延长的区域对齐(图1213)。图中可见,由于后随链作360°绕转,前导链和后随链的延长方向和延长点都处在DNA pol llI核心酶的催化位点上。解链方向就是酶的前进方向,亦即复制叉向前伸展的方向。因为复制叉上解开的模板单链走向相反,所以其中一股出现不连续复制的冈崎片段。 (a)DNA pol皿的核心酶和B亚基;(b)(c)(d)分别是后随链的巳复制、正在复制和未复制的片段,实线是母链,虚线代表子链DNA复制延长速度相当快。以E. coli为例,营养充足、生长条件适宜时,细菌20分钟即可繁殖一代。E. coli基因组DNA全长约4600kb,依此计算,每秒钟能掺入的核昔酸达3800个。 三、复制的终止 复制的终止过程,包括切除引物、填补空缺和连接切口(动画12-9“复制的终止")。原核生物基因是环状DNA,复制是双向复制,从起点开始各进行180°,同时在终止点上汇合。 由于复制的半不连续性,在后随链上出现许多冈崎片段。每个冈崎片段上的引物是RNA而不是DNA。复制的完成还包括去除RNA引物和换成DNA,最后5'把DNA片段连接成完整的子链。这一过程用图12-14加以5'`从___--NVVW说明。实际上此过程在子链延长中已陆续进行,不必等到RNA酶引物的水解靠细胞核内的DNA pol I,水解后留下'i'-OH P空隙(gap)。空隙的填补由DNA pol I而不是DNA pol poll!dNTP皿催化,从5'端向3'端用dNTP为原料生成相当千引物长度的DNA链。dNTP的掺入要有3'-0H,在原引物5'相邻的子链片段提供3'-0H继续延伸,就是说,由后复S'tvVVVv-----—-P制的片段延长以填补先复制片段的引物空隙。填补至足够长度后,还是留下相邻的3'-0H和5'-P的缺口5'(nick)。缺口由连接酶连接。按照这种方式,所有的冈`, V崎片段在环状DNA上连接成完整的DN A子链。前导链图12-14子链中的RNA引物被取代也有引物水解后的空隙,在环状DNA最后复制的3'-0H齿状线代表引物端继续延长,即可填补该空隙及连接,完成基因组DNA的整个复制过程。 第四节真核生物DNA复制过程 真核生物的基因组复制在细胞分裂周期的DNA合成期(S期)进行。细胞周期进程在体内受到微环境中的增殖信号、营养条件等诸多因素影响,多种蛋白质因子和酶控制细胞进入S期的时机和DNA合成的速度。真核生物DNA合成的基本机制和特征与原核生物相似,但是由于基因组庞大及核小体的存在,反应体系、反应过程和调节均更为复杂。 一、真核生物DNA复制的起始与原核生物基本相似 真核生物DNA分布在许多染色体上,各自进行复制。每个染色体有上千个复制子,复制的起点很多。复制有时序性,就是说复制子以分组方式激活而不是同步启动。转录活性高的DNA在S期早期就进行复制。高度重复的序列如卫星DNA、连接染色体双倍体的部位即中心体(cen trosome)和线性染色体两端即端粒(telomere)都是在S期的最后阶段才复制的。 真核生物复制起点序列较E. coli的oriC复杂。酵母DNA复制起点含llbp富含AT的核心序列:A(T)TTTATA(G)TTTA(T),称为自主复制序列(autonomous replication sequence, ARS)。也发现比E.coli的oriC序列长的真核生物复制起点。 真核生物复制起始也是打开双链形成复制叉已,形成引发体和合成RNA引物。但详细的机制,包括酶及各种辅助蛋白质起作用的先后顺序,尚未完全明了。复制的起始需要DNA pol ex、pole和pol8的参与(表12-2)。此外还需解旋酶,拓扑酶和复制因子(replication factor, RF),如RFA、RFC等。 增殖细胞核抗原(proliferation cell nuclear antigen, PCNA)在复制起始和延长中发挥关键作用。PCNA为同源三聚体,具有与E. coli DNA pol皿的B亚基相同的功能和相似的构象,即形成闭合环形的可滑动的DNA夹子,在RFC的作用下PCNA结合千引物-模板链;并且PCNA使pol8获得持续合成的能力。PCNA尚具有促进核小体生成的作用(见后)。PCNA的蛋白质水平也是检验细胞增殖能力的重要指标。 二、真核生物DNA复制的延长发生DNA聚合酶转换 现在认为DNApol ex主要催化合成引物,然后迅速被具有连续合成能力的DNA pol8和DNA pole所替换,这一过程称为聚合酶转换。DNA pol8负责合成后随链,DNA pole负责合成前导链。真核生物是以复制子为单位各自进行复制的,所以引物和后随链的冈崎片段都比原核生物的短。 实验证明,真核生物的冈崎片段长度大致与一个核小体(nucleosome)所含DNA碱基数(135bp)或其若干倍相等。可见后随链的合成到核小体单位之末时,DNA pol8会脱落,DNA pol ex再引发下游引物合成,引物的引发频率是相当高的。pol ex与pol8之间的转换频率高,PCNA在全过程也要多次发挥作用。以上描述的实际是真核生物复制子内后随链的起始和延长交错进行的复制过程。前导链的连续复制,亦只限于半个复制子的长度。当后随链延长了一个或若干个核小体的长度后,要重新合成引物。FENl和RNase H等负责去除真核复制RNA引物。 真核生物DNA合成,就酶的催化速率而言,远比原核生物慢,估算为50个dNTP/S。但真核生物是多复制子复制,总体速度是不慢的。原核生物复制速度与其培养(营养)条件有关。真核生物在不同楛官组织、不同发育时期和不同生理状况下,复制速度大不一样。 三、真核生物DNA合成后立即组装成核小体 复制后的DNA需要重新装配。原有的组蛋白及新合成的组蛋白结合到复制叉后的DNA链上,真核生物DNA合成后立即组装成核小体。生化分析和复制叉的图像一致表明,核小体的破坏仅局限在紧邻复制叉的一段短的区域内,复制叉的移动使核小体破坏,但是复制叉向前移动时,核小体在子链上迅速形成。核小体组蛋白八聚体的数量是同期合成的一个核小体DNA长度的两倍,核素标记实验证明,原有组蛋白大部分可重新组装至DNA链上,但在S期细胞也大蜇、迅速地合成新的组蛋白。 四、端粒酶参与解决染色体末端复制问题 真核生物DNA复制与核小体装配同步进行,复制完成后随即组合成染色体并从G2期过渡到M期。染色体DNA是线性结构。复制中冈崎片段的连接,复制子之间的连接,都易于理解,因为均在线性DNA的内部完成。 染色体两端DNA子链上最后复制的RNA引物,去除后留下空隙。剩下的DNA单链母链如果不填补成双链,就会被核内DNase酶解。某些低等生物作为少数特例,染色体经多次复制会变得越来越短(图12-15)。早期的研究者们在研究真核生物复制终止时,曾假定有一种过渡性的环状结构帮助染色体末端复制的完成,后来一直未能证实这种环状结构的存在。然而,染色体在正常生理状况下复制,是可以保持其应有长度的。 \江>,已'.,..亨`.·, 3'鲁``...i^,,,:嚷二..霉如•重'"..;_,`“·土r...产...5'3'~.'``,.·勺A5'5'V,·:.'『凸·.-·.•.,,3'3'••'I俨憾m,付曹阶晶“'5'5',;,'.....、3'端粒是真核生物染色体线性DNA分子的末端结构。形态学上,染色体DNA末端膨大成粒状,这是因为DNA和它的结合蛋白质紧密结合,像两顶帽子那样盖在染色体两端,因而得名包。在某些情况下,染色体可以断裂,这时,染色体断端之间会发生融合或断端被DNA酶降解。但正常染色体不会整体地互相融合,也不会在末端出现遗传信息的丢失。可见,端粒在维待染色体的稳定性和DNA复制的完整性中有着重要的作用。DNA测序发现端粒结构的共同特点是富含T-G短序列的多次重复。如仓鼠和人类端粒DNA都有(Tn Gn),的重复序列,重复达数十至上百次,并能反折成二级结构。 20世纪80年代中期发现了端粒酶(telom erase)。1997年,人类端粒酶基因被克隆成功并鉴定了该酶由三部分组成:约45l nt或150~1300nt的端粒酶RNA(human telomerase RNA,----///z/-新合成的端粒端粒酶延长重复序列hTR)、端粒酶协同蛋白1(human telomerase associat ed protein l, hTPl)和端粒酶逆转录酶该酶兼有提供RNA模板和催化逆转录的功能。复制终止时,染色体端粒区域的DNA确有可能缩短或断裂。端粒酶通过一种称为爬养传代次数增加,端粒长度逐渐缩短。生殖细胞中端粒长于体细胞,成年人细胞中端粒比胚胎细胞中端粒短。据上述的实验结果,至少可以认为在细胞水平,老化是和端粒酶活性下降有关的。当然,生物个体的老化,受多种环境因素和体内生理条件的影响,不能简单地归结为某单一因素的作用。 此外,在增殖活跃的肿瘤细胞中发现端粒酶活性增高。但在临床研究中也发现某些肿瘤细胞的端粒比正常同类细胞显著缩短。可见,端粒酶活性不一定与端粒的长度成正比。端粒和端粒酶的研究,在肿瘤学发病机制、寻找治疗靶点上,已经成为一个重要领域。 246第三篇遗传信息的传递 五、真核生物染色体DNA在每个细胞周期中只能复制—次真核染色体DNA复制的一个重要特征是复制仅仅出现在细胞周期的S期,而且只能复制一次。染色体的任何一部分的不完全复制,均可能导致子代染色体分离时发生断裂和丢失。不适当的DNA复制也可能产生严重后果,如增加基因组中基因调控区的拷贝数,从而可能在基因表达、细胞分裂、对环境信号的应答等方面产生灾难性后果。 真核细胞DNA复制的起始分两步进行,即复制基因的选择和复制起点的激活,这两步分别出现千细胞周期的特定阶段。复制基因(replicator)是指DNA复制起始所必需的全部DNA序列。复制基因的选择出现于G1期,在这一阶段,基因组的每个复制基因位点均组装前复制复合物(pre-replicative complex, pre-RC)。复制起点的激活仅出现于细胞进入S期以后,这一阶段将激活pre-RC,募集若干复制基因结合蛋白和DNA聚合酶,并起始DNA解旋。 复制起点的激活与细胞周期进程一致。细胞周期蛋白D的水平在G1后期升高,激活S期的CDK(cyclin-dependent kinase, CDK)。复制许可因子(replication licensing factor)是CDK的底物,为发动DNA复制所必需。复制许可因子一般不能通过核膜进入核内,但是在有丝分裂的末期、核膜重组之前可以进入细胞核,与DNA的复制起点结合。等待被刺激进入S期的CDK激活,启动复制。一旦复制启动,复制许可因子即失去活性或被降解。在细胞周期的其他时间内,新的复制许可因子不能进入细胞核内,保证在一个细胞周期内只能进行一次基因组的复制。 在原核细胞中,复制基因的识别与DNA解旋、募集DNA聚合酶偶联进行。E. coli的复制基因是oriC。而在真核细胞中,这两个阶段相分离可以确保每个染色体在每个细胞周期中仅复制一次。 六、真核生物线粒体DNA按D环方式复制 D-环复制(D-loop replication)是线粒体DNA的复制方式。复制时需合成引物。mtDNA为闭合环状双链结构,第一个引物以内环为模板延伸。至第二个复制起点时,又合成另一个反向引物,以外环为模板进行反向的延伸。最后完成两个双链环状DNA的复制(图12-17)。复制中呈字母D形状而得名。D环复制的特点是复制起点不在双链DNA图12-17进行中的D环复制同一位点,内、外环复制有时序差别。左:第一个引物在第一起点上合成;右:延长至第二真核生物的DNA pol-y是线粒体催化DNA复起点,合成第二引物制的DNA聚合酶。20世纪50年代以前,只知道DNA存在千细胞核染色体中。后来在细菌染色体外也发现能进行自我复制的DNA,例如质粒,以后就利用质粒作为基因工程的常用载体。真核生物细胞器—一线粒体,也发现存在mtDNA。人类的mtDNA已知有37个基因。线粒体的功能是进行生物氧化和氧化磷酸化。其中13个mtDNA基因就是为ATP合成有关的蛋白质和酶编码的。其余24个基因转录为tRNA(22个)和rRNA(2个),参与线粒体蛋白质的合成。 mtDNA容易发生突变,损伤后的修复较困难。mtDNA的突变与衰老等自然现象有关,也和一些疾病的发生有关。所以mtDNA的突变与修复,成为医学研究上引起广泛兴趣的科学问题。线粒体内蛋白质翻译时,使用的遗传密码和通用的密码有一些差别。 第五节逆转录 双链DNA是大多数生物的遗传物质。然而,某些病毒的遗传物质是RNA。原核生物的质粒,真核生物的线粒体DNA,都是染色体外存在的DNA。这些非染色体基因组,采用特殊的方式进行复制。 第十二章DNA的合成247 一、逆转录病毒的基因组RNA以逆转录机制复制 RNA病毒的基因组是RNA而不是DNA,其复制方式是逆转录(reverse transcription),因此也称为逆转录病毒(retrovirus)尽。但是并非所有的RNA病毒都是逆转录病毒。逆转录的信息流动方向(RNA一DNA)与转录过程(DNA--+-RNA)相反,是一种特殊的复制方式。1970年,H. Temin和D. B斗timore分别从RNA病毒中发现能催化以RNA为模板合成双链DNA的酶,称为逆转录酶(reverse transcriptase),全称是依赖RNA的DNA聚合酶(RNA-dependent DNA polymerase)已从单链RNA到双链DNA的生成可分为三步(图12-18):首先是逆转录酶以病毒基因组RNA为模板,催化dNTP聚合生成DNA互补链,产物是RNA/DNA杂化双链。然后,杂化双链中的RNA被逆转录酶中有RNase活性的组分水解,被感染细胞内的RNase H(H=Hybrid)也可水解RNA链。RNA分解后剩下的单链DNA再用作模板,由逆转录酶催化合成第二条DNA互补链。逆转录酶有三种活性:RNA指导的DNA聚合酶活性,DNA指导的DNA聚合酶活性和RNase H活性,作用需Zn2+为辅因子。合成反应也按照5'一3'延长的规律。有研究发现,病毒自身的tRNA可用作复制引物。 5'---一一RNA模板5'----------AAAAAA3,合成cDNA第一链 i . 逆转录酶i逆转录酶RNA/DNA-----_____AAAAAA33'杂化双链3'TITITI'5'(a)逆转录病毒细胞内复制。病毒的tRNA可作为cDNA第二链合成的引物;(b)试管内合成cD NA。单链cDNA的3'端能够形成发夹状的结构作为引物,在大肠杆菌聚合酶I Klenow作用下,合成cDNA的第二链按上述方式,RNA病毒在细胞内复制成双链DNA的前病毒(provirus)。前病毒保留了RNA病毒全部遗传信息,并可在细胞内独立繁殖。在某些情况下,前病毒基因组通过基因重组(gene recombination),插入到细胞基因组内,并随宿主基因一起复制和表达。这种重组方式称为整合(integration)。前病毒独立繁殖或整合,可成为致病的原因。 二、逆转录的发现发展了中心法则 逆转录酶或逆转录现象的发现是分子生物学研究中的重大事件。中心法则认为,DNA的功能兼有遗传信息的传代和表达,因此DNA处于生命活动的中心位置。逆转录现象说明,至少在某些生物,RNA同样兼有遗传信息传代功能。这是对传统的中心法则的挑战。、飞i}对逆转录病毒的研究,拓宽了20世纪初已注意到的病毒致癌理论,至20世纪70年代初,从逆转录病毒中发现了癌基因。至今,癌基因研究仍是病毒学、肿瘤学和分子生物学领域的重大课题。艾滋病病原人类免疫缺陷病毒(human immunodeficiency virus, HIV)也是RNA病毒,有逆转录活性。 分子生物学研究还应用逆转录酶作为获取基因工程目的基因的重要方法之一,此法称为cDNA法。在人类这样庞大的基因组DNA(3.2xl09bp)中,要选取其中一个目的基因,有相当大难度。对RNA进行提取、纯化,相对较为可行。取得RNA后,可以通过逆转录方式在试管内操作。用逆转录酶催化dNTP在RNA模板指引下的聚合,生成RNA/DNA杂化双链。用酶或碱把杂化双链上的RNA除去,剩下的DNA单链再作为第二链合成的模板。在试管内以DNA pol I的大片段,即Klenow片段催化dNTP聚合。第二次合成的双链DNA,称为cDNA。c是互补(compleme ntary)的意思。cDNA就是编码蛋白质的基因,通过转录又得到原来的模板RNA,现在已利用该方法建立了多种不同种属和细胞来源的含所有表达基因的cDNA文库,方便人们从中获取目的基因。 ”“'.,'.小结 DNA复制是指DNA基因组的扩增过程。在此过程中,以亲代DNA作为模板,按照碱基配对原则合成子代DNA分子。复制需多种酶和蛋白质辅因子的参与。细胞内的DNA复制有半保留性、半不连续性和双向性等特征。 原核生物的复制过程包括起始、延长和终止。起始是将DNA双链解开形成复制又。复制的延长由引物或延长中的子链提供3'-0H,供dNTP掺入生成磷酸二酣键,延长中的子链有前导链和后随链之分,复制产生的不连续片段称为冈崎片段。复制的终止需要去除RNA引物、填补留下的空隙并连接片段之间的缺口使之成为连续的子链DNA。 真核生物复制发生于细胞周期的S期,其过程与原核生物相似,但更为复杂和精致。复制的延长与核小体组蛋白的分离和重新组装有关。复制的终止需要端粒酶延伸端粒DNA。 非朵色体基因组采用特殊的方式进行复制。逆转录是RNA病毒的复制方式。逆转录现象的发现,加深了人们对中心法则的认识,拓宽了RNA病毒致癌、致病的研究。在基因工程操作上,还可用逆转录酶制备cDNA。D环复制是真核生物线粒体DNA的复制方式。 思考题 (高国全) 第十三章DNA损伤和损伤修复 生物遗传物质DNA的遗传保守性是维持生物物种相对稳定的最主要因素。然而,在长期的生物演进过程中,生物体时刻受到来自内、外环境中各种因素的影响,DNA的改变不可避免。各种体内外因素所导致的DNA组成与结构变化称为DNA损伤(DNA damage)。DNA损伤可产生两种后果:一是损伤导致DNA的结构发生永久性改变,即突变;二是损伤导致DNA失去作为复制和(或)转录的模板的功能。 在长期的生物进化中,无论低等生物还是高等生物均形成了自己的DNA损伤修复系统,可随时修复损伤的DNA,恢复DNA的正常结构,保持细胞的正常功能。实际上,DNA损伤的同时即伴有DNA损伤修复系统的启动。受损细胞的转归,在很大程度上,取决于DNA损伤的修复效果,如损伤被正确修复,细胞的DNA的结构恢复正常,细胞就能够维持正常状态;如损伤严重,DNA不能被有效修复,则可能通过凋亡的方式,清除这些DNA受损的细胞,降低DNA损伤对生物体遗传信息稳定性的影响。另外,当DNA的损伤发生不完全修复时,DNA发生突变,染色体发生畸变,可诱导细胞出现功能改变,甚至出现衰老、细胞恶性转化等生理病理变化。当然,如果遗传物质具有绝对的稳定性,那么生物将失去其进化的基础,就不会呈现大千世界、万物生辉的自然景象。因此,自然界生物的多样性依赖于DNA损伤与DNA损伤修复之间的良好平衡。 第一节DNA损伤 DNA损伤的诱发因素众多,一般可分为体内因素与体外因素。体内因素主要包括机体代谢过程中产生的某些活性代谢物,DNA复制过程中发生的碱基错配,以及DNA本身的热不稳定性等,均可诱发DNA“自发“损伤。体外因素则主要包括辐射、化学毒物、药物、病毒感染、植物以及微生物的代谢产物等。值得注意的是,体内因素与体外因素的作用,往往是不能截然分开的。通常,体外因素是通过体内因素引发DNA损伤的。然而,不同因素所引发的DNA损伤的机制往往又是不相同的。 —、多种因素通过不同机制导致DNA损伤 (—)体内因素 1. DNA复制错误在DNA复制过程中,碱基的异构互变,4种dNTP之间的浓度的不平衡等均可能引起碱基的错配,即产生非Watson-Crick碱基对。尽管绝大多数错配的碱基会被DNA聚合酶的即时校读功能所纠正,但依然不可避免地有极少数的碱基错配被保留下来。DNA复制的错配率约此外,复制错误还表现为片段的缺失或插入。特别是DNA上的短片段重复序列,在真核细胞基因组上广泛分布,导致DNA复制系统工作时可能出现“打滑“现象,使得新生DNA上的重复序列的拷贝数发生变化。DNA重复片段在长度方面表现出的高度的多态性,在遗传性疾病的研究上有重大价值。亨廷顿病(huntington disease)、脆性X综合征(fragile X syndrome)、肌强直性营养不良(myotonic dystrophy)等神经退行性疾病均属千此类。 2. DNA自身的不稳定性在DNA自发性损伤中,DNA结构自身的不稳定性是最频繁发挥作用的因素。当DNA受热或所处环境的pH发生改变时,DNA分子上连接碱基和核糖之间的糖昔键可自发发生水解,导致碱基的丢失或脱落,其中以脱嗦呤最为普遍。另外,含有氨基的碱基可能自发发生脱氨基反应,转变为另一种碱基,如C转变为U,A转变为I(次黄嗦呤)等。 3.机体代谢过程中产生的活性氧机体代谢过程中产生的活性氧(reacti ve oxygen species, ROS)可以直接作用修饰碱基,如修饰鸟嗦呤,产生8-轻基脱氧鸟嗦呤等。(二)体外因素最常见的导致DNA损伤的体外因素,主要包括物理因素、化学因素和生物因素等。这些因素导致DNA损伤的机制各有其特点。 1.物理因素物理因素中最常见的是电磁辐射。根据作用原理的不同,通常将电磁辐射分为电离辐射和非电离辐射。a粒子、B粒子、X射线、丫射线等,能直接或间接引起被穿透组织发生电离,损伤DNA,属电离辐射;而紫外线和波长长于紫外线的电磁辐射属非电离辐射。 低波长紫外线的吸收,可使DNA分子中同一条链相邻的两个胸腺啥唗碱基(T),以共价键连接形成胸腺瞪唗二聚体结构(TI),也称为环丁烧型啼唗二聚体,见图13-1。另外,紫外线也可导致其他啥唗间形成类似的二聚体,如CT和CC二聚体等。二聚体的形成可使DNA产生弯曲和扭结,影响DNA的双螺旋结构,使复制与转录受阻。再者,紫外线还会导致DNA链间的其他交联或链的断裂等损伤。 脱氧尺一风鳍—N C=0 脱氧/c—N\(核糖\栏V—d/\/核糖—N\/c=0H/\CH3日\/'c||—N\-H UV器—N\C二/c=0\脱氧 /』 0 三 H (b)磷酸酷/H,,\C一c/—CH32.化学因素能引起DNA损伤的化学因素种类繁多,主要包括自由基、碱基类似物、碱基修饰物和嵌入染料等。值得注意的是,许多肿瘤化疗药物是通过诱导DNA损伤,包括碱基改变、单链或双链DNA断裂等,阻断DNA复制或RNA转录的,进而抑制肿瘤细胞的增殖。因此,对DNA损伤,以及后继的肿瘤细胞死亡机制的认识,将十分有助千对肿瘤化疗药物的改进。 (1)自由基导致DNA损伤:自由基是指能够独立存在,外层轨道带有未配对电子的原子、原子团或分子。自由基的化学性质异常活跃,可引发多种化学反应,影响细胞功能。自由基的产生可以是体外因素与体内因素相互作用的结果,如电离辐射产生胫自由基(·OH)和氢自由基(H.),而生物体内的代谢过程可产生活性氧自由基。.OH具有极强的氧化性质,而H·则具有极强的还原性质。这些自由基可与DNA分子发生反应,导致碱基、核糖和磷酸基损伤,引发DNA的结构与功能异常。 物理因素和化学因素造成的DNA损伤的情况如图13-2所示。 插入/只H/ 一尸-」_、广HO H 啥唗二聚体碱基交换碱基的碱基的 如 c 的形成c-u自发丢失化学修饰A-I3.苯并芘的诱变衍生物3生物因素生物因素主要指病毒和霉菌,如麻疹病毒、风疹病毒、疤疹病毒、黄曲霉、寄生曲霸等,其蛋白质表达产物或产生的毒素和代谢产物,如黄曲霉素等有诱变作用。 黄曲霉素主要由黄曲霉产生。在湿热地区的食品和饲料中出现黄曲霉毒素的概率最高。它们存252.,第三篇遗传信息的传递在于土壤、动植物、各种坚果中,特别是容易污染花生、玉米、稻米、大豆、小麦等粮油产品,是霉菌毒素中毒性最大、对人类健康危害极为突出的一类霉菌毒素。 二、DNA损伤有多种类型 DNA分子中的碱基、核糖与磷酸二酣键均是DNA损伤因素作用的靶点。根据DNA分子结构改变的不同,DNA损伤有碱基脱落、碱基结构破坏、瞪唗二聚体形成、DNA单链或双链断裂、DNA交联等多种类型。 1.缄基损伤与糖基破坏化学毒物可通过对碱基的某些基团进行修饰而改变碱基的理化性质,破坏碱基的结构。比如:O亚硝酸等可导致碱基脱氨;@在胫自由基的攻击下,晓唗碱基易发生加成、脱氢等反应,导致碱基环破裂;@具有氧化活性的物质可造成DNA中嗦呤或瞪唗碱基的氧化修饰,形成8轻基脱氧鸟昔或6~甲基尿啼唗等氧化代谢产物。DNA分子中的戊糖基的碳原子和轻基上的氢可能与自由基反应,由此戊糖基的正常结构被破坏。 由千碱基损伤或糖基破坏,在DNA链上可能形成一些不稳定点,最终导致DNA链的断裂。 2碱基之间发生错配如前所述,碱基类似物的掺入、碱基修饰剂的作用可改变碱基的性质,导致DNA序列中的错误配对。在正常的DNA复制过程中,存在着一定比例的自发的碱基错配发生,最常见的是组成RNA的尿密唗替代胸腺瞪唗掺入到DNA分子中。 3. DNA链发生断裂DNA链断裂是电离辐射致DNA损伤的主要形式。某些化学毒剂也可导致DNA链断裂。戊糖环的破坏、碱基的损伤和脱落都是引起DNA断裂的原因。碱基损伤或糖基的破坏可引起DNA双螺旋局部变性,形成酶敏感性位点,特异的核酸内切酶能识别并切割这样的位点,造成DNA链断裂。DNA链上受损碱基也可以被另一种特异的DNA-糖昔酶除去,形成无嗦呤啥唗位点(ap urinic-apyrimi di ni c site, AP site),或称无碱基位点,这些位点在内切酶等的作用下可造成DNA链的断裂。DNA断裂可以发生在单链或双链上,单链断裂能迅速在细胞中以另一条互补链为模板重新合成,完成修复;而双链断裂在原位修复的概率很小,需依赖重组修复,这种修复导致染色体畸变的可能性很大。因此,一般认为双链断裂的DNA损伤与细胞的致死性效应有直接联系。 4. DNA链的共价交联被损伤的DNA分子中有多种DNA交联形式。DNA分子中同一条链中的两个碱基以共价键结合,称为DNA链内交联(DNA intrastrand cross-linking)。低波长紫外线照射后形成的瞪唗二聚体就是DNA链内交联的最典型的例子。DNA分子一条链上的碱基与另一条链上的碱基以共价键结合,称为链间交联(DNA interstrand cross-linking)。DNA分子还可与蛋白质以共价键结合,称为DNA-蛋白质交联(DNA protein cross-linking)。 以上对各种类型的DNA损伤进行了阐述。实际上DNA损伤是相当复杂的。当DNA受到严重损伤时,在其局部范围所发生的损伤常常不止一种,而是多种类型的损伤复合存在。最常见的是碱基损伤、糖基破坏和链断裂可能同时存在。这样的损伤部位被称为局部多样性损伤部位。 上述DNA损伤可导致DNA模板发生碱基置换、插入、缺失、链的断裂等变化,并可能影响到染色体的高级结构。就碱基置换来讲,DNA链中的一种嗦呤被另一种嗦呤取代,或一种瞪唗被另一种l密唗取代,称为转换;而嗦呤被啼唗取代或反之,则称为颠换。转换和颠换在DNA复制时可引起碱基错配,导致基因突变。碱基的插入和缺失可引起移码突变。DNA断裂可阻止RNA合成过程中链的延伸。而DNA损伤所引起的染色质结构变化也可以造成转录的异常。所有这些变化均可造成某种或某些基因信息发生异常或丢失,进而导致其表达产物的量与质的变化,对细胞的功能造成不同程度的影响。 需要指出的是,由于密码子的简并性(第十五章),上述的碱基置换并非一定发生氨基酸编码的改变。碱基置换可以造成改变氨基酸编码的错义突变(missense mutation)、变为终止密码子的无义突变(nonsense mutation)和不改变氨基酸编码的同义突变(same sense mutation)。教科书和文献中对千错义突变用氨基酸的单字母符号和位置共同注明,如B-Raf的第600位的颌氨酸突变为谷氨酸则写为V600E,具体标示为B-RafV600E0在生命的各种活动中,生物体发生DNA损伤不可避免。这种损伤所导致的结局取决于DNA损伤的程度,以及细胞对损伤DNA的修复能力。DNA损伤修复是指纠正DNA两条单链间错配的碱基、清除DNA链上受损的碱基或糖基、恢复DNA的正常结构的过程。DNA修复(DNA repair)是机体维持DNA结构的完整性与稳定性,保证生命延续和物种稳定的重要环节。 细胞内存在多种修复DNA损伤的途径或系统。常见的DNA损伤修复途径或系统包括,直接修复、切除修复、重组修复和损伤跨越修复等(表13-1)。值得注意的是,一种DNA损伤可通过多种途径修复,而一种修复途径也可同时参与多种DNA损伤的修复过程。 一、有些DNA损伤可以直接修复 直接修复是最简单的一种DNA损伤的修复方式。修复酶直接作用千受损的DNA,将之恢复为原来的结构。 1晇哫二聚体的直接修复瞪唗二聚体的直接修复又称为光复活修复或光复活作用。生物体内存在着一种DNA光裂合酶(DNA photolyase),能够直接识别和结合于DNA链上的瞪唗二聚体部位。在可见光(400nm)激发下,光复活酶可将瞪唗二聚体解聚为原来的单体核昔酸形式,完成修复(图13-3)。DNA光裂合酶最初在低等生物中发现,有两个与吸收光子有关的生色基团,次甲基四氢气:了三产五\三二霄霄合气叶酸和FADH2。次甲基四氢叶酸吸收光子后将FAD比激活,再由激活的FADH2将电子转移给瞪唗二聚体,使其还原。鸟类等高等生物虽然也存在DNA光裂合酶,但是光复活修复并不是高等生物修复啼唗二聚体的主要方式。哺乳动物细胞缺乏DNA光裂合酶。 2.浣基化喊基的直接修复催化此类直接修复的酶是一类特异的烧基转移酶,可以将烧基从核背酸直接转移到自身肤链上,修复DNA的同时自身发生不可逆转的失活。比如,人类06-甲基鸟嗦呤DNA甲基转移酶,能够将06位的甲基转移到酶自身的半胱氨酸残基上,使甲基化的鸟噤呤恢复正常结构(图13-4)。 带有活性SHi基团的甲基转移酶结合在甲基化的碱基部位固IA.l日拔国1,l飞I DNA复制@同,'且,)它DNA复制l甲基化后失活ll同包,四修复的结果的甲基转移酶突变的结果圈13-4院基化城基的直接修复3.单链断裂的直接修复DNA连接酶能够催化DNA双螺旋结构中一条链上缺口处的5'-磷酸基团与相邻片段的3'-轻基之间形成磷酸二醋键,从而直接参与DNA单链断裂的修复,如电离辐射所造成DNA单链上的切口。 二、切除修复是最普遍的DNA损伤修复方式 切除修复是生物界最普遍的一种DNA损伤修复方式。通过此修复方式,可将不正常的碱基或核昔酸除去并替换掉。依据识别损伤机制的不同,又分为碱基切除修复和核昔酸切除修复两种类型。 1碱基切除修复碱基切除修复(base excision repa订,BER)依赖于生物体内存在的一类特异的DNA糖昔酶。整个修复过程包括:心识别水解:DNA糖昔酶特异性识别DNA链中已受损的碱基并将其水解去除,产生一个无碱基位点;@切除:在此位点的5'-端,无碱基位点核酸内切酶将DNA链的磷酸二酷键切开,同时去除剩余的磷酸核糖部分;@合成:DNA聚合酶在缺口处以另一条链为模板修补合成互补序列;@连接:由DNA连接酶将切口重新连接,使DNA恢复正常结构(图13-5)。尽抑癌蛋白p53在哺乳动物细胞中参与调控碱基切除修复。直接证据是DNA烧化剂诱导的DNA损伤,在表达野生型p53的细胞可被有效修复,而在p53缺失的细胞,其修复速度明显减慢。 2.核昔酸切除修复与碱基切除修复不同,核昔酸切除修复(nucleotide excision repair, NER)系统并不识别具体的损伤,而是识别损伤对DNA双螺旋结构所造成的扭曲,但修复过程与碱基切除修复相似。首先,由一个酶系统识别DNA损伤部位;其次,在损伤部位两侧切开DNA链,去除两个切口之间的一段受损的寡核昔酸;再次,在DNA聚合酶作用下,以另一条链为模板,合成一段新的DNA,填补缺损区;最后由连接酶连接,完成损伤修复。区切除修复是DNA损伤修复的一种普遍形式,它并不局限于某种特殊原因造成的损伤,而能一般«r炉』性地识别和纠正DNA链及DNA双螺旋结构的变化,修复系统能够使用相同的机制和一套修复蛋白DNA糖昔酶特异性识别并水t单核昔酸缺口解受损碱基,产生AP位点切除剩余磷酸核糖,产生缺口j声言.怕恤伽屾咖吓皿皿) 核昔酸并连接 彝仆仙们加国国仙叭仙仙) 质去修复一系列性质各异的损伤。 遗传性着色性干皮病(xeroderma pigmentosum, XP)的发病是由于DNA损伤核昔酸切除修复系统基因缺陷所致。有关入类XP相关的核昔酸切除修复系统缺陷基因的一般情况见表13-2。此外,Cockyne综合征和人毛发低硫营养不良等疾病的遗传病因也是DNA损伤核甘酸切除修复系统基因缺陷。 基因名称基因的染色编码蛋白质的编码蛋白质编码蛋白质的主要功能体定位氨基酸数细胞定位XPA9q22.3273细胞核可能结合受损的DNA,为切除修复复合体其他因子到达DNA受损部位指示方向XPB2q21782细胞核在DNA切除修复中,发挥解螺旋酶的功能XPC3p25940细胞核可能是受损DNA的识别蛋白质XPD19ql3.3760细胞核转录因子TFII H的一个亚单位,与XPB一起,在受损DNA修复中,发挥解螺旋酶的功能XPE llql2-131140细胞核主要结合受损DNA的啼唗二聚体处llpll-12427XPF16pl3.12905细胞核结构专一性DNA修复核酸内切酶,在DNA损伤切除修复中,在受损DNA的5'-端切口XPG13q331186细胞核镁依赖的单链核酸内切酶,在DNA损伤切除修复中,在受损DNA的3'-端切口人类的DNA损伤核背酸切除修复需要大约30多种蛋白质的参与。其修复过程如下:CD由损伤部位识别蛋白XPC和XPA等,再加上DNA复制所需的SSB,结合在损伤DNA的部位;(2)XPB和XPD发挥解旋酶的活性,与上述蛋白质共同作用在受损DNA周围形成一个凸起;@XPG与XPF发生构象改变,分别在凸起的3'-端和5'-端发挥核酸内切酶活性,在增殖细胞核抗原(proliferating cell nuclear antigen, PCNA)的帮助下,切除并释放受损的寡核昔酸;@遗留的缺损区由DNA聚合酶8或e进行修补合成;@由连接酶完成连接。 256第三篇遗传信息的传递 核昔酸切除修复不仅能够修复整个基因组中的损伤,而且能够修复那些正在转录的基因模板链上的损伤,后者又称为转录偶联修复(transcription-coupled repair),因此,更具积极意义。在此修复中,所不同的是由RNA聚合酶承担起识别损伤部位的任务。 3.碱基错配修复错配是指非Watson-Crick碱基配对。碱基错配修复也可被看作是碱基切除修复的一种特殊形式,是维持细胞中DNA结构完整稳定的重要方式,主要负责纠正以下错误:心复制与重组中出现的碱基配对错误;@因碱基损伤所致的碱基配对错误;@碱基插入;@碱基缺失。从低等生物到高等生物,均拥有保守的碱基错配修复系统或途径。 大肠杆菌参与DNA复制中错配修复的蛋白质包括Mut(mutase)H、Mu tL,MutS、DNA解旋酶、单链DNA结合蛋白、核酸外切酶I、DNA聚合酶皿,以及DNA连接酶等l0余种蛋白质或相关酶成分,修复过程十分复杂已。修复过程中面临的主要问题是如何区分母链和子链。在细菌DNA中甲基化修饰是一个重要标志,母链是高度甲基化的,主要是其腺噤呤A发生甲基化修饰,而新合成子链中的腺嗦呤A的甲基化修饰尚未进行,这提示错配修复应在此链上进行。首先由M utS蛋白识别错配碱基,随后由MutL和MutH等蛋白质协同相应的核酸外切酶,将包含错配点在内的一小段DNA水解、切除,经修补、连接后,恢复DNA正确的碱基配对。 继细菌错配修复机制被揭示之后,真核细胞的错配修复机制的研究,近年来也取得很大进展。现已发现多种与大肠杆菌的M utS和Mu tL高度同源的参与错配修复的蛋白质,如与大肠杆菌M u tS高度同源的人类的MSH2(M utS Homolog2)、MSH6和MSH3等。MSH2和MSH6的复合物可识别包括碱基错配、插入、缺失等DNA损伤,而由MSH2和MSH3形成的蛋白质复合物则主要识别碱基的插入与缺失。真核细胞并不像原核细胞那样以甲基化来区分母链和子链,可能是依赖修复酶与复制复合体之间的联合作用识别新合成的子链。有关入类错配修复系统成员的一般情况见表l3-3。 蛋白质基因染色体cDNA全长氨基主要功能细胞组织分布名称定位全长(bp)定位酸数MLHJ3p21.32484756错配修复细胞核大肠、乳腺、肺、脾、睾丸、前列腺、甲状腺、胆袋、心肌MLH314q24.348951453错配修复细胞核广泛,尤多见于消化道上皮PMSJ2q31-333121932错配修复细胞核与MLHl组织分布一致PMS27p222859862错配修复细胞核与MLHl组织分布一致MSH22p22-213181934错配修复细胞核广泛,在肠道表达多限于隐窝MSHJ Sql1-1231871137错配修复细胞核在非小细胞肺癌和造血系统恶性肿瘤中表达减少MSH4l p313085936染色体重组细胞核睾丸、卵巢MSH56p21.32883834染色体重组细胞核广泛,尤其在睾丸、胸腺和免疫系统中高表达MSH62p1642631360错配修复细胞核_、DNA严重损伤时需要重组修复双链DNA分子中的一条链断裂,可被模板依赖的DNA修复系统修复,不会给细胞带来严重后果。然而,DNA分子的双链断裂是一种极为严重的损伤。与其他修复方式不同的是,双链断裂修复由千没有互补链可言,因此难以直接提供修复断裂所必需的互补序列信息。为此,需要另外一种更为复杂的机制,即重组修复来完成DNA双链断裂的修复。重组修复是指依靠重组酶系,将另一段未受损伤的DNA移到损伤部位,提供正确的模板,进行修复的过程。依据机制的不同,重组修复可分为同第十三卓DNA损伤和损伤修复257源重组修复和非同源末端连接重组修复。 1.同源重组修复所谓的同源重组修复(homologous recombination repa江),指的是参加重组的两段双链DNA在相当长的范围内序列相同(;;;,:,200bp),这样就能保证重组后生成的新区序列正确。大肠杆菌同源重组的分子机制已比较清楚,起关键作用的是RecA蛋白,也被称作重组酶,它是一个由352个氨基酸组成的蛋白质。多个RecA单体在DNA上聚集,形成右手螺旋的核蛋白细丝,细丝中具有深的螺旋凹槽,可以识别和容纳DNA链。在ATP存在的情况下,RecA可与损伤的DNA单链区结合,使DNA伸展,同时RecA可识别一段与受损DNA序列相同的姐妹链,并使之与受损DNA链并列排列,交叉互补,并分别以结构正常的两条DNA链为模板重建损伤链。最后在其他酶的作用下,解开交叉互补连接新合成的链,完成同源重组。同源重组生成的新片段具有很高的忠实性。有关酵母同源重组的分子机制也已被研究揭示,与大肠杆菌的相似,详见图13-6。在酵母的重组修复过程中先后有Mre、Nbs、Rad50、Rad52、Rad51B、Rad51C、Racl51D、XRCC2、XRCC3和RPA等相关蛋白质或酶参与。 DNA双链断裂损伤部位 i DNA末端加工,' DNA末端加工35,' XRCC2/XRCC3链交换 DNA合成III' F35''l-I-I-I-l-I立重鱼l1-1 (1)由黑色与灰色线条组成的DNA双链为断裂损伤的DNA双链。(2)由深蓝色与浅蓝色线条组成的DNA双链为完好DNA双链,与断裂损伤的DNA双链序列同源。(3)上图D,两个方向的重组合成的DNA中,只有右侧的酶或相关蛋白质被标示出来。(4)上图E,虚线条框所示的四条DNA单链的交叉互补中,灰色的DNA单链与浅蓝色的DNA单链互补,后者是前者合成的模版;黑色的DNA单链与深蓝色的DNA单链互补,同样后者是前者合成的模版2非同源末端连接的重组修复非同源末端连接重组修复(non-homologous end joining recombination repair)是哺乳动物细胞DNA双链断裂的一种修复方式,顾名思义,即两段DNA链的末端不需要同源性就能相互替代连接巴。因此,非同源末端连接重组修复的DNA链的同源性不高,修复的D NA序列中可存在一定的差异。对千拥有巨大基因组的哺乳动物细胞来说,发生错误的位置可能并不在必需基因上,这样依然可以维持受损细胞的存活。非同源末端连接重组修复中起关键作用的蛋白质分子是DNA依赖的蛋白激酶(DNA-dependen t protein kinase, DNA-PK),是一种核内的丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶,由一个分子量大约为465kD的催化亚基(DNA-PKcs)和一个能结合DNA游离端的杂二聚体蛋白Ku组成。DNA-PKcs的作用是介导DNA-PK的催化功能,而Ku蛋白可与双链DNA的断端连接,促进双链断裂的重接。\il吓另一个参与非同源末端连接重组修复的重要蛋白质是XRCC4(X-ray repa订,compleme nting defective, in Chinese hams ter),它能与DNA连接酶形成复合物,增强连接酶的活力,在DNA连接酶与组装在DNA末端的DN~-PK复合物相结合的过程中起中间体作用。非同源末端连接重组修复既是修复DNA损伤的一种方式,又可以被看作是一种生理性基因重组的策略,将原来并未连在一起的基因或片段连接产生新的组合,如B淋巴细胞、T淋巴细胞的受体基因、免疫球蛋白基因的构建与重排等。 四、跨越损伤DNA合成是一种差错倾向性DNA损伤修复当DNA双链发生大范围的损伤,DNA损伤部位失去了模板作用,或复制叉已解开母链,致使修复系统无法通过上述方式进行有效修复,此时,细胞可以诱导一个或多个应急途径,通过跨过损伤部位先进行复制,再设法修复。而根据损伤部位跨越机制的不同,这种跨越损伤DNA的修复又被分为重组跨越损伤修复与合成跨越损伤修复两种类型。 1.重组跨越损伤修复当DNA链的损伤较大,致使损伤链不能作为模板复制时,细胞利用同源重组的方式,将DNA模板进行重组交换,使复制能够继续下去岱。然而,在大肠杆菌中,还有某些新的机制,当复制进行到损伤部位时,DNA聚合酶皿停止移动,并从模板上脱离下来,然后在损伤部位的下游重新启动复制,从而在子链DNA上产生一个缺口。RecA重组蛋白将另一股健康母链上对应的序列重组到子链DNA的缺口处填补。通过重组跨越,解决了有损伤的DNA分子的复制问题,但其损伤并没有真正地被修复,只是转移到了另一个新合成的一个子代的DNA分子上,由细胞内其他修复系统来后继修复。 2合成跨越损伤修复当DNA双链发生大片段、高频率的损伤时,大肠杆菌可以紧急启动应急修复系统,诱导产生新的DNA聚合酶(DNA聚合酶W或V),替换停留在损伤位点的原来的DNA聚I:,----------------_,,_-----------------------------1!LexA基因RecA基因可诱导基因:I一一一一一一一一一一一一一一一一一:}------------------------------1,今今`激令令'自水解个个个失阻遏VWWN,/1VWWM/1VWVWIM mRNALexA基因RecA基因可诱导基因图13-7sos修复中LexA-RecA操纵子的作用机制DNA损伤,RecA活化,激活LexA水解酶活性,LexA自切断,失阻遏功能操纵子被诱导合酶皿,在子链上以随机方式插入正确或错误的核昔酸使复制继续,越过损伤部位之后,这些新的DNA聚合酶完成使命后从DNA链上脱离,再由原来的DNA聚合酶皿继续复制。因为诱导产生的这些新的DNA聚合酶的活性低,识别碱基的精确度差,一般无校对功能,所以这种合成跨越损伤复制过程的出错率会大大增加,是大肠杆菌SOS反应或SOS修复的一部分。 在大肠杆菌等原核细胞中,SOS修复反应是由RecA蛋白与LexA阻遏物的相互作用引发的,有近30个SOS相关基因编码蛋白质参与此修复反应。正常情况下,RecA基因以及其他的SOS相关的可诱导基因的上游,有一段共同的操纵序列(5'-CTG-NlO-CAG-3')被LexA阻遏蛋白所阻遏,只有低水平的转录和翻译,产生少量的相应蛋白质。当DNA严重损伤时,RecA蛋白表达,激活LexA的自水解酶活性当LexA阻遏蛋白因水解从RecA基因,以及SOS相关的可诱导基因的操纵序列上解离下来后,一系列受LexA阻遏的基因得以表达,参与SOS修复活动。完成修复后,LexA阻遏蛋白重新合成,SOS相关的可诱导基因重新关闭(图13-7)。需要指出的是,SOS反应诱导的产物可参与重组修复、切除修复和错配修复等修复过程。这种修复机制因海空紧急呼救信号“SOS”而得名。 此外,对于受损的DNA分子,除了启动上述诸多的修复途径,以修复损伤之外,细胞还可以通过其他的途径将损伤的后果降至最低。例如,通过DNA损伤应激反应活化的细胞周期检查点机制,延迟或阻断细胞周期进程,为损伤修复提供充足的时间,诱导修复基因转录翻译,加强损伤的修复,使细胞能够安全进入新一轮的细胞周期。与此同时,细胞还可以激活凋亡机制,诱导严重受损的细胞凋亡,在整体上维持生物体基因组的稳定。 第三节DNA损伤及其修复的意义 遗传物质稳定性的世代相传是维待物种稳定的主要因素。然而,如果遗传物质是绝对一成不变的话,自然界也就失去了进化的基础,也就不会有新的物种出现。因此,生物多样性依赖于DNA损伤与损伤修复之间的良好的动态平衡。 一、DNA损伤具有双重效应 一般认为DNA损伤是有害的;然而,就损伤的结果而言,DNA损伤具有双重效应,DNA损伤是基因突变的基础。通常,DNA损伤通常有两种生物学后果。一是给DNA带来永久性的改变,即突变,可能改变基因的编码序列或基因的调控序列。二是DNA的这些改变使得DNA不能用作复制和转录的模板,使细胞的功能出现障碍,重则死亡。 从久远的生物史来看,进化是遗传物质不断突变的过程。可以说没有突变就没有如今的生物物种的多样性。当然在短暂的某一段历史时期,我们往往无法看到一个物种的自然演变,只能见到长期突变的累积结果,适者生存。因此突变是进化的分子基础。 DNA突变可能只改变基因型,而不影响其表型,并表现出个体差异。目前,基因的多态性已被广泛应用于亲子鉴定、个体识别,器官移植,以及疾病易感性分析等。DNA损伤若发生在与生命活动密切相关的基因上,可能导致细胞,甚至是个体的死亡。人类常利用此性质杀死某些病原微生物。 DNA突变还是某些遗传性疾病的发病基础。有遗传倾向的疾病,如高血压和糖尿病,尤其是肿瘤,均是多种基因与环境因素共同作用的结果。 二、DNA损伤修复障碍与多种疾病相关 细胞中DNA损伤的生物学后果,主要取决千DNA损伤的程度和细胞的修复能力。如果损伤得不到及时正确的修复,就可能导致细胞功能的异常。DNA碱基的损伤将可能导致遗传密码子的变化,经转录和翻译产生功能异常的RNA与蛋白质,引起细胞功能的衰退、凋亡,甚至发生恶性转化。双链DNA的断裂可通过同源或非同源重组修复途径加以修复,但非同源重组修复的忠实性差,修复过程中可能获得或丧失核昔酸,造成染色体畸形,导致严重后果。DNA交联影响染色体的高级结构,妨碍基因的正常表达,对细胞的功能同样产生影响。因此,DNA损伤与肿瘤、衰老以及免疫性疾病等多种疾病的发生有着非常密切的关联(表13-4)巴。 疾病易患肿瘤或疾病修复系统缺陷 着色性干皮病皮肤癌、黑色素瘤核昔酸切除修复遗传性非息肉性结肠癌结肠癌、卵巢癌错配修复转录偶联修复遗传性乳腺癌乳腺癌、卵巢癌同源重组修复Bloom综合征白血病、淋巴瘤非同源末端连接重组修复范科尼贫血再生障碍性贫血、白血病、生长迟缓重组跨越损伤修复Cockyne综合征视网膜萎缩、侁儒、耳聋、早衰、对UV敏感核昔酸切除修复、转录偶联修复毛发低硫营养不良毛发易断、生长迟缓核昔酸切除修复(-)DNA损伤修复系统缺陷与肿瘤先天性DNA损伤修复系统缺陷病人容易发生恶性肿瘤。肿瘤发生是DNA损伤对机体的远期效应之一。众多研究表明,DNA损伤一DNA损伤修复异常一基因突变一肿瘤发生是贯穿肿瘤发生发展的重要环节。DNA损伤可导致原癌基因的激活,也可使抑癌基因失活。癌基因与抑癌基因的表达失衡是细胞恶变的重要机制。参与DNA损伤修复的多种基因具有抑癌基因的功能,目前已发现这些基因在多种肿瘤中发生突变而失活。1993年,有研究发现,人类遗传性非息肉性结肠癌(hereditary nonpolyposis colorectal cancer, HNPCC)细胞存在错配修复与转录偶联修复缺陷,造成细胞基因组的不稳定性,进而引起调控细胞生长的基因发生突变,引发细胞恶变。在HNPCC中MLHJ和MSH2基因的突变时有发生。MLHI基因的突变形式主要有错义突变、无义突变、缺失和移码突变等。而MSH2基因的突变形式主要有移码突变、无义突变、错义突变以及缺失或插入等;其中以第622位密码子发生Cl T转换,导致脯氨酸突变为亮氨酸最为常见,结果使MSH2蛋白的功能丧失。 BRCA基因(breas t cancer gene)参与DNA损伤修复的启动与细胞周期的调控。BRCA基因的失活可增加细胞对辐射的敏感性,导致细胞对双链DNA断裂修复能力的下降。现已发现BRCAJ基因在70%的家族遗传性乳腺癌和卵巢癌病例中发生突变而失活。 值得注意的是,DNA修复功能缺陷虽可引起肿瘤的发生,但巳癌变的细胞本身DNA修复功能往往并不低下,相反会显著升高,使得癌细胞能够充分修复化疗药物引起的DNA的损伤,这也是大多数抗癌药物不能奏效的直接原因,所以关于DNA修复的研究可为肿瘤联合化疗提供新思路。 (二)DNA损伤修复缺陷与遗传性疾病 着色性干皮病(XP)病人的皮肤对阳光敏感,照射后出现红斑、水肿,继而出现色素沉着、干燥、角化过度,最终甚至会出现黑色素瘤、基底细胞癌、鳞状上皮癌及棘状上皮瘤等瘤变发生。具有不同临床表现的XP病人存在明显的遗传异质性,表现为不同程度的核酸内切酶缺乏引发的切除修复功能缺陷,所以病入的肺、胃肠道等器官在受到有害环境因素刺激时,会有较高的肿瘤发生率。然而,在对XP的进一步研究中发现,一些病入虽具有明显的临床症状,但在UV辐射后的核昔酸切除修复中却没有明显的缺陷表型,故将其定名为“XP变种“(XP variant, XPV)。这类病人的细胞在培养中表现出对UV辐射的轻微增高的敏感性,变种的切除修复功能正常,但复制后修复的功能有缺陷。最新的研究发现,某些XP变种的分子病理学机制是由它对D NA碱基损伤耐受的缺陷所致,而不是修复方面的缺陷。已共济失调毛细血管扩张症(ataxia telangiectasia, AT)是一种常染色体隐性遗传病,主要影响机体.八1,的神经系统、免疫系统与皮肤。AT病人的细胞对射线及拟辐射的化学因子,如博来霉素等敏感,具有极高的染色体自发畸变率,以及对辐射所致的DNA损伤的修复缺陷。病人的肿瘤发病率相当高。AT的发生与在DNA损伤信号转导网络中发挥关键作用的ATM分子的突变有关。此外,DNA损伤核昔酸切除修复的缺陷可以导致人毛发低硫营养不良(trichothiodystrophy, TTD)、Cockayne综合征(Cockayne syndrome,CS)和范科尼贫血(Fanconi anemia)等遗传病勹。 (三)DNA损伤修复缺陷与免疫性疾病 DNA修复功能先天性缺陷病人,其免疫系统常有缺陷,主要是T淋巴细胞功能缺陷。随着年龄的增长,细胞中的DNA修复功能逐渐衰退,如果同时发生免疫监视功能的障碍,便不能及时清除癌变的突变细胞,从而导致发生肿瘤。因此,DNA损伤修复、免疫和肿瘤等均是紧密关联的。 (四)DNA损伤修复与衰老 有关DNA损伤修复能力比较研究发现,寿命长的动物如象、牛等的DNA损伤的修复能力较强;寿命短的动物如小鼠、仓鼠等的DNA损伤的修复能力较弱。人的DNA修复能力也很强,但到一定年龄后会逐渐减弱,突变细胞数与染色体畸变率相应增加。如人类常染色体隐性遗传的早老症和韦尔纳综合征病人,其体细胞极易衰老,一般早年死于心血管疾病或恶性肿瘤。 ,.n一”“m一' 小结 DNA损伤是指各种体内外因素导致的DNA组成与结构上的变化,主要有碱基或戊糖基的破坏、碱基错配、DNA单链或双链断裂、DNA链共价交联等多种表现形式。 细胞内在因素,如DNA复制中的错配、DNA结构本身的不稳定性、机体代谢中产生的有害活性分子等,均可诱发DNA的“自发"损伤。外环境中的物理因素(电离辐射、紫外线)、化学因素(自由基、碱基类似物、碱基修饰剂、嵌入性朵籵)和生物因素等也均可损伤DNA。 DNA损伤具有双重生物学效应。各种因素诱发的DNA结构改变是生物进化的基础;同时DNA的损伤也可使细胞功能出现障碍,与多种疾病,如肿瘤等相关。 细胞拥有DNA损伤修复机制,可以修复DNA链上的损伤,恢复DNA的正常结构。这一机制对于维持DNA结构的完整性与稳定性,保证生命延续和物种稳定至关重要。细胞有直接修复、切除修复、重组修复和跨越损伤修复等多种DNA损伤修复途径。一种DNA损伤可通过多种途径修复,一种修复途径也可参与多种DNA损伤的修复。DNA损伤修复的缺陷与肿瘤、衰老以及免疫性疾病等密切相关。 思考题 1有很多突变,对于野生型基因是隐形的,也就是说,在一个含有野生型与突变型基因的二倍体细胞中,只有野生型的特性才能够得到表达。请根据基因突变的理论解释这一事实。 2. RecA蛋白是如何调节SOS的? 3.为什么DNA的甲基化状态可以被DNA损伤修复所利用?4突变能影响高等真核生物结构基因表达的几个水平?5.假如发生了碱基对的错配,如何被有效修复? (李恩民) 第十四章RNA的合成 生物体以DNA为模板合成RNA的过程称为转录(tran scrip tion),意指将DNA的碱基序列转抄为RNA。DNA分子上的遗传信息是决定蛋白质氨基酸序列的原始模板,mRNA是蛋白质合成的直接模板。通过RNA的合成,遗传信息从染色体的贮存状态转送至细胞质,从功能上衔接DNA和蛋白质这两种生物大分子。1958年,F. Crick将上述遗传信息的传递方式归纳为中心法则(central dogma)。1970年H. Temin发现了逆转录现象,对中心法则进行了补充。 在生物界,RNA合成有两种方式。一是DNA指导的RNA合成,也称转录,为生物体内的主要合成方式。转录产物除mRNA、rRNA和tRNA外,在真核细胞内还有snRNA、miRNA等非编码RNA。对RNA转录过程的调节可以导致蛋白质合成速率的改变,并由此而引发一系列细胞功能变化。因此,理解转录机制对于认识许多生物学现象和医学问题具有重要意义。mRNA在转录、转录后加工发生错误可引起细胞异常和疾病。RNA的转录合成是本章的主要内容。 另一种是RNA依赖的RNA合成(RNA-dependent RNA synthesis),也称RNA复制(RNA replication),由RNA依赖的RNA聚合酶(RNA-dependent RNA polymerase)催化,常见于病毒,是逆转录病毒以外的RNA病毒在宿主细胞以病毒的单链RNA为模板合成RNA的方式,限于篇幅本章未予叙述。 第一节原核生物转录的模板和酶 RNA的生物合成属于酶促反应,反应体系中需要DNA模板、NTP(包括ATP、UTP、CTP和GTP)、DNA依赖的RNA聚合酶(DNA-dependent RNA polymerase,简称RNA pol汃其他蛋白质因子及M忙等。合成方向为5'__,3',核昔酸间的连接方式为3',5'-磷酸二酣键。 一、原核生物转录的模板 在DNA分子双链上,一股链作为模板,按碱基配对规律指导转录生成RNA,另一股链则不转录。用核酸杂交法对模板DNA和转录产物RNA进行测定,或对DNA、RNA的碱基进行序列测定,都可证明DNA分子上的一个基因只有一股链一模板链出编码链。 二、RNA聚合酶催化RNA合成 (—)RNA聚合酶能从头启动RNA链的合成 RNA pol催化RNA的转录合成。该反应以DNA为模板,以ATP、GTP、UTP和CTP为原料,还需要Mg”作为辅基。RNA合成的化学机制与DNA的复制合成相似。RNA pol通过在RNA的3'-0H端加入核昔酸,延长RNA链而合成RNA。3'-0H在反应中是亲核基团,攻击所进入的核昔三磷酸的a磷酸,并释放出焦磷酸,总的反应可以表示为:(NMP)n+NTP--t(NMP)n+l+PPi。 RNA pol和双链DNA结合时活性最高,但是只以双链DNA中的一股DNA链为模板。新加入的核甘酸以Watson-Crick碱基配对原则和模板的碱基互补。注意在此与DNA链中A配对的是U而不是T。 前述的DNA聚合酶在启动DNA链延长时需要RNA引物存在,而RNA pol能够在转录起点处使两个核昔酸间形成磷酸二醋键,即直接启动转录(图14-2),因而RNA链的起始合成不需要引物。 令令 令念 RNA聚合酶 (二)RNA聚合酶由多个亚基组成 大肠杆菌(E. coli)的RNA pol是目前研究得比较透彻的分子。这是一个分子量达450kD,由5种亚基a2(2个a)、B、B'、Q和6组成的六聚体蛋白质。各主要亚基及功能见表14-1。 264第三篇遗传信息的传递 核心酶(core enzyme)由凸邸'Q亚基组成。试管内的转录实验(含有模板、酶和底物NTP等)证明,核心酶能够催化NTP按模板的指引合成RNA。但合成的RNA没有固定的起始位点。加有叭sigma)亚基的酶能在特定的起始点上开始转录,可见G亚基的功能是辨认转录'ITGACA起始点。6亚基加上核心酶称为全酶(holoenzyme)。活细胞的转录起始,是需要全酶-35的。转录延长阶段则仅需核心酶。图14-3显示RNA pol全酶在转录起始区的结合。 大肠杆菌内有一些不同的RNA pol全图14-3原核生物RNA聚合酶全酶及其在转录起始区酶,其差异是6亚基的不同。目前已发现多的结合DNA双链己打开,o因子尚未脱落种o亚基,并用其分子量命名区别,最常见的是句0(分子量70kD)。句0是辨认典型转录起始点的蛋白质,大肠杆菌中的绝大多数启动子可被含有句0因子的全酶所识别并激活。将细菌从通常培养的37°C升温至42屯,细菌可迅速增加一套共17种蛋白质的合成。这些蛋白质被称为热激蛋白(heat shock proteins, HSP)。当温度升至50宽,大部分蛋白质合成已停止,HSP却能继续合成。HSP的编码基因称为热激基因(Hsp)。Hsp基因的转录起点的上游序列与其他基因不同,因而需另一种6因子,即社2(分子量32kD)辨认及启动其转录。可见,社2是应答热刺激而被诱导产生的,它本身也属于一种HSP。其他原核生物的RNA pol在结构和功能上均与大肠杆菌相似。抗生素——利福平(rifampicin)可以特异抑制原核生物的RNA pol,成为抗结核菌治疗的药物。它特异性地结合RNA聚合酶的B亚基。若在转录开始后才加入利福平,仍能发挥其抑制转录的作用,这说明B亚基是在转录全过程都起作用的。 三、RNA聚合酶结合到启动子上启动转录 对于整个基因组来讲,转录是分区段进行的。每一转录区段可视为一个转录单位,称为操纵子(operon)(见第十六章)。操纵子中包括了若干个基因的编码区及其调控序列。调控序列中的启动子(promote1)是RNA p ol结合模板DNA的部位,也是决定转录起始点的关键部位。原核生物是以RNA pol全酶结合到启动子上而启动转录的,其中由G亚基辨认启动子,其他亚基相互配合。 启动子结构的阐明回答了转录从哪里起始这一问题,是转录机制研究的重要发现。为了确认RNA pol在基因组的结合位点,研究中采用了一种巧妙的方法,即RNA pol保护法国。在实验中,先将提取的DNA与提纯的RNA pol混合温育一定时间,再加入核酸外切酶进行反应。结果显示,大部分DNA链被核酸酶水解为核昔酸,但一个40-60bp的DNA片段被保留下来。这段DNA没有被水解,是因为RNA pol结合在上面,因而受到保护。受保护的DNA位于转录起始点的上游,并最终被确认为是被RNA pol辨认和紧密结合的区域,是转录起始调节区(图14-4)。 对数百个原核生物基因操纵子转录上游区段进行的碱基序列分析,证明RNA pol保护区存在共有序列。以开始转录的5'-端第一位核昔酸位置转录起点(transcription start site, TSS;或initiator)为+l,用负数表示其上游的碱基序号,发现-35和-10区A-T配对比较集中。-35区的最大一致性序列是TTGACA。-l0区的一致性序列TATAAT,是在1975年由D. Pribnow发现的,故被称为Pribnow盒(Prib now box)。-35区与-l0区相隔16~18个核昔酸,-10区与转录起点相距6或7个核昔酸。 A-T配对相对集中,表明该区段的DNA容易解链,因为A-T配对只有两个氢键维系。比较RNA pol结合不同区段测得的平衡常数,发现RNA pol结合在-10区比结合在-35区更为牢固。把RNA pol分子大小与DNA链长度进行比较,可确定其结合DNA链时分子的跨度。从这些结果推论出:-35区RNA聚合酶保护区结构基因终止点图14-4RNA聚合酶保护法研究转录起始区图中部为受酶保护的DNA区段放大,图最下方示-35区段和-10区段的共有序列是RNA pol对转录起始的识别序列(recognition sequence)。结合识别序列后,RNA pol向下游移动,达到Pribnow盒,与DNA形成相对稳定的RNA pol-DNA复合物,就可以开始转录。 第二节原核生物的转录过程 原核生物的转录过程可分为转录起始、转录延长和转录终止三个阶段。 —、转录起始需要RNA聚合酶全酶 转录全过程均需RNA pol催化,起始过程需全酶,由G亚基辨认起始点,延长过程的核昔酸聚合仅需核心酶催化。简言之,转录起始就是RNA pol在DNA模板的转录起始区装配形成转录起始复合体,打开DNA双链,并完成第一和第二个核背酸间聚合反应的过程(动画14-1”原核生物的转录起始")。转录起始复合物中包含有RNA pol全酶、DNA模板以及与转录起点配对的NTPs。 起始阶段的第一步是由RNA pol识别并结合启动子,形成闭合转录复合体(closed transcription comp lex),其中的DNA仍保持完整的双链结构。原核生物需要靠RNA pol中的6亚基辨认转录起始区和转录起点。首先被辨认的DNA区段是-35区的TTGACA序列,在这一区段,酶与模板的结合松弛;接着酶移向-10区的TATAAT序列并跨过了转录起点,形成与模板的稳定结合。 起始的第二步是DNA双链打开,闭合转录复合体成为开放转录复合体(open transcription complex)。开放转录复合体中DNA分子接近-10区域的部分双螺旋解开后转录开始。无论是转录起始或延长中,DNA双链解开的范围都只在17bp左右,这比复制中形成的复制叉小得多。 起始的第三步是第一个磷酸二酷键的形成。转录起始不需引物,两个与模板配对的相邻核昔酸,在RNA pol催化下生成磷酸二酷键。转录起点配对生成的RNA的第一位核昔酸,也是新合成的RNA分子的5'-端,以GTP或ATP较为常见。比如,当5'-端第一位核昔酸GTP与第二位的NTP聚合生成磷酸二酣键后,仍保留其5'-端3个磷酸基团,生成聚合物是5'-pppGpN-OH-3',其3'-端的游离经基,可以接收新的NTP并与之聚合,使RNA链延长下去。RNA链的5'-端结构在转录延长中一直保留,至转录完成。 RNA合成开始时会发生流产式起始(abortiv e initiation)的现象。发生流产式起始的时候,RNA pol在完全进入延伸阶段前不从启动子上脱离,而是合成长度小千10个核昔酸的RNA分子,并将这些短片段RNA从聚合酶上释放而终止转录。这个过程可在进入转录延长阶段前重复多次,从而产生多个短片段RNA。流产式起始被认为是启动子校对(promoter proofreading)的过程,其发生可能与266第三篇遗传信息的传递RNA聚合酶和启动子的结合强度有关。 当一个聚合酶成功合成一条超过10个核昔酸的RNA时,便形成一个稳定的包含有DNA模板、RNA pol和RNA片段的三重复合体,从而进入延长阶段。当RNA合成起始成功后,RNA pol离开启动子,称为启动子解脱(promoter escape),也叫启动子清除(promoter clearance)。启动子清除发生后,转录进入延长阶段。 二、RNA聚合酶核心酶独立延长RNA链 第一个磷酸二酷键生成后,转录复合体的构象发生改变,G亚基从转录起始复合物上脱落,并离开启动子,RNA合成进入延长阶段。此时,仅有RNA pol的核心酶留在DNA模板上,并沿DNA链不断前移,催化RNA链的延长。实验证明,G亚基若不脱落,RNA pol则停留在起始位置,转录不继续进行。化学计量又证明,每个原核细胞,RNA pol各亚基比例为:a:13:13':a=4000:2000:2000:600, a因子的量在细胞内明显比核心酶少。在体外进行的RNA合成实验也证明,RNA的生成量与核心酶的加入量成正比;开始转录后,产物量与6亚基加入与否无关。脱落后的6因子又可再形成另一全酶,反复使用。 RNA链延长时,核心酶会沿着模板DNA不断向下游前移。聚合反应局部前方的DNA双链不断解链,合成完成后的部分又重新恢复双螺旋结构。核心酶可以覆盖40bp以上的DNA分子段落,但转录解链范围约17bp。RNA链延长过程中的解链和再聚合可视为这一17bp左右的开链区在DNA上的动态移动,其外观类似泡状,被称为“转录泡"(transcription bubble)。 在解链区局部(图14-5), RNA pol的核心酶催化着模板指导的RNA链延长,转录产物3'-端会有一小段暂时与模板DNA保持结合状态,形成一8bp的RNA-DNA杂合双链(hybrid duplex)。随着RNA链不断生长,5'-端脱离模板向空泡外伸展。从化学结构看,DNA/DNA双链结构比DNA/RNA形成的杂化双链稳定。核酸的碱基之间有3种配对方式,其稳定性是:G=C>A=T>A=U。GC配对有3个氢键,是最稳定的;AT配对只在DNA双链形成;AU配对可在RNA分子或DNA/RNA杂化双链上形成,是3种配对中稳定性最低的。所以已转录完毕的局部DNA双链,就必然会复合而不再打开。根据这些道理,也就易于理解空泡为什么会形成,而转录产物又是为什么可以向外伸出了。 转录泡 模板链 杂合双螺旋8bp 转录方向 观察图14-5中的“转录泡"局部,可概括出转录延长以下特点:心核心酶负责RNA链延长反应;(2)RNA链从5'-端向3'-端延长,新的核昔酸都是加到3'-0H上;@对DNA模板链的阅读方向是3'-端向5'-端,合成的RNA链与之呈反向互补,即酶是沿着模板链的3'一5'方向或沿着编码链的5'一3'方向前进的;@合成区域存在着动态变化的8bp的RNA-DNA杂合双链;@模板DNA的双螺旋结构随着核心酶的移动发生解链和再复合的动态53变化。 三、原核生物转录延长与蛋白质的翻译同时进行 在电子显微镜下观察原核生物的转录产物,可看到像羽毛状的图形(图14-6)。正在进行翻译的核糖体进一步分析表明,在同一个DNA模板分子上,有多个转录复合体同时在进行着RNA图14-6原核生物转录和翻译同步现象示意图的合成;在新合成的mRNA链上还可观察到结合在上面的多个核糖体,即多聚核糖体。这是因为在原核生物,RNA链的转录合成尚未完成,蛋白质的合成已经将其作为模板开始进行翻译了。转录和翻译的同步进行在原核生物是较为普遍的现象,保证了转录和翻译都以高效率运行,满足它们快速增殖的需要。 四、原核生物转录终止分为依赖p因子与非依赖p因子两大类RNA pol在DNA模板上停顿下来不再前进,转录产物RNA链从转录复合物上脱落下来,就是转录终止。依据是否需要蛋白质因子的参与,原核生物的转录终止分为依赖p(Rho)因子与非依赖p因子两大类。 (一)依赖p因子的转录终止 用T4噬菌体DNA作体外转录实验,发现其转录产物比在细胞内转录出的产物要长。这一方面说明转录终止点是可以被跨越而继续转录的;还说明细胞内的某些因子有执行转录终止的功能。根据这些线索,1969年,Roberts J在T4噬菌体感染的大肠杆菌中发现了能控制转录终止的蛋白质,命名为p因子。体外转录体系中加入了p因子后,转录产物长于细胞内的现象不复存在。p因子是由相同亚基组成的六聚体蛋白质,亚基分子量为46kD。p因子能结合RNA,又以对polyC的结合力最强,但对polydC/dG组成的DNA的结合能力就低得多。 在依赖p因子终止的转录中,产物RNA的3'端会依照DNA模板,产生较丰富而且有规律的C碱三三三另三三三三些了了三三五三三三三二:;;ol,图14-7依赖p因子的转录终止RNA链上条纹线处代表富含C的p因子结合区段;p因子结合RNA(图右侧部分)发挥其ATP酶及解旋酶活性(二)非依赖因子的转录终止p DNA模板上靠近转录终止处有些特殊碱基序列,转录出RNA后,RNA产物可以形成特殊的结构子的转录终止。可导致终止的转录产物的3'-端常有多个连续的U,其上游的一段特殊碱基序列又可形成鼓梩状的茎环或发夹形式的二级结构,这些结QG顷结构的形成是非依赖因子终止的信号。p如图14-8所示,RNA链延长至接近终止区时,(转录出的RNA片段随即形成茎环结构。这种二级-结构是阻止转录继续向下游推进的关键。其机制可从两方面理解:一是RNA分子形成的茎环结构可能改变RNApol的构象。注意RNApol的分子量大,它不但覆盖转录延长区,也覆盖部分3'-端新合成的3'RNA聚合酶RNA链,包括刚形成的RNA茎环结构。RNA茎环3'5'结构可影响RNApol的结构而使其构象改变,从而图14-8非依赖因子的转录终止模式p使RNAl-DNA模板的结合方式发生改变。RNApo pol不再向下游移动,于是转录停止。其二,转录复合物(RNApolDNARNA)上形成的局部RNA/--DNA杂化短链的碱基配对是不稳定的,随着RNA茎环结构的形成,RNA从DNA模板链上脱离,单链DNA复原为双链,转录泡关闭,转录终止。另外,RNA链上的多聚U也是促使RNA链从模板上脱落的重要因素。(动画14-3“非依赖因子的转录终止”)p真核生物的转录过程比原核复杂。真核生物和原核生物的RNApol种类不同,结合模板的特性不一样。原核生物RNApol可直接结合DNA模板,而真核生物RNApol需与辅因子结合后才结合模板,所以两者的转录起始过程有较大区别,转录终止也不相同。真核基因组中转录生成的RNA中有20%以上存在反义RNA(antisenseRNA),提示某些DNA双链区域在不同的时间点两条链都可以作为来终止转录,不需要蛋白因子的协助,即非依赖p因DNA模板进行转录。另外,基因组中的基因间区也可以作为模板被转录而产生长非编码RNA等,提示真核基因组RNA生物合成是很广泛的现象。 一、真核生物有多种DNA依赖的RNA聚合酶 真核生物至少具有3种主要的RNA pol,分别是RNA聚合酶I(RNA pol I)、RNA聚合酶II(RNA pol II)和RNA聚合酶皿(RNA pol ill)。RNA pol I位于细胞核的核仁(nucleolus),催化合成rRNA的前体,rRNA的前体再加工成28S、5.8S及18S rRNA。 RNA pol II在核内转录生成前体mRNA,然后加工成mRNA并输送给胞质的蛋白质合成体系。mRNA是各种RNA中寿命最短、最不稳定的,需经常重新合成。在此意义上说,RNA pol II是真核生物中最活跃的RNA pol。RNA pol II也合成一些非编码RNA如长非编码RNA(long non-coding RNA, lncRNA)微小RNA和piRNA(与Piwi蛋白相互作用的RNA)。 RNA pol皿位千核仁外,催化tRNA、5SrRNA和一些核小RNA(sma ll nuclear RNA, snRNA)的合成。真核细胞的三种RNA pol不仅在功能和理化性质上不同,而且对一种毒蘑菇含有的环八肤(cyclic octapeptide)毒素一—a-鹅膏覃碱(a-aman itine)的敏感性也不同,RNA pol I对a-鹅膏覃碱不敏感;RNA pol II对a-鹅膏覃碱十分敏感;RNA pol皿对a-鹅膏簟碱比较敏感(表14-2)。 种类I Il皿转录产物45SrRNA前体mRNA, lncRNA, piRNA, miRNA tRNA,5SrRNA,snRNA对鹅吁妞碱的反应耐受极敏感中度敏感真核生物RNA pol的结构比原核生物复杂,以上所述三种真核生物的RNA pol都有两个不同的大亚基和十几个小亚基。三种真核生物RNA pol都具有核心亚基,与大肠杆菌RNA pol的核心亚基有一些序列同源性。最大的亚基(分子质量160-220kD)和另一大亚基(分子质量128-150kD)与大肠杆菌RNA pol的B'和B亚基有一定同源性。例如,RNA pol JI由12个亚基组成,其最大的亚基称为RBPl。除核心亚基外,3种真核生物RNA pol具有数个共同小亚基。另外,每种真核生物RNA pol各自还有3~7个特有的小亚基。这些小亚基的作用还不十分清楚,但是,每一种亚基对真核生物RNApol发挥正常功能都是必需的。三种聚合酶所含亚基的比较见图14-9。 大肠杆菌的核心酶亚基组成 叩亘萸 真核RNA聚合酶 P'和p样亚基 曰日门日 ◄[>CTD.叩-亡]图14-9真核生物三种RNA聚合酶的亚基◄t>三种真核RNA聚合酶(RNA pol)均含有的5啤亚基种核心亚基与原核的B、旷两个a亚基和Q令。令。令。亚基有同源性,作为比较参考,大肠杆菌RNA pol的亚基组成列在上方。图中的田和卧分别。。。代表B'和B样亚基;◄、[>、·和仁]为Q样亚共同亚基4基;O为w样亚基。三种酶都含有4种共同的口口口亚基(O、O、口和.)。另外,RNA pol I、II和皿分别含有5、3、7种独有的特异性亚基... 酶特异性亚基5个3个7个 RNA pol II最大亚基的狻基末端有一段共有序列(consensus sequence),为Tyi·-Ser-Pro-Thr-Ser-ProSer样的七肤重复序列片段,称为狻基末端结构域(carboxyl-terminal domain, CTD)。RNA pol I和RNA pol皿没有CTD。所有真核生物的RNA pol II都具有CTD,只是7个氨基酸共有序列的重复程度不同。酵母RNA pol II的CTD有27个重复共有序列,其中18个与上述7个氨基酸共有序列完全一致;哺乳动物RNA pol II的CTD有52个重复基序,其中21个与上述7个氨基酸共有序列完全一致。CTD对于维持RNA pol II的催化活性是必需的。体内外实验都证明,CTD的磷酸化在转录起始中起关键作用。当RNA pol II启动转录后,CTD的许多Ser和一些Tyr残基是处千磷酸化状态。 RNA聚合酶I、II皿分别使用不同类型的启动子,分别为I类、II类和皿类启动子,其中皿类启动子又可被分为3个亚型(见第十一章)。 染色体上两个相邻基因的转录方向有的是相同的,有的是不同的。双向启动子(b吐rectional promote1)是位千两个相邻且转录方向相反的基因之间的一段DNA序列(图14-10)。近年来在人类等动植物基因组中存在大量的相邻且转录方向相反的基因,被称为双向转录基因对(b吐rectional gene p扣rs),也被称之为`头对头“基因对(head-to-head gene pairs)。当这两个相邻的"头对头“基因转录起始位点之前导链间的距离小于1kb左右时,这段基因间DNA序列可称之为双向启动子。根据相反方向基因重叠程度的不同,双向转录基因对可分为两类:基因5'-端不重叠基因2的双向转录基因对和基因5'-端重叠的双向转录基因对。相应的双向启动子也分为两类:启动子序列重叠基因1反向链的双向启动子和启动子序列不重叠的双向启动子。<1000bp~第1类双向启动子是真正意义上的双向启动子。真核细胞内还有其他类型的DNA依赖的RNA图14-10双向启动子hp, base-pair.,碱基对聚合酶,例如RNA聚合酶N(RNA polymerase N)在植物中合成小干扰RNA(s iRNA); RNA聚合酶V(RNA polymerase V)在植物中合成的RNA与siRNA介导的异染色质形成有关。真核细胞线粒体的RNA聚合酶属于单亚基RNA聚合酶蛋白质家族,与上述RNA聚合酶在结构上非常不同,在此不详述。 二、顺式作用元件和转录因子在真核生物转录起始中有重要作用RNA pol II催化基因转录的过程,可以分为3个期:起始期(RNA pol II和通用转录因子形成闭合复合体)、延长期和终止期,起始期和延长期都有相关的蛋白质参与。真核生物的转录起始上游区段比原核生物多样化。转录起始时,RNA pol不直接结合模板,其起始过程比原核生物复杂。(—)与转录起始有关的顺式作用元件不同物种、不同细胞或不同的基因,转录起始点上游可以有不同的DNA序列,但这些序列都可统称为顺式作用元件(cis-acting element),一个典型的真核生物基因上游序列示意如图14-11。顺式作用元件包括核心启动子序列、启动子上游元件(upstream promoter elements),又叫近端启动子元件(proximal promoter elements)等近端调控元件和增强子(enhancer)等远隔序列。 转录起始点至上游-37bp的启动子区域是核心启动子(core promote1)区,是转录起始前复合物(prein山ation complex, PIC)的结合位点。真核生物转录起始也需要RNA pol对起始区上游DNA序列作辨认和结合,生成起始复合物。起始点上游多数有共同的TATA序列,称为Hognest盒或TATA盒(TATA box)。通常认为这就是启动子的核心序列。TATA盒的位置不像原核生物上游-35区和-10区那样典型。某些真核生物基因如管家基因(house-keeping gene)也可以没有TATA盒。许多RNA pol II识别的启动子具有保守的共有序列:位千转录起始点附近的起始子(initiator, Inr)(图14-11)。 启动子上游元件是位于TATA盒上游的DNA序列,多在转录起始点上游约40~200bp的位置,比较常见的是位于-70bp至-200bp的CAAT盒和GC盒。这些元件与相应的蛋白因子结合能提高或改变转录效率。 增强子是能够结合特异基因调节蛋白并促进邻近或远隔特定基因表达的DNA序列。增强子距转录起始点的距离变化很大,从lOOObp到50OOObp,甚至更大,但一般作用于最近的启动子,在所控基因的上游和下游都可发挥调控作用,但以上游为主。 (二)转录因子 RNA pol II启动转录时,需要一些称为转录因子(transcription factor, TF)的蛋白质,才能形成具有活性的转录复合体。能直接、间接辨认和结合转录上游区段DNA或增强子的蛋白质,统称为反式作用因子(trans-acting factor)。前缀trans-有“分子外”的意义,指的是它们从DNA分子之外影响转录过程。反式作用因子包括通用转录因子(general transcription factor)和特异转录因子。通用转录因子,有时称为基本转录因子(basal transcription factor),是直接或间接结合RNA pol的一类转录调控因子。相应于RNA pol I、II、皿的TF,分别称为TF I、TF II、TF皿。真核生物的TF II又分为TFIIA,TFIIB等,主要的TF II的功能巳清楚,列于表14-3。所有的RNA pol II都需要通用转录因子,这些通用转录因子有TFII A、TFIIB、TFIID、TFIIE、TF II F、TFII H,在真核生物进化中高度保守。 转录因子功能TFil D含TBP亚基,结合启动子的TATA盒DNA序列TFII A辅助和加强TBP与DNA的结合TF II B结合TFII D,稳定TFII D-DNA复合物;介导RNA polII的募集TFII E募集TFIIH并调节其激酶和解螺旋酶活性;结合单链DNA,稳定解链状态TFII F结合RNA Pol II并随其进入转录延长阶段,防止其与DNA的接触TFIIH解旋酶和ATPase酶活性;作为蛋白激酶参与CTD磷酸化通用转录因子TFII D不是一种单一蛋白质。它实际上是由TATA盒结合蛋白质(TATA binding protein, TBP)和8~l0个TBP相关因子(TEP-associated factor, TAF)组成的复合物。TBP结合一个lObp长度DNA片段,刚好覆盖基因的TATA盒,而TFII D则覆盖一个35bp或者更长的区域。TBP的分子量为20-40kD,而TFIID复合物的分子量大约为700kD。TBP支待基础转录但是不是诱导等所致的增强转录所必需的。而TFII D中的TAFs对诱导引起的增强转录是必要的。有时把TAFs叫做辅激活因子(co-activator)。人类细胞中至少有12种TAF。可以想象TF II D复合物中不同TAFs与TBP的结合可能结合不同启动子,这可以解释这些因子对特定启动子存在不同的亲和力和在各种启动子中的选择性活化。中介子(mediator)也是在反式作用因子和RNA pol之间的蛋白质复合体,它与某些反式作用因子相互作用,同时能够促进TF IIH对RNA pol狻基端结构域的磷酸化。有时把中介子也归类于辅激活因子。 此外,还有与启动子上游元件如GC盒、CAAT盒等顺式作用元件结合的转录因子,称为上游因子(upstream factor),如SPl结合到GC盒上,C/EBP结合到CAAT盒上。这些转录因子调节通用转录因子与TATA盒的结合、RNA pol在启动子的定位及起始复合物的形成,从而协助调节基因的转录效率。 特异转录因子是在特定类型的细胞中高表达,并对一些基因的转录进行时间和空间特异性调控的转录因子(见第十六章)。与远隔调控序列如增强子等结合的转录因子是主要的特异转录因子。例如,属于特异转录因子的可诱导因子(inducible factor)是与增强子等远端调控序列结合的转录因子。它们只在某些特殊生理或病理情况下才被诱导产生的,如MyoD在肌肉细胞中高表达,HIF-1在缺氧时高表达。可诱导因子在特定的时间和组织中表达而影响转录。 RNA pol II与启动子结合后启动转录,这需要多种蛋白质因子的协同作用。这通常包括:可诱导霄因子或上游因子与增强子或启动子上游元件的结合;辅激活因子和(或)中介子在可诱导因子、上游因子与通用转录因子RNA pol II复合物之间起中介和桥梁作用;通用转录因子和RNA pol II在启动子处组装成转录起始前复合物。因子和因子之间互相辨认、结合,以准确地控制基因是否转录、何时转录。表14-4列出了识别、结合II类启动子的四类转录因子及其功能。应该指出的是,上游因子和可诱导因子等在广义上也称为转录因子,但一般不冠以TF的词头而各有自己特殊的名称。 通用机制结合部位具体组分功能通用转录因子TBP结合TATA盒TBP,TF II A、B、E、G、F和H转录定位和起始辅激活因子TAF和中介子在聚合酶和转录因子间起中介上游因子启动子上游元件SPl、ATF、CTF等协助基本转录因子可诱导因子增强子等元件MyoD、HIF-1等时空特异性地调控转录真核生物RNA pol不与DNA分子直接结合,而需依靠众多的转录因子。首先是TF II D的TBP亚基结合TATA,另一TF II D亚基TAF有多种,在不同基因或不同状态转录时,不同的TAF与TBP进行搭配。在TFIIA和IIB的促进和配合下,形成II D-II A-II B-DNA复合体(图14-12)。 具有转录活性的闭合复合体形成过程中,先由TBP结合启动子的TATA盒,这时DNA发生弯曲,然后TF II B与TBP结合,TF II B也能与TATA盒上游邻近的DNA结合。TF II A不是必需的,其存在时能稳定巳与DNA结合的TF II D-TBP复合体,并且在TBP与不具有特征序列的启动子结合时(这种结合比较弱)发挥重要作用。TFII B可以结合RNA pol II。TF II B-TBP复合体再与由RNA pol II和TFII F组成的复合体结合。TFII F的作用是通过和RNA pol II一起与TF II B相互作用,降低RNA polII晶 tTBP(或TFIID和I或TFII A)DNA 品 tTFIIB tTFIIF-RNA聚合酶II II与DNA的非特异部位的结合,来协助RNA pol II靶向结合启动子。最后是TF II E和TF II H加入,形成闭合复合体,装配完成,这就是转录起始前复合物(动画14-4“真核生物转录起始前复合物形成”)。 TFII H具有解旋酶(helicase)活性,能使转录起始点附近的DNA双螺旋解开,使闭合复合体成为开放复合体启动转录。TFil H还具有激酶活性,它的一个亚基能使RNA pol II的CTD磷酸化。还有一种使CTD磷酸化的蛋白质是周期蛋白依赖性激酶9(cycl in-dependent kinase9, CDK9),是正性转录延长因子(positive transcription elongation factor, P-TEFh)复合体的组成部分,对RNA pol II的活性起正性调节作用。CTD磷酸化能使开放复合体的构象发生改变,启动转录。这时TFIID、TFIIA和TF II B等就会脱离转录起始前复合物。当合成一段含有30个左右核昔酸的RNA时,TFIIE和TFII H释放,RNA pol II进入转录延长期(图14-12)。在延长阶段,TFII F仍然结合RNA pol II,防止其与DNA的结合。CTD磷酸化在转录延长期也很重要,而且影响转录后加工过程中转录复合体和参与加工的酶之间的相互作用。 (四)少数几个反式作用因子的搭配启动特定基因的转录上述的是典型而有代表性的RNA pol II催化的转录起始。RNA pol I、RNA pol皿的转录起始与此大致相似。不同基因转录特性的研究已广泛开展,并发现数以百计、数量还在不断增加的转录因子。人类编码蛋白质的基因估计有2万个左右,为了保证转录的准确性,不同基因的转录起始需要不同的转录因子来参与,这是可理解的。转录因子是蛋白质,也需要基因为它们编码。一般认为,数个反式作用因子(主要是可诱导因子和上游因子等转录因子)之间互相作用,再与基本转录因子、RNA pol搭配而有针对性地结合、转录相应的基因。可诱导因子和上游因子常常通过辅激活因子或中介子与基本转录因子、RNA pol结合,但有时可不通过它们而直接与基本转录因子、RNA pol结合。转录因子的相互辨认结合,恰如儿童玩具七巧板那样,搭配得当就能拼出多种不同的图形。人类基因虽数以万计,但需要的转录因子可能几百个就能满足表达不同类型基因的需要。目前不少实验都支持这一理论。用生物信息学估算人类细胞中大约有2000种编码DNA结合蛋白的基因,约占基因总数的10%。其中大部分可能是反式作用因子。 三、真核生物RNA转录延长过程不与翻译同步 真核生物转录延长过程与原核生物大致相似,但因有核膜相隔,没有转录与翻译同步的现象。真核生物基因组DNA在双螺旋结构的基础上,与多种组蛋白组成核小体(nucleosome)高级结构。RNA pol前移处处都遇上核小体。RNA聚合酶(500kD,14nm x13nm)和核小体组蛋白核小体八聚体(300kD,6nmx16nm)大小差别不(a)太大。转录延长可以观察到核小体移位和解聚现象。用含核小体结构的DNA片段作模板,在酶、底物存在及合适反应条件下进行转录,能够观察到核小体移位。在试管内(in vitro)转录实验中以(b)DNA酶对DNA进行水解,从DNA电泳图像观察到约200bp及其倍数的阶梯形电泳条带。这种阶梯形电泳条带证明了(c)核小体在转录过程中存在,提示转录过程中核小体只是发生了移位(图14-13)。图14-13真核生物转录延长中的核小体移位但在培养细胞的体内(in vivo)转录实验(a)RNA聚合酶前移将遇到核小体;(b)原来绕在组蛋白上的中观察到,组蛋白中含量丰富的精氨酸DNA解聚及弯曲;(c)一个区段转录完毕,核小体移位发生了乙酰化,该修饰降低正电荷。核小体组蛋白与DNA的结合是靠碱性氨基酸提供正电荷和核昔酸磷酸根上的负电荷来维系的。据此推论:核小体在转录过程中可能发生一时性解聚并重新装配。 四、真核生物的转录终止和加尾修饰同时进行 真核生物的转录终止,是和转录后修饰密切相关的(动画14-5“真核生物转录终止")。真核生物mRNA有多聚腺昔酸[poly(A)]尾巴结构,是转录后才加进去的,因为在模板链上没有相应的多聚胸甘酸(poly dT)。转录不是在poly(A)的位置上终止,而是超出数百个乃至上千个核甘酸后才停止。已发现在可读框的下游,常有一组共同序列AATAAA,再下游还有相当多的GT序列。这些序列称为转录终止的修饰点(图14-14)。 初知/3'加工 切切Cuc RNA pol Il 修饰点 m-RNA核酸酶-AAUAAA-Poly(A)5'解旋酶i B 停顿 `_气放C 转录越过修饰点后,前体mRNA在修饰点处被切断,随即加入poly(A)尾及5'-帽子结构。下游的RNA虽继续转录,但很快被RNA酶降解。因此有理由相信,帽子结构是保护RNA免受降解的,因为修饰点以后的转录产物无帽子结构,很快被降解。 RNA pol缺乏具有校读(proofreading)功能的3'一5'核酸外切酶活性,因此转录发生的错误率比复制发生的错误率高,大约是十万分之一到万分之一。因为对大多数基因而言,一个基因可以转录产生许多RNA拷贝,而且RNA最终是要被降解和替代的,所以转录产生错误RNA对细胞的影响远比复制产生错误DNA对细胞的影响小。 第四节真核生物前体RNA的加工和降解 真核生物转录生成的RNA分子是前体RNA(pre-RNA),也称为初级RNA转录物(primary RNA transcript),几乎所有的初级RNA转录物都要经过加工,才能成为具有功能的成熟的RNA。加工主要在细胞核中进行。 一、真核前体mRNA经首、尾修饰、剪接和编辑加工后才能成熟真核生物前体mRNA合成后,需要进行5'-端和3'-端(首、尾部)的修饰以及对前体mRNA进行剪接(splicing),才能成为成熟的mRNA,被转运到核糖体,指导蛋白质翻译。 (—)前体mRNA在5'-端加入“帽''结构 前体mRNA(precursor mRNA)也称为初级mRNA转录物(primary mRNA transcript)或核不均一RNA(heterogeneous nuclear RNA, hnRNA)。大多数真核mRNA的5'-端有7-甲基鸟噤呤的帽结构。RNA pol JI催化合成的新生RNA在长度达25~30个核昔酸时,其5'-端的核昔酸就与7-甲基鸟嗦呤核背通过不常见的5',5'-三磷酸连接键相连(图14-15)。 。`逞九1 碱基1 卢三千。干—05oIPIO$~帽2 帽结构 加帽过程 磷酸酶j\去除y磷酸基团 pp5'NpNp鸟昔酸转移酶lcGTP5'-5'三磷酸键形成 鸟嗦呤N-7甲基转移酶!G7位上的甲基 2'-0核糖甲基转移酶』靡谥$言声盓 图14-15真核mRNA的5'-帽结构及加帽过程图中示新加上的第一个G的N-7位甲基化(称为帽l);甲基化也可以发生在第二位核昔酸上(帽2);第三位核昔酸的C-2'上也可以发生甲基化加帽过程由加帽酶(capping enzyme)和甲基转移酶(methyltransferase)催化完成。加帽酶有两个亚基。在添加帽结构的过程中,此酶与RNA pol II的CTD结合在一起,其氨基端部分具有磷酸酶活性,其作用是去除新生RNA的5'-端核昔酸的丫-磷酸;其狻基端部分具有mRNA鸟昔酸转移酶活性,将一个GTP分子中的GMP部分和新生RNA的5'端结合,形成5',5'-三磷酸结构;然后由S-腺昔甲硫氨酸先后提供甲基,使加上去的GMP中鸟嗦呤的N7和原新生RNA的5'-端核昔酸的核糖2'-0甲基巨化这两步甲基化反应由不同的甲基转移酶,即鸟嗦呤N-7甲基转移酶和2'-0核糖甲基转移酶进行催化的(图14-15)(动画14-6“帽子结构的修饰”)。 5'帽结构可以使mRNA免遭核酸酶的攻击,也能与帽结合蛋白质复合体(cap-binding complex of protein)结合,并参与mRNA和核糖体的结合,启动蛋白质的生物合成。 (二)前体mRNA在3'-端特异位点断裂并加上多聚腺昔酸尾真核mRNA,除了组蛋白的mRNA,在3'-端都有多聚腺昔酸[poly(A)]尾结构,约含80~250个腺。 276第三篇遗传信息的传递 昔酸。大多数已研究过的基因中,都没有3'-端相应的多聚胸背酸序列,说明poly(A)尾的出现是不依赖千DNA模板的。5'J I3'转录最初生成的前体mRNA3'端长千成熟CPSFi前体mRNA的mRNA。因此认为,加入poly(A)之前,先由核酸内切酶切去前体mRNA3'端的一些核昔酸,然后加入poly(A)。前体mRNA F IPCF II csl F\v,上的断裂点也是聚腺甘酸化(polyadenylation)的起始点,断裂点的上游l0~30nt有c sF AAUAAA信号序列,断裂点的下游20~40nt有富含G和U的序列,前者是特异序列,后者是非特异序列。在前体mRNA上PAPi CStF也发现poly(A)尾巴,推测这一过程也应在核内完成,而且先千mRNA中段的剪接。尾部修饰是和转录终止同时进行的过程。 一般认为poly(A)的长度与mRNA的寿命呈正相关。随着poly(A)缩短,以该尸mRNA作为模板的翻译活性下降。因此推测,poly(A)的有无与长短与维持mRNA本身稳定性和mRNA作为翻译模板的活性高度相关。一般真核生物在细胞质内出现的PAP"CStF mRNA,其poly(A)长度在100~200个核昔ATP慢速多腺昔酸化酸之间,也有少数例外,如组蛋白基因的转PP+•CF I CF11CStF颐录产物,无论是初级的或成熟的,都没有前体mRNA分子的断裂和加poly(A)PABPlli尾是多步骤过程(图14-16)。断裂和聚腺PABP11昔酸化特异性因子(cleavage and polyadenylation specificity factor, CPSF)是由4条不同的多肤组成的蛋白质,分子质量为360kD。A::霍巳:酸化CPSF先与AAUAAA信号序列形成不稳定的复合体,然后至少有3种蛋白质-~断裂激动因子(cleavage stimulato1-y factor,图14-16真核mRNA3'-多聚腺苦酸化过程CStF)、断裂因子I(cleavage factor I, CF CPSF,断裂和聚腺昔酸化特异性因子;CF,断裂因子I(cleavage factor); CStF,断裂激动因子;PAP,多聚腺昔酸聚I)、断裂因子Il(CF Il)与CPSF-RNA复合酶;PABPII,多聚腺昔酸结合蛋白II合体结合。CStF与断裂点的下游富含G和U的序列相互作用能使形成的多蛋白复合体稳定。最后在前体mRNA分子断裂之前,多聚腺昔酸聚合酶[poly(A)polymerase, PAP]加入到多蛋白质复合体,前体mRNA在断裂点断裂后,立即在断裂产生的游离3'-0H进行多聚腺昔酸化。在加入大约前12个腺昔酸时,速度较慢,随后快速加入腺昔酸,完成多聚腺昔酸化。多聚腺昔酸化的快速期有一种多聚腺昔酸结合蛋白Il[poly(A)binding protein n,简称PABP Il或PAB Il,与细胞质里的腺背酸结合蛋白PABP不同]参与,PABPil和慢速期合成的多聚腺昔酸结合,提高多聚腺昔酸聚合酶合成多聚腺昔酸的速度。PABPil的另一个功能是:当多聚腺昔酸尾结构达足够长时,使多聚腺昔酸聚合酶停止作用。 (三)前体mRNA的剪接主要是去除内含子 正如第十一章所述,真核基因结构最突出的特点是其不连续性,即:如果将成熟的mRNA分子序列与其基因序列比较,可以发现并不是全部的基因序列都保留在成熟的mRNA分子中,有一些区段被去除了,因此真核基因又称为断裂基因。 实际上,在细胞核内出现的初级转录物的分子量往往比在胞质内出现的成熟mRNA大几倍,甚至数十倍。核酸序列分析证明,mRNA来自前体mRNA,而前体mRNA和DNA模板链可以完全配对。 前体mRNA中被剪接去除的核酸序列为内含子的序列,而最终出现在成熟mRNA分子中、作为模板指导蛋白质翻译的序列为外显子序列。去除初级转录物上的内含子,把外显子连接为成熟RNA的过程称为mRNA剪接。 以鸡的卵清蛋白基因为例说明mRNA剪接:卵清蛋白基因全长为7.7kb,有8个外显子和7个内含子(图14-17)。图中蓝色并用数字表示的部分是外显子(其中外显子1又被称为前导序列);用字母表示的白色部分是内含子。初级转录物即前体mRNA是和相应的基因等长的,说明内含子也存在于初级转录物中。成熟的mRNA分子长度约为1.2kb,编码386个氨基酸。 i转录 (a)卵清蛋白基因结构;(b)转录初级产物,也称为前体mRNA或杂化核RNA(hnRNA);(c)前体mRNA的首、尾修饰;(d)剪接过程中套索RNA的形成;(e)细胞质中出现的mRNA,套索已去除。图上方为成熟mRNA与DNA模板链杂交的电镜所见示意图,虚线代表mRNA,实线为1.内含子形成套索RNA被剪除剪接首先涉及套索RNA(lariat RNA)的形成,即内含子区段弯曲,使相邻的两个外显子互相靠近而利千剪接。 2.内含子在剪接接口处剪除从前体rnRNA一级结构分析及特性的研究,目前对剪接已有较深了解。前体mRNA含有可被剪接体所识别的特殊序列,其内含子两端存在一定的序列保守性。内含子含有5'-剪接位点(5'-splice site)、剪接分支点(branch point)和3'-剪接位点(3'-splice site)。大多数内含子都以GU为5'-端的起始序列,而其末端则为AG-OH-3'。5'-GU···…AG-OH-3'称为剪接接口(spl icing junction)或边界序列。 278第三篇遗传信息的传递 3剪接过程需两次转酷反应图14-18中可见,外显子1和外显子2之间的内含子因与剪接体结合而弯曲,内含子5'-端与内含子中的剪接分支点和内含子3'-端互相靠近。第一次转酣反应是由位于内含子分支点的腺嗦呤核昔酸的2'-0H作为亲核基团攻击连接外显子l与内含子之间的3',5'磷酸二酷键,使外显子1与内含子之间的键断裂,外显子l的3'-0H游离出来。此时套索状的内含子与外显子2仍然相连。第二次转酷反应由外显子1的3'-0H对内含子和外显子2之间的磷酸二酣键进行亲核攻击,使内含子与外显子2断开,由外显子1取代了套索状内含子。这样,两个外显子被连接起来而内含子则被以套索状的形式切除掉。在这两步反应中磷酸酷键的数目并没有改变,因此也没有能量的消耗。 /.一一、 }第一次转酣反应 吨勹—A:p i第二次转酣反应 图14-18剪接过程的二次转酷反应虚线箭头示由核糖的3'-0H对磷酸二酷键的亲核攻击4.剪接体是内含子剪接场所前体mRNA的剪接发生在剪接体(spliceosome),因此这类内含子称为剪接体内含子。剪接体是一种超大分子(supramolecule)复合体,由5种核小RNA(snRNA)和100种以上的蛋白质装配而成。其中的snRNA被分别称为Ul、U2、U4、U5和U6,其长度范围在100~300个核昔酸,分子中的碱基以尿啼唗含量最为丰富,因而以U作分类命名。每一种snRNA分别与多种蛋白质结合,形成5种核小核糖核蛋白(small nuclear ribonucleoprotein, snRNP)颗粒。从酵母到入类,真核生物的snRNP中的RNA和蛋白质都高度保守。各种snRNP在内含子剪接过程中先后结合到前体mRNA上,使内含子形成套索并拉近上、下游外显子。剪接体的装配需要ATP提供能量。 剪接体的形成步骤如图14-19所示:O内含子5'-端和分支点分别与Ul、U2的snRNA结合,使snRNP结合在内含子上。@U4、U5和U6加入,形成完整的剪接体。此时内含子发生弯曲而形成套索状。上、下游的外显子1和外显子2靠近。@结构调整,释放Ul和U4。U2和U6形成催化中心,发生第一次转酷反应。此时内含子发生弯曲而形成套索状。随后发生第二次转酷反应,内含子被以套索状切除,外显子1和外显子2被连接在一起。snRNA是以snRNP的形式参与剪切体的组装的,但剪接体中起催化作用的是其中所含的RNA组分。近期的研究证明结合金属离子的U6催化剪接反应。 称为可变剪接(alternative splicing),又称选择性剪接。 (a) 也就是说,这些真核生物前体mRNA分子的加工可能具有2个以上 的加多聚腺甘酸的断裂和多聚腺昔酸化 (b)的位点,因而可采取剪切(图14-20a)或(和)可变剪接(图14-20b)形成不同的 mRNA。可变剪接提高了有限的基因数目的利用率,是增加生物蛋白质多样性的机制之一。 例如,免疫球蛋白重链基因的前体mRNA分子有几个加多聚腺昔酸的断裂和多聚腺昔酸化的位点,通过多聚腺昔酸位点选择机制,经过剪切产生免疫球蛋白重链的多样性;果蝇发育过程中的不同阶段会产生3种不同形式的肌球蛋白重链,这是由于同一肌球蛋白重链的前体mRNA分子通过选择性剪接机制,产生3(c)种不同形式的mRNA。同一种前体第一次mRNA分子在大鼠甲状腺产生降钙素转酣反(calciton i n),而在大鼠脑产生降钙素-基因相关肤(calcitonin-gene related peptide, CGRP),是由千两种机制都参与了加工过程(图14-21)。 第二次(四)mRNA编辑是对基因的编码 转酣反应2I+序列进行转录后加工 }有些基因的蛋白质产物的氨基酸序 列与基因的初级转录物序列并不完全对固14-19snRNP与前体mRNA结合成为剪接体应,mR NA上的一些序列在转录后发生了(a)Ul、U2分别结合内含子5'-端和分支点;(b)U4、U5、U6加入改变,称为RNA编辑(RNA editing)。形成完整剪接体,外显子l和外显子2接近;(c)U2、U6形成催化中心,经两次转酷反应将内含子以套索状切除,将外显子1和例如,人类基因组上只有1个载脂外显子2连接。snRNA以snRNP的形式参与剪切体的组装蛋白B(apolipoprotein B, ApoB)的基因,转录后发生RNA编辑,编码产生的apoB蛋白却有2种,一种是apoBlOO,由4536个氨基酸残基构成,在肝细胞合成;另一种是apoB48,含2152个氨基酸残基,由小肠黏膜细胞合成。这两种apoB都是由ApoB基因产生的mRNA编码的,然而小肠黏膜细胞存在一种胞啼唗核昔脱氨酶(cytosine deaminase),能将ApoB基因转录生成的mRNA的第2153位氨基酸的密码子CAA(编码Gln)中的C转变为U,使其变成终止密码子UAA,因此apoB48的mRNA翻译在第2153个密码子处终止(图14-22)。 又如,脑细胞谷氨酸受体(GluR)是一种重要的离子通道。编码GluR的mRNA在转录后还可发生脱氨基使A转变为G,导致一个关键位点上的谷氨酰胺密码子CAG变为CGG(精氨酸),含精氨酸的GluR不能使Ca2+通过。这样,不同功能的脑细胞就可以选择地产生不同的受体。入类基因组计划执行中曾估计入类基因总数在5万~10万甚至10万以上。测序完成后,现在认为入类只有约l.9万个编码蛋白质的基因。RNA编辑作用说明,基因的编码序列经过转录后加工,是可有多用途分化的,因此也称为分化加工(differe ntial RNA processing)。 280第三篇遗传信息的传递 (a)多(聚)A位点(b)S'剪接位点3'剪接位点多(聚)A位点 芦勿丿 AI }校::.帽结构帽结构!剪切及多(聚)腺昔酸化A1位点的剪切及A2位点的剪切及多(聚)腺昔酸化多(聚)腺昔酸化劓I I IIIIl圈圈斟滚滚沁跻件-AAA(A). 外显子1外显子2外显子3 卢AAA(A).影饥勿瞿酗暑-AAA(A).趴II IIIII贮瓣i杂。牛AAA(A). IJilllllill旯狩抖-AAA(A). 外显子1外显子1外显子2外显子1外显子2外显子3外显子1外显子3成熟的mRNA成熟的mRNA图14-20真核细胞基因的前体mRNA交替加工的两种机制--AAA(A). 修佩眉蹦::仆-AAA(A). 成熟的mRNA仆 成熟的mRNA}-AAA(A)n 降钙素图14-21大鼠降钙素基因转录本的可变剪接CGRP:降钙素基因相关蛋白人肝细胞5'一一厄玉卫]C卫卫]厄卫卫]区互卫]肛玉工i仄卫忑]从U A|lCA A脰卫工邯:瓦卫]肛玉卫]肛玉工压'(apoBlOO)-Gln-Leu-Gln-Thr-Tyr-Met-Ile-Gln-Phe-Asp-Gln-Yyr人肠上皮细胞---匝卫卫]厄卫卫]匝工互l仄互卫]匝卫卫]区卫玉]区卫卫]肛工玉]肛卫卫]匝五卫]贮玉忑]厄玉卫] (apoB48)-Gln-Leu-Gln-Thr-Tyr-Met-Ile-Stop氨基酸残基数214621482150215221542156二、真核前体rRNA经过剪切形成不同类别的rRNA真核细胞的rRNA基因(rDNA)属于冗余基因(redundant gene)族的DNA序列,即染色体上一些相似或完全一样的纵列串联基因(tandem gene)单位的重复。属于冗余基因族的还有5S rRNA基因、组蛋白基因、免疫球蛋白基因等。不同物种基因组可有数百或上千个rDNA,每个基因又被不能转录的基因间隔(gene spacer)分段隔开。可转录片段大小为7~13kb,间隔区也有若干kb大小。这些基因间隔不是内含子。rDNA位千核仁内,每个基因各自为一个转录单位。 真核生物基因组的rRNA基因中,18S、5.8S和28S rRNA基因是串联在一起的,转录后产生45S的转录产物。45S rRNA是3种rRNA的前身。45S rRNA在核仁小RNA(small nucleolar RNA, snoRNA)以及多种蛋白质分子组成的核仁小核糖核蛋白(small nucleolar ribonucleoprotein, snoRNP)的介导下经历了2'-0-核糖甲基化等化学修饰,这些修饰可能与其后续的加工、折叠和组装后的核糖体功能有关。45S rRNA经过某些核糖核酸内切酶和核糖核酸外切酶的剪切,去除内含子等序列,而产生成熟的18S、5.8S及28S的rRNA(图14-23)。 45S rRNA····......一一一….... 剪切18S rRNA5.8S+28S rRNA 剪切18S rRNA5.8S rRNA28S rRNA 貂雪内含子……….基因间隔 圈14-23真核前体rRNA转录后的剪切 rRNA成熟后,就在核仁上装配,与核糖体蛋白质一起形成核糖体,输送到胞质。生长中的细胞,其rRNA较稳定;静止状态的细胞,其rRNA的寿命较短。 三、真核前体tRNA的加工包括核苦酸的碱基修饰 真核生物的大多数细胞有40~50种不同的tRNA分子。编码tRNA的基因在基因组内都有多个拷贝。前体tRNA分子需要多种转录后加工才能成为成熟的tRNA。 以酵母前体tRNAT“分子为例,加工主要包括以下变化:心酵母前体tRNATy,分子5'-端的16个核昔酸前导序列由核糖核酸酶P(RNase P)切除,核糖核酸酶P属千核酶(Ribozyme)。核酶是具有催化功能的RNA。@氨基酸臂的3'-端2个U被核糖核酸内切酶RNase Z切除,有时核糖核酸外切酶RNase D等也参与切除过程,然后氨基酸臂的3'-端再由核昔酸转移酶加上特有的CCA末端。@茎环结构中的一些核昔酸碱基经化学修饰为稀有碱基,包括某些嗦呤甲基化生成甲基嗦呤、某些尿晓唗还原为二氢尿啼唗(DHU)、尿啼唗核昔转变为假尿啼唗核昔(中汃某些腺昔酸脱氨成为次黄嗦呤核昔酸(I)等。@通过剪接切除茎-环结构中部14个核昔酸的内含子。内含子剪切由tRNA剪接内切酶(tRNA-splicing endonuclease, TSEN)完成。切除后的连接反应由tRNA连接酶催化。前体tRNA分子必须折叠成特殊的二级结构,剪接反应才能发生,内含子一般都位于前体tRNA分子的反密码子环(图14-24)。 c连图1424前体RNA的剪接t 三厂 酶接 四、RNA催化—些内含子的自剪接 1982年,美国科学家T. Cech和他的同事发现四膜虫编码rRNA前体的DNA序列含有间隔内含子序列,他们在体外用从细菌纯化得到的RNA pol转录从四膜虫纯化的编码rRNA前体的DNA,发现在没有任何来自四膜虫的蛋白质情况下,rRNA前体能准确地剪接去除内含子。这种由RNA分子催化自身内含子剪接的反应称为自剪接(self-splicing)。随后,在其他原核生物以及真核生物的线粒体、叶绿体的rRNA前体加工中,亦证实了这种剪接。这些自身剪接内含子的RNA具有催化功能,属千核酶。 一些噬菌体的前体mRNA及细菌tRNA前体也发现有这类自身剪接的内含子,并被称之为组I型内含子(group I intron)。组I型内含子以游离的鸟噤呤核昔或鸟嗦呤核昔酸作为辅因子完成剪接。鸟嗦呤核昔或鸟嗦呤核昔酸的3'-0H与内含子的5'-磷酸共同参与转酕反应,切除的内含子是线状。 许多生物中还存在组Il型内含子(group ITin tron)。组Il型内含子是另一类独特的、能起催化作用的RNA,其RNA能催化内含子的自剪接。组Il型内含子不如组I型内含子更普遍。这两类内含子有一个共同的特性,就是在体外(in vitro)能够自我剪接,而不需要任何蛋白质酶的催化。但是在体内(in vivo)它们却都需要蛋白质帮助折叠成二级结构。组Il型内含子与组I型内含子的内部保守序列和折叠结构不同。另外,组Il型内含子通过产生一个套索状中间体来进行自剪接,而组I型内含子则不形成套索状中间体(图14-25)。 组Il型内含子的剪接与前面介绍的前体mRNA的剪接都形成套索状结构,但是前者没有剪接体参与(图14-25)。 与上面三种内含子不同的是,真核细胞tRNA和古菌tRNA的内含子属于tRNA内含子。这些tRNA中位于内部的内含子是由蛋白质催化来进行剪接的,参与的酶是tRNA剪切内切酶和tRNA连接酶。因此,现在发现至少存在有4种类型的内含子,它们分别是组I型内含子、组Il型内含子、剪接体内含子和tRNA内含子。 需要指出的是,剪接和剪切等RNA转录后加工在原核生物细胞内的前体rRNA、前体tRNA等非编码RNA中普遍存在,但是,原核生物细胞内没有剪接体,其编码蛋白质的mRNA没有内含子,不进行剪接等转录后加工,也不进行5'-末端"帽”结构和3'-端多聚腺昔酸尾的添加。 五、真核RNA在细胞内的降解有多种途径 真核细胞的mRNA降解途径可分为两类:正常转录物的降解和异常转录物的降解。正常转录物(a)棘于脱腺昔的mRNA降解(b)非依赖于脱腺昔的mRNA降解脱腺昔酸化酶I'一,'—:,'=,",,:-AAAA脱帽酶2戒G了爵厅尸=梦立—===士。 外切体 5':.....3'外切酶图14-26正常mRNA的降解途径m7G一l.:.一=..AAAA—l-m7G-,'l.,一气,,,占',l...l-AAAA—m7c一一气豆劂(c)核酸内切酶介导的mRNA降解外切体:;:|5'一3'降解It~rn7r.t3'外切酶核糖体核糖体UPFl磷酸化AUG,翻译起始点;UPF,无义转录物调节因子EJC,外显子拼接复合体;PTC,提前终止密码子;. NMD诱导 蛋白质翻译产物正常转录产物,无提前终止密码子. EJC被核糖体替无NMD激活 2/mRNA进行剪接加工时,异常的剪接反应会在可读框架内产生无义的终止密码子,常称作提前终止密码子(premature translational-termination codon, PTC)。PTC也可由错误转录或翻译过程中的移码而产生。无义介导的mRNA降解(nonsense-mediated mRNA decay, NMD)是一种广泛存在于真核生物细胞中的mRNA质量监控机制。该机制通过识别和降解含有PTC的转录产物防止有潜在毒性的截短蛋白的产生(图14-27)。外显子拼接复合体(exon-junction complex, EJC)是诱导无义介导的mRNA降解的重要因子。EJC通常位于外显子和外显子拼接点的上游附近,在翻译过程中,结合在mRNA上的EJC会随着核糖体在mRNA上的滑动而被逐一移除(图14-27)。如果在外显子-外显子的拼接点之前出现PTC,核糖体会被从mRNA上提前释放,这时PTC下游的EJC仍然保留在mRNA上,EJC结合的一些蛋白质如UPF3(无义转录物调节因子3)等诱导UPF l的磷酸化。磷酸化的UPFl募集脱帽酶Dcpla和外切酶Xrn l等,对mRNA进行降解。许多遗传性疾病是由出现PTC而引起的。 除无义介导的mRNA降解外,异常转录物尚有无终止密码子引起的mRNA降解(non-stop decay, NSD降解)和非正常停滞引起的mRNA降解(no-go decay, NGD降解)及核糖体延伸介导的降解(1ibo some extension-mediated decay, REMD)等,不详述。 小结 RNA是细胞中广泛分布而且非常丰富的一类多功能分子。多数细胞中有三种主要的RNA类型:mRNA、rRNA和tRNA。mRNA的一个重要功能就是将基因组信息传递给蛋白质。rRNA和tRNA也是细胞内蛋白质生物合成所必需的。 RNA pol以DNA为模板,以5'-三磷酸核糖核廿为原朴催化合成与模板互补的RNA,这个过程称为转录(transcription)。转录有RNA pol与启动子(promoter)结合、起始、延长和终止几个阶段,RNA合成的方向是从5'~3'。原核RNA pol只有一种,全酶形式是rra2l3l3w,以G亚基识别启动子,核心酶0'.2部'o催化合成RNA。原核生物的转录终止有p因子依赖终止和p因子不依赖终止两种方式。 真核细胞的核内至少具有3种主要的RNA pol。RNA pol I合成大部分rRNA前体,RNA pol II合成前体mRNA(precursor mRNA),RNA pol皿合成tRNA和5S rRNA前体。真核RNA pol由多亚基组成。RNA pol II与启动子的结合需要多种转录因子(transcription factor)参与;聚合酶II最大亚基有狻基末端结构域(carboxyl-terminal domain, CTD),在转录起始和延长阶段被磷酸化。 真核前体mRNA的5'-端加上7-甲基乌噤呤核菩残基的帽结构,3'-端通过断裂及多聚腺芬酸化加上多聚腺符酸尾结构,内含子通过剪接切除。一个前体mRNA分子可经过剪接和剪切两种模式而加工成多个mRNA分子。有些真核的rRNA、tRNA和前体mRNA含有自身剪接内含子,这类内含子的剪接不需要蛋白质参与,内含子自身的RNA具有催化剪接的功能。这些RNA具有核酶活性。有些mRNA要经过编辑。 mRNA降解是细胞保持其正常的生理状态所必需的。mRNA降解包括正常转录物的降解和异常转录物的降解。正常转录物是指细胞产生的有正常功能的mRNA。异常转录物是细胞产生的一些非正常转录物。在真核细胞中,正常转录物和异常转录物的降解都有多种方式。 除mRNA、rRNA和tRNA外,真核细胞内还有核小RNA(snRNA)、微RNA(microRNA, miRNA)和长非编码RNA(long non-coding RNA)等非编码RNA,分别与mRNA的剪切和基因表达调控有关(见笫二章和笫十六章)。对于RNA生物过程的调节,可以导致蛋白质合成速率的改变以及由此而引发的一系列代谢变化,因此了解RNA合成的基本原理甚为重要。这些原理既关系到所有生物是如何适应环境变化的,也关系到细胞特定结构和功能的形成机制。mRNA转录物的错误加工和剪切可引起疾病,例如某些类型的地中海贫血。除参与蛋白质的生物合成外,非编码RNA等RNA还具有其他重要的生物学功能。 286第三篇遗传信息的传递 第十五章蛋白质的合成 蛋白质具有多种生物学功能,参与生命的几乎所有过程,是生命活动的物质基础。通常一个细胞在某一特定时刻,其生存及活动约需数千种结构蛋白质和功能蛋白质的参与。蛋白质具有高度的种属特异性,不同种属间蛋白质不能互相替代,因此各种生物的蛋白质均由机体自身合成。 蛋白质由基因编码,是遗传信息表达的主要终产物。mRNA带有蛋白质合成的编码信息,是蛋白质合成的模板。蛋白质在机体内的合成过程,实际上就是遗传信息从DNA经mRNA传递到蛋白质的过程,此时mRNA分子中的遗传信息被具体地翻译成蛋白质的氨基酸排列顺序,因此这一过程也被形象地称为翻译(translation)。从低等生物细菌到高等哺乳动物,蛋白质合成机制高度保守。 新合成的蛋白质多肤链通常并不具备生物学活性,需经过各种修饰、加工并折叠为正确构象,然后靶向运输至合适的亚细胞部位才能行使其功能。 第一节蛋白质合成体系 蛋白质生物合成是细胞最为复杂的活动之一。参与细胞内蛋白质生物合成的物质除原料氨基酸外,还需要mRNA作为模板,tRNA作为特异的氨基酸"搬运工具”,核糖体作为蛋白质合成的装配场所,有关的酶与蛋白质因子参与反应,并且需要ATP或GTP提供能量。 —、mRNA是蛋白质合成的模板 mRNA的发现回答了细胞核内基因组的遗传信息如何编码蛋白质这一重要间题。由DNA转录而来的mRNA在细胞质内作为蛋白质合成的模板,mRNA编码区(可读框)中的核昔酸序列作为遗传密码(genetic code),在蛋白质合成过程中被翻译为蛋白质的氨基酸序列。 mRNA分子中核昔酸序列的翻译以3个相邻核昔酸为单位进行。在mRNA的可读框区域,每3个相邻的核昔酸为一组,编码一种氨基酸或肤链合成的起始/终止信息,称为密码子(codon),又称三联体密码(tripl et code)。例如,UUU是苯丙氨酸的密码子,UCU是丝氨酸的密码子,GCA是丙氨酸的密码子。构成mRNA的4种核昔酸经排列组合可产生64个密码子,其中的61个编码20种在蛋白质合成中作为原料的氨基酸,另有3个(UAA、UAG、UGA)不编码任何氨基酸,而是作为肤链合成的终止密码子(termination codon)。需要注意的是,AUG具有特殊性,不仅代表甲硫氨酸,如果位于mRNA的翻译起始部位,它还代表肤链合成的起始密码子(initiation codon)(表15-1)。 遗传密码具有以下几个重要特点岱: 1方向性组成密码子的核昔酸在mRNA中的排列具有方向性。翻译时的阅读方向只能从5'至3',即从mRNA的起始密码子AUG开始,按5'-+3'的方向逐一阅读,直至终止密码子。mRNA可读框中从5'-端到3'-端排列的核背酸顺序决定了肤链中从N-端到C-端的氨基酸排列顺序(图15-1a)。 2连续性mRNA中密码子之间没有间隔核节酸,即从起始密码子开始,密码子被连续阅读,直至终止密码子出现。因密码子具有连续性,若可读框中插入或缺失了非3的倍数的核昔酸,将会引起mRNA可读框发生移动,称为移码(frame s hift)。移码导致后续氨基酸编码序列改变,使得其编码的蛋白质彻底丧失或改变原有功能,称为移码突变(frameshift mutation)(图15-lb)。若连续插入或缺失3个核昔酸,则只会在多肤链产物中增加或缺失l个氨基酸残基,但不会导致可读框移位。 288第三篇遗传信息的传递 第1个核旮酸第2个核旮酸(5'-端)u c A Gu 第3个核旮酸(3'-端) 苯丙氨酸丝氨酸酪氨酸半胱氨酸UCAGUCAGUCAGUCAG苯丙氨酸丝氨酸酪氨酸半胱氨酸亮氨酸丝氨酸终止密码子终止密码子亮氨酸丝氨酸终止密码子色氨酸亮氨酸脯氨酸组氨酸精氨酸亮氨酸脯氨酸组氨酸精氨酸亮氨酸脯氨酸谷氨酰胺精氨酸亮氨酸脯氨酸谷氨酰胺精氨酸异亮氨酸苏氨酸天冬酰胺丝氨酸异亮氨酸苏氨酸天冬酰胺丝氨酸异亮氨酸苏氨酸赖氨酸精氨酸.甲硫氨酸苏氨酸赖氨酸精氨酸缅氨酸丙氨酸天冬氨酸甘氨酸缅氨酸丙氨酸天冬氨酸甘氨酸缅氨酸丙氨酸谷氨酸甘氨酸颌氨酸丙氨酸谷氨酸甘氨酸.位千mRNA起始部位的AUG为肤链合成的起始信号。作为起始信号的AUG具有特殊性,在原核生物中代表甲酰甲硫氨酸,在真核生物中代表甲硫氨酸mRNA5'1A勹1c1G「丁勹1c I I I I I I|「勹1u n3'U G A C U UGCGAUU C C A GA匕飞户...JL六广...J L六广....J L__,.,-J三匕匕匕六广4多肤链Met—Gly—Leu Asn—Ala—Ile—-Pro(终止密码) (b)读码方向/插入的核昔酸5'3' ;』[;;;[』; I卢;;』』上;UI GCCAUG L-v_JL-v_仁六广_J"-y--1L六广.....JL六厂」匕匕多肤链Met-Gly—Leu-Thr一Cy_s一Asp--Ala-Met(a)氨基酸的排列顺序对应于mRNA中密码子的排列顺序;(b)核昔酸插入导致移码突变3.简并性64个密码子中有61个编码氨基酸,而氨基酸只有20种,因此有的氨基酸可由多个密码子编码,这种现象称为简并性(degeneracy)。例如,UUU和UUC都是苯丙氨酸的密码子,UCU、UCC、UCA、UCG、AGU和AGC都是丝氨酸的密码子。 为同一种氨基酸编码的各密码子称为简并性密码子,也称同义密码子。多数情况下,同义密码子的前两位碱基相同,仅第三位碱基有差异,即密码子的特异性主要由前两位核昔酸决定,如苏氨酸的密码子是ACU、ACC、ACA、ACG。这意味着密码子第三位核昔酸的改变往往不改变其编码的氨基酸,合成的蛋白质具有相同的一级结构。因此,遗传密码的简并性可减少基因突变所带来的生物学效应。 4.摆动性密码子通过与tRNA的反密码子配对而发挥翻译作用,但这种配对有时并不严格遵循Watson-Crick碱基配对原则,出现摆动(wobble)。此时mRNA密码子的第1位和第2位碱基(5'-+3')与?记tRNA反密码子的第3位和第2位碱基(5'一3')之间仍为Watson-Crick配对,而反密码子的第1位碱基与密码子的第3位碱基配对有时存在摆动现象。例异亮氨酸一5'如,反密码子第1位碱基为次黄嗦呤(inosine, I),3'可与密码子第3位的A、C或U配对;反密码子第1位的U可与密码子第3位的A或G配对;反密tRNA,反密码环码子第1位的G可与密码子第3位的C或U配对摆动位点(图15-2)。由此可见,密码子的摆动性能使一种tRNA识别1nRNA中的多种简并性密码子。mRNA5.通用性遗传密码具有通用性(umveI'Sal)'5'密码子3'即从低等生物如细菌到人类都使用着同一套遗传图15-2反密码子与密码子的识别方式与密码,这为地球上的生物来自同一起源的进化论提摆动配对供了有力证据,另外也使得利用细菌等生物来制造人类蛋白质成为可能。但遗传密码的通用性并不是绝对的,也有少数例外。例如,在哺乳类动物线粒体内,UGA除了代表终止信号,也代表色氨酸;AUA不再代表异亮氨酸,而是作为甲硫氨酸的密码子。 二、tRNA是氨基酸和密码子之间的特异连接物 作为蛋白质合成原料的20种氨基酸,翻译时由其各自特定的tRNA负责转运至核糖体。tRNA通过其特异的反密码子与mRNA上的密码子相互配对,将其携带的氨基酸在核糖体上准确对号入座。虽然已发现的tRNA多达数十种,一种氨基酸通常与多种tRNA特异结合(与密码子的简并性相适应),但是一种tRNA只能转运一种特定的氨基酸。通常在tRNA的右上角标注氨基酸的三字母符号,以代表其特异转运的氨基酸,如tRNAr“表示这是一种特异转运酪氨酸的tRNA。 tRNA上有两个重要的功能部位:一个是氨基酸结合部位,另一个是mRNA结合部位。与氨基酸结合的部位是tRNA的氨基酸臂的-CCA末端的腺昔酸3'-0H;与mRNA结合的部位是tRNA反密码环中的反密码子。参与肤链合成的氨基酸需要与相应tRNA结合,形成各种氨酰-tRNA(am inoacyltRNA),再运载至核糖体,通过其反密码子与mRNA中对应的密码子互补结合(图15-2),从而按照mRNA的密码子顺序依次加入氨基酸。 三、核糖体是蛋白质合成的场所 合成肤链时mRNA与tRNA的相互识别、肤键形成、肤链延长等过程全部在核糖体上完成。核糖体类似千一个移动的多肤链"装配厂",沿着模板mRNA链从5'端向3'端移动。在此期间携带着各种氨基酸的tRNA分子依据密码子与反密码子配对关系快速进出其中为延长肤链提供氨基酸原料(动画15-1"30S小亚氨酰-tRNA基-tRNA”)。肤链合成完毕,核糖体立刻离开mRNA分子。原核生物和真核生物的核糖体上均存在A位、P位和E位这3个重要的功能部位。A位结合氨酰-tRNA,称氨酰位(am in oacyl site); P位结合肤酰-tRNA,称肤酰位(peptidy l site); E位释放已经卸载了氨基核糖体移动方向>酸的tRNA,称排出位(exit site)(图15图15-3核糖体在翻译中的功能部位3)。 290第三篇遗传信息的传递 四、蛋白质合成需要多种酶类和蛋白质因子 蛋白质合成需要由ATP或GTP供能,需要Mg气肤酰转移酶、氨酰-tRNA合成酶等多种分子参与反应。此外,起始、延长及终止各阶段还需要多种因子参与:心起始因子(initiation factor, IF),原核生物和真核生物的起始因子分别以IF和eIF表示;@延长因子(elongation factor, EF),原核生物与真核生物的延长因子分别以EF和eEF表示;@终止因子(termination factor),又称释放因子(release factor, RF),原核生物与真核生物的释放因子分别以RF和eRF表示。各类因子的种类及其生物学功能见表15-2(原核生物)及表15-3(真核生物)。 种类生物学功能 起始因子IFl占据核糖体A位,防止tRNA过早结合于A位IF2促进fMe t-tRNA仆ie'与小亚基结合IF3防止大、小亚基过早结合;增强P位结合fMet-tRNA仆ic'的特异性延长因子EF-Tu促进氨酰-tRNA进入A位,结合并分解GTP EF-Ts EF-Tu的调节亚基EF-G有转位酶活性,促进mRNA-肤酰-tRNA由A位移至P位释放因子RFl特异识别终止密码UAA或UAG;诱导肤酰转移酶转变为酷酶RF2特异识别终止密码UAA或UGA;诱导肤酰转移酶转变为酷酶RF3具有GTPase活性当新合成肤链从核糖体释放后,促进RF l或RF2与核糖体分离起始因子eIFl结合于小亚基的E位,促进eIF2-tRNA-GTP复合物与小亚基相互作用eIFl A原核IFl的同源物,防止tRNA过早结合千A位eIF2具有GTPase活性,促进起始Me t-tRNAM"与小亚基结合eIF2B,eIF3最先与小亚基结合的起始因子;促进后续步骤的进行eIF4A eIF4F复合物成分,具有RNA解旋酶活性,解开mRNA二级结构,使其与小亚基结合eIF4B结合mRNA,促进mRNA扫描定位起始密码AUG eIF4E eIF4F复合物成分,结合于mRNA的5'-帽结构eIF4G eIF4F复合物成分,结合eIF4E和poly(A)结合蛋白质(PABP)eIF4F包含eIF4A、eIF4E、e IF4G的复合物eIF5促进各种起始因子从小亚基解离,从而使大、小亚基结合eIF5B具有GTPase活性,促进各种起始因子从小亚基解离,从而使大、小亚基结合延长因子eEFlot与原核EF-Tu功能相似eEFl衍与原核EF-Ts功能相似eEF2与原核EF-G功能相似释放因子eRF识别所有终止密码子参与肤链合成的氨基酸需要与相应tRNA结合,形成各种氨酰-tRNA。该过程是由氨酰-tRNA合成酶(aminoacyl-tRNA synthetase)所催化的耗能反应。氨基酸与特异的tRNA结合形成氨酰-tRNA的过程称为氨基酸的活化。 —、氨酰tRNA合成酶识别特定氨基酸和tRNA mRNA密码子与tRNA反密码子间的识别主要由tRNA决定,而与氨基酸无关,"搭错车"的氨基酸仍将依据tRNA的种类进入多肤链导致合成出错。因此氨基酸与tRNA连接的准确性是正确合成蛋白质的关键。 氨基酸与tRNA连接的准确性由氨酰-tRNA合成酶决定,该酶对底物氨基酸和tRNA都有高度特异性。目前发现氨酰-tRNA合成酶至少有23种,分别与组成蛋白质的各种氨基酸一一对应,并能准确识别相应的tRNA。在组成蛋白质的常见20种氨基酸中,除了赖氨酸有两种氨酰-t凡NA合成酶与其对应,其他氨基酸各自对应一种氨酰-tRNA合成酶,另外还有识别磷酸化丝氨酸和咄咯酪氨酸的氨酰-tRNA合成酶。 每个氨基酸活化为氨酰-tRNA时需消耗2个来自ATP的高能磷酸键,其总反应式如下:氨基酸+tRNA+ATP氨酰-tRNA合成酶,氨酰-tRNA+AMP+PPi氨酰-tRNA合成酶所催化反应的主要步骤包括:心氨酰-tRNA合成酶催化ATP分解为焦磷酸与AMP;(2)AMP、酶、氨基酸三者结合为中间复合体(氨酰-AMP-酶),其中氨基酸的狻基与磷酸腺昔的磷酸以酐键相连而活化;@活化氨基酸与tRNA3'-CCA末端的腺昔酸的核糖2'或3'位的游离轻基以酕键结合,形成相应的氨酰-tRNA,腺昔一磷酸(AMP)以游离形式被释放出来(图15-4)包。 氨酰AMP 勹尸 上了 氨酰-tRNA 氨酰-t RNA 合成 巳经结合了不同氨基酸的氨酰-t RNA用前缀氨基酸三字母代号表示,如Tyr-tRNAT“代表tRNATyr的氨基酸臂上已经结合有酪氨酸。氨酰-tRNA合成酶还有校对活性(proofreading activity),能将错误结合的氨基酸水解释放,再换上正确的氨基酸,以改正合成过程出现的错配,从而保证氨基酸和tRNA结合反应的误差小于10-4包。 二、肤链合成的起始需要特殊的起始氨酰-tRNA 从遗传密码表中可见(表15-1),编码甲硫氨酸的密码子在原核生物与真核生物中同时又作为起始密码子。目前已知,尽管都携带着甲硫氨酸,但结合在起始密码子处的氨酰-tRNA,与结合可读框内部甲硫氨酸密码子的氨酰-tRNA在结构上是有差别的包。结合于起始密码子的属于专门的起始氨酰-tRNA,在原核生物为fMet-tRNA™•',其中的甲硫氨酸被甲酰化,成为N-甲酰甲硫氨酸(N-formyl methionine, fMet);在真核生物,具有起始功能的是tRNA,Met(initiator tRNA),它与甲硫氨酸结合后,可以在mRNA的起始密码子AUG处就位,参与形成翻译起始复合物。Met-tRNA;Me'和Met-tRNAMe'可分别被起始或延长过程起催化作用的酶和蛋白质因子识别。\J,{i}翻译过程包括起始(in山ation)、延长(elongation)和终止(termination)三个阶段。真核生物的肤链合成过程与原核生物的肤链合成过程基本相似,只是反应更复杂、涉及的蛋白质因子更多。 —、翻译起始复合物的装配启动脓链合成 翻译的起始是指mRNA、起始氨酰-tRNA分别与核糖体结合而形成翻译起始复合物(translationinitiation complex)的过程。(一)原核生物翻译起始复合物的形成原核生物翻译起始复合物的形成需要30S小亚基、mRNA、fMet-tRNA™"'和sos大亚基,还需要3种IF、GTP和Mg2+包。其主要步骤如下:1.核糖体大小亚基分离完整核糖体在IF的帮助下,大、小亚基解离,为结合rnRNA和fMet tRNA仆如做好准备。IF的作用是稳定大、小亚基的分离状态,如没有IF存在,大、小亚基极易重新聚合。 2. mRNA与核糖体小亚基结合小亚基与mRNA结合时,可准确识别可读框的起始密码子AUG,而不会结合内部的AUG,从而正确地翻译出所编码蛋白质。保证这一结合准确性的机制是:mRNA起始密码子AUG上游存在一段被称为核糖体结合位点(ribosome-binding site, RBS)的序列。该序列距AUG上游约10个核昔酸处通常为-AGGAGG-(也称Shine-Dalgarno序列,S-D序列),可被16S rRNA通过碱基互补而精确识别,从而将核糖体小亚基准确定位于mRNA(图15-5)。 3'末端人令 ...卿一- 一···一 5'-G A U U C C U lliilliilillili U U G A C C U正正召贮匝mRNA上的S-D序列起始密码子3. fMeHRNAfMel结合在核糖体P位fMet-tRNA仆1e'与结合了GTP的IF2一起,识别并结合对应于小亚基P位的mRNA的AUG处。此时,A位被IFl占据,不与任何氨酰-tRNA结合。 4.翻译起始复合物形成结合千IF2的GTP被水解,释放的能量促使3种IF释放,大亚基与结合了mRNA、fMet-tRNA file'的小亚基结合,形成由完整核糖体、mRNA、fMet-tRNAfMe'组成的翻译起始复合物。 如前所述,核糖体上存在着A位、P位和E位这三个重要的功能部位。在肤链合成过程中,新的氨酰-tRNA首先进入A位,形成肤键后移至P位。但是在翻译起始复合物装配时,结合起始密码子的fMet-tRNA仆1et是直接结合于核糖体的P位,A位空留,且对应于AUG后的密码子,为下一个氨酰-tRNA的进入及肤链延长做好准备。原核生物翻译起始复合物的装配见图15-6。 (二)真核生物翻译起始复合物的形成 真核生物翻译起始复合物的装配所需起始因子的种类更多,其装配过程更复杂,且mRNA的5'帽和3'-多聚(A)尾均为正确起始所必需。此外,起始氨酰-tRNA先千mRNA结合于小亚基,与原核生物的装配顺序不同苍。其主要步骤如下:1.43S前起始复合物的形成多种起始因子与核糖体小亚基结合,其中eIFlA和eIF3与原核起始因子IFl和IF3功能相似,可阻止tRNA结合A位,并防止大亚基和小亚基过早结合。eIFl结合于1iL E位,GTP-elF2与起始氨酰-tRNA结合,随后eIF5和elF5B加入,形成43S的前起始复合物。 言 [ 码 口忑 294第三篇遗传信息的传递 扫描定位 起始密/ 核糖体小亚基3' 核糖体大亚基 43S前起始5'复合物 糖体释放。GTP-EF-Tu又可循环生成。 核糖体对氨酰-tRNA的进位有校正作用。肤链生物合成以很高速度进行,延长阶段的每一过程都有时限。在此时限内,只有正确的氨酰-tRNA能迅速发生反密码子-密码子互补配对而进入A位。反之,错误的氨酰-tRNA因反密码子-密码子不能配对结合而从A位解离。这是维待肤链生物合成的高度保真性的机制之一。 2成肤指核糖体A位和P位上的tRNA所携带的氨基酸缩合成肤的过程。在起始复合物中,P位上起始tRNA所携带的甲酰甲硫氨酸与A位上新进位的氨酰tRNA的a-氨基缩合形成二肤。第一个肤键形成后,二肤酰-tRNA占据核糖体A位,而卸载了氨基酸的tRNA仍在P位。成肤(peptide bond formation)过程由肤酰转移酶(peptidyl transferase)催化,该酶的化学本质不是蛋白质,而是RNA,在原核生物为23S rRNA,在真核生物为28S rRNA。因此肤酰转移酶属于一种核酶(ribozyme)。 3转位成肤反应后,核糖体需要向mRNA的3'-端移动一个密码子的距离,方可阅读下一个密码子,此过程为转位(translocation)。核糖体的转位需要延长因子EF-G(即转位酶),并需要GTP水解供能。转位的结果是:心P位上的tRNA所携带的氨基酸或肤在成肤后交给A位上的氨基酸,P位上卸载的tRNA转位后进入E位,然后从核糖体脱落;@成肤后位千A位的肤酰-tRNA移动到P位;@A位得以空出,且准确定位在mRNA的下一个密码子,以接受下一个氨酰-tRNA进位。 肤链延长过程的三步反应如图15-8所示。 经过第二轮进位—成肤一转位,P位出现三肤酰-tRNA,A位空留并对应于第四个氨酰-tRNA进位。重复此过程,则有四肤酰-tRNA、五肤酰-tRNA等陆续出现千核糖体P位,A位空留,接受下一个氨酰-tRNA进位。这样,核糖体从mRNA的5'-端向3'-端顺序阅读密码子,进位、成肤和转位三步反应吓已循环进行,每循环一次向肤链C端添加一个氨基酸残基,肤链由N-端向C-端逐渐延长。 进位 }成肤 转位 真核生物的肤链延长机制与原核生物基本相同,但亦有差异,如两者所需延长因子不同,真核生物需要eEFla、eEFl阳和eEF2这三类延长因子,其功能分别对应于原核生物的EF-Tu、EF-Ts和EFG。此外,在真核生物,一个新的氨酰-tRNA进入A位后会产生别构效应,致使空载tRNA从E位排出。 在肤链延长阶段,每生成一个肤键,都需要水解2分子GTP(进位与转位各1分子)获取能量,即消耗2个高能磷酸键。若出现不正确氨基酸进入肤链,也需要消耗能量来水解清除;此外,氨基酸活化为氨酰-tRNA时需消耗2个高能磷酸键。因此,在蛋白质合成过程中,每生成1个肤键,至少需消耗4个高能磷酸键。 三、终止密码子和释放因子导致肤链合成终止 肤链上每增加一个氨基酸残基,就需要经过一次进位、成肤和转位反应。如此往复,直到核糖体的A位与mRNA的终止密码子对应。 终止密码子不被任何氨酰-tRNA识别,只有释放因子RF能识别终止密码子而进入A位,这一识别过程需要水解GTP。RF的结合可触发核糖体构象改变,将肤酰转移酶转变为酷酶,水解P位上肤酰tRNA中肤链与tRNA之间的酷键,新生肤链随之释放,mRNA、tRNA及RF从核糖体脱离,核糖体大小亚基分离包。mRNA模板、各种蛋白质因子及其他组分都可被重新利用。 原核生物有3种RF。RFl特异识别UAA或UAG,RF2特异识别UAA或UGA,且两者均可诱导肤酰转移酶转变为酣酶。RF3具有GTPase活性,当新生肤链从核糖体释放后,促进RFl或RF2与核糖体分离。真核生物仅有一种释放因子eRF,3种终止密码子均可被其识别。 无论在原核细胞还是真核细胞内,1条mRNA模板链上都可附着10~100个核糖体。这些核糖体依次结合起始密码子并沿mRNA5'一3'方向移动,同时进行同一条肤链的合成。多个核糖体结合在1条mRNA链上所形成的聚合物称为多聚核糖体(polyribosome或polysome)。多聚核糖体的形成可以使肤链合成高速度、高效率进行(图15-9)。 原核生物的转录和翻译过程紧密偶联,转录未完成时已有核糖体结合于mRNA分子的5'-端开始翻译。真核生物的转录发生在细胞核,翻译在细胞质,因此这两个过程分隔进行。 296第三篇遗传信息的传递 大亚基 小亚基多肤链 第四节蛋白质合成后的加工和靶向输送 新生肤链并不具有生物活性,它们必须正确折叠形成具有生物活性的三维空间结构,有的还需形成二硫键,有的需通过亚基聚合形成具有四级结构的蛋白质。此外,许多蛋白质在翻译后还要经过水解作用切除一些肤段或氨基酸,或对某些氨基酸残基的侧链基团进行化学修饰等,才能成为有活性的成熟蛋白质。这一过程称为翻译后加工(post-translational processing)。 蛋白质合成后还需要被输送到合适的亚细胞部位才能行使各自的生物学功能。有的蛋白质驻留于细胞质,有的被运输到细胞器或镶嵌入细胞膜,还有的被分泌到细胞外。蛋白质合成后在细胞内被定向输送到其发挥作用部位的过程称为蛋白质靶向输送(protein targeting)或蛋白质分拣(protein sorting)。 一、新生脓链折叠需要分子伴侣 蛋白质在合成时,尚未折叠的肤段有许多疏水基团暴露在外,具有分子内或分子间聚集的倾向,使蛋白质不能形成正确空间构象。这种结构混乱的肤链聚集体产生过多会对细胞有致命的影响。实际上,细胞中大多数天然蛋白质折叠并不是自发完成的,其折叠过程需要其他酶或蛋白质的辅助,这些辅助性蛋白质可以指导新生肤链按特定方式正确折叠,它们被称为分子伴侣(molecular chaperone)。 原核生物和真核生物都存在多种类型的分子伴侣,目前研究得较为清楚的是热激蛋白70(heat shock protein70, Hsp70)家族和伴侣蛋白(chaperonin)。 Hsp70因其分子量接近70kD而得名,高温刺激可诱导其合成。在蛋白质翻译后加工过程中,Hsp70与未折叠蛋白质的疏水区结合,既可避免蛋白质因高温而变性,又可防止新生肤链过早折叠。Hsp70也可以使一些跨膜蛋白质在转位至膜前保持非折叠状态。有些Hsp70通过与多肤链结合、释放的循环过程,使多肤链发生正确折叠。这个过程需要ATP水解供能,并需要其他伴侣蛋白如Hsp40的共同作用。未折叠多肤链与Hsp70结合,还可以解开多肤链之间的聚集或防止新聚集的产生。多肤链从Hsp70释放后,可以重新折叠成天然构象。如果多肤链折叠不充分,上述过程可重复进行直至天然构象形成(图15-10)。 待折叠-未完全折叠天然构象`多肤链士或错误折叠多肤链开放的Hsp70-A吓复合物闭合的Hsp70-ADP复合物(低亲和力)(高亲和力) 人热激蛋白家族可存在于细胞质、内质网腔、线粒体、细胞核等部位,发挥多种细胞保护功能,如使线粒体和内质网蛋白质以未折叠状态转运和跨膜;避免蛋白质变性后因疏水基团暴露而发生不可逆聚集;清除变性或错误折叠的肤链中间物等。 有些肤链的正确折叠还需要伴侣蛋白发挥辅助作用。伴侣蛋白的主要作用是为非自发性折叠肤链提供正确折叠的微环境。例如,在大肠杆菌,约有10%~15%的细胞内蛋白质的正确折叠依赖伴侣系统GroEl/GroES,热激条件下依赖该系统的蛋白质则高达30%。在真核细胞,与GroEl/GroES功能类似的伴侣蛋白是Hsp60。 GroEL是由14个相同亚基组成的多聚体,可形成一桶状空腔,顶部是空腔的出口。GroES是由7个相同亚基组成的圆顶状复合物,可作为GroEL桶的盖子。需要折叠的肤链进入GroEL的桶状空腔后,GroES可作为盖子瞬时封闭GroEL出口。封闭后的桶状空腔为肤链折叠提供微环境,折叠过程需消耗大量ATP。折叠完成后,形成天然构象的多肤链被释放,尚未完全折叠的肤链可进入下一轮循环,重复以上过程,直至天然构象形成(图15-11)。 除了需要分子伴侣协助肤链折叠外,一些蛋白质形成正确空间构象还需要异构酶(isomerase)的参与。已发现两种异构酶可以帮助细胞内新生肤链折叠为功能蛋白质,一种是蛋白质二硫键异构酶(protein disulfide isomerase, PDI),另一种是肤脯氨酰基顺-反异构酶(peptide prolyl cis-trans isomerase, PPI)。前者帮助肤链内或肤链间二硫键的正确形成,后者可使肤链在各脯氨酸残基弯折处形成正确折叠。这些都是蛋白质形成正确空间构象和发挥功能的必要条件。 298第三篇遗传信息的传递 完成折叠的多肤链 未折叠多肤链进入 7Pi7ADP, ES GroEL7ATP, ES 丿工 气产 折叠 1未完全折叠的多肮链职尥趴GroEUGroES 二、肤链水解加工产生具有活性的蛋白质或多肤 新生肤链的水解是肤链加工的重要形式。新生肤链N-端的甲硫氨酸残基,在肤链离开核糖体后,大部分即由特异的蛋白水解酶切除。原核细胞中约半数成熟蛋白质的N-端经脱甲酰基酶切除N-甲酰基而保留甲硫氨酸,另一部分被氨基肤酶水解而去除N-甲酰甲硫氨酸。真核细胞分泌蛋白质和跨膜蛋白质的前体分子的N-端都含有信号肤(signal peptide)序列,由13~36个氨基酸残基组成,在蛋白质成熟过程中需要被切除。有些情况下,C-端的氨基酸残基也需要被酶切除,从而使蛋白质呈现特定功能。 另外,还有许多蛋白质在初合成时是分子量较大的没有活性的前体分子,如胰岛素原、胰蛋白酶原等。这些前体分子也需经过水解作用切除部分肤段,才能成为有活性的蛋白质分子或功能肤。 有些多肤链经水解可以产生数种小分子活性肤。如阿黑皮素原(pro-opiomelanocortin,POMC)可被水解而生成促肾上腺皮质激素、B-促脂解素、a-激素、促皮质素样中叶肤、丫-促脂解素、B-内啡肤、B促黑激素、丫-内啡肤及a-内啡肤等9种活性物质(图15-12)。 信号肤 ACTH。-促脂解素(42-134) 二仁 a.-MSH CLIP丫-促脂解素o-内啡肤(1-13)(18-39)(42-101)(104-134)~-MSH丫-内啡肤(84-101)(104-118)图15-12POMC的水解修饰POMC的水解位点由Arg-Lys、Lys-Arg或Lys-Lys序列构成,用数字l~7表示。各活性物质下方括号内的数字为其在POMC中对应的氨基酸编号(将ACTH的N端第一位氨基酸残基编为1号) 三、氨基酸残基的化学修饰改变蛋白质的活性 直接参与肤链合成的氨基酸约有20种,合成后某些氨基酸残基的侧链基团发生化学修饰,这样就显著增加了肤链中的氨基酸种类。巳发现蛋白质中存在100多种修饰性氨基酸。这些修饰可改变蛋白质的溶解度、稳定性、亚细胞定位以及与细胞中其他蛋白质的相互作用等,从而使蛋白质的功能具有多样性。体内常见的蛋白质化学修饰见表15-4。 化学修饰类型被修饰的氨基酸残基 磷酸化丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸N-糖基化天冬酰胺0-糖基化丝氨酸、苏氨酸胫基化脯氨酸、赖氨酸甲基化赖氨酸、精氨酸、组氨酸、天冬酰胺、天冬氨酸、谷氨酸乙酰化赖氨酸、丝氨酸硒化半胱氨酸上述化学修饰均为酶促反应,蛋白激酶、糖基转移酶、轻化酶、甲基转移酶等都在这一过程中发挥重要作用。 四、亚基聚合形成具有四级结构的活性蛋白质 在生物体内,许多具有特定功能的蛋白质由2条以上肤链构成,各肤链之间通过非共价键或二硫键维持一定空间构象,有些还需与辅基聚合才能形成具有活性的蛋白质。由2条以上肤链构成的蛋白质,其亚基相互聚合时所需要的信息蕴藏在肤链的氨基酸序列之中,而且这种聚合过程往往又有一定顺序,前一步骤的聚合往往促进后一步骤的进行。例如,成人血红蛋白由2条a链、2条B链及4个血红素分子组成。a链合成后从核糖体自行脱离,与尚未从核糖体释放的B链相结合,将B链带离核糖体,形成游离的叩二聚体。此二聚体再与线粒体内生成的两个血红素相结合,最后才形成一个由4条肤链(气队)和4个血红素构成的有功能的血红蛋白分子。 五、蛋白质合成后被靶向输送至细胞特定部位 蛋白质在细胞质合成后,还必须被靶向输送至其发挥功能的亚细胞区域,或分泌到细胞外。所有需靶向输送的蛋白质,其一级结构都存在分拣信号,可引导蛋白质转移到细胞的特定部位。这类分拣信号又称信号序列(signal sequence),是决定蛋白质靶向输送特性的最重要结构。有的信号序列存在于肤链的N-端,有的在C-端,有的在肤链内部;有的输送完成后切除,有的保留。现代生物信息学技术可通过基因的结构推测其编码蛋白质在细胞内的可能定位(表15-5)。 蛋白质种类信号序列结构特点分泌蛋白质和膜蛋白质信号肤由13~36个氨基酸残基组成,位于新生肤链N-端核蛋白质核定位序列由4~8个氨基酸残基组成,通常包含连续的碱性氨基酸(Arg或Lys),在肤链的位置不固定内质网蛋白质内质网滞留信号肤链C-端的Lys-Asp-Glu-Leu序列核基因组编码的线粒体线粒体前导肤由20~35个氨基酸残基组成,位于新生肤链N-端蛋白质溶酶体蛋白质溶酶体靶向信号甘露糖-6-磷酸(Man-6-P)有的蛋白质在合成过程中已开始靶向输送,而另有一些蛋白质的靶向输送是从核糖体上释放后才开始的。 (一)分泌蛋白质在内质网加工及靶向输送 细胞内分泌蛋白质的合成与靶向输送同时发生,其N-端存在由数十个氨基酸残基组成的信号序列,又称信号肤(signal peptide)。已发现有数百种信号肤存在,它们的共同特点是:(DN-端含一个或多个碱性氨基酸残基;@中段含l0~l5个疏水性氨基酸残基;@C-端由一些极性较大、侧链较短的氨基酸残基组成,与信号肤裂解位点(cleavage site)邻近(图15-13)。 信号肤酶裂解位点人前胰岛素原MetAlaLeuTrpMet匹扣u I.euPro~Gly Pro AspPro AJaAJaAlaPheVal-牛生长激素Met Met Ala Ala GlyPro匹袒虹Se寸1.eu压压AlaPheAla1.euleuc评leu压加IThr Gin Val Val Gly'Ala Phe-分泌蛋白质的合成及转运机制为:CD在游离核糖体上,信号肤因位于肤链N-端而首先被合成,随后被信号识别颗粒(signal recognition particle, SRP)识别并结合,SRP随即结合到核糖体上;@内质网膜上有SRP的受体(亦称为SRP对接蛋白),借此受体,SRP-核糖体复合物被引导至内质网膜上;@在内质网膜上,肤转位复合物(peptide translocation complex)形成跨内质网膜的蛋白质通道,合成中的肤链穿过内质网膜孔进入内质网;@SRP脱离信号肤和核糖体,肤链继续延长直至完成;@信号肤在内质网内被信号肤酶(signal peptidase)切除;@肤链在内质网中折叠形成最终构象,随内质网膜”出芽"形成的襄泡转移至高尔基复合体,最后在高尔基复合体中被包装进分泌小泡,转运至细胞膜,再分泌到细胞外(图15-14)。 延伸的多肤细胞质 SRP受体 内质网膜 信号肤酶内质网腔 气蛋白`` (二)内质网蛋白质的C-端含有滞留信号序列内质网中含有多种帮助新生肤链折叠成天然构型的蛋白质,如分子伴侣等。这些需要停留在内质网中执行功能的蛋白质,先经粗面内质网上附着的核糖体合成并进入内质网腔,然后随禄泡输送至高尔基复合体。内质网蛋白肤链的C-端含有内质网滞留信号序列,它们被输送到高尔基复合体后,可通过这一滞留信号与内质网上相应受体结合,随痰泡输送回内质网。 (三)大部分线粒体蛋白质在细胞质合成后靶向输入线粒体线粒体虽然自身含有DNA、mRNA、tRNA和核糖体等,可以进行蛋白质的合成,但绝大部分线粒体蛋白质(超过95%,约1100种)是由细胞核基因组的基因编码,它们在细胞质中的游离核糖体中合成后靶向输送到线粒体,其中大部分定位于线粒体基质,其他定位于内膜、外膜或膜间腔。 定位于线粒体基质的蛋白质,其前体分子的N-端包含前导肤序列,由20~35个氨基酸残基组成,富含丝氨酸、苏氨酸及碱性氨基酸。这类蛋白质的靶向输送过程是:心新合成的线粒体蛋白质与热激蛋白或线粒体输入刺激因子结合,以稳定的未折叠形式转运至线粒体外膜;@通过前导肤序列识别,与线粒体外膜的受体复合物结合;@在热激蛋白水解ATP和跨内膜电化学梯度的动力共同作用下,蛋白质穿过由外膜转运体和内膜转运体共同构成的跨膜蛋白质通道,进入线粒体基质;@蛋白质前体被蛋白酶切除前导肤序列,在分子伴侣作用下折叠成有功能构象的蛋白质。 输送到线粒体内膜和膜间隙的蛋白质除了上述前导肤外,还另有一段信号序列,其作用是引导蛋白质从基质输送到线粒体内膜或穿过内膜进入膜间隙。 (四)质膜蛋白质由襄泡靶向输送至细胞膜 定位于细胞质膜的蛋白质,其靶向跨膜机制与分泌蛋白质相似。不过,跨膜蛋白质的肤链并不完全进入内质网腔,而是描定在内质网膜上,通过内质网膜”出芽”方式形成襄泡。随后,跨膜蛋白质随翍泡转移至高尔基复合体进行加工,再随痰泡转运至细胞膜,最终与细胞膜融合而构成新的质膜。 不同类型的跨膜蛋白质以不同形式铀定于膜上。例如,单次跨膜蛋白质的肤链中除N-端含信号序列外,还有一段由疏水性氨基酸残基构成的跨膜序列,即停止转移序列(stop transfer sequence),是跨膜蛋白质在膜上的嵌入区域。当合成中的多肤链向内质网腔导入时,疏水的停止转移序列可与内质网膜的脂双层结合,从而使导入中的肤链不再向内质网腔内转移,形成一次性跨膜的描定蛋白质。多次跨膜蛋白质的肤链中因有多个信号序列和多个停止转移序列,可在内质网膜上形成多次跨膜。 (五)核蛋白质由核输入因子运载经核孔入核 细胞核内含有多种蛋白质,如参与DNA复制和转录的各种酶及蛋白质因子、组蛋白、调节基因表达的转录因子等,它们都是在细胞质中合成后经核孔进入细胞核的,其靶向输送由特异的核定位序列(nuclear localization sequence, NLS)引导。NLS由4~8个氨基酸残基组成,通常包含连续的碱性氨基酸(Arg或Lys),在肤链的位置不固定,定位完成后保留于肤链而不被切除。 核蛋白质的靶向输送还需要多种蛋白质的参与,如核输入因子(nuclear importin)a和B、Ras相关核蛋白质(Ras-related nuclear protein, Ran)等。核输入因子a和B形成异二聚体,识别并结合核蛋白质的NLS序列。核蛋白质的靶向输送基本过程是:心在细胞质合成的核蛋白质与核输入因子结合形成复合物后被导向核孔;@具有GTPase活性的Ran蛋白水解GTP释能,核蛋白质-核输入因子复合物通过耗能机制经核孔进入细胞核基质;@核输入因子B和a先后从上述复合物中解离,移出核孔后可被再利用,核蛋白质定位于细胞核内(图15-15)。 生物体内的蛋白质历经肤链合成的起始、延长、终止,以及加工和靶向输送后发挥生物学功能。其后,蛋白质在特定的时空条件下被降解。蛋白质的生物合成及其降解是几乎所有生命活动的基础。 302第三篇遗传信息的传递 核输入因子`$白质 细胞质 核膜 二复勹十.又勹P+P1 核基质 芦用二\尸 第五节蛋白质合成的干扰和抑制 蛋白质生物合成是许多药物和毒素的作用靶点。这些药物或毒素通过阻断原核或真核生物蛋白质合成体系中某组分的功能,来干扰和抑制蛋白质合成过程。真核生物与原核生物的翻译过程既相似又有差别,这些差别在临床医学中有重要应用价值。如抗生素能杀灭细菌但对真核细胞无明显影响,因此原核生物蛋白质合成所必需的关键组分可作为研发抗菌药物的靶点。此外,蛋白质合成的每一步反应几乎都可被特定的抗生素所抑制,这些抗生素可被用于蛋白质合成机制的研究。某些毒素作用于基因信息传递过程,对毒素作用机制的研究,不仅有助于理解其致病机制,还可从中探索研发新药的途径。 一、许多抗生素通过抑制蛋白质合成发挥作用 某些抗生素(an tibioti c)可抑制细胞的蛋白质合成,仅仅作用千原核细胞蛋白质合成的抗生素可作为抗菌药,抑制细菌生长和繁殖,预防和治疗感染性疾病。作用千真核细胞蛋白质合成的抗生素可以作为抗肿瘤药。(一)抑制脓链合成起始的抗生素伊短菌素(e deine)和密旋霉素(pactamyci n)可引起mRNA在核糖体上错位,从而阻碍翻译起始复合物的形成,对原核生物和真核生物的蛋白质合成均有抑制作用。伊短菌素还可以影响起始氨酰tRNA的就位和IF3的功能。晚霉素(everninomicin)结合千原核23S rRNA,阻止fMet-tRNA仆1c1的转位。(二)抑制肤链延长的抗生素1干扰进位的抗生素四环素(tetracycline)特异性结合30S亚基的A位,从而抑制氨酰-tRNA的进位。粉霉素(pulvomycin)可降低EF-Tu的GTP酶活性,从而抑制EF-Tu与氨酰-tRNA结合;黄色霞素(kirromycin)可阻止EF-Tu从核糖体释出。 2.引起读码错误的抗生素氨基糖背类抗生素能与30S亚基结合,影响翻译的准确性。例如,链霉素(streptomycin)与30S亚基结合,在较低浓度时引起读码错误(在高浓度时是抑制蛋白质合成的起始);潮霉素B(hygromycin B)和新霉素(neomycin)能与16S rRNA及rpS12结合,千扰30S亚基的解码部位,引起读码错误。这些抗生素均能使延长中的肤链引入错误的氨基酸残基,从而改变细菌蛋白质合成的忠实性。3影响成肤的抗生素氯霉素(chloramphenicol)可结合核糖体亚基,通过阻止肤酰转移而sos常见抗生素的作用位点、作用原理及应用总结于表15-6。应用抗生素作用位点作用原理伊短菌素阻碍翻译起始复合物的形成抗病毒药原核、真核核糖体的小亚基四环素抗菌药抑制氨酰-tRNA与小亚基结合原核核糖体的小亚基链霉素、新霉素、巴龙霉素原核核糖体的小亚基引起读码错误抑制起始抗菌药;氯霉素、林可霉素、红霉素原核核糖体的大亚基抑制肤酰转移酶,阻断肤链延长抗菌药放线菌酮真核核糖体的大亚基抑制肤酰转移酶,阻断肤链延长医学研究噤呤霉素使肤酰基转移到它的氨基上,肤抗肿瘤药原核、真核核糖体夫西地酸、微球菌素原核延长因子EFG阻止转位抗菌药-大观霉素原核核糖体的小亚基阻止转位抗菌药二、某些毒素抑制真核生物的蛋白质合成。比十了。 抑制肤键形成;林可霉素(lincomycin)作用于A位和P位,阻止tRNA在这两个位置就位而抑制肤键形成;大环内酷类抗生素如红霉素(e1-ythromycin)能与核糖体so s亚基中肤链排出通道结合,阻止新生肤链从核糖体大亚基中排出,从而阻止肤键的进一步形成;嗦呤霉素(puromycin)的结构与酪氨酰tRNA相似,在翻译中可取代酪氨酰-tRNA而进入核糖体A位,中断肤链合成;放线菌酮(cycloheximide)特异性抑制真核生物核糖体肤酰转移酶的活性。 4.影响转位的抗生素夫西地酸(£us心c acid汃硫链丝菌肤(thiostrepton)和微球菌素(micrococcin)抑制EF-G的转位酶活性,从而阻止核糖体转位。大观霉素(spectinomycin)结合核糖体30S亚基,阻碍小亚基变构,抑制转位反应。 链脱落 某些毒素可通过干扰真核生物的蛋白质合成而呈 现毒性。白喉毒素(diphtheria toxin)是真核细胞蛋白 质合成的抑制剂,它作为一种修饰酶,可使eEF2发生ADP核糖基化修饰,生成eEF2腺昔二磷酸核糖衍生物,使eEF2失活,从而抑制蛋白质的合成(图15-16)。AD。 苠麻毒蛋白(ricin)是栳麻籽中所含的植物糖蛋FN H(有活性)`白,由A、B两条肤链组成,两条肤链之间由一个二硫+A白喉毒素键连接。A链是一种蛋白酶,可作用于真核生物核糖体大亚基的28S rRNA,特异催化其中一个腺昔酸发. 生脱嗦呤反应,导致28S rRNA降解而使核糖体大亚 基失活。B链对A链发挥毒性起重要的促进作用,另外B链上的半乳糖结合位点也是能麻毒蛋白发挥毒性作用的活性部位。 白喉毒素的作用原理 304第三篇遗传信息的传递 蛋白质是生命活动的重要物质基础。蛋白质具有高度的种属特异性,所以各种生物的蛋白质必须由机体自身合成。蛋白质合成体系包括原朴氨基酸,模板mRNA、氨基酸搬运工具tRNA、蛋白质合成场所核糖体,以及合成各阶段所需的酶和蛋白质因子等,合成过程还需要ATP或GTP供能。 mRNA是蛋白质合成的模板。mRNA可读框中每3个相邻核芬酸编码一种氨基酸,称为密码子。密码子共有64个,其中61个编码各种氨基酸,3个作为肤链合成的终止密码子。密码子具有方向性、连续性、简并性、摆动性和通用性等特点。tRNA是氨基酸和密码子之间的特异衔接子。tRNA与特异氨基酸的连接由氨酰-tRNA合成酶催化,tRNA通过反密码子与mRNA的密码子识别,为肤链合成提供氨基酸原料。核糖体由大、小亚基组成,具有A住、P位和E位三个功能部位,是蛋白质合成的场所。 蛋白质合成过程包括起始、延长和终止三个阶段。肤链合成的起始是在各种起始因子的协助下,mRNA、起始氨酰-tRNA分别与核糖体结合,装配成翻译起始复合物的过程。肤链的延长是在核糖体上重复进行的进位、成肤和转位的循环过程,每循环1次,肤链上即可增加1个氨基酸残基。肤链的延长过程需要数种延长因子以及GTP等参与。当核糖体的A位对应于mRNA的终止密码子时,释放因子RF进入A位,致使肤酰转移酶转变为酣酶,水解肤链与tRNA间的酣键,新生肤链释放,核糖体大小亚基分离,肤链合成终止。 原核生物和真核生物的肤链合成过程基本相似,只是真核生物的反应更为复杂、涉及的蛋白质因子更多。原核生物和真核生物均以多聚核糖体形式进行肤链的高效合成。原核生物的转录和翻译过程紧密偶联。真核生物的转录发生在细胞核,翻译在细胞质,因此这两个过程分隔进行。 新生肤链并不具有生物活性,需要经过复杂的翻译后加工,才能成为有活性的成熟蛋白质。翻译后加工包括在分子伴侣帮助下的肤链折叠、肤链末端及内部的水解、肤链中氨基酸残基的化学修饰、亚基聚合等方式。蛋白质在细胞质合成后,还需要被靶向输送至其发挥功能的亚细胞区域,或分泌到细胞外。所有需靶向输送的蛋白质,其一级结构都存在分拣信号。 蛋白质生物合成是许多药物和毒素的作用靶点。这些药物或毒素通过阻断原核或真核生物蛋白质合成体系中某组分的功能,来干扰和抑制蛋白质合成过程。真核生物与原核生物的翻译过程既相似又有差别,这些差别在临床医学中有重要应用价值。 -------------------------------------------一一一一一一一一一一一一一一一一一一一一一-----------------------------------------------------------------------------------1.蛋白质合成过程中有哪些机制保证多肤链翻译的准确性?2.对蛋白质合成机制的研究有何重要意义? 3.真核生物与原核生物的翻译过程既相似又有差别,这些差别在临床医学中有何重要应用价值? (倪菊华) 第十六章基因表达调控 20世纪50年代末,生物学家们揭示了遗传信息从DNA传递到蛋白质的规律一中心法则。此后,科学家们一直在探索究竟何种机制调控着遗传信息的传递。1961年,Jacob F和Monod JL提出了著名的操纵子学说,开创了基因表达调控研究的新纪元。 基因表达调控的研究使得人们了解到多细胞生物是如何从一个受精卵及所具有的一套遗传基因组,最终形成具有不同形态和功能的多组织、多器官的个体;也使得人们初步知晓,为何同一个体中不同的组织细胞拥有基本相同的遗传信息,却可以产生各自专一的蛋白质产物,因而具有完全不同的生物学功能。因此,了解基因表达调控是认识生命体和疾病不可或缺的重要内容。 第一节基因表达调控的基本概念与特点 原核生物体系和真核生物体系在基因组结构以及细胞结构上的差异使得它们的基因表达方式有所不同。原核细胞没有细胞核,遗传信息的转录和翻译发生在同一空间,并以偶联的方式进行。真核细胞具有细胞核,使得转录和翻译不仅具有空间分布的特征,而且还有时间特异性。尽管如此,原核生物体系和真核生物体系的基因表达调控遵循一些共同的基本规律。 —、基因表达产生有功能的蛋白质和RNA 基因表达(gene expression)就是基因转录及翻译的过程,也是基因所携带的遗传信息表现为表型的过程,包括基因转录成互补的RNA序列,对于蛋白质编码基因,mRNA继而翻译成多肤链,并装配加工成最终的蛋白质产物。在一定调节机制控制下,基因表达通常经历转录和翻译过程,产生具有特异生物学功能的蛋白质分子,赋予细胞或个体一定的功能或形态表型。但并非所有基因表达过程都产生蛋白质。rRNA、tRNA编码基因转录产生RNA的过程也属于基因表达。 不同生物的基因组含有不同数量的基因。细菌的基因组一般约含4000个基因;多细胞生物的基因达数万个,人类基因组含约2万个蛋白质编码基因(见第十一章)。在某一特定时期或生长阶段,基因组中只有小部分基因处千表达状态。例如,大肠杆菌通常只有约5%的基因处于高水平转录活性状态,其余大多数基因不表达或表达水平极低,即生成很少的RNA或蛋白质。基因表达水平的高低不是固定不变的。例如,平时与细菌蛋白质生物合成有关的延长因子编码基因表达十分活跃,而参与DNA损伤修复有关的酶分子编码基因却极少表达;当有紫外线照射引起DNA损伤时,这些修复酶编码基因的表达就变得异常活跃。可见,生物体中具有某种功能的基因产物在细胞中的数量会随时间、环境而变化。 二、基因表达具有时间特异性和空间特异性 所有生物的基因表达都具有严格的规律性,即表现为时间特异性和空间特异性。生物物种愈高级基因表达规律愈复杂愈精细,这是生物进化的需要。基因表达的时间、空间特异性由特异的基因启动子(序列)和(或)调节序列与调节蛋白相互作用决定。 (一)时间特异性是指基因表达按一定的时间顺序发生按功能需要,某一特定基因的表达严格按一定的时间顺序发生,这就是基因表达的时间特异性306第三篇遗传信息的传递(tempora l specificity)。如噬菌体病毒或细菌侵入宿主后,呈现一定的感染阶段。随感染阶段发展、生长环境变化,这些病原体以及宿主的基因表达都有可能发生改变。有些基因开启,有些基因关闭。例如,霍乱弧菌在感染宿主后,44种基因的表达上调,193种基因的表达受到抑制,而相伴随的是这些细菌呈现出高传染状态。编码甲胎蛋白(a-fetoprotein, a-AFP)的基因在胎儿肝细胞中活跃表达,因此合成大量的甲胎蛋白;在成年后这一基因的表达水平很低,故几乎检测不到AFP。但是,当肝细胞发生转化形成肝癌细胞时,编码AFP的基因又重新被激活,大量的AFP被合成。因此,血浆中AFP的水平可以作为肝癌早期诊断的一个重要指标。 多细胞生物从受精卵发育成为一个成熟个体,经历很多不同的发育阶段。在每个不同的发育阶段,都会有不同的基因严格按照自己特定的时间顺序开启或关闭,表现为与分化、发育阶段一致的时间性。因此多细胞生物基因表达的时间特异性又称阶段特异性(stage specificity)。 (二)空间特异性是指多细胞生物个体在特定生长发育阶段,同—基因在不同的组织器官表达不同在多细胞生物个体某一发育、生长阶段,同一基因产物在不同的组织器官表达水平也可能不同。在个体生长、发育过程中,一种基因产物在个体的不同组织或器官表达,即在个体的不同空间出现,这就是基因表达的空间特异性(spatial specifici ty)。如编码胰岛素的基因只在胰岛的B细胞中表达,从而指导生成胰岛素;编码胰蛋白酶的基因在胰岛细胞中几乎不表达,而在胰腺腺泡细胞中有高水平的表达。基因表达伴随时间或阶段顺序所表现出的这种空间分布差异,实际上是由细胞在器官的分布所决定的,因此基因表达的空间特异性又称细胞特异性(cell specificity)或组织特异性(tissue specificity)。 同一个体内不同器官、组织、细胞的差异性的基础是特异的基因表达或称为差异基因表达(differential gene expression)。细胞的基因表达谱(gene expression profi le),即基因表达的种类和强度决定了细胞的分化状态和功能。换言之,在个体内决定细胞类型的不是基因本身,而是基因表达模式(gene expression pattern)。 三、基因表达的方式存在多样性 不同种类的生物遗传背景不同,同种生物不同个体生活环境不完全相同,不同的基因功能和性质也不相同。因此,不同的基因对生物体内、外环境信号刺激的反应性不同。有些基因在生命全过程中持续表达,有些基因的表达则受环境影响。基因表达调控(regulation of gene expression)就是指细胞或生物体在接受内、外环境信号刺激时或适应环境变化的过程中在基因表达水平上作出应答的分子机制,即位于基因组内的基因如何被表达成为有功能的蛋白质(或RNA),在什么组织表达,什么时候表达,表达多少等。按照对刺激的反应性,基因表达的方式或调节类型存在很大差异。 (一)有些基因几乎在所有细胞中持续表达 有些基因产物对生命全过程都是必需的或必不可少的。这类基因在一个生物个体的几乎所有细胞中待续表达,不易受环境条件的影响,或称基本表达。这些基因通常被称为管家基因(housekeeping gene)。例如,三狻酸循环是一中枢性代谢途径,催化该途径各阶段反应的酶的编码基因就属这类基因。管家基因的表达水平受环境因素影响较小,而是在生物体各个生长阶段的大多数或几乎全部组织中持续表达,或变化很小。我们将这类基因表达称为基本(或组成性)基因表达(constitutive gene expression)。基本基因表达只受启动子和RNA聚合酶等因素的影响,而基本不受其他机制调节。但实际上,基本基因表达水平并非绝对“一成不变”,所谓“不变”是相对的。 (二)有些基因的表达受到环境变化的诱导和阻遏与管家基因不同,另有一些基因表达很容易受环境变化的影响。随外环境信号变化,这类基因的表达水平可以出现升高或降低的现象。在特定环境信号剌激下,相应的基因被激活,基因表达产物增加,即这种基因表达是可诱导的。可诱导基因(inducible gene)在一定的环境中表达增强的过程称为诱导(induction)。例如,在有DNA损伤时,修复酶基因就会在细菌体内被激活,导致修复酶反应性地增加。 相反,如果基因对环境信号应答时被抑制,这种基因称为可阻遏基因(repressible gene)。可阻遏基因表达产物水平降低的过程称为阻遏(repression)。例如,当培养基中色氨酸供应充分时,细菌体内与色氨酸合成有关的酶编码基因表达就会被抑制。这类基因的调控序列通常含有针对特异刺激的反应元件。 诱导和阻遏是同一事物的两种表现形式,在生物界普遍存在,也是生物体适应环境的基本途径。乳糖操纵子机制是认识诱导和阻遏表达的经典模型(见本章第二节)。 (三)生物体内不同基因的表达受到协调调节 在生物体内,一个代谢途径通常是由一系列化学反应组成,需要多种酶参与;此外,还需要很多其他蛋白质参与作用物在细胞内、外区间的转运。这些酶及转运蛋白等的编码基因被统一调节,使参与同一代谢途径的所有蛋白质(包括酶)分子比例适当,以确保代谢途径有条不紊地进行。在一定机制控制下,功能上相关的一组基因,无论其为何种表达方式,均需协调一致、共同表达,即为协同表达(coordinate expression)。这种调节称为协同调节(coordinate regulation)。基因的协调表达体现在生物体的生长发育全过程。 生物体通过协调调节不同基因的表达以适应环境、维持生长和增殖。生物体所处的内、外环境是在不断变化的。所有生物的所有活细胞都必须对内、外环境的变化作出适当反应,以使生物体能更好地适应变化着的环境状态。生物体这种适应环境的能力总是与某种或某些蛋白质分子的功能有关。细胞内某种功能蛋白质分子的有或无、多或少的变化则由编码这些蛋白质分子的基因表达与否、表达水平高低等状况决定。通过一定的程序调控基因的表达,可使生物体表达出合适的蛋白质分子,以便更好地适应环境,维持其生长。 原核生物、单细胞生物调节基因的表达就是为适应环境、维持生长和细胞分裂。例如,当葡萄糖供应充足时,细菌中与葡萄糖代谢有关的酶编码基因表达增强,其他糖类代谢有关的酶基因关闭;当葡萄糖耗尽而有乳糖存在时,与乳糖代谢有关的酶编码基因则表达,此时细菌可利用乳糖作为碳源,维持生长和增殖。高等生物也普遍存在适应性表达方式。经常饮酒者体内醇氧化酶活性较高即与相应基因表达水平升高有关。 在多细胞生物,基因表达调控的意义还在于维待细胞分化与个体发育。在多细胞个体生长、发育的不同阶段,细胞中的蛋白质分子种类和含量变化很大;即使在同一生长发育阶段,不同组织器官内蛋白质分子分布也存在很大差异,这些差异是调节细胞表型的关键。例如,果蝇幼虫(蛹)最早期只有一组“母本效应基因(maternal effect gene)”表达,使受精卵发生头尾轴和背腹轴固定,以后有三组“分节基因“顺序表达,控制蛹的“分节”发育过程,最后这些“节”分别发育为成虫的头、胸、翅膀、肢体、腹及尾等。高等哺乳类动物的细胞分化,各种组织、器官的发育都是由一些特定基因控制的。当某种基因缺陷或表达异常时,则会出现相应组织或器官的发育异常。 四、基因表达受调控序列和调节分子共同调节 一个生物体的基因组中既有携带遗传信息的基因编码序列,也有能够影响基因表达的调控序列(regulatory sequence)。一般说来,调控序列与被调控的编码序列位千同一条DNA链上,也被称为顺式作用元件(cis-acting element)或顺式调节元件(cis-regulator element, CRE)。还有一些调控基因远离被调控的编码序列,实际上是其他分子的编码基因,只能通过其表达产物来发挥作用。这类调控基因产物称为调节蛋白(regulatory protein)。调节蛋白不仅能对处于同一条DNA链上的结构基因的表达进行调控,而且还能对不在一条DNA链上的结构基因的表达起到同样的作用。因此,这些蛋白质分子又被称为反式作用因子(trans-acting factor)。这些反式作用因子以特定的方式识别和结合在顺式作用元件上,实施精确的基因表达调控。还有一类调控基因的产物为调节RNA,这些RNA分子以不同的作用方式对基因表达进行精细调节。 第三篇遗传信息的传递 作为反式作用因子的调节蛋白具有特定的空间结构,通过特异性地识别某些DNA序列与顺式作用元件发生相互作用。例如,DNA双螺旋结构的大沟是调节蛋白最容易与DNA序列发生相互作用的部位。真核生物基因组结构比较复杂,使得有些调节蛋白不能直接与DNA相互作用,而是首先形成蛋白质-蛋白质的复合物,然后再与DNA结合参与基因表达的调控。蛋白质-DNA以及蛋白质-蛋白质的相互作用是基因表达调控的分子基础。 五、基因表达调控呈现多层次和复杂性 无论是原核生物还是真核生物,基因表达调控体现在基因表达的全过程中,即在RNA转录合成和蛋白质翻译两个阶段都有控制其表达的机制。因此基因表达的调控是多层次的复杂过程,改变其中任何环节均会导致基因表达的变化(动画16-1“基因表达多层次调控”)。 首先,遗传信息以基因的形式贮存于DNA分子中,基因拷贝数越多,其表达产物也会越多,因此基因组DNA的部分扩增(amplification)可影响基因表达。在多细胞生物,某一特定类型细胞的选择性扩增可能就是通过这种机制使某种或某些蛋白质分子高表达的结果。为适应某种特定需要而进行的DNA重排(DNA rearrangement),以及DNA甲基化(DNA methylation)等均可在遗传信息水平上影响基因表达。 其次,遗传信息经转录由DNA传递给RNA的过程,是基因表达调控最重要、最复杂的一个层次。在真核细胞,初始转录产物需经转录后加工修饰才能成为有功能的成熟RNA,并由细胞核转运至细胞质,对这些转录后加工修饰以及转运过程的控制也是调节某些基因表达的重要方式,例如:对mRNA的选择性剪接、RNA编辑等。近年来,以miRNA为代表的非编码RNA对基因表达调控的作用也日益受到重视,使我们可以在一个新的层面上理解基因表达调控。 蛋白质生物合成即翻译是基因表达的最后一步,影响蛋白质合成的因素同样也能调节基因表达。并且,翻译与翻译后加工可直接、快速地改变蛋白质的结构与功能,因而对此过程的调控是细胞对外环境变化或某些特异刺激应答时的快速反应机制。总之,在遗传信息传递的各个水平上均可进行基因表达调控。 尽管基因表达调控可发生在遗传信息传递过程的任何环节,但发生在转录水平,尤其是转录起始水平的调节,对基因表达起着至关重要的作用,即转录起始是基因表达的基本控制点。 第二节原核基因表达调控 原核生物基因组是具有超螺旋结构的闭合环状DNA分子,在结构上有以下特点:O基因组中很少有重复序列;@编码蛋白质的结构基因为连续编码,且多为单拷贝基因,但编码rRNA的基因仍然是多拷贝基因;@结构基因在基因组中所占的比例(约占50%)远远大千真核基因组;@许多结构基因在基因组中以操纵子为单位排列。此外,原核生物的细胞结构也比较简单,其基因组的转录和翻译可以在同一空间内完成,并且时间上的差异不大。在转录过程终止之前mRNA就已经结合在核糖体上,开始了蛋白质的生物合成。 —、操纵子是原核基因转录调控的基本单位 前已述及,大肠杆菌的RNA聚合酶由G亚基(或称6因子)和核心酶构成,其中u亚基的作用是识别和结合在DNA模板上的启动序列,启动转录过程。原核生物在转录水平的调控主要取决千转录起始速度,即主要调节的是转录起始复合物形成的速度。 原核生物大多数基因表达调控是通过操纵子机制实现的。操纵子由结构基因、调控序列和调节基因组成包。结构基因通常包括数个功能上有关联的基因,它们串联排列,共同构成编码区。这些结构基因共用一个启动子和一个转录终止信号序列,因此转录合成时仅产生一条mRNA长链,为几种不同的蛋白质编码。这样的mRNA分子携带了几条多肤链的编码信息,被称为多顺反子(polycistron)mRNA。 调控序列主要包括启动子和操纵元件(operator)。启动子是RNA聚合酶结合的部位,是决定基因表达效率的关键元件。各种原核基因启动序列特定区域内,通常在转录起始点上游-10及-35区域存在一些相似序列(见第十四章),称为共有序列。E. coli及一些细菌启动序列的共有序列在-10区域是TATAAT,又称Pribnow盒,在-35区域为TTGACA(图16-1)。这些共有序列中的任一碱基突变或变异都会影响RNA聚合酶与启动子的结合及转录起始。因此,共有序列决定启动子的转录活性大小。操纵元件并非结构基因,而是一段能被特异的阻遏蛋白识别和结合的DNA序列。操纵序列与启动序列毗邻或接近,其DNA序列常与启动子交错、重叠,它是原核阻遏蛋白(repressor)的结合位点。当操纵序列结合有阻遏蛋白时会阻碍RNA聚合酶与启动子的结合,或使RNA聚合酶不能沿DNA向前移动,阻遏转录,介导负性调节。原核操纵子调控序列中还有一种特异的DNA序列可结合激活蛋白(activator),结合后RNA聚合酶活性增强,使转录激活,介导正性调节。 -35区-10区RNA转录起点 Ara BAD CTGACG~I N16TACTGT N6A共有序列TIGACA TATAAT 图16-15种E. coli启动子的共有序列-10区域的TATAAT和-35区域的TIGACA为共有序列调节基因(regulatory gene)编码能够与操纵元件结合的阻遏蛋白。阻遏蛋白可以识别、结合特异的操纵元件,抑制基因转录,所以阻遏蛋白介导负性调节(negative regulation)。阻遏蛋白介导的负性调节机制在原核生物中普遍存在。 此外,还有一些调控蛋白质对原核基因转录调控起着重要的作用,如特异因子和激活蛋白。这些调控蛋白质的作用分别是:O特异因子决定RNA聚合酶对一个或一套启动序列的特异性识别和结合能力。@激活蛋白可结合启动子邻近的DNA序列,提高RNA聚合酶与启动序列的结合能力,从而增强RNA聚合酶的转录活性,是一种正性调节(positive regulation)。分解(代谢)物基因激活蛋白(catabolite gene activator protein, CAP)就是一种典型的激活蛋白。有些基因在没有激活蛋白存在时,RNA聚合酶很少或根本不能结合启动子,所以基因不能转录。 阻遏蛋白、特异因子和激活蛋白等原核调控蛋白都是一些DNA结合蛋白。凡是能够诱导基因表达的分子称为诱导剂,而凡是能够阻遏基因表达的分子称为阻遏剂。 二、乳糖操纵子是典型的诱导型调控 操纵子在原核基因表达调控中具有普遍意义。大多数原核生物的多个功能相关基因串联在一起,依赖同一调控序列对其转录进行调节,使这些相关基因实现协调表达尽。以大肠杆菌的乳糖操纵子(lac operon)为例介绍原核生物的操纵子调控模式。乳糖代谢酶基因的表达特点是:在环境中没有乳糖时,这些基因处千关闭状态;只有当环境中有乳糖时,这些基因才被诱导开放,合成代谢乳糖所需要的酶。乳糖操纵子是最早发现的原核生物转录调控模式。 310第三篇遗传信息的传递 (一)乳糖操纵子的结构 E. coli的乳糖操纵子含Z、Y及A三个结构基因,分别编码B-半乳糖昔酶((3-galactosidase汃通透酶(permease)和乙酰基转移酶(acetyltransferase),此外还有一个操纵序列0(operator,0)、一个启动子P(promoter, P)及一个调节基因I。I基因具有独立的启动子(PI),编码一种阻遏蛋白,后者与0序列结合,使操纵子受阻遏而处千关闭状态。在启动子P上游还有一个CAP结合位点。由P序列、0序列和CAP结合位点共同构成乳糖操纵子的调控区,三个酶的编码基因即由同一调控区调节,实现基因表达产物的协同表达(图16-2)。 别乳糖或IPTG I]J[m衫/呻`///,I z]y 固16-2lac操纵子与阻遏蛋白的负性调节阻遏蛋白由具有独立启动子(PI)的I基因编码生成后,与操纵序列(0序列)结合,使操纵子受阻遏而处千关闭状态。别乳糖或异丙基硫代半乳糖昔(IPTG)等可以结合阻遏蛋白,使其构象变化而去阻遏(二)乳糖操纵子受到阻遏蛋白和CAP的双重调节1.阻遏蛋白的负性调节在没有乳糖存在时,lac操纵子处于阻遏状态。此时,I序列在PI启动序列作用下表达的Lac阻遏蛋白与0序列结合,阻碍RNA聚合酶与P序列结合,抑制转录启动。阻遏蛋白的阻遏作用并非绝对,偶有阻遏蛋白与0序列解聚。因此,每个细胞中可能会有寥寥数个分子的B-半乳糖昔酶、通透酶生成。 当有乳糖存在时,lac操纵子即可被诱导。在这个操纵子体系中,真正的诱导剂并非乳糖本身。乳糖经通透酶催化、转运进入细胞,再经原先存在于细胞中的少数6-半乳糖甘酶催化,转变为别乳糖(allolactose)。后者作为一种诱导剂分子结合阻遏蛋白,使蛋白质构象变化,导致阻遏蛋白与0序列解离而发生转录,可使B-半乳糖昔酶分子增加达1000倍。别乳糖的类似物异丙基硫代半乳糖昔(i sopropylthiogala ctoside, IPTG)是一种作用极强的诱导剂,不被细菌代谢而十分稳定,因此在基因工程领域和分子生物学实验中被广泛应用。 2. CAP的正性调节CAP是同二聚体,在其分子内有DNA结合区及cAMP结合位点。当培养基中缺乏葡萄糖时,cAMP浓度增高,cAMP与CAP结合,这时CAP结合在lac启动序列附近的CAP位点,可刺激RNA聚合酶转录活性,使之提高50倍己;当有葡萄糖存在时,cAMP浓度降低,cAMP与CAP结合受阻,因此lac操纵子表达下降。 由此可见,对lac操纵子来说,CAP是正性调节因素,Lac阻遏蛋白是负性调节因素。两种调节机制根据存在的碳源性质及水平协调调节lac操纵子的表达。 3.协同调节Lac阻遏蛋白负性调节与CAP正性调节两种机制协同合作岱:当Lac阻遏蛋白阻遏转录时,CAP对该系统不能发挥作用;但是如果没有CAP存在来加强转录活性,即使阻遏蛋白从操纵序列上解离仍几无转录活性。可见,两种机制相辅相成、互相协调、相互制约。由于野生型lac启动子作用很弱,所以CAP是必不可少的。 lac操纵子的负调节能很好地解释在单纯乳糖存在时,细菌是如何利用乳糖作为碳源的。然而,细菌生长环境是复杂的,倘若有葡萄糖或葡萄糖/乳糖共同存在时,细菌首先利用葡萄糖才是最节能的。这时,葡萄糖通过降低cAMP浓度,阻碍cAMP与CAP结合而抑制lac操纵子转录,使细菌只能利用葡萄糖。葡萄糖对lac操纵子的阻遏作用称分解代谢阻遏(catabolic repress ion)。lac操纵子强的诱导作用既需要乳糖存在又需要缺乏葡萄糖。lac操纵子协同调节机制如图16-3所示。 I PI|1|CAP结合位点1P|(匠二]z Y仁三二] t无转录 阻遏蛋白C二二](a)有葡萄糖,无乳糖 I PI I I I CA啤合位点1P|。z|Y|A|巨I羞l。z|Y|A|阻遏蛋白仁二二)—i i i诱导剂t::::==-一一习(a)当葡萄糖存在,没有乳糖存在时,阻遏蛋白封闭转录,CAP不能发挥作用;(b)当乳糖存在时,去阻遏,但因有葡萄糖存在,CAP不能发挥作用;(c)当葡萄糖不存在,乳糖存在时,即去阻遏,CAP又能发挥作用,对lac操纵子有强的诱导调节三、色氨酸操纵子通过阻遏作用和衰减作用抑制基因表达原核生物体积小,受环境影响大,在生存过程中需要最大限度减少能源消耗,对非必需氨基酸都,一,讨负}尽量关闭其编码基因。例如,只要环境中有相应的氨基酸供应,大肠杆菌就不会自己去合成,而会将相应氨基酸的合成代谢酶编码基因全部关闭。大肠杆菌色氨酸操纵子(trp operon)就是一个阻遏操纵子。在细胞内无色氨酸时,阻遏蛋白不能与操纵序列结合,因此色氨酸操纵子处于开放状态,结构基因得以表达。当细胞内色氨酸的浓度较高时,色氨酸作为辅阻遏物与阻遏蛋白形成复合物并结合到操纵序列上,关闭色氨酸操纵子,停止表达用于合成色氨酸的各种酶。 色氨酸操纵子的有效关闭还有一种属于促进巳经开始转录的mRNA合成终止的方式来进一步加强,这种方式称为转录衰减(transcription attenuation),即色氨酸操纵子还可通过转录衰减的方式抑制基因表达。这种作用是利用原核生物中转录与翻译过程偶联进行,转录时先合成的一段前导序列L来实现的。 前导序列的结构特点及其发挥衰减作用的机制如图16-4所示。前导序列L的结构特点是:心它可以转录生成一段长度为162bp、内含4个特殊短序列的前导mRNA;@其中序列l有独立的起始和终止密码子,可翻译成为一个有14个氨基酸残基的前导肤,它的第10位和第11位都是色氨酸残基;@序列1和序列2间、序列2和序列3间、序列3和序列4间存在一些互补序列,可分别形成发夹结构,形成发卡结构的能力依次是1/2发夹>2/3发夹>3/4发夹;@序列4的下游有一个连续的U序列,是一个不依赖于p因子的转录终止信号。 ,,,,,,/}转、;、、、、、、三、、~、、、5'1,序列1”Z正已序列3巳习曰=uuuu|3'前导mRNA(a)前导序列的结构特征;(b)在Trp低浓度时,核糖体停滞在序列l上,2/3发卡结构形成,转录继续进行;(c)在Trp高浓度时,3/4发卡结构和多聚U序列使得转录提前终止转录衰减的机制是:心色氨酸浓度较低时,前导肤的翻译因色氨酸量的不足而停滞在第10/11的色氨酸密码子部位,核糖体结合在序列l上,因此前导mRNA倾向于形成2/3发夹结构,转录继续进行;@色氨酸浓度较高时,前导肤的翻译顺利完成,核糖体可以前进到序列2,因此发夹结构在序列3和序列4形成,连同其下游的多聚U使得转录中途终止,表现出转录的衰减。原核生物这种在色氨酸浓度高时通过阻遏作用和转录衰减机制共同关闭基因表达的方式,保证了营养物质和能量的合理利用。 前导序列发挥了随色氨酸浓度升高而降低转录的作用,故将这段序列称为衰减子(attenuator)。在trp操纵子中,阻遏蛋白对结构基因转录的负调节起到粗调的作用,而衰减子起到精调的作用。细菌中其他氨基酸合成系统的操纵子(如phe、加、leu、thr等)中也有类似的衰减调控机制。 四、原核基因表达在翻译水平受到精细调控 与转录类似,翻译一般在起始和终止阶段受到调节,尤其是起始阶段。翻译起始的调节主要靠调节分子,调节分子可直接或间接决定翻译起始位点能否为核糖体所利用。调节分子可以是蛋白质,也可以是RNA。 (一)蛋白质分子结合千启动子或启动子周围进行自我调节无论是单顺反子还是多顺反子mRNA,许多体系应用了类似的机制,即调节蛋白结合mRNA靶位点,阻止核糖体识别翻译起始区,从而阻断翻译的机制。调节蛋白一般作用于自身mRNA,抑制自身的合成,因而这种调节方式称为自我控制(au togenous control)。细菌mRNA起始密码子上游约10个核昔酸之前的SD序列与16和RNA序列互补的程度以及从起始密码子AUG到嗦呤片段的距离也都强烈地影响翻译起始的效率(见第十五章)。不同基因的mRNA有不同的SD序列,它们与16S rRNA的结合能力也不同,从而控制着单位时间内翻译过程中起始复合物形成的数目,最终控制着翻译的速度。 (二)翻译阻遏利用蛋白质与自身mRNA的结合实现对翻译起始的调控翻译起始与转录起始相类似,也受调节蛋白的作用,但与转录不同,RNA在翻译起始过程中有重要的作用。编码区的起始点可与调节分子(蛋白质或RNA)直接或间接地结合来决定翻译起始。在此调控机制中,调节蛋白可以结合到起始密码子上,阻断与核糖体的结合。例如,S8是组成核糖体小亚基的一个蛋白质,可以与16S rRNA的茎环结构结合;L5是组成核糖体大亚基的一个蛋白质,它的mRNA的5'-末端也能形成一个与16S rRNA的茎环结构相类似的结构。因此S8也能与L5的mRNA结合。当16S rRNA含量充足时,可以与所有的S8蛋白结合,不影响L5蛋白质的合成;而当16S rRNA含量不足时,多余的S8则与L5mRNA结合,阻遏L5蛋白质的合成,防止L5合成过量。 (三)反义RNA利用结合mRNA翻译起始部位的互补序列调节翻译起始此外,在一些细菌和病毒中还存在一类调节基因,能够转录产生反义RNA(antisense RNA)。反义RNA含有与特定mRNA翻译起始部位互补的序列,通过与mRNA杂交阻断30S小亚基对起始密码子的识别及与SD序列的结合,抑制翻译起始。这种调节称为反义控制(antisense control)。反义RNA的调节作用具有非常重要的理论意义和实际意义。 (四)mRNA密码子的编码频率影响翻译速度 遗传密码表显示,除色氨酸和甲硫氨酸外,其他的氨基酸都有2个或2个以上的遗传密码子。有些是使用频率较高的常用密码子,而有些则是使用频率较低的稀有密码子。当基因中的密码子是常用密码子时,mRNA的翻译速度快,反之,mRNA的翻译速度慢。大肠杆菌dnaG基因是引物酶的编码基因,含有较多的稀有密码子,使得mRNA的翻译速度缓慢,防止引物酶合成过多。 第三节真核基因表达调控 原核细胞的基因表达调控机制已经十分复杂,与之相比,真核生物的基因组结构要复杂得多,加之个体内细胞间广泛存在的信号通讯网络,其基因表达调控的多样性和复杂性远非原核生物所能比拟。 一、真核基因表达特点 多细胞真核生物的基因表达调控具有以下特点:心真核基因组比原核基因组大得多。@原核基\,`fi因组的大部分序列都为编码基因,而哺乳类基因组中大约只有10%的序列编码蛋白质、rRNA、tRNA等,其余90%的序列,包括大量的重复序列,功能至今还不清楚,可能参与调控。@真核生物编码蛋白质的基因是不连续的,转录后需要剪接去除内含子,这就增加了基因表达调控的层次。@原核生物的基因编码序列在操纵子中,多顺反子mRNA使得几个功能相关的基因自然协调控制;而真核生物则是一个结构基因转录生成一条mRNA,即mRNA是单顺反子(monocistron),许多功能相关的蛋白质,即使是一种蛋白质的不同亚基也将涉及多个基因的协调表达。@真核生物DNA在细胞核内与多种蛋白质结合构成染色质,这种复杂的结构直接影响着基因表达。@真核生物的遗传信息不仅存在于核DNA上,还存在于线粒体DNA上,核内基因与线粒体基因的表达调控既相互独立又需要协调。 由于真核基因组的这些特点,真核基因表达的调控过程较原核生物要复杂许多(图16-5)。该过程包括了染色质激活、转录起始、转录后修饰、转录产物的细胞内转运、翻译起始、翻译后修饰等多个步骤。在上述过程的每一个环节都可以对基因表达进行干预,从而使得基因表达调控呈现出多层次和综合协调的特点。但是,转录起始的调控是基因表达调控较为关键的环节。 染色体e><今、 :染色质激活 双链DNA~.卜$嚣$卢甘贯 i•------转录起始 hnRNA"1TTTTTTTTTTTTT转录后加工«----一修饰及转运 基因表达 过程中的J mRNA^了~^了~翻译起始 ~i◄成熟蛋白质飞9云 二、染色质结构与真核基因表达密切相关 以染色质形式组装在细胞核内的DNA所携带的遗传信息表达直接受到染色质结构的制约。当基因被激活时,可观察到染色质相应区域发生某些结构和性质变化,这些具有转录活性的染色质被称为活性染色质(ac tive chromatin)。 (一)转录活化的染色质对核酸酶极为敏感 当染色质活化后,常出现一些对核酸酶(如DNase I)高度敏感的位点,称之超敏位点(hypersensitive si t e)。超敏位点通常位于被活化基因的5'-侧翼区1kb内,但有时也会在更远的5'-侧翼区或3'侧翼区出现一些超敏位点。这些转录活化区域是缺乏或没有核小体蛋白结合的"裸露“DNA链。 (二)转录活化染色质的组蛋白发生改变 转录活跃区域的染色质中组蛋白的特点是:CD富含赖氨酸的H1组蛋白含量降低;@H2A-H2B组蛋白二聚体的不稳定性增加,使它们容易从核小体核心中被置换出来;@核心组蛋白H3、H4可发生乙酰化、磷酸化以及泛素化等修饰。这些都使得核小体的结构变得松弛而不稳定,降低核小体蛋白对DNA的亲和力,易于基因转录。 在真核细胞中,核小体是染色质的主要结构单位,四种组蛋白(H2A、H2B、H3和H4各2个分子)组成的八聚体构成核小体的核心区(core particle),其外面盘绕着DNA双螺旋链。每个组蛋白的氨基端都会伸出核小体外,形成组蛋白尾巴(图16-6)。这些尾巴可以形成核小体间相互作用的纽带,同时也是发生组蛋白修饰的位点。这些修饰包括对组蛋白中富含的赖氨酸、精氨酸、组氨酸等带有正电荷的碱性氨基酸进行的乙酰化、磷酸化和甲基化等修饰过程。 (a)组蛋白与DNA组成的核小体;(b)组蛋白的氨基端伸出核小体,形成组蛋白尾巴;(c)四种组蛋白组成的八聚体一般来说,乙酰化修饰能够中和组蛋白尾巴上碱性氨基酸残基的正电荷,减弱组蛋白与带有负电荷的DNA之间的结合,选择性地使某些染色质区域的结构从紧密变得松散,有利于转录因子与DNA的结合,从而开放某些基因的转录,增强其表达水平。而组蛋白甲基化通常不会在整体上改变组蛋白尾巴的电荷,但是能够增加其碱性度和疏水性,因而增强其与DNA的亲和力。乙酰化修饰和甲基化修饰都是通过改变组蛋白尾巴与DNA之间的相互作用发挥基因表达调控的功能,而乙酰化修饰和甲基化修饰的作用往往又是相互排斥的。组蛋白的磷酸化修饰在细胞有丝分裂和减数分裂期间染色体浓缩以及基因转录激活过程中发挥重要的调节作用。 组蛋白乙酰化、磷酸化和甲基化修饰对染色质结构和功能的影响总结于表16-1。此外,组蛋白修饰还包括泛素化修饰和ADP-核糖基化。各种不同修饰的效应可能是协同的,也可能是相反的;可能是同时发生,也可能是在不同时刻;修饰的组蛋白底物可能相同,也可能不同。组蛋白修饰对于基因表达影响的机制也包括两种相互包容的理论,即组蛋白的修饰直接影响染色质或核小体的结构,以及化学修饰募集了其他调控基因转录的蛋白质,为其他功能分子与组蛋白结合搭建了一个平台。这些理论构成了”组蛋白密码“假说。当然,组蛋白修饰对基因表达调控的研究还刚刚开始,许多问题仍有待解决。 发挥组蛋白共价修饰作用的一些蛋白质分子,如组蛋白乙酰基转移酶(histone acetyltransferase,HAT)和组蛋白去乙酰化酶(hi stone deacetylase, HDAC),在DNA水平的基因表达调控中具有重要作用。HAT使组蛋白发生乙酰化,促使染色质结构松弛,有利千基因的转录,被称为转录辅激活因子(co-activator),而HDAC促进组蛋白的去乙酰化,抑制基因的转录,被称为转录辅抑制因子(co-repressor)。 316第三篇遗传信息的传递 组蛋白氨基酸残基位点修饰类型功能H3Lys-4甲基化激活H3Lys-9甲基化染色质浓缩H3Lys-9甲基化DNA甲基化所必需H3Lys-9乙酰化激活H3Ser-10磷酸化激活H3Lys-14乙酰化防止Lys-9的甲基化H3Lys-79甲基化端粒沉默H4Arg-3甲基化激活或抑制.H4Lys-5乙酰化装配H4Lys-12乙酰化装配H4Lys-16乙酰化核小体装配H4Lys-16乙酰化Fly X激活.不同的酶催化产生不同的效应DNA甲基化是真核生物在染色质水平控制基因转录的重要机制。真核基因组中胞啥唗的第5位碳原子可以在DNA甲基转移酶(DNA methyltransferase)的作用下被甲基化修饰为5-甲基胞瞪唗,并且以序列CG中的胞啥唗甲基化更加常见。但是这些甲基化胞瞪唗在基因组中并不是均匀分布,有些成簇的非甲基化CG存在千整个基因组中,人们将这些GC含量可达60%,长度为300-3000bp的区段称作CpG岛(CpG island)。CpG岛主要位千基因的启动子和第一外显子区域,约有60%以上基因的启动子含有CpG岛。业已发现处于转录活跃状态的染色质中,CpG岛的甲基化程度下降,例如管家基因的CpG岛中胞瞪唗甲基化水平较低。CpG岛的高甲基化促进染色质形成致密结构,因而不利于基因表达。 染色质结构对基因表达的影响可以遗传给子代细胞,其机制是细胞内存在着具有维持甲基化作用的DNA甲基转移酶,可以在DNA复制后,依照亲本DNA链的甲基化位置催化子链DNA在相同位置上发生甲基化。这种现象称为表观遗传(epigenetic i nheritance)。这种遗传信息不是蕴藏在DNA序列中,而是通过对染色质结构的影响及基因表达变化而实现的。表观遗传对基因表达的调控不仅体现在DNA甲基化上,组蛋白的乙酰化、甲基化以及非编码小RNA的调控等都属于表观遗传调控的范畴。 三、转录起始的调节 与原核细胞一样,转录起始是真核生物基因表达调控的关键,但是真核生物的基因转录起始过程比原核细胞的复杂得多。这是因为真核生物的RNA聚合酶需要与多个转录因子相互作用,才能完成转录起始复合物的装配,装配速度决定着基因表达的水平。 (—)顺式作用元件是转录起始的关键调节部位 绝大多数真核基因调控机制都涉及编码基因附近的非编码DNA序列一顺式作用元件。顺式作用元件是指可影响自身基因表达活性的DNA序列(图16-7)。真核生物基因组中每一个基因都有各自特异的顺式作用元件。顺式作用元件通常是非编码序列,但是并非都位于转录起始点上游。根据顺式作用元件在基因中的位置、转录激活作用的性质及发挥作用的方式,可将真核基因的这些功能元件分为启动子、增强子、沉默子及绝缘子等。 1.真核生物启动子结构和调节远较原核生物复杂真核生物不同基因的启动子序列间的一致性不像原核生物那样明显,而且RNA聚合酶与DNA的结合需要多种蛋白质因子的相互协调作用。因此,真核生物的启动子序列要比原核生物的复杂得多、序列也更长。 fr父,七 转录起始点 图16-7顺式作用元件图中A、B分别代表同一基因中的两段特异DNA序列。B序列通过一定机制影响A序列,并通过A序列控制该基因的转录起始的准确性及频率。A、B序列就是调节这个基因转录活性的顺式作用元件真核生物启动子一般位于转录起始点上游,为100-200bp序列,包含有若干具有独立功能的DNA序列元件,每个元件长7-30bp。启动子通常含有1个以上的功能组件,其中最具典型意义的就是TATA盒,它的共有序列是TATAAAA(见第十一章)。TATA盒是基本转录因子TF II D的结合位点通常位于转录起始点上游-25--30bp区域,控制转录起始的准确性及频率。除TATA盒外,GC盒(GGGCGG)和CAAT盒(GCCAAT)也是很多基因中常见的功能组件。此外,还发现很多其他类型的功能组件。典型的II类启动子由TATA盒或下游启动子元件(downstream promoter element, DPE)和起始元件(initiator element, Inr)以及上游调控元件组成。 然而,还有很多启动子并不含TATA盒,这类启动子分为两类:一类为富含GC的启动子,最初发现于一些管家基因,这类启动子一般含数个分离的转录起始点,并有数个转录因子SP l结合位点,对基本转录活化有重要作用;另一类启动子既不含TATA盒,也没有GC富含区,这类启动子可有一个或多个转录起始点,大多转录活性很低或根本没有转录活性,而是在胚胎发育、组织分化或再生过程中受调节。 真核生物主要有三种RNA聚合酶,它们分别结合在三类不同的启动子上负责转录不同的RNA~(见第十一章和第十四章)。 2增强子是—种能够提高转录效率的顺式作用元件增强子的长度大约是200bp,可使旁侧的基因转录效率提高100倍或更多。增强子也是由若干功能组件组成,有些功能组件既可在增强子中出现,也可在启动子中出现。这些功能组件是特异转录因子结合DNA的核心序列。增强子的核心组件常为8-12bp,可以单拷贝或多拷贝串联形式存在。增强子和启动子常交错覆盖或连续。酵母有一种类似高等真核生物增强子样作用的序列,称为上游激活序列(upstream activator sequence, UAS),其在转录激活中的作用方式与增强子类似。增强子的功能及其作用特征如下:(])增强子与被调控基因位于同一条DNA链上,属千顺式作用元件。 (2)增强子是组织特异性转录因子的结合部位,当某些细胞或组织中存在能够与之相结合的特异转录因子时方能表现活性。(3)增强子不仅能够在基因的上游或下游起作用,而且还可以远距离实施调节作用(通常为1~4kb),个别情况下甚至可以调控30kb以外的基因。 318第三篇遗传信息的传递 (4)增强子作用与序列的方向性无关。将增强子的方向倒置后依然能起作用,而方向倒置后的启动子就不能起作用。(5)增强子需要有启动子才能发挥作用,没有启动子存在,增强子不能表现活性。但增强子对启动子没有严格的专一性,同一增强子可以影响不同类型启动子的转录。 3.沉默子能够抑制基因的转录沉默子是一类基因表达的负性调控元件,当其结合特异蛋白因子时,对基因转录起阻遏作用,最初在酵母中发现。已有的证据显示沉默子与增强子类似,其作用亦不受序列方向的影响,也能远距离发挥作用,并可对异源基因的表达起作用。 4.绝缘子阻碍其他调控元件的作用绝缘子最初在酵母中发现,一般位于增强子或沉默子与启动子之间,与特异蛋白因子结合后,阻碍增强子或沉默子对启动子的作用。绝缘子还可位千常染色质与异染色质之间,保护常染色质的基因表达不受异染色质结构的影响。绝缘子与增强子类似,发挥作用与序列的方向性无关。 (二)转录因子是转录起始调控的关键分子 真核基因的转录调节蛋白又称转录调节因子或转录因子(transcrip tion factor, TF)。绝大多数真核转录调节因子由其编码基因表达后进人细胞核,通过识别、结合特异的顺式作用元件而增强或降低相应基因的表达。转录因子也被称为反式作用蛋白或反式作用因子。 如本章第一节所述,这些反式作用因子的编码基因与其作用的靶基因之间不存在结构的关联,而顺式作用元件则是在结构上与靶基因串联连接在一起。这种来自于一个基因编码的蛋白质对另一基因的调节作用称为反式激活或反式抑制作用。真核生物转录调控的基本方式就是反式作用因子对顺式作用元件的识别与结合,即通过DNA-蛋白质的相互作用实施调控。并不是所有真核转录调节蛋白都起反式作用,也有些基因产物可特异识别、结合自身基因的调节序列,调节自身基因的开启或关闭,这就是顺式调节作用。具有这种调节方式的调节蛋白称为顺式作用蛋白(图16-8)。 依据功能特性,可将转录因子分为通用转录因子(general transcription factor)和特异转录因子(spec ial transcrip tion fac tor)两大类。 反式调节 蛋白质A勹 转录起始点 DNA~歹'彶 蛋白质B 顺式调节 茵16-8反式与顺式作用蛋白蛋白质A由它的编码基因表达后,通过与B基因特异的顺式作用元件的识别、结合,反式激活B基因的转录,蛋白质A即反式作用蛋白或反式作用因子。B基因产物也可特异识别、结合自身基因的调节序列,顺式调节自身基因的开启或关闭,因此,B调节蛋白称为顺式作用蛋白发挥顺式调节作用1通用转录因子这些转录因子是RNA聚合酶介导基因转录时所必需的一类辅助蛋白质,帮助聚合酶与启动子结合并起始转录,对所有基因都是必需的。有入将其视为RNA聚合酶的组成成分或亚基,故又称为基本转录因子。正如第十四章中所述,通用转录因子TFil D是由TBP和TAFs组成的复合物。TFilD复合物中不同TAFs与TBP的结合可能结合不同启动子,这可以解释这些因子在各种启动子中的选择性活化作用以及对特定启动子存在不同的亲和力。中介子(mediator)也是在反式作用因子和RNA聚合酶之间的蛋白质复合体,它与某些反式作用因子相互作用,同时能够促进TFil H对RNA聚合酶最大亚基的狻基端结构域的磷酸化。有时将中介子也归类于辅激活因子。通用转录因子的存在没有组织特异性,因而对于基因表达的时空选择性并不重要。 2.特异转录因子这些转录因子为个别基因转录所必需,决定该基因表达的时间空间特异性,故称特异转录因子。此类特异因子有的起转录激活作用,有的起转录抑制作用。前者称转录激活因子(transcription activator),后者称转录抑制因子(transcription inhibitor)。 转录激活因子通常是一些增强子结合蛋白(enhancer binding prot ein, EBP);多数转录抑制因子是沉默子结合蛋白,但也有抑制因子以不依赖DNA的方式起作用,而是通过蛋白质-蛋白质相互作用“中和“转录激活因子或TFil D,降低它们在细胞内的有效浓度,抑制基因转录。 因为在不同的组织或细胞中各种特异转录因子分布不同,所以基因表达状态、方式不同。这些组织特异性的转录因子才真正决定着细胞基因的时间、空间特异性表达。特异转录因子自身的含量、活性和细胞内定位随时都受到细胞所处环境的影响,是使环境变化在基因表达水平得到体现的关键分子。组织特异性转录因子在细胞分化和组织发育过程中具有重要作用。例如,胚胎干细胞的分化方向在相当大的程度上是由细胞内转录因子的种类所决定。阐明各种组织细胞所特有的转录因子种类,就有可能控制细胞的分化方向。诱导多能干细胞(induced pluripotent stem cell, iPS)的建立说明关键转录因子可以改变一个细胞的命运。科学家们仅用4种转录因子就可以使终末分化的皮肤成纤维细胞转变成为类似于胚胎千细胞样的具有多向分化能力的细胞。 此外,还有与启动子上游元件如GC盒、CAAT盒等顺式作用元件结合的蛋白质,称为上游因子(upstream factor),如SPl结合到GC盒上,C/EBP结合到CAAT盒上。这些反式作用因子调节通用转录因子与TATA盒的结合、RNA聚合酶与启动子的结合及起始复合物的形成,从而协助调节基因的转录效率。 与远隔调控序列如增强子等结合的反式作用因子有很多。可诱导因子(inducible factor)是与增强子等远端调控序列结合的转录因子。它们能结合应答元件,只在某些特殊生理或病理情况下才被诱导产生,如MyoD在肌细胞中高表达,HIF-1在缺氧时高表达。与上游因子不同,可诱导因子只在特定的时间和组织中表达而影响转录。RNA聚合酶Il与启动子结合并启动转录需要多种蛋白质因子的协同作用。这通常包括:可诱导因子或上游因子与增强子或启动子上游元件的结合;通用转录因子在核心启动子处的组装;辅激活因子和(或)中介子在通用转录因子或RNA聚合酶Il复合物与可诱导因子、上游因子之间的辅助和中介作用,以准确地控制基因是否转录、何时转录。应该指出的是,上游因子和可诱导因子等在广义上也可称为转录因子,但一般不冠以TF的词头而各有自己特殊的名称。 3.转录因子的结构特点转录因子是DNA结合蛋白,至少包括两个不同的结构域:DNA结合结构域(DNA binding domain)和转录激活结构域(activation domain)。此外,很多转录因子还包含一个介导蛋白质-蛋白质相互作用的结构域,最常见的是二聚化结构域。 (1)转录因子的DNA结合结构域 l)锌指(zinc finge1)模体结构:是一类含锌离子的模体。每个重复的”指“状结构含20多个氨基酸残基,形成1个a-螺旋和2个反向平行B-折叠的二级结构。常见的锌指模体中每个B-折叠上有l个半胱氨酸(Cys)残基,而a-螺旋上有2个组氨酸(His)或半胱氨酸(Cys)残基。这4个氨基酸残基与二价锌离子之间形成配位键(图16-9)。整个蛋白质分子可有多个这样的锌指重复单位。每一个单位可将其a-螺旋伸入DNA双螺旋的大沟内,接触4个或更多的碱基。例如与GC盒结合的人成纤维细胞转录因子SPl中就有3个锌指重复结构。',中fa图16-9锌指模体结构C=半胱氨酸;H=组氨酸;F=苯丙氨酸;L=亮氨酸;Y=酪氨酸;Zn=锌离子2)碱性螺旋环-螺旋(basic helix-loop-helix, bHLH)模体结构:至少有两个a-螺旋,由一个短肤段形成的环所连接,其中一个a-螺旋的N-端富含碱性氨基酸残基,是与DNA结合的结合域(图16-10)。bHLH模体通常以二聚体形式存在,而且两个a-螺旋的碱性区之间的距离大约与DNA双螺旋的一个螺距相近(3.4nm),使两个a-螺旋的碱性区刚好分别嵌入DNA双螺旋环c的大沟内。 3)碱性亮氨酸拉链(basic leucine zipper, bZIP)模体结构:特点是在蛋白质C-末端的氨(a)(b)基酸序列中,每隔6个氨基酸残基是一个疏水图16-10碱性螺旋-环-螺旋模体结构性的亮氨酸残基。当C-末端形成a-螺旋结构(a)独立的碱性螺旋-环-螺旋模体结构示意图;时,肤链每旋转两周就出现一个亮氨酸残基,(b)bHLH模体二聚体与DNA结合的示意图。两并且都出现在a-螺旋的同一侧。这样的两个个a-螺旋的碱性区分别嵌入DNA双螺旋的大沟内肤链能以疏水力结合成二聚体,形同拉链一样的结构(图16-11)。该二聚体的N-端是富含碱性氨基酸的区域,可以借助其正电荷与DNA骨架上的磷酸基团结合。(2)转录因子的转录激活结构域:不同的转录因子具有不同的转录激活结构域,根据氨基酸的组成特点,转录激活结构域可分为三类。 4.二聚化是常见的蛋白质-蛋白质相互作用方式二聚化作用与bZIP的亮氨酸拉链、bHLH的螺旋-环螺旋结构有关。?,记以上介绍的各种转录因子的功能结构形式都是最典型、最常见的。此外尚有一些独特的结构(a)碱性亮氨酸拉链模体结构示意图;(b)bZIP模体与DNA结合的示意图。两个a-螺旋上的亮氨酸残基彼此接近,形成了类似拉链的结构,而富含碱性氨基酸残基的区域与DNA骨架上的磷酸基团结合形式。 (三)转录起始复合物的组装是转录调控的主要方式DNA元件与调节蛋白对转录激活的调节最终是由RNA聚合酶活性体现的,其中的关键环节是转录起始复合物的形成。真核生物主要有三种RNA聚合酶,分别负责催化生成不同的RNA分子(见第十四章)。其中RNA聚合酶II参与转录生成所有mRNA前体及大部分snRNA。参与RNA聚合酶II转录起始的DNA调控序列及转录因子要复杂得多,以满足RNA聚合酶II转录成千上万种处于不同表达水平的基因的需要。 真核RNA聚合酶II不能单独识别、结合启动子,而是先由基本转录因子TFlID识别、结合启动子序列,再同其他TF II与RNA聚合酶II经由一系列有序结合形成一个功能性的转录前起始复合物(transcriptionpreinitiation complex,详见第十四章)。此外,一些诸如转录激活因子(activator)、中介子(mediator)以及染色质重塑因子(chromatin remodeler)等调节复合体也可参与转录前起始复合物的形成,使RNA聚合酶II得以真正启动mRNA的有效转录(图16-12)。在不同的细胞或阶段,还有一些特异性转录因子通过特定的结合,发挥特异性转录调节作用。 也正是由于这些基本转录因子和特异转录因子决定了RNA聚合酶Il的活性,这些调节蛋白的浓度与分布将直接影响相关基因的表达。如前所述,特异转录因子的表达具有时间或空间特异性,因此,由它们所参与组成的转录起始复合物也将呈现一种动态变化。\i}IT四、转录后调控主要影响真核mRNA的结构与功能真核生物的基因表达调控在转录后层次不同千原核生物。这一方面是由于两者的转录产物的剪接、修饰等成熟加工过程有很大的差异,另一方面是由于真核生物的RNA产物要被运送至细胞质中去执行功能,其稳定性以及其降解过程都可以影响基因表达的最终结果。 (-)mRNA的稳定性影响真核生物基因表达 mRNA是蛋白质生物合成的模板,因此它的稳定性将直接影响到基因表达最终产物的数量,是转录后对基因表达进行调控的一个重要因素。真核生物mRNA分子的半衰期差别很大,有的可长达数十小时以上,而有的则只有几十分钟或更短。一般而言,半衰期短的mRNA多编码调节蛋白,因此,这些蛋白质的水平可以随着环境的变化而迅速变化,达到调控其他基因表达的目的。影响细胞内mRNA稳定性的因素很多,主要有下面几点:1.5'-端的帽结构可以增加mRNA的稳定性该结构可以使mRNA免于在5'-核酸外切酶的作用下被降解,从而延长了mRNA的半衰期。此外,帽结构还可以通过与相应的帽结合蛋白结合而提高翻译的效率,并参与mRNA从细胞核向细胞质的转运。 2.3'端的poly(A)尾结构防止mRNA降解poly(A)及其结合蛋白可以防止3'-核酸外切酶降解mRNA,增加mRNA的稳定性。如果3'-poly(A)被去除,mRNA分子将很快被降解。此外,3'-poly(A)尾结构还参与了翻译的起始过程。实验证明,mRNA的细胞质定位信号有些也位于3'-非翻译区(3'-untranslated region,3'-UTR)上。组蛋白mRNA没有3'-poly(A)尾的结构,但它的3'-端会形成一种发夹结构,使其免受核酸酶的攻击。一些mRNA的3'-UTR存在一个约50个核昔酸长的AU富含序列(AU-rich sequence, ARE)区,可以与ARE结合蛋白结合,促使poly(A)核酸酶切除poly(A)尾,使mRNA降解(见第十四章)。因此含有ARE区的mRNA通常都不稳定。 RNA无论是在核内进行加工、由细胞核运至细胞质,还是在细胞质内停留(至降解),都是通过与蛋白质结合形成核糖核蛋白颗粒(ribonucl eoprotein particle, RNP)进行的。mRNA运输、在细胞质内的稳定性等均与某些蛋白质成分有关。 所有类型RNA分子中,mRNA寿命最短。mRNA稳定性是由合成速率和降解速率共同决定的(见第十四章)。大多数高等真核细胞mRNA半衰期较原核为长,一般为几个小时。mRNA的半衰期可影响蛋白质合成的量,通过调节某些mRNA的稳定性,即可使相应蛋白质合成量受到一定程度的控制。例如,mRNA5'-端的帽结构和3'-端的尾结构的删除可直接影响mRNA的稳定性。 蛋白质产物也可调节mRNA的降解,如铁转运蛋白受体(transferrin receptor, Tffi)mRNA的降解速率受细胞质内某些蛋白质成分的调节,并与mRNA自身结构有关。当细胞内铁足量时,Tffi mRNA降解速度加快,致使Tffi水平很快下降。当细胞内铁不足时,Tffi mRNA稳定性增加,受体蛋白质合成增多。Tffi mRNA稳定性的调节取决于mRNA分子中特定的重复序列,它位于3'-UTR,称为铁反应元件(iron response element, IRE)。每个IRE大约为30bp长,可形成柄-环结构,环上有5个特异的核昔酸,并富含A-U序列。当铁浓度高时,A-U富含序列通过目前尚不得知的机制促进Tffi mRNA降解;当铁浓度下降时,一种IRE结合蛋白质(IRE-binding protein, IRE-BP)通过识别环的特异序列及柄的二级结构结合IRE。IRE-BP的结合可能破坏了某些机制对Tffi mRNA的降解作用,使Tffi mRNA的寿命延长。这一发现提示,其他稳定性可调节的mRNA可能也含有与特异蛋白质相互作用的反应元件,致降解速率变慢。 (二)一些非编码小分子RNA可引起转录后基因沉默与原核基因表达调节一样,某些小分子RNA也可调节真核基因表达。这些RNA都是非编码RNA(non-coding RNA,ncRNA)。除了我们在前几章谈到过的具有催化活性的RNA(核酶)、核小RNA(snRNA)以及核仁小RNA(snoRNA)以外,还有目前入们广泛关注的非编码RNA,如miRNA、piRNA和siRNA等。小气分子RNA对基因表达的调节十分复杂,将于真核基因表达在翻译及翻译后调控部分再做阐述。 (三)mRNA前体的选择性剪接可以调节真核生物基因表达真核生物基因所转录出的mRNA前体含有交替连接的内含子和外显子。通常状态下,mRNA前体经过剔除内含子序列后成为一个成熟的mRNA,并被翻译成为一条相应的多肤链。但是,参与拼接的外显子可以不按照其在基因组内的线性分布次序拼接,内含子也可以不完全被切除,由此产生了选择性剪接(见第十四章)。选择性剪接的结果是由同一条mRNA前体产生了不同的成熟mRNA,并由此产生了完全不同的蛋白质。这些蛋白质的功能可以完全不同,显示了基因调控对生物多样性的决定作用。值得指出的是,被切除的内含子是否具有功能目前成为研究的热点。有学者认为:内含子是在进化中出现或消失的,其功能可能是有利于物种的进化选择。例如,细菌丢失了内含子,可以使染色体变小和复制速度加快。真核生物保留内含子,则可以产生外显子移动,有利于真核生物在适应环境改变时能合成功能不同而结构上只有微小差异的蛋白质。但也有学者认为内含子具有基因表达涸控的功能。例如,现在已知某些遗传性疾病,其变异是发生在内含子而不在外显子。有些内含子在调控基因表达的过程中起作用,有些内含子还编码核酸内切酶或含有小分子RNA序列等。 五、真核基因表达在翻译及翻译后仍可受到调控 蛋白质生物合成过程复杂,涉及众多成分。通过调节许多参与成分的作用可使基因表达在翻译水平以及翻译后阶段得到控制。在翻译水平上,目前发现的一些调节点主要在起始阶段和延长阶段,尤其是起始阶段,如对起始因子活性的调节、Met-tRNA Me'与小亚基结合的调节、mRNA与小亚基结合的调节等。其中通过磷酸化作用改变起始因子活性这一点备受关注。mRNA与小亚基结合的调节对某些mRNA的翻译控制也具有重要意义。近年来,包括小分子RNA在内的非编码RNA对基因表达调控的影响成为新的研究热点。 (—)对翻译起始因子活性的调节主要通过磷酸化修饰进行1.翻译起始因子elF-2a的磷酸化抑制翻译起始蛋白质合成速率的快速变化在很大程度上取决于起始水平,通过磷酸化调节真核起始因子(eukaryotic initiation factor, elF)的活性对起始阶段有重要的控制作用。eIF-2主要参与起始Met-tRNA产的进位过程,其a亚基的活性可因磷酸化(cAMP依赖性蛋白激酶所催化)而降低,导致蛋白质合成受到抑制。如血红素对珠蛋白合成的调节就是由于血红素能抑制cAMP依赖性蛋白激酶的活化,从而防止或减少了elF-2的失活,促进了蛋白质的合成。在病毒感染的细胞中,细胞抗病毒的机制之一即是通过双链RNA(double-stranded RNA, dsRNA)激活一种蛋白激酶,使eIF-2a磷酸化,从而抑制蛋白质合成的起始。 2. elF-4E及elF-4E结合蛋白的磷酸化激活翻译起始帽结合蛋白eIF-4E与mRNA帽结构的结合是翻译起始的限速步骤,磷酸化修饰及与抑制物蛋白的结合均可调节eIF-4E的活性。磷酸化的e1F-4E与帽结构的结合力是非磷酸化的eIF-4E的4倍,因而可提高翻译的效率。胰岛素及其他一些生长因子都可增加elF-4E的磷酸化从而加快翻译,促进细胞生长。同时,胰岛素还可以通过激活相应的蛋白激酶而使一些与elF-4E结合的抑制物蛋白磷酸化,磷酸化后的抑制物蛋白会与elF-4E解离,激活eIF-4E。 (二)RNA结合蛋白参与对翻译起始的调节 所谓RNA结合蛋白(RNA binding protein, RBP),是指那些能够与RNA特异序列结合的蛋白质。基因表达的许多调节环节都有RBP的参与,如前述转录终止、RNA剪接、RNA转运、RNA在细胞质内稳定性控制以及翻译起始等。铁蛋白相关基因的mRNA翻译调节就是RBP参与基因表达调控的典型例子。 如前所述,IRE结合蛋白质(IRE-BP)作为特异RNA结合蛋白,在调节铁转运蛋白受体(Tffi)mRNA稳定性方面起重要作用。同时,它还能调节另外两个与铁代谢有关的蛋白质的合成,这两种蛋白质是铁蛋白和8-氨基勹-酮戊酸(ALA)合酶。铁蛋白与铁结合,是体内铁的贮存形式,ALA合酶是血红素合成的限速酶。与Tffi mRNA不同,IRE位于铁蛋白及ALA合酶mRNA的5'-UTR,而且无A-U富含区,不促进mRNA降解。当细胞内铁浓度低时,IRE-BP处于活化状态,结合IRE而阻碍40S小亚基与mRNA5'-端起始部位结合,抑制翻译起始;铁浓度偏高时,IRE-BP不能与IRE结合,两种mRNA的翻译起始可以进行。 (三)对翻译产物水平及活性的调节可以快速调控基因表达新合成蛋白质的半衰期长短是决定蛋白质生物学功能的重要影响因素。因此,通过对新生肤链的水解和运输,可以控制蛋白质的浓度在特定的部位或亚细胞器保持在合适的水平。此外,许多蛋白质需要在合成后经过特定的修饰才具有功能活性。通过对蛋白质可逆的磷酸化、甲基化、酰基化修饰,可以达到调节蛋白质功能的作用,是基因表达的快速调节方式。 (四)小分子RNA对基因表达的调节十分复杂 1.微RNA(microRNA, miRNA)miRNA是一个大家族,属小分子非编码单链RNA,长度约22个碱基,由一段具有发夹环结构的前体加工后形成。编码miRNA的基因与编码蛋白质的基因一样,由RNA聚合酶II负责催化其转录合成。 它们在细胞内首先形成长度约为数百个碱基的pri-miRNA,经过一次加工后,成为长度为70~90个碱基的单链RNA前体(pre-miRNA),再经过一种称为Dicer酶的RNA酶进行剪切后形成长20~24nt的成熟miRNA。这些成熟的miRNA与其他蛋白质一起组成RNA诱导的沉默复合体(RNAinduced silencing complex, RISC),通过与其靶mRNA分子的3'-UTR互补匹配,促使该mRNA分子的降解或抑制其翻译。 最早被确认的miRNA是1993年在线虫中发现的加-4。这种单链RNA的表达具有阶段性,通过碱基配对的方式结合到靶mRNA lin-14的3'-UTR,从而抑制lin-14的翻译,但并不影响其转录。2000年,另一个促进线虫幼虫向成虫转变的基因let-7被发现,它的转录产物为21个碱基的RNA分子,也具有明显的阶段表达特异性,对线虫的发育具有重要的调控作用。 miRNA具有一些鲜明的结构与功能特点:心其长度一般为20~25个碱基,个别也有20个5'3'>30bp双链RNA(dsRNA)碱基以下的报道;@在不同生物体中普遍存在,3'5'包括线虫、果蝇、家鼠、人及植物等;@其序列在不同生物中具有一定的保守性,但是尚未发现动植物之间具有完全一致的miRNA序列;@具l l l l l l I I l l l l l l有明显的表达阶段特异性和组织特异性;I I l l l I I I I l I l l lI I l I l I I@miRNA基因以单拷贝、多拷贝或基因簇等多种I l l I l l l形式存在千基因组中,而且绝大部分位千基因间隔区。miRNA的广泛性和多样性提示它们可能具有非常重要的生物学功能。 2.干扰小RNA(sma ll interfering RNA, siRNA)siRNA是细胞内的一类双链RNA(dsRNA),在特定情况下通过一定酶切机制,转变为具有特定长度(21~23个碱基)和特定序列 的小片段RNA。siRNA参与RISC组成,与特异的靶mRNA完全互补结合,导致靶mRNA降解, 亡IIIIIIIIII阻断翻译过程。图16-13s iRNA介导的RNA干扰作用siRNA和miRNA都可以介导基因表达抑制,双链RNA分子被水解为21~23个碱基对的干扰小这种作用被称为RNA干扰(RNA interference, RNA(siRNA),siRNA与一些蛋白质形成RNA诱导RNAi)(图16-13)。的沉默复合体(RISC),并通过碱基互补与特异的'{, i!.. RN扣可通过降解特异mRNA,在转录后水mRNA结合使其降解平对基因表达进行调节机制,是生物体本身固有的一种对抗外源基因侵害的自我保护现象。它能识别、清除外源dsRNA或同源单链RNA,提供了一种防御外源核酸入侵的保护措施。同时,由于外源dsRNA导入细胞后也可以引起与dsRNA同源的mRNA降解,进而抑制其相应的基因表达,RN扣又被作为一种新技术广泛应用于功能基因组研究中。通常认为,siRNA及其介导的RNAi具有很高的特异性,但也有报道显示siRNA序列中一个或几个碱基的改变并不影响siRNA的活性。 siRNA和miRNA都属于非编码小分子RNA,它们具有一些共同的特点:均由Dicer切割产生;长度都在22个碱基左右;都与RISC形成复合体,与mRNA作用而引起基因沉默。它们之间的差异见表16-2。 项目siRNA miRNA前体内源或外源长双链RNA诱内源发夹环结构的转录导产生产物结构双链分子单链分子功能降解mRNA阻遏其翻译靶mRNA结合需完全互补不需完全互补生物学效应抑制转座子活性和病毒感染发育过程的调节(五)长非编码RNA在基因表达调控中的作用不容忽视长非编码RNA(long non-coding RNA, lncRNA)是一类转录本长度超过200个核昔酸的RNA分子,一般不直接参与基因编码和蛋白质合成,但是可在表观遗传水平、转录水平和转录后水平调控基因的表达。尽管我们目前对lncRNA的种类、数量、功能都不明确,但lncRNA在很多生命活动中发挥重要作用,与机体的生理和病理过程均有密切的关系,因此对lncRNA的研究成为当今分子生物学前沿研究领域之一。 从上述内容中我们可以看到,蛋白质特别是组蛋白的修饰对基因表达调控的影响虽然显而易见,但是真正的作用机制仍有待揭示。长久以来,人们一直关注着编码RNA,却突然发现非编码RNA也有着重要的作用。因此,全面了解非编码RNA的时空表达谱及生物学意义的“转录物组学(transcriptomics)“应运而生。人们也只有在对核酸(DNA和RNA)和蛋白质进行全面深入的研究之后,才有可能破解生命之谜。 小结 基因表达主要是基因转录及翻译的过程,产生有功能的蛋白质和RNA。个体内不同细胞的基因表达具有严格时空特异性,这种特异性主要由特异基因的启动子(序列)和(或)增强子与调节蛋白相互作用决定。 基因表达的方式有组成性表达及诱导/阻遏之分。某些基因产物对生命全过程都是必需的或必不可少的。这类基因在一个生物个体的几乎所有细胞中持续表达,称为管家基因。另有一些基因表达随外环境信号变化:有些基因对环境信号应答时被激活,基因表达产物增加,这种基因表达方式称为诱导;有些基因对环境信号应答时被抑制,基因表达产物水平降低,这种基因表达方式称为阻遏。 基因表达调控是在多级水平上进行的复杂事件。其中,转录起始调控最为重要。基因转录激活调节基本要素涉及DNA序列、调节蛋白以及这些因素对RNA聚合酶活性的影响。 大多数原核基因调控通过操纵子机制实现。E.coli乳糖操纵子的Z、Y及A三个结构基因在缺乏乳糖时,可借助阻遏蛋白结合于操纵序列而被关闭,又可因乳糖的存在失去阻遏能力而开放。CAP与调控区结合位点的结合可进一步提高乳糖操纵子的转录效率。色氨酸操纵子存在一类特殊的衰减调控作用,可使RNA的转录提前终止。 326第三篇遗传信息的传递 真核基因表达调控的某些机制与原核存在明显差别。处于转录激活状态的染色质结构会发生明显变化,如对核酸酶敏感,DNA碱基的甲基化修饰和组蛋白的乙酰化、甲基化或磷酸化修饰改变等。 真核基因转录激活受顺式作用元件与反式作用因子相互作用调节。顺式作用元件按功能特性分为启动子、增强子、沉默子及绝缘子。真核基因启动子就是决定RNA聚合酶转录起始位点的DNA序列。增强子通常远离转录起始点、决定基因的时间空间特异性表达、增强启动子转录活性的DNA序列,其发挥作用的方式通常与方向、距离无关。 真核转录因子可分为基本转录因子和特异转录因子。基本转录因子是RNA聚合酶结合启动子所必需的一组蛋白质。特异转录因子通过结合相应的调节序列而激活或阻遏相应基因的转录。所有基因的转录调节都涉及包括RNA聚合酶在内的转录起始复合物的形成。真核生物RNA转录后的加工修饰、翻译起始蛋白的活性、mRNA分子的寿命、mRNA的5'-非翻译区以及3'-非翻译区结构都会影响细胞蛋白质合成的速度。此外,miRNA和长非编码RNA对真核基因表达调控的影响也日益受到重视。 1.何谓基因表达?基因表达有哪些方式,其特点或规律是什么?2.何谓顺式作用元件?顺式作用元件在基因表达调控中有何作用?3.真核生物染色质活化有哪些主要表现? 4.何谓反式作用因子?简述真核生物转录因子的基本结构及作用。 5.何谓反义RNA、miRNA、siRNA、lncRNA和RNA干扰?(张晓伟) 第十七章细胞信号转导的分子机制 生物体内各种细胞在功能上的协调统一是通过细胞间相互识别和相互作用来实现的。在多细胞生物中,细胞间或细胞内高度精确和高效地发送与接收信息,并通过放大机制引起快速的细胞生理反应,这一过程称为细胞通讯(cell communication)。细胞对来自外界的刺激或信号发生反应,通过细胞内多种分子相互作用引发一系列有序反应,将细胞外信息传递到细胞内,并据以调节细胞代谢、增殖、分化、功能活动和凋亡的过程称为信号转导(signal transduction)。细胞通讯和信号转导过程是高等生物生命活动的基本机制。阐明细胞信号转导机制对于认识生命活动的本质具有重要的理论意义,同时也为医学的发展带来了新的机遇和挑战。 第一节细胞信号转导概述 细胞信号转导是通过多种分子相互作用的一系列有序反应,将来自细胞外的信息传递到细胞内各种效应分子的过程。通过这一过程,细胞可接收细胞间的接触刺激信号、或所处微环境中的各种化学和物理信号,并将其转变为细胞内各种分子数量、分布或活性的变化,从而改变细胞内的某些代谢过程,或改变生长速度,或改变细胞迁移等生物学行为。在某些情况下,细胞可在外来信号的诱导下进入程序化死亡过程(凋亡)。 一、细胞外化学信号有可溶性和膜结合性两种形式细胞可以感受物理信号,但体内细胞所感受的外源信号主要是化学信号。化学信号通讯的建立是生物为适应环境而不断变异、进化的结果。单细胞生物可直接从外界环境接收信息;而多细胞生物中的单个细胞则主要接收来自其他细胞的信号,或所处微环境的信息。最原始的通讯方式是细胞与细胞间通过孔道进行的直接物质交换,或者是通过细胞表面分子相互作用实现信息交流,这种调节方式至今仍然是高等动物细胞分化、个体发育及实现整体功能协调、适应的重要方式之一。但是,相距较远细胞之间的功能协调必须有可以远距离发挥作用的信号。 (—)可溶性信号分子作为游离分子在细胞间传递多细胞生物中,细胞可通过分泌化学物质(如蛋白质或小分子有机化合物)而发出信号,这些分子作用于靶细胞表面或细胞内的受体,调节靶细胞的功能,从而实现细胞之间的信息交流。可溶性信号分子可根据其溶解特性分为脂溶性化学信号和水溶性化学信号两大类;而根据其在体内的作用距离,则可分为内分泌信号、旁分泌信号和神经递质三大类(表17-1)。有些旁分泌信号还作用于发出信号的细胞自身,称为自分泌。 (二)膜结合性信号分子需要细胞间接触才能传递信号每个细胞的质膜外表面都有众多的蛋白质、糖蛋白、蛋白聚糖分子。相邻细胞可通过膜表面分子的特异性识别和相互作用而传递信号。当细胞通过膜表面分子发出信号时,相应的分子即为膜结合性信号分子,而在靶细胞表面存在与之特异性结合的分子,通过这种分子间的相互作用而接收信号,并将信号传入靶细胞内。这种细胞通讯方式称为膜表面分子接触通讯。属千这一类通讯的有相邻细胞间黏附因子的相互作用、T淋巴细胞与B淋巴细胞表面分子的相互作用等。 第三篇遗传信息的传递 二、细胞经由特异性受体接收细胞外信号 细胞接收信号时,是通过受体(receptor)将信号导入细胞内。受体通常是细胞膜上或细胞内能特异识别生物活性分子并与之结合,进而引起生物学效应的特殊蛋白质,个别糖脂也具有受体作用。能够与受体特异性结合的分子称为配体(ligand)。可溶性和膜结合性信号分子都是常见的配体。 (-)受体有细胞内受体和膜受体两种类型 按照其在细胞内的位置,受体分为细胞内受体和细胞表面受体(图17-1)。细胞内受体包括位于细胞质或胞核内的受体,其相应配体是脂溶性信号分子,如类固醇激素、甲状腺激素、维甲酸等。水溶性信号分子和膜结合性信号分子(如生长因子、细胞因子、水溶性激素分子、黏附分子等)不能进入靶细胞,其受体位于靶细胞的细胞质膜表面。 水溶性化学信号受体 细胞因子 趋化因子\\ 生物活性肤\\ 氨基酸及其衍生物核昔和核昔酸 I I'\\ 细胞内反应 类固醇激素 甲状腺激素前列腺素维生素A维生素D脂类和气体 脂溶性化学信号. (二)受体结合配体并转换信号 受体识别并与配体结合,是细胞接收外源信号的第一步反应。受体有两个方面的作用:一是识别外源信号分子并与之结合;二是转换配体信号,使之成为细胞内分子可识别的信号,并传递至其他分子引起细胞应答。 1.细胞内受体能够直接传递信号或通过特定的途径传递信号有许多细胞内受体是基因表达的调控蛋白,与进入细胞的信号分子结合后,可以直接传递信号,即直接调控基因表达。另有一些细胞内受体可以结合细胞内产生的信号分子(如细胞应激反应中产生的细胞内信号分子),直接激活效应分子或通过一定的信号转导途径激活效应分子。2.膜受体识别细胞外信号分子并转换信号膜受体识别并结合细胞外信号分子,将细胞外信号转换成为能够被细胞内分子识别的信号通过信号转导途径将信号传递至效应分子,引起细胞的应答。 (三)受体与配体的相互作用具有共同的特点受体在膜表面和细胞内的分布可以是区域性的,也可以是散在的,其作用都是识别和接收外源信号。受体与配体的相互作用有以下特点:3.可饱和性细胞内受体和细胞表面受体的数目都是有限的。增加配体浓度,可使受体与配体的结合达到饱和。当受体全部被配体占据时,再提高配体浓度不会增强效应。 4.可逆性受体与配体以非共价键结合,当生物效应发生后,配体即与受体解离。受体可恢复到原来的状态再次接收配体信息。 5.特定的作用模式受体的分布和含量具有组织和细胞特异性,并呈现特定的作用模式,受体与配体结合后可引起某种特定的生理效应。 三、细胞内多条信号转导途径形成信号转导网络 细胞内多种信号转导分子,依次相互识别、相互作用,有序地转换和传递信号。由一组特定信号转导分子形成的有序化学变化并导致细胞行为发生改变的过程称为信号转导途径(signal transduction pathway)。一条途径中的信号转导分子可以与其他途径中的信号转导分子间相互作用,不同的信号转导途径之间具有广泛的交联互动(cross-talking),形成复杂的信号转导网络(signal transd uction network)(图17-2)。信号转导途径和网络的形成是动态过程,随着信号的种类和强度的变化而不断变化。 信号转导分子:介导信号在细胞内传递的所有分子信号转导通路:信号转导过程信号转导分子的排列方式信号转导网络:信号转导通路交叉联系形成的调控系统:.............,l.一一心•····•jm7竺AAAA令··:·····i一·•..细胞骨架. 蛋白质合成;..转录因子飞 ;染色质相关蛋白飞.It RNA加工蛋白; 应答反应.:. RNA转运蛋白..:.飞细胞周期蛋白......飞.................... 在高等动物体内,细胞外信号分子的作用都具有网络调节特点。如一种细胞因子或激素的作用会受到其他细胞因子或激素的影响,发出信号的细胞又受到其他细胞信号的调节。细胞外信号分子的产生及其调控在另一个层次上形成复杂的网络系统。网络调节使得机体内的细胞因子或激素的作用都具有一定程度的冗余和代偿性,单一缺陷不会导致对机体的严重损害。一些特殊的细胞内事件也可以在细胞内启动信号转导途径。如DNA损伤、活性氧(ROS)、低氧状态等,可通过激活特定的分子而启动信号转导。这些途径可以与细胞外信号分子共用部分转导途径、共用一些信号分子,也可以是一些特殊的途径(如凋亡信号转导途径)。 330第三筒遗传信息的传递 第二节细胞内信号转导分子 细胞外的信号经过受体转换进入细胞内,通过细胞内一些蛋白质分子和小分子活性物质进行传递这些能够传递信号的分子称为信号转导分子(signal transducer)。这些分子是构成信号转导途径的基础。依据作用特点,信号转导分子主要有三大类:小分子第二信使、酶、调节蛋白。受体及信号转导分子传递信号的基本方式包括:心改变下游信号转导分子的构象;@改变下游信号转导分子的细胞内定位;@信号转导分子复合物的形成或解聚;@改变小分子信使的细胞内浓度或分布等。 —、第二信使结合并激活下游信号转导分子 配体与受体结合后并不进入细胞内,但能间接激活细胞内其他可扩散、并调节信号转导蛋白活性的小分子或离子,这些在细胞内传递信号的分子称为第二信使(second messenger),又称细胞内小分子信使。如钙离子、环腺昔酸(cAMP)、环鸟昔酸(cGMP)、环腺昔二磷酸核糖、甘油二酷(diglyceride, DAG汃肌醇1,4,5-三磷酸(inositol triphosphate, IP3汃花生四烯酸、神经酰胺、一氧化氮和一氧化碳等。 (一)小分子信使传递信号具有相似的特点 1.上游信号转导分子使第二信使的浓度升高或分布变化多数小分子信使的上游信号转导分子是酶类。这些酶被其上游信号转导分子激活,从而催化小分子信使的生成,使其浓度在细胞内迅速升高。如cAMP、cGMP、DAG、IP3等都是以这种方式产生。Ca2+则是由其上游分子改变其在细胞内的分布。 2.小分子信使浓度可迅速降低第二信使的浓度变化是传递信号的重要机制,其浓度在细胞接收信号后变化非常迅速,可以在数分钟内被检测出来。而细胞内存在相应的水解酶,可迅速将它们清除,使信号迅速终止,细胞回到初始状态,再接受新的信号。只有当其上游分子(酶)持续被激活,才能使小分子信使待续维持在一定的浓度。 3.小分子信使激活下游信号转导分子小分子信使大都是蛋白质的别构激活剂,当其结合于下游蛋白质分子后,通过改变蛋白质的构象而将其激活,从而使信号进一步传递。(二)环核昔酸是重要的细胞内第二信使目前已知的细胞内环核昔酸类第二信使有cAMP和cGMP两种。 1. cAMP和cGMP的上游信号转导分子是相应的核昔酸环化酶cAMP的上游分子是腺甘酸环化酶(adenylate cyclase, AC), AC是膜结合的糖蛋白,哺乳类动物组织来源的AC至少有8型同工酶。cGMP的上游分子是鸟背酸环化酶(guanylate cyclase, GC), GC有两种形式,一种是膜结合型的受体分子;另一种存在于细胞质。细胞质中的GC含有血红素辅基,可直接受一氧化氮(NO)和相关化,/cAMP2.环核昔酸在细胞内调节蛋白激酶活性,但蛋 、夕>0--cAMP ATP3oeAMP 白激酶不是cAMP和cGMP的唯一靶分子cAMP无活性PKA的下游分子是蛋白激酶A(protein kinase A, PK.A)。PK.A属千蛋白质丝氨酸/苏氨酸激酶类,是由2个催气(磷酸化酶b激酶)_p化亚基(C)和2个调节亚基(R)组成的四聚体。R亚i基抑制C亚基的催化活性。cAMP特异性结合R亚糖原分附反应增强基,使其变构,从而释放出游离的、具有催化活性的C i亚基(图17-3)。血糖升岛cGMP的下游分子是蛋白激酶G(protein kinase图17-3cAMP激活PKA而升高血糖作G,PKG)。PKG是由相同亚基构成的二聚体。与用机制示意图PKA不同,PKG的调节结构域和催化结构域存在于同一个亚基内。PKG在心肌及平滑肌收缩调节方面具有重要作用。环核昔酸作为别构效应剂还可以作用千细胞内其他非蛋白激酶类分子。一些离子通道可以直接受cAMP或cGMP的别构调节。 3.磷酸二酷酶催化环核昔酸水解细胞中存在多种催化环核昔酸水解的磷酸二酷酶(phosphodiesterase, PDE)。在脂肪细胞中,胰高血糖素在升高cAMP水平的同时会增加PDE活性,促进cAMP的水解这是调节cAMP浓度的重要机制。PDE对cAMP和cGMP的水解具有相对特异性。 (三)脂质也可衍生出细胞内第二信使 1.磷脂酰肌醇激酶和磷脂酶催化生成第二信使磷脂酰肌醇激酶(PI kinase, PI-K)催化磷脂酰肌醇(phosphatidylinositol,PI)的磷酸化。根据肌醇环的磷酸化轻基位置不同,这类激酶有PI-3K、PI4K和PI-5k等。而磷脂酰肌醇特异性磷脂酶C(p hospholipase C, PLC)可将磷脂酰肌醇-4,5-二磷酸(PIP2)分解成为DAG和IP3。PI-K和磷脂酶催化产生的第二信使如图17-4所示。 DAG廿肌醇-1-磷酸DAG-+l肌醇-1,4-二磷酸DAG-+l肌醇-1,4,5-三磷酸3-磷酸酶I I Pl-3K3-磷酸酶I IPI-3K3-磷酸酶I I PI-3K磷脂酰肌醇-3-磷酸磷脂酰肌醇-3,4-二磷酸磷脂酰肌醇-3,4,5-三磷酸2.脂质第二信使作用千相应的靶蛋白分子DAG是脂溶性分子,生成后仍留在质膜上。趴是水溶性分子,可在细胞内扩散至内质网或肌质网膜上,并与其受体结合。Ca2+通道是IP3的受体,结合I凡后开放,促进细胞钙库内的Ca2+迅速释放,细胞中局部Ca2+浓度迅速升高。DAG和钙离子在细胞内的靶分子之一是蛋白激酶C(PKC)。PKC属千蛋白质丝氨酸/苏氨酸激酶。目前发现的PKC同工酶有12种以上,不同的同工酶有不同的酶学特性、特异的组织分布和亚细胞定位,对辅助激活剂的依赖性亦不同。 (四)钙离子可以激活信号转导相关的酶类 1.钙离子在细胞中的分布具有明显的区域特征细胞外液游离钙浓度远高于细胞内钙浓度,而细胞内的Ca2+则有90%以上储存于细胞内钙库(内质网和线粒体内),胞质内的钙浓度很低。如果细胞质膜或细胞内钙库的Ca2+通道开启,可引起胞外钙的内流或细胞内钙库的钙释放,使胞质内Ca2+浓度急剧升高。而Ca正进入胞质后,又可再经细胞质膜及钙库膜上的钙泵(Ca2+-ATP酶)返回细胞外或细胞内钙库,维待细胞质内的低钙状态。 2钙离子的下游信号转导分子是钙调蛋白钙调蛋白(calmodulin, CaM)是一种钙结合蛋白,分子中有4个结构域,每个结构域可结合一个Ca2+。细胞质中Ca2+浓度低时,钙调蛋白不易结合Ca气随着细胞质中Ca2+浓度增高,钙调蛋白可结合不同数量的Ca2+,形成不同构象的Ca2+/CaM复合物。钙调蛋白本身无活性,形成Ca2+/CaM复合物后则具有调节功能,可调节钙调蛋白依赖性蛋白激酶的活性。 3.钙调蛋白不是钙离子的唯—靶分子除了钙调蛋白,Ca2+还结合PKC、AC和cAMP-PDE等多种信号转导分子,通过别构效应激活这些分子。(五)NO等小分子也具有信使功能细胞内一氧化氮(ni trogen monoxide, NO)合酶可催化精氨酸分解产生瓜氨酸和NO。NO可通过332第三篇遗传信息的传递激活鸟昔酸环化酶、ADP-核糖转移酶和环氧化酶等而传递信号。除了NO以外,co和H2S的第二信使作用近年来也得到证实。 二、多种酶通过酶促反应传递信号 细胞内的许多信号转导分子都是酶。作为信号转导分子的酶主要有两大类。一是催化小分子信使生成和转化的酶,如腺昔酸环化酶、鸟昔酸环化酶、磷脂酶C、磷脂酶D(PLD)等;二是蛋白激酶,作为信号转导分子的蛋白激酶主要是蛋白质丝氨酸/苏氨酸激酶和蛋白质酪氨酸激酶。 (一)蛋白激酶和蛋白磷酸酶可调控信号传递 蛋白激酶(protein kinase, PK)与蛋白磷酸酶(protein phosphatase, PP)催化蛋白质的可逆磷酸化修饰,对下游分子的活性进行调节。蛋白质的磷酸化修饰可能提高其活性,也可能降低其活性,取决于构象变化是否有利于反应的进行。它们对特定底物的催化作用特异性及其在细胞内的分布特异性决定了信号转导途径的精确性。 1.蛋白质丝氨酸/苏氨酸激酶和蛋白质酪氨酸激酶是主要的蛋白激酶蛋白激酶是催化ATP的丫-磷酸基转移至靶蛋白的特定氨基酸残基上的一类酶。迄今发现的蛋白激酶已超过800种。主要的几类蛋白激酶见表17-2。目前对蛋白质丝氨酸/苏氨酸激酶和蛋白质酪氨酸激酶类的结构与功能研究较多。 磷酸基团的受体1 琉基酰基 三;二/言昙詈]:王酸激酶 酸激酶 2.蛋白磷酸酶括抗蛋白激酶诱导的效应蛋白磷酸酶使磷酸化的蛋白质发生去磷酸化,拈抗蛋白激酶的作用,两者共同构成了蛋白质活性的调控系统。 蛋白磷酸酶的分类也是依据其所作用的氨基酸残基。目前已知的蛋白磷酸酶包括蛋白质丝氨酸/苏氨酸磷酸酶和蛋白质酪氨酸磷酸酶两大类。有少数蛋白质磷酸酶具有双重作用,可同时去除酪氨酸和丝氨酸/苏氨酸残基上的磷酸基团。 (二)许多信号途径涉及蛋白质丝氨酸庞;氨酸激酶的作用细胞内重要的蛋白质丝氨酸/苏氨酸激酶包括受环核昔酸调控的PKA和PKG、受DAG/Ca2+调控的PKC、受Ca2+/CaM调控的ca2+/CaM-PK、受PIP3调控的PKB及受丝裂原控制的丝裂原激活的蛋白激酶(mitogen activated protein kinase, MAPK)等。 (三)蛋白质酪氨酸激酶转导细胞增殖与分化信号蛋白质酪氨酸激酶(protein tyrosine kinase, PTK)催化蛋白质分子中的酪氨酸残基磷酸化。酪氨酸磷酸化修饰的蛋白质大部分对细胞增殖具有正向调节作用,无论是生长因子作用后正常细胞的增殖、恶性肿瘤细胞的增殖,还是T细胞、B细胞或肥大细胞的活化都伴随着快速发生的多种蛋白质分子的酪氨酸磷酸化。 基因家族名称举例细胞内定位主要功能 SRC家族Src、Fyn、Lek、Lyn等常与受体结合存在于质膜接受受体传递的信号发生磷酸化而激内侧活,通过催化底物的酪氨酸磷酸化向下游传递信号ZAP70家族ZAP70、Syk与受体结合存在于质膜接受T淋巴细胞的抗原受体或B淋巴内侧细胞的抗原受体的信号TEC家族Btk、Itk、Tee等存在于细胞质位于ZAP70和Src家族下游接受T淋巴细胞的抗原受体或B淋巴细胞的抗原受体的信号JAK家族JAKl、JAK2、JAK3等与一些白细胞介素受体结介导白细胞介素受体活化信号合存在于质膜内侧核内PTK Ahl、Wee细胞核参与转录过程或细胞周期调节三、信号转导蛋白通过蛋白质相互作用传递信号信号转导途径中的信号转导分子主要包括G蛋白、衔接体蛋白质和支架蛋白,其中许多信号转导分子是没有酶活性的蛋白质,它们通过分子间的相互作用被激活或激活下游分子。(—)G蛋白的GTP/GDP结合状态决定信号的传递鸟昔酸结合蛋白(guanine nucleotide-binding protein, G protein)简称G蛋白,亦称GTP结合蛋白。 分别结合GTP和GDP时,G蛋白处于不同的构象。结合GTP时处于活化形式,能够与下游分子结合,并通过别构效应而激活下游分子。G蛋白自身均具有GTP酶活性,可将结合的GTP水解为GDP,回到非活化状态,停止激活下游分子。 在细胞中存在一些专门控制低分子量G蛋白活性的调节因子。有的可增强其活性,如鸟嗦呤核昔酸交换因子,促进G蛋白结合GTP而将其激活;有的可以降低其活性,如GTP酶活化蛋白等,可促进G蛋白将GTP水解成GDP。 (二)衔接蛋白和支架蛋白连接信号转导网络 1蛋白质相互作用结构域介导信号转导途径中蛋白质的相互作用信号转导途径中的一些环节是由多种分子聚集形成的信号转导复合物(signaling complex)来完成信号传递的。信号转导复合物的形成是一个动态过程,针对不同外源信号,可聚集成不同成分的复合物。信号转导复合物形成的基础是蛋白质相互作用。蛋白质相互作用的结构基础则是各种蛋白质分子中的蛋白质相互作用结构域(protein interaction domain)。这些结构域大部分由50~100个氨基酸残基构成,其特点是(图17-5):心一个信号分子中可含有两种以上的蛋白质相互作用结构域,因此可同时结合两种以上的其他信号分子;@同一类蛋白质相互作用结构域可存在千不同的分子中。这些结构域的一级结构不同,因此选择性结合下游信号分子;@这些结构域没有催化活性。目前已经确认的蛋白质相互作用结构域已经超过40种表l7-4列举了几种主要的蛋白质相互作用结构域以及它们识别和结合的模体。v叮i}蛋白激酶BTK(亘工只勹五)一`~习四转录因子STAT~结合区}——--{SH2六-上L/细胞骨架蛋白tensin//——. s卫2六」卫L六—尸B...l厂尸SH2, iI I IHy-X-N-P-X-pY--P-X-X-P-X--P-P-X-Y--pY-X-X-Hy图17-5信号转导分子中蛋白质相互作用结构域的分布及作用图上方为蛋白质相互作用结构域在四个不同种类蛋白质中的分布,下方为几种结构域可识别和结合的结构Src homology2Src homology3Pleck strin homology Protein tyrosine binding识别模体含磷酸化酪氨酸模体富含脯氨酸模体磷脂衍生物含磷酸化酪氨酸模体蛋白质相互作用结构域是通过相应的结合位点而介导蛋白质分子间的相互作用。例如,一个蛋白分子中有SH2结构域,另一个蛋白质分子经磷酸化作用而产生SH2结合位点,两个蛋白质分子就可以通过SH2结构域和SH2结合位点相互作用。 第三节细胞受体介导的细胞内信号转导 不同信号转导分子的特定组合及有序的相互作用,构成不同的信号转导途径。因此,对信号转导的了解,关键是各种信号转导途径中信号转导分子的基本组成、相互作用及引起的细胞应答。 目前将各种细胞内受体归为一类;而依据结构、接收信号的种类、转换信号方式等差异,膜表面受体则分为三种类型:离子通道受体、GPCR(七次跨膜受体)和酶偶联受体(单次跨膜受体)(表17-5)。每种类型的受体都有许多种,各种受体激活的信号转导途径由不同的信号转导分子组成,但同一类型受体介导的信号转导具有共同的特点。本节以几类典型受体所介导的信号转导途径为例,介绍细胞a信号转导的基本特点。 特性离子通道受体G蛋白偶联受体酶偶联受体 配体神经递质神经递质,激素,趋化因子,外源生长因子,细胞因子刺激(味、光) 结构寡聚体形成的孔道单体具有或不具有催化活性的单体功能离子通道激活G蛋白激活蛋白激酶细胞应答去极化与超极化去极化与超极化,调节蛋白质功调节蛋白质的功能和表达水平,调能和表达水平节细胞分化和增殖一、细胞内受体通过分子迁移传递信号位于细胞内的受体多为转录因子。当与相应配体结合后,能与DNA的顺式作用元件结合,在转录水平调节基因表达。在没有信号分子存在时,受体往往与具有抑制作用的蛋白质分子(如热激蛋白)形成复合物,阻止受体与DNA的结合。没有结合信号分子的胞内受体主要位于细胞质中,有一些则在细胞核内。 能与该型受体结合的信号分子有类固醇激素、甲状腺激素、视黄酸和维生素D等。当激素进入细胞后,如果其受体是位于细胞核内,激素被运输到核内,与受体形成激素-受体复合物。如果受体是位于细胞质中,激素则在细胞质中结合受体,导致受体的构象变化,与热激蛋白分离,并暴露出受体的核内转移部位及DNA结合部位,激素-受体复合物向细胞核内转移,穿过核孔,迁移进入细胞核内,并结合于其靶基因邻近的激素反应元件上。结合于激素反应元件的激素-受体复合物再与位于启动子区域的基本转录因子及其他的特异转录询节分子作用,从而开放或关闭其靶基因,进而改变细胞的基因表达谱(图17-6)。不同的激素-受体复合物结合千不同的激素反应元件(表17-6)。 细胞外 细胞质工O脂溶性信号结合区 DNA结合区及核定位区暴露 图17-6细胞内受体结构及作用机制示意图脂溶性激素受体存在于细胞内,它们通常都是转录因子,分子中具有锌指结构作为其DNA结合区。在没有激素作用时,受体与抑制蛋白(热激蛋白)形成复合物,因此阻止了受体向细胞 核的移动及其与DNA的结合。当激素与受体结合时,受体构象发生变化,导致热休克蛋白与其解聚,暴露出受体的核内转移部位及DNA结合部位,激素-受体复合物向核内转移,并结合 @在特异基因的激素反应元件上,诱导相应的基因表达,引起细胞功能改变激素举例受体所识别的DNA特征序列肾上腺皮质激素5'-AGAACAXXXTGTTCT-3'3'-TCTTGTXXXACAAGA-5'雌激素5'-AGGTCAXXXTGACCT-3'3'-TCCAGTXXXACTGGA-5'甲状腺激素5'-AGGTCATGACCT-3'3'-TCCAGTACTGGA-5'二、离子通道型受体将化学信号转变为电信号离子通道型受体是一类自身为离子通道的受体。离子通道是由蛋白质寡聚体形成的孔道,其中部分单体具有配体结合部位。通道的开放或关闭直接受化学配体的控制,称为配体门控受体型离子通道,其配体主要为神经递质。 离子通道受体的典型代表是N型乙酰胆碱受体,由B、丫、8亚基以及2个a亚基组成。a亚基具有配体结合部位。两分子乙酰胆碱的结合可使通道开放,但即使有乙酰胆碱的结合,该受体处于通道开放构象状态的时限仍十分短暂,在几十毫微秒内又回到关闭状态。然后乙酰胆碱与之解离,受体恢复到初始状态,做好重新接受配体的准备(图17-7)。国侧切观配体结合,通道巳关闭图17-7N型乙酰胆碱受体的结构与功能模式图乙酰胆碱受体由5个同源性很高的亚基构成,包括2个a亚基,1个6亚基,1个丫亚基和1个8亚基。每一个亚基都是一个四次跨膜蛋白,跨膜部分为四个a螺旋结构,其中一个是亲水性a螺旋(含较多的极性氨基酸),五个亚基的亲水性a螺旋共同在膜中形成一个亲水性的通道。乙酰胆碱的结合部位位于a亚基上。乙酰胆碱受体可以三种构象存在。两分子乙酰胆碱的结合可以使之处于通道开放构象,但即使有乙酰胆碱的结合,通道开放构象持续的时间仍十分短暂,在几十毫微秒内又回到关闭状态,然后乙酰胆碱与之解离,受体恢复到初始状态,做好重新接受配体的准备离子通道受体信号转导的最终效应是细胞膜电位改变。这类受体引起的细胞应答主要是去极化与超极化。可以认为,离子通道受体是通过将化学信号转变成为电信号而影响细胞功能的。离子通道型受体可以是阳离子通道,如乙酰胆碱、谷氨酸和5-胫色胺的受体;也可以是阴离子通道,如甘氨酸和丫-氨基丁酸的受体。阳离子通道和阴离子通道的差异是由千构成亲水性通道的氨基酸组成不同,'也因而通道表面携带有不同电荷所致。 三、G蛋白偶联受体通过G蛋白和小分子信使介导信号转导G蛋白偶联受体(GPCR)在结构上为单体蛋白,氨基端位于细胞膜外表面,狻基端在胞膜内侧,其肤链反复跨膜七次,因此又称为七次跨膜受体。由千肤链反复跨膜,在膜外侧和膜内侧形成了几个环状结构,分别负责接受外源信号(化学、物理信号)的刺激和细胞内的信号传递,受体的胞内部分可与三聚体G蛋白相互作用。此类受体通过G蛋白向下游传递信号,因此称为G蛋白偶联受体。 (-)G蛋白偶联受体介导的信号转导途径具有相同的基本模式不同的G蛋白(不同的a陌组合)可与不同的下游分子组成信号转导途径。GPCR介导的信号传递可通过不同的途径产生不同的效应,但信号转导途径的基本模式大致相同,主要包括以下几个步骤或阶段:O细胞外信号分子结合受体,通过别构效应将其激活。@受体激活G蛋白,G蛋白在有活性和无活性状态之间连续转换,称为G蛋白循环(G protein cycle)(图17-8)。@活化的G蛋白激活下游效应分子。不同的a亚基激活不同的效应分子,如AC、PLC等效应分子都是由不同的G蛋白所激活(表17-7)。有的a亚基可以激活AC,称为a,(s代表stimulate);有的a亚基可以抑制AC,称为a,(1代表inh心t)。@G蛋白的效应分子向下游传递信号的主要方式是催化产生小分子信使,如AC催化产生cAMP,PLC催化产生DAG和IP3。有些效应分子可以通过对离子通道的调节改变Ca2+在细胞内的分布,其效应与IP3的效应相似。@小分子信使作用于相应的靶分子(主要是蛋白激酶),使之构象改变而激活。@蛋白激酶通过磷酸化作用激活一些与代谢相关的酶、与基因表达相关的转录因子以及一些与细胞运动相关的蛋白质,从而产生各种细胞应答反应。 效应分子细胞外E ll嫘霆质膜 胞内细恢复了三聚体的 蛋白可再次接受受体信号 G 图17-8G蛋白循环配体激活的受体与G蛋白结合,使之发生构象改变,a亚基与GDP的亲和力下降,因而释放GDP,随即与GTP结合。a亚基结合了GTP后即与陌亚基解离,成为活化状态的a亚基,能够结合并激活下游的效应分子。而下游分子则可激活a亚基的GTP酶活性,将GTP水解成GDP,a亚基又恢复到原来的构象,从而与效应分子解离,重新与衍亚基结合形成三聚体,回到静止状态(二)不同G蛋白偶联受体可通过不同途径传递信号不同的细胞外信号分子与相应受体结合后,通过G蛋白传递信号,但传入细胞内的信号并不一样。这是因为不同的G蛋白与不同的下游分子组成了不同的信号转导途径。有几条途径是较常见的,本节主要介绍其中3条途径(图17-9)。 配体r配体i 受体==气芝=王 墓:言勹三厂p:E1:勹言质膜 C l rPKc)Asp气(Gq+通了气PKA 促肾上腺皮质激素等可激活此途径。 lAC勹二 AMP白效三LC:;C:M改激变酶 PKA活化后,可使多种蛋白质底物的丝ATp 氨酸/苏氨酸残基发生磷酸化,改变其活性状态,底物分子包括一些糖代谢和脂代谢相关的酶类、离子通道和某些转录因子。 质应 效应蛋白质效应蛋白质 (1)调节代谢:PKA可通过调节关 生物学效应生物学效应 键酶的活性,对不同的代谢途径发挥调 节作用,如激活糖原磷酸化酶b激酶、激 素敏感脂肪酶、胆固醇酷酶,促进糖原、脂肪、胆固醇的分解代谢;抑制乙酰CoA狻化酶、糖原合酶,抑制脂肪合成和糖原合成。 2. IP3/DAG-PKC途径促甲状腺素释放激素、去甲肾上腺素、抗利尿素与受体结合后所激活的G蛋白可激活PLC。PLC水解膜组分PIP2,生成DAG和IP3。I凡促进细胞钙库内的Ca2+迅速释放,使回细胞质内的Ca2+浓度升高。Ca2+与细胞质内的PKC结合并聚集至质膜。质膜上的DAG、磷脂酰丝氨,?酸与Ca“共同作用千PKC的调节结构域,使PKC变构而暴露出活性中心。(动画17-2"IP3/DAG-PKC受PKC磷酸化修饰的蛋白质包括一些质膜受体、膜蛋白及多种酶,因此,PKC可参与多种生理功能的调节。此外,PKC能使立早基因(immediate-early gen e)的转录调控因子磷酸化,加速立早基因的表达。立早基因多数为细胞原癌基因(如c-fos),其表达产物经磷酸化修饰后,进一步活化晚期反应基因并促进细胞增殖。3. Ca2+/钙调蛋白依赖的蛋白激酶途径G蛋白偶联受体至少可通过三种方式引起细胞内Ca2+彸吓巳浓度升高:某些G蛋白可以直接激活细胞质膜上的钙通道,或通过PKA激活细胞质膜的钙通道,促进Ca2+流入细胞质;或通过I凡促使细胞质钙库释放Ca气细胞质中的Ca"浓度升高后,通过结合钙调蛋白传递信号。Ca2+/CaM复合物的下游信号转导分子是一些蛋白激酶,它们的共同特点是可被Ca2+/CaM复合物激活,因而统称为钙调蛋白依赖性蛋白激酶。钙调蛋白依赖性激酶属于蛋白质丝氨酸/苏氨酸激酶,如肌球蛋白轻链激酶(MLCK)、磷酸化酶激酶(PhK)、钙调蛋白依赖性激酶(Cal-PK)I、II、ill等。这些激酶可激活各种效应蛋白质,可在收缩和运动、物质代谢、神经递质的合成、细胞分泌和分裂等多种生理过程中起作用。如Cal-PK II可修饰激活突触蛋白I、酪氨酸胫化酶、色氨酸胫化酶、骨骼肌糖原合酶等,参与神经递质的合成与释放以及糖代谢等多种细胞功能的调节。 四、酶偶联受体主要通过蛋白质修饰或相互作用传递信号酶偶联受体主要是生长因子和细胞因子的受体。此类受体介导的信号转导主要是调节蛋白质的功能和表达水平、调节细胞增殖和分化。 (一)蛋白激酶偶联受体介导的信号转导途径具有相同的基本模式蛋白激酶偶联受体介导的信号转导途径较复杂。细胞内的蛋白激酶有许多种,不同蛋白激酶组合成不同的信号转导途径。各种途径的具体作用模式虽有差别,但基本模式大致相同,主要包括以下几个阶段:心胞外信号分子与受体结合,导致第一个蛋白激酶被激活。这一步反应是"蛋白激酶偶联受体”名称的由来。"偶联“有两种形式。有的受体自身具有蛋白激酶活性,此步骤是激活受体胞内结构域的蛋白激酶活性。有些受体自身没有蛋白激酶活性,此步骤是受体通过蛋白质蛋白质相互作用激活某种蛋白激酶。@通过蛋白质-蛋白质相互作用或蛋白激酶的磷酸化修饰作用激活下游信号转导分子,从而传递信号,最终仍是激活一些特定的蛋白激酶。@蛋白激酶通过磷酸化修饰激活代谢途径中的关键酶、转录调控因子等,影响代谢途径、基因表达、细胞运动、细胞增殖等。 (二)常见的蛋白激酶偶联受体介导的信号转导途径目前已发现的蛋白激酶偶联受体介导的信号转导途径有十几条,如JAK-STAT途径、Smad途径、PI-3K途径、NF-KB途径等,本节介绍最常见的MAPK途径。以丝裂原激活的蛋白激酶(MAPK)为代表的信号转导途径称为MAPK途径,其主要特点是具有MAPK级联反应。MAPK至少有12种,分属于ERK家族、p38家族、JNK家族。这3条信号转导途径的组成和信号转导的细胞内效应见图17-10。 在不同的细胞中,MAPK途径的成员组成及诱导的细胞应答有所不同。其中了解最清楚的是Ras/MAPK途径(图17-11)(动画17-3"Ras/MAPK信号途径”)。Ras/MAPK途径转导生长因子,如表皮生长因子(EGF)信号,其基本过程是:O受体与配体结合后形成二聚体,激活受体的蛋白激酶活性;©受体自身酪氨酸残基磷酸化,形成SH2结合位点,从而能够结合含有SH2结构域的接头、蛋白Grb2;@Grb2的两个SH3结构域与SOS分子中的富含脯氨酸序列结合,将SOS活化;@活化的SOS结合Ras蛋白,促进Ras释放GDP、结合GTP;@活化的Ras蛋白(Ras-GTP)可激活MAPKKK,活化的MAPKKK可磷酸化MAPKK而将其激活,活化的MAPKK将MAPK磷酸化而激活;@活化的MAPK可以转位至细胞核内,通过磷酸化作用激活多种效应蛋白,从而使细胞对外来信号产生生物学应答。 上述Ras/MAPK途径是EGFR的主要信号途径之一。此外,许多单次跨膜受体也可以激活这一信号途径,甚至G蛋白偶联受体也可以通过一些调节分子作用在这一途径。由于EGFR的胞内段存在着多个酪氨酸磷酸化位点,因此除Grb2外,还可募集其他含有SH2结构域的信号转导分子,激活PLC-IP3/DAG-PKC途径、PI-3K等其他信号途径。 340第三篇遗传信息的传递 受体体 熙础 Ras二之Ra8\GDP\\ 其他信号转导分子-cdc42/Rac 等子因录转 核的胞用细作 入进 所酶 细胞增殖、细胞转化细胞分化 RRRRRt臣1f穴RRRRI巴·?i臣飞fffffffffff?ffffffffffffffffffffffff?ff 细胞膜 嘉句严心心贷;闷嘉嘉嘉吵守U毋邑嘉嘉邸嘉嘉 ',、^CTP义夕 MAPK三级级联激活 第四节细胞信号转导的基本规律 每一条信号转导途径都是由多种信号转导分子组成,不同分子间有序地依次进行相互作用,上游分子引起下游分子的数量、分布或活性状态变化,从而使信号向下游传递。信号转导分子之间的相互作用构成了信号转导的基本机制。 一、信号的传递和终止涉及许多双向反应 信号的传递和终止实际上就是信号转导分子的数量、分布、活性转换的双向反应。如AC催化生成cAMP而传递信号,磷酸二酷酶则将cAMP迅速水解为5'-AMP而终止信号传递。以Ca2+为细胞内信使时,Ca2+可以从其贮存部位迅速释放,然后又通过细胞Ca2+泵作用迅速恢复初始状态。PLC催化PIP2分解成DAG和IP3而传递信号,DAG激酶和磷酸酶分别催化DAG和IP3转化而重新合成PIP2。对于蛋白质信号转导分子,则是通过与上、下游分子的迅速结合与解离而传递信号或终止信号传递,或者通过磷酸化作用和去磷酸化作用在活性状态和无活性状态之间转换而传递信号或终止信号传递。 二、细胞信号在转导过程中被逐级放大 细胞在对外源信号进行转换和传递时,大都具有信号逐级放大的效应。G蛋白偶联受体介导的信号转导过程和蛋白激酶偶联受体介导的MAPK途径都是典型的级联反应过程。 三、细胞信号转导途径既有通用性又有专—性 细胞内许多信号转导分子和信号转导途径常常被不同的受体共用,而不是每一个受体都有专用的分子和途径。换言之,细胞的信号转导系统对不同的受体具有通用性。信号转导途径的通用性使得细胞内有限的信号转导分子可以满足多种受体信号转导的需求。另一方面,不同的细胞具有不同的受体,而同样的受体在不同的细胞又可利用不同的信号转导途径,同一信号转导途径在不同细胞中的最终效应蛋白又有所不同。因此,配体-受体-信号转导途径-效应蛋白可以有多种不同组合,而一种特定组合决定了一种细胞对特定的细胞外信号分子产生专一性应答。 四、细胞信号转导途径具有多样性 配体-受体-信号转导分子效应蛋白并不是以一成不变的固定组合构成信号转导途径,细胞信号转导是复杂的,且具有多样性。这种复杂性和多样性反映在以下几个方面。 (-)一种细胞外信号分子可通过不同信号转导途径影响不同的细胞白介素lB(IL-lB)是在局部和全身炎症反应中起核心作用的细胞因子。然而,由千其受体分布广泛,IL-1[3的作用并不仅限于炎症。IL-1[3可以通过G蛋白偶联受体(涉及cAMP途径、cGMP途径、PKC途径等)和蛋白激酶偶联受体介导的MAPK途径传递信号。近年又发现IL-1[3可通过其他几条重要途径介导信号转导,包括:IL-1受体相关激酶途径、PI-3K途径、JAK-STAT途径、离子通道。IL-1[3受体在多种细胞表面存在,受体可通过不同信号转导途径传递信号,它不仅可以作用于各种炎症相关细胞,还可以通过JAK-STAT途径作用于胰岛B细胞,通过激活离子通道影响神经细胞、血管平滑肌细胞、成纤维细胞、骨髓基质细胞等多种细胞的功能。 (二)受体与信号转导途径有多样性组合 一种受体并非只能激活一条信号转导途径。有些受体自身磷酸化后产生多个与其他蛋白相互作用的位点,可以激活几条信号转导途径。如血小板衍生生长因子(PDGF)的受体激活后,可激活Src激酶活性、结合Grb2并激活Ras、激活PI-3K、激活PLC-y,因而同时激活多条信号转导途径而引起复杂的细胞应答反应。另一方面,一条信号转导途径也不是只能由一种受体激活,例如,有多种受体可以激活PI-3K途径。(三)一种信号转导分子不一定只参与一条途径的信号转导GPCRs主要是促进第二信使产生而调节代谢,因而GPCRs一般是在分化成熟的组织细胞参与信号转导。但GPCRs在某些增殖细胞中也可表达,在这些细胞中,G蛋白的阶二聚体可激活Src激酶家族(如Src、Fyn、Lyn和Yes蛋白酪氨酸激酶)(动画17-4"G蛋白的阶二聚体”),后者使She的酪氨酸残基磷酸化,形成SH2结合位点,从而与Grb2结合形成Shc-Grb2复合物,通过SOS、Ras蛋白激活MAPK途径,调控细胞增殖所需基因的转录。 (四)一条信号转导途径中的功能分子可影响和调节其他途径细胞内的信号转导途径并不是各自独立存在,不同途径之间存在着多种交互的联系。当一条途径中的信号转导分子对另一条途径中的信号转导分子发挥调节作用时,可对该途径发挥调控作用。下面两个例子可使我们对此有一个初步了解。 1. Ras/MAPK途径可调节Smad途径Ras/ERK途径转导的信号可促进细胞增殖,而Smad途径转导的信号则抑制细胞增殖。对于正常上皮细胞,作为维持细胞稳态的TGF-(3占主导地位,并对抗由生长因子经Ras途径激活的增殖反应。然而,当大量的生长因子(如EGF、HGF)刺激细胞或RAS基因激活后,使Ras/ERK途径激活,活化的ERKl/2蛋白激酶将Smacl2/3等分子的特定位点磷酸化,使Smad2/3向核内聚集的能力减弱,从而削弱了Smad传递信号的作用。此时增殖成为细胞的主要反应。 2.蛋白激酶C可调节蛋白质酪氨酸激酶系统PKC是肌醇磷脂系统的重要酶,但它可对蛋白酪氨酸激酶系统产生调节作用。PKC通过磷酸化修饰EGF受体、Ras、Raf-1等,对Ras/MAPK途径产生调节作用。 (五)不同信号转导途径可参与调控相同的生物学效应趋化因子是体内一类能够诱导特定细胞趋化运动的分子。趋化因子受体是一类表达于不同类型细胞上的GPCR。然而趋化因子可以通过不同的信号转导途径传递信号,如激活PK.A途径、洞节细胞内Ca2+浓度、G蛋白陌亚单位和磷酸酪氨酰肤协同作用可激活PI-3K途径、MAPK途径,还可以激活JAK-STAT途径。这些信号途径不同,但都参与调控细胞趋化运动。 第五节细胞信号转导异常与疾病 信号转导机制研究在医学发展中的意义主要体现在两个方面,一是对发病机制的深入认识,二是为疾病诊断提供新的标记物和治疗提供新靶位。目前,人们对信号转导机制及信号转导异常与疾病关系的认识还相对有限,该领域研究的不断深入将为新的诊断和治疗技术提供更多的依据。 一、信号转导异常可发生在两个层次 引起细胞信号转导异常的原因是多种多样的,基因突变、细菌毒素、自身抗体和应激等均可导致细胞信号转导的异常。细胞信号转导异常可以局限千单一途径,亦可同时或先后累及多条信号转导途径造成信号转导网络失衡。细胞信号转导异常的原因和机制虽然很复杂,但基本上可从两个层次来认识,即受体功能异常和细胞内信号转导分子的功能异常。 (—)受体异常激活和失能 1受体异常激活在正常情况下,受体只有在结合外源信号分子后才能激活,并向细胞内传递信号。但基因突变可导致异常受体的产生,不依赖外源信号的存在而激活细胞内的信号途径。如EGF受体只有在结合EGF后才能激活MAPK途径,但ERB-B癌基因表达的变异型EGF受体则不同,该受体缺乏与配体结合的胞外区,而其胞内区则处千活性状态,因而可持续激活MAPK途径。 在某些条件下,受体编码基因可因某些因素的调控作用而过度表达,使细胞表面呈现远远多于正常细胞的受体数量。在这种情况下,外源信号所诱导的细胞内信号转导途径的激活水平会远远高于正常细胞,使靶细胞对外源信号的刺激反应过度。外源信号异常也可导致受体的异常激活。如自身免疫性甲状腺病中,病人产生针对促甲状腺激首厂.回言;ro言言二二°Tns言言勹有体TOSHTS;:廿言二两T种SH言了勹本动蠡2.受体异常失活受体分子数量、结构或调节功能发生异常变化时,可导致受体异常失能,不能正常传递信号。如基因突变可导致遗传性胰岛素受体异常,包括:心受体合成减少或结构异常的受体在细胞内分解加速导致受体数量减少;@受体与配体的亲和力降低,如735位精氨酸突变为丝氨酸可导致受体与胰岛素亲和力下降;@RTK活性降低,如1008位甘氨酸突变为缅氨酸可致胞内区PTK结构域异常,从而使之磷酸化酪氨酸残基的能力减弱。在这些情况下,受体均不能正常传递胰岛素的信号。 自身免疫性疾病中产生的自身抗体,也可能导致特定受体失活。如前述自身免疫性甲状腺病中产生的TSH受体的两种抗体中,有一种是阻断性抗体。这种抗体与TSH受体结合后,可抑制受体与TSH结合,从而减弱或抑制受体的激活,不能传递TSH的信号。 (二)信号转导分子的异常激活和失活 细胞内信号转导分子可因各种原因而发生功能的改变。如果其功能异常激活,可持续向下游传递信号,而不依赖外源信号及上游信号转导分子的激活。如果信号转导分子失活,则导致信号传递的中断,使细胞失去对外源信号的反应性。 1.细胞内信号转导分子异常激活细胞内信号转导分子的结构发生改变,可导致其激活并维持在活性状态。如三聚体G蛋白的a亚基可因基因突变而发生功能改变。当a亚基的201位精氨酸被半胱氨酸或组氨酸所取代、或227位谷氨酰胺被精氨酸取代时,可致a亚基失去GTP酶活性,使a亚基处于持续激活状态,因而待续向下游传递信号。此外,霍乱毒素的A亚基进入小肠上皮细胞后,可酉汰沉祀回直接结合G蛋白的a亚基,使其发生ADP-核糖化修饰,抑制其GTP酶活性,导致a亚基持续激活(动画17-6“霍乱毒素致病机制”)。小分子G蛋白Ras也可因基因突变而导致其异常激活。Ras的12位或13位甘氨酸、61位谷氨酰胺被其他氨基酸取代时,均可导致Ras的GTP酶活性降低,使其处千持续活化状态。 2.细胞内信号转导分子异常失活细胞内信号转导分子表达降低或结构改变,可导致其失活。胰岛素受体介导的信号转导途径中包括PI-3K途径。基因突变可导致PI-3K的p85亚基表达下调或结构改变,使PI-3K不能正常激活或不能达到正常激活水平,因而不能正常传递胰岛素信号。 在遗传性假性甲状旁腺素低下疾病中,甲状旁腺素信号途径中G蛋白的a亚基基因的起始密码子突变为GTG,使得核糖体只能利用第二个ATG(第60位密码子)起始翻译,产生N-端缺失了59个氨基酸残基的异常a亚基,从而使G蛋白不能向下游传递信号。 二、信号转导异常可导致疾病的发生 异常的信号转导可使细胞获得异常功能或者失去正常功能,从而导致疾病的发生,或影响疾病的过程。许多疾病的发生和发展都与信号转导异常有关。本节主要通过一些具体的例子说明较典型的信号转导异常与疾病的关系。 (一)信号转导异常导致细胞获得异常功能或表型1细胞获得异常的增殖能力正常细胞的增殖在体内受到严格控制。机体通过生长因子调控细胞的增殖能力。当ERB-B癌基因异常表达时,细胞不依赖EGF的存在而待续产生活化信号,从而使细胞获得持续增殖的能力。MAPK途径是调控细胞增殖的重要信号转导途径,RAS基因突变时,使Ras蛋白处于持续激活状态,因而使MAPK途径待续激活这是肿瘤细胞持续增殖的重要机制之一。\叩9@(二)信号转导异常导致细胞正常功能缺失1.失去正常的分泌功能如TSH受体的阻断性抗体可抑制TSH对受体的激活作用,从而抑制甲状腺素的分泌,最终可导致甲状腺功能减退。 2.失去正常的反应性慢性长期儿茶酚胺刺激可以导致B-肾上腺素能受体(~-AR)表达下降,并使心肌细胞失去对肾上腺素的反应性,细胞内cAMP水平降低,从而导致心肌收缩功能不足。 3.失去正常的生理调节能力胰岛素受体异常是一个最典型的例子。由于细胞受体功能异常而不能对胰岛素产生反应,不能正常摄入和贮存葡萄糖,从而导致血糖水平升高。 抗利尿激素(antidiuretic hormone,ADH)的受体是G蛋白偶联受体,ADHV2受体位于远端肾小管或集合管上皮细胞膜。该受体激活后,通过cAMP-PKA途径使微丝微管磷酸化,促进位于细胞质内的水通道蛋白向集合管上皮细胞管腔侧膜移动并插入膜内,集合管上皮细胞膜对水的通透性增加,管腔内水进入细胞,并按渗透梯度转移到肾间质,使肾小管腔内尿液浓缩。基因突变可导致ADH受体合成减少或受体胞外环结构异常,不能传递ADH的刺激信号,集合管上皮细胞不能有效进行水的重吸收,导致肾性尿崩症的发生。 三、细胞信号转导分子是重要的药物作用靶位 细胞信号转导机制研究的发展,尤其是对于各种疾病过程中的信号转导异常的不断认识,为发展新的疾病诊断和治疗手段提供了更多的机会。在研究各种病理过程中发现的信号转导分子结构与功能的改变为新药的筛选和开发提供了靶位,由此产生了信号转导药物这一概念。信号转导分子的激动剂和抑制剂是信号转导药物研究的出发点,尤其是各种蛋白激酶的抑制剂更是被广泛用作母体药物进行抗肿瘤新药的研发。 一种信号转导干扰药物是否可以用于疾病的治疗而又具有较小的副作用,主要取决于两点。一是它所干扰的信号转导途径在体内是否广泛存在,如果该途径广泛存在于各种细胞内,其副作用则很难控制。二是药物自身的选择性,对信号转导分子的选择性越高,副作用就越小。基于上述两点,人们一方面正在努力筛选和改造已有的化合物,以发现具有更高选择性的信号转导分子的激动剂和抑制剂,同时也在努力了解信号转导分子在不同细胞的分布情况。这些努力已经使得一些药物得以用千临床,特别是在肿瘤治疗领域。 细胞通讯和细胞信号转导是机体内一部分细胞发出信号,另一部分细胞接收信号并将其转变为细胞功能变化的过程。细胞信号转导的相关分子包括细胞外信号分子、受体、细胞内信号转导分子。信号的传递和终止、信号转导过程中的级联放大效应、信号转导途径的通用性和特异性、信号转导途径的复杂且多样性形成了细胞信号转导的基本规律。受体的基本类型包括细胞内受体和膜表面受体两大类。膜受体又有离子通道型受体、G蛋白偶联受体和蛋白激酶偶联受体三个亚类。受体的功能是结合配体并将信号导入细胞。各种信号转导分子的特定组合及有序的相互作用,构成了不同的信号转导途径。信号转导分子通过引起下游分子的数量、分布或活性状态变化而传递信号。小分子信使以浓度和分布的迅速变化为主,蛋白质信号转导分子通过蛋白质的相互作用而传递信号。受体或细胞内信号转导分子的数量或结构改变,可导致信号转导途径的异常激活或失活,从而使细胞产生异常功能或失去正常功能,导致疾病的发生或影响疾病的进程。 思考题 1.一种受体为什么可以同时激活几条信号转导途径?2.当外源信号分子刺激细胞时,细胞内信号传递和终止的双向反应是否同时发生?为什么? 3.在GPCR介导的信号途径中,为什么会存在G蛋白循环这一反应?有何意义? 4.蛋白质分子中有许多含有经基的氨基酸残基,作为信号转导分子的蛋白激酶在修饰底物时,是将底物蛋白分子的所有含径基的氨基酸残基都磷酸化,还是只将一个(或某几个)氨基酸残基磷酸化? (黄建) 第四篇 医学生化专题 人类健康依赖于体内所有的分子保持正常的结构功能和有序的反应,而一切非健康或疾病状态的产生和发展都有其特有的分子基础。近百余年,生物化学与分子生物学的发展已经为从分子层次认识疾病的发生和发展机制提供了新的理论。本篇所涉及的理论知识是理解疾病状态下机体的生物化学与分子生物学变化的重要基础。 本篇首先关注的是重要组织器官的生物化学特点。尽管在代谢调节一章中已有一些阐述,本篇还是独立为肝和血液设章。血液的有形细胞成分参与02与CO2的运输、防御病原微生物入侵等重要功能;血液中的可溶性蛋白质成分和非蛋白质成分,更是种类繁多,功能多样。肝是有机体物质代谢的大本营,除在三大营养物质代谢中发挥重要作用外,还在维生素、激素、胆汁酸和其他非营养物质代谢方面起到至关重要的作用。 正常生理活动的完成,或者说生物大分子的作用始终离不开维生素和微量元素。这些物质的特殊生物化学作用是必不可少的生物化学内容。维生素的发现和认识在近代医学发展中具有重要历史地位。维生素缺乏病曾是人类的常见病,发现和合成各种维生素的科学家对这些疾病的诊断和治疗作出了巨大贡献。十余名科学家先后在7个年度,因他们在各种维生素研究中的贡献获得诺贝尔生理学或医学奖。无机元素对维待人体正常生理功能必不可少,在体内一般结合成化合物或络合物,广泛分布千各组织中,含量较恒定。微量元素通过参与构成酶活性中心或辅酶、激素和维生素等在体内发挥十分重要的生理功能。 基因和疾病的关系是医学的重大问题之一,入类的多种疾病都与基因的结构、功能、或表达异常有关。因此,在医学研究中,对基因的研究是必不可少的内容。正常细胞活动中癌基因、抑癌基因、生长因子的作用,其激活或失活在肿瘤发生发展中的意义,尤其是以癌基因/抑癌基因为靶标的肿瘤靶向治疗研究为人类攻克肿瘤带来了希望。因此,将有关知识归入本专题篇加以叙述,作为从基因变异层次认识复杂疾病的一个范例。 医学所涉及的生物化学与分子生物学问题复杂多样,从本篇获得的知识将仅仅是冰山一角。(药立波) 第十八章血液的生物化学 血液(blood)是流动于心血管系统内的液体组织,主要发挥运输物质的作用。正常人体的血液总量约占体重的8%,由血浆(plasma)、血细胞和血小板组成。血浆占全血容积的55%~60%。血液凝固后析出淡黄色透明液体,称作血清(serum)。 正常入血液的含水量约为77%~81%,比重为1.050-1.060,它主要取决于血液内的血细胞数和蛋白质的浓度。血液的pH为7.40的.05,血浆渗透压在37°C时接近7.70xl02kPa,即300m0sm/kg·H20。 血浆的固体成分可分为无机物和有机物两大类。无机物主要以电解质为主,重要的阳离子有Na\K\Ca2\Mg2+,重要的阴离子有Cl\HCO3\HPO42一等,它们在维持血浆晶体渗透压、酸碱平衡以及神经肌肉的正常兴奋性等方面起重要作用。有机物包括蛋白质、非蛋白质类含氮化合物、糖类和脂质等。非蛋白质类含氮化合物主要有尿素、肌酸、肌酸酐、尿酸、胆红素和氨等,它们中的氮总量称为非蛋白质氮(non-protein nitrogen, NPN)。正常人血中NPN含量为14.28-24.99mmoVL。其中血尿素氮(bloodurea nitrogen, BUN)约占NPN的1/2。 第一节血浆蛋白质—、血浆蛋白质的分类与性质 入血浆中蛋白质总浓度为70-75g/L,它们是血浆主要的固体成分。血浆蛋白质种类很多,目前已知的血浆蛋白质有200多种,其中既有单纯蛋白质又有结合蛋白质,如糖蛋白和脂蛋白,血浆中还有几千种抗体。血浆内各种蛋白质的含量差异很大,多者每升达数十克,少的仅为毫克水平。 可将血浆蛋白质分成5条区带:清蛋白(albumin,又称白蛋白)、m球蛋白(globulin)、0'.2球蛋白、B球蛋白和丫球蛋白(图18-1、表18-1)。清蛋白是人体血浆中最主要的蛋白质,浓度达38-48g/L,约占血浆总蛋白的50%。肝每天约合成12g清蛋白。清蛋白以前清蛋白的形式合成,成熟的清蛋白是含585个氨基酸残基的单一多肤链,分子形状呈椭圆形。球蛋白的浓度为15-30g/L。正常的清蛋白与球蛋白的比例(A/G)为1.5-2.5。血浆蛋白质电泳是临床常用的辅助诊断方法。 正常含量血浆蛋白质种类生成部位主要功能(g/100ml血浆) 清蛋白肝维持血浆渗透压、运输3.8~4.8Ct球蛋白主要在肝营养运输1.5~3.0Ct1球蛋白Ct2球蛋白B球蛋白大部分在肝运输丫球蛋白主要在肝外免疫纤维蛋白原肝凝血0.2-0.4聚丙烯酰胺凝胶电泳是分辨率更高的电泳方法,可将血清中的蛋白质分成数十条区带。超速离心法则是根据蛋白质的密度将其分离,例如血浆脂蛋白的分离。(二)血浆蛋白质的性质尽管血浆蛋白质的种类繁多,但由于血浆蛋白质较易获得,且许多编码血浆蛋白质的基因序列已知,故对这些蛋白质的结构、功能、合成和更新等已有较深入的了解,现将血浆蛋白质的性质归纳如下:1.绝大多数血浆蛋白质在肝合成如清蛋白、纤维蛋白原和纤维粘连蛋白等血浆蛋白质都是在肝合成,还有少量的蛋白质是由其他组织细胞合成,如1球蛋白是由浆细胞合成。 2.血浆蛋白质的合成场所一般位于膜结合的多核糖体上血浆蛋白质在进入血浆前,在肝细胞内经历了从粗面内质网到高尔基复合体再抵达质膜而分泌入血液的途径。即合成的蛋白质转移入内质网池,然后被酶切去信号肤,蛋白质前体成为成熟蛋白质。血浆蛋白质自肝细胞内合成部位到血浆的时间为30分钟至数小时不等。 3除清蛋白外,几乎所有的血浆蛋白质均为糖蛋白这些糖蛋白含有N-或0-连接的寡糖链。这些寡糖链包含了许多生物信息,发挥重要的作用。血浆蛋白质合成后需要定向输送,此过程需要寡糖链。寡糖链中包含的生物信息具有识别作用。例如,红细胞的血型物质含糖达80%-90%,A BO系统中血型物质A、B均是在血型物质0的糖链非还原端各加上N-乙酰氨基半乳糖(N-acetylgalactosamine, GalNAc)或半乳糖(galactose, Gal)。正是一个糖基的差别,使红细胞能识别不同的抗体。再如用唾液酸酶(neuraminidase)切除霖糖链末端唾液酸残基,常可使一些血浆蛋白质的半衰期缩短。 4.许多血浆蛋白质呈现多态性多态性是孟德尔式或单基因遗传的性状。在人群中,如果某一蛋白质具有多态性说明它至少有两种表型,每一种表型的发生率不少于1%~2%。ABO血型是广为人知的多态性,另外a抗胰蛋白酶、结合珠蛋白、运铁蛋白(transferrin, TRF汃铜蓝蛋白和免疫球蛋白等均具有多态性。研究血浆蛋白质的多态性对遗传学、人类学和临床医学均有重要意义。 C反应蛋白(C-reactiv e protein, CRP)、a1抗胰蛋白酶、结合珠蛋白、a1酸性蛋白和纤维蛋白原等。这些350第四脯医学生化专题蛋白质水平的增高,少则增加50%,多则可增加上于倍。患慢性炎症或肿瘤时,也会出现这种升高,提示急性期蛋白在人体炎症反应中起一定作用。例如,m抗胰蛋白酶能使急性炎症期释放的某些蛋白酶失效;白细胞介素1(IL-1)是单核巨噬细胞释放的一种多肤,它能刺激肝细胞合成许多急性期反应物(acu te phase reactant, APR)。急性期,亦有些蛋白质浓度出现降低,如清蛋白和运铁蛋白等。 二、血浆蛋白质的功能 血浆蛋白质种类繁多,虽然其中不少蛋白质的功能尚未完全阐明,但对血浆蛋白质的一些重要功能已有较深入的了解,现概述如下。(一)维持血浆胶体渗透压虽然血浆胶体渗透压仅占血浆总渗透压的极小部分(1/230),但它对水在血管内外的分布具有决定性的作用。正常人血浆胶体渗透压的大小,取决于血浆蛋白质的摩尔浓度。由于清蛋白的分子噩小(69kD),在血浆内的总含量大、摩尔浓度高,加之在生理pH条件下,其电负性高,能使水分子聚集其分子表面,故清蛋白能最有效地维持胶体渗透压。清蛋白所产生的胶体渗透压占血浆胶体总渗透压的75%-80%。当血浆蛋白质浓度,尤其是清蛋白浓度过低时,血浆胶体渗透压下降,导致水分在组织间隙游留,出现水肿。 (二)维持血浆正常的pH 正常血浆的pH为7.40的.05。蛋白质是两性电解质,血浆蛋白质的等电点大部分在pH4.07.3之间,血浆蛋白盐与相应蛋白质形成缓冲对,参与维持血浆正常的pH,如蛋白质钠盐/蛋白质是血浆中的主要缓冲对之一。 (三)运输作用 血浆蛋白质分子的表面上分布有众多的亲脂性结合位点,脂溶性物质可与其结合而被运输。血浆蛋白质还能与易被细胞摄取和易随尿液排出的一些小分子物质结合,防止它们从肾丢失。例如,脂溶性维生素A以视黄醇形式存在于血浆中,它先与视黄醇结合蛋白形成复合物,再与前清蛋白以非共价键缔合成视黄醇-视黄醇结合蛋白-前清蛋白复合物。这种复合物一方面可防止视黄醇的氧化,另一方面防止小分子量的视黄醇-视黄醇结合蛋白复合物从肾丢失。血浆中的清蛋白能与脂肪酸、Ca气胆红素、磺胺等多种物质结合。此外血浆中还有皮质激素传递蛋白、运铁蛋白、铜蓝蛋白等。这些载体蛋白除结合运输血浆中某种物质外,还具有调节被运输物质代谢的作用。 (四)免疫作用 血浆中的免疫球蛋白,lgG、lgA、l gM、IgD和lgE,又称为抗体,在体液免疫中起至关重要的作用。此外,血浆中还有一组协助抗体完成免疫功能的蛋白酶一补体。免疫球蛋白能识别特异性抗原并与之结合,形成的抗原抗体复合物能激活补体系统,产生溶菌和溶细胞现象。 (五)催化作用 血浆中的酶称作血清酶。根据血清酶的来源和功能,可分为以下三类:1.血浆功能酶这类酶主要在血浆发挥催化功能,如凝血及纤溶系统的多种蛋白水解酶,它们都以酶原的形式存在于血浆内,在一定条件下被激活后发挥作用。此外血浆中还有生理性抗凝物质、假胆碱酣酶、卵磷脂:胆固醇酰基转移酶、脂蛋白脂肪酶和肾素等。血浆功能酶绝大多数由肝合成后分泌入血,并在血浆中发挥催化作用。 2外分泌酶外分泌腺分泌的酶类包括胃蛋白酶、胰蛋白酶、胰淀粉酶、胰脂肪酶和唾液淀粉酶等。在生理条件下这些酶少量逸入血浆,它们的催化活性与血浆的正常生理功能无直接的关系。但当这些脏器受损时,逸入血浆的酶量增加,血浆内相关酶的活性增高,在临床上有诊断价值。 3.细胞酶细胞酶存在千细胞和组织内,参与物质代谢。随着细胞的不断更新,这些酶可释放至血。正常时它们在血浆中含量甚微。这类酶大部分无器官特异性;小部分来源于特定的组织,表现为器官特异性。当特定的器官有病变时,血浆内相应的酶活性增高,可用于临床酶学检验。如肝功能严重受损时,血浆中谷丙转氨酶与谷草转氨酶的活性会显著升高。 (六)营养作用 每个成人3L左右的血浆中约有200g蛋白质。体内的某些细胞,如单核-吞噬细胞系统,吞噬血浆蛋白质,然后由细胞内的酶类将吞入细胞的蛋白质分解为氨基酸参入氨基酸池,用于组织蛋白质的合成,或转变成其他含氮化合物。此外,蛋白质还能分解供能。 (七)凝血、抗凝血和纤溶作用 血浆中存在众多的凝血因子、抗溶血及纤溶物质,它们在血液中相互作用、相互制约,保持循环血流通畅。但当血管损伤、血液流出血管时,即发生血液凝固,以防止血液的大量流失。(八)血浆蛋白质异常与临床疾病血浆蛋白质在维持入体正常代谢中有重要功能,血浆蛋白质异常可见于多种临床疾病,如风湿病、肝疾病和多发性骨髓瘤等。 1.风湿病风湿病血浆蛋白质的异常改变主要包括急性炎症反应和由于抗原刺激引起的免疫系统增强的反应。其特征为:CD免疫球蛋白升高,特别是IgA,并可有IgG及IgM的升高;©炎症活动期可有alAG、Hp、C3成分升高。 2.肝疾病急性肝炎时,出现非典型的急性时相反应,前清蛋白(prealbumin, PAB)是肝功能损害的敏感指标。肝硬化时,血浆蛋白质含量呈现特征性改变,如清蛋白减少、球蛋白增加,清蛋白/球蛋白(AIG)倒置等。 3多发性骨髓瘤多发性骨髓瘤是由浆细胞恶性增生所致的一种肿瘤。总的蛋白质电泳图谱表现为:CD在原丫区带外出现一特征性的M蛋白峰;@清蛋白区带下降。 第二节血红素的合成 血红蛋白(hemoglobin, Hh)是红细胞中最主要的成分,由珠蛋白和血红素(heme)组成。血红素不但是Hh的辅基,也是肌红蛋白、细胞色素、过氧化物酶等的辅基。血红素可在机体多种细胞内合成,参与血红蛋白组成的血红素主要在骨髓的幼红细胞和网织红细胞中合成。 一、血红素的合成过程 合成血红素的基本原料是甘氨酸、唬珀酰CoA和Fe2+等。合成的起始和终末阶段均在线粒体内进行,而中间阶段在胞质内进行。血红素的生物合成可受多种因素的调节。血红素的生物合成可分为四个步骤。 (-)8氨基-叶酮戊酸的合成 在线粒体内,由唬珀酰CoA与甘氨酸缩合生成8-氨基-丫-酮戊酸(8-am.inolevulinicacid, ALA)(图18-2)。催化此反应的酶是ALA合酶(ALA synthase),其辅酶是磷酸11比哆睦。此酶是血红素合成的限速酶,受血红素的反馈调节。 (二)胆色素原的合成 ALA生成后从线粒体进入胞质,在ALA脱水酶(ALA dehydrase)催化下,2分子ALA脱水缩合生。。 HC成1分子胆色素原(potl)hob山nogen, PBG)(图 比比~ +『比NH2_L-f2 18-3)。ALA脱水酶含有琉基,对铅等重金属的抑制作用十分敏感。 c110磷酸咄哆醒)严(三)尿叶瞅原与粪卧瞅原的合成。C=O在胞质中,由尿卧啾原I同合酶(UPG I如—NH2cosynthase,又称胆色素原脱氨酶)催化,使4分图18-26氨基--y-酮戊酸的合成子胆色素原脱氨缩合生成1分子线状四阰咯,后者再由UPG皿同合酶催化生成尿卧啾原皿(UPG皿)。这两种酶的关系尚不清楚。但是UPG皿同合酶单独存在时并无活性,必须与UPG I同合酶协同作用;反之,若无UPG皿同合酶时,线状四咄咯化合物不稳定,可自然环化生成尿叶啾原I(UPG I)。UPG I与UPG皿的区别是,前者第7位侧链为乙酸基(A),第8位为丙酸基(P);而后者却相反,第7位为丙酸基(P),第8位为的合成是主要途径,UPG I极少(ill:I为。UPG ill进一步经尿叶啾原皿脱C I比C I I凡. ALA脱水酶HO,中叶cI\x//I。 勹二勹f—H2凡0 C I凡H+N—H凡N 皿2ALA胆色素原 乙酸基(A)(图18-4)。在正常生理情况下,UPG ill10000:1沁在某些病理情况下,UPG ill合成受阻,生成较多的UPG ICPGill),反应如图18-4所示。酶素辅红狻酶催化,使其4个乙酸基(A)侧链脱狻基变为甲基(M),从而生成粪叶啾原皿(coproporphyrinogen ill,—粪叶琳原皿尿叶琳原皿图18-4血红素的生物合成A:-CH2COOH;P:—CH2CH2COOH; M:—CH3;V:—CHCH2(四)血红素的生成胞质中生成的粪叶啾原皿再进入线粒体,经粪卧啾原皿氧化脱狻酶作用,使其2,4位两个丙酸基(P)氧化脱狻变成乙烯基(V),从而生成原卧啾原IX,再由原叶啾原IX氧化酶催化,使其4个连接咄咯环的亚甲基氧化成次甲基,则成为原卧啾IX(protoporph yrin IX)。通过亚铁赘合酶(ferrochelatase,又称血红素合成酶)的催化,原卧啾IX和Fe2+结合,生成血红素(图18-4)。铅等重金属对亚铁鳌合酶也有抑制作用。 血红素生成后从线粒体转运到胞质,在骨髓的有核红细胞及网织红细胞中,与珠蛋白结合成为血红蛋白。 血红素合成的全过程总结千图18-4。血红素合成的特点可归结如下:心体内大多数组织均具有合成血红素的能力,但合成的主要部位是骨髓与肝,成熟红细胞不含线粒体,故不能合成血红素。@血红素合成的原料是唬珀酰CoA、甘氨酸及Fe”等简单小分子物质。其中间产物的转变主要是咄咯环侧链的脱狻和脱氢反应。各种卧啾原化合物的咄咯环之间无共辄结构,均无色,性质不稳定,易被氧化,对光尤为敏感。@血红素合成的起始和最终过程均在线粒体中进行,而其他中间步骤则在胞质中进行。这种定位对终产物血红素的反馈调节作用具有重要意义。关于中间产物进出线粒体的机制,目前尚不清楚。 二、血红素合成的调节 血红素的合成受多种因素的调节,其中最主要的调节步骤是ALA的合成。 (-)ALA合酶 ALA合酶是血红素合成体系的限速酶,受血红素的反馈抑制。由于血红素与该酶的底物和产物均不类似,因此可能属千别构抑制。此外,血红素还可以阻抑ALA合酶的合成。由于磷酸咄哆醒是该酶的辅基,维生素B6缺乏将影响血红素的合成。ALA合酶本身的代谢较快,半衰期约为1小时。正常情况下,血红素合成后迅速与珠蛋白结合成血红蛋白,不致有过多的血红素堆积;血红素结合成血红蛋白后,对ALA合酶不再有反馈抑制作用。如果血红素的合成速度大于珠蛋白的合成速度,过多的血红素可以氧化成高铁血红素,后者对ALA合酶也具有强烈抑制作用。某些固醇类激素,例如睾酮在体内的5-B还原物,能诱导ALA合酶的合成,从而促进血红素的生成。许多在肝中进行生物转化的物质,例如致癌物质、药物、杀虫剂等,均可导致肝ALA合酶显著增加,因为这些物质的生物转化作用需要细胞色素P450,后者的辅基正是铁叶啾化合物。由此,通过肝ALA合酶的增加,以适应生物转化的需求。 (二)ALA脱水酶与亚铁鳌合酶 ALA脱水酶虽然也可被血红素抑制,但并不引起明显的生理效应,因为此酶的活性较ALA合酶强80倍,故血红素的抑制基本上是通过ALA合酶而起作用。ALA脱水酶和亚铁赘合酶对重金属的抑制均非常敏感,因此血红素合成的抑制是铅中毒的重要体征。此外,亚铁赘合酶还需要还原剂(如谷胱甘肤),任何还原条件的中断也会抑制血红素的合成。 (三)促红细胞生成素 促红细胞生成素(erythropoietin, EPO)主要在肾合成,缺氧时即释放入血,运至骨髓,借助一种含两个不同亚基和一些结构域的特异性跨膜载体,EPO可同原始红细胞[如红系爆式集落形成单位(burst forming unit-erythroind,BFU-E)和红系集落形成单位(colony forming unit-eryt加)id,CFU-E)]相互作用,促使它们繁殖和分化,加速有核红细胞的成熟以及血红素和Hb的合成。因此,EPO是红细胞生成的主要调节剂。它是一种由166个氨基酸残基组成的糖蛋白,分子量30-39kD。 铁卧啾合成代谢异常而导致卧琳或其中间代谢物排出增多,称为叶琳症(porphyria)。叶啾症有先天性和后天性两大类。先天性叶啾症是由某种血红素合成酶系的遗传性缺陷所致;后天性叶啾症则主要指铅中毒或某些药物中毒引起的铁卧啾合成障碍,例如铅等重金属中毒,除抑制前面提及的两种酶外,还能抑制尿卧啾合成酶。 354第四篇医学生化专题 第三节血细胞物质代谢 血液中存在有多种血细胞:红细胞,主要的功能是运送氧;白细胞,在机体免疫反应中发挥重要作用;血小板,在凝血过程中起重要作用。血小板是由骨髓造血组织中的巨核细胞产生的细胞碎片,本节重点介绍红细胞和白细胞的主要代谢特点。 —、红细胞的代谢 红细胞是血液中最主要的细胞,它是在骨髓中由造血干细胞定向分化而成的红系细胞。在红系细胞发育过程中,经历了原始红细胞、早幼红细胞、中幼红细胞、晚幼红细胞、网状红细胞等阶段,最后才成为成熟红细胞。在成熟过程中,红细胞发生一系列形态和代谢的改变(表18-2)。 代谢能力有核红细胞网织红细胞成熟红细胞 分裂增殖能力+DNA合成+ RNA合成+ RNA存在++蛋白质合成++血红索合成++脂质合成++三狻酸循环++氧化磷酸化十+糖酵解+++磷酸戊糖途径+++注:"+",”-“分别表示该途径有或无.晚幼红细胞为"-“哺乳动物的成熟红细胞除质膜和胞质外,无细胞核和线粒体等细胞器,其代谢比一般细胞单纯。葡萄糖是成熟红细胞的主要能猛物质。血液循环中的红细胞每天大约从血浆摄取30g葡萄糖,其中90%~95%经糖酵解通路和2,3-二磷酸甘油酸(2,3-b isphosp hoglycerate,2,3-BPG)支路进行代谢,5%~10%通过磷酸戊糖途径进行代谢。(一)糖酵解是红细胞获得能量的唯一途径红细胞中存在催化糖酵解所需要的所有的酶和中间代谢物(表18-3),糖酵解的基本反应和其他组织相同。糖酵解是红细胞获得能量的唯一途径,lmol葡萄糖经酵解生成2mol乳酸的过程中,产生2molATP和2molNADH+H+,通过这一途径可使红细胞内ATP的浓度维持在1.85x103mol/L水平。 糖酵解中间产物动脉血静脉血 24.8果糖-6-磷酸9.33.3果糖-1,6-二磷酸0.81.3磷酸丙糖4.55.0葡糖6-磷酸30.0...严冒L+-俨`4暑. 3-磷酸甘油酸19.216.52-磷酸甘油酸5.01.0磷酸烯醇式丙酮酸10.8红细胞中的ATP主要用千维持以下几方面的生理活动:1维持红细胞膜上钠泵(Na+, K+-ATP酶)的运转N旷和K十一般不易通过细胞膜,钠泵通过消耗ATP将Na十泵出、K十泵入红细胞以维持红细胞的离子平衡以及细胞容积和双凹盘状形态。 2.维持红细胞膜上钙泵(Ca2+-ATP酶)的运行将红细胞内的Ca2+泵入血浆以维持红细胞内的低钙状态。正常情况下,红细胞内的Ca2+浓度很低(20µmol/L),而血浆的Ca2•浓度为2-3mmol/L。血浆内的Ca2+会被动扩散进入红细胞。缺乏ATP时,钙泵不能正常运行,钙将聚集并沉积于红细胞膜,使膜失去柔韧性而趋千僵硬,红细胞流经狭窄的脾窦时易被破坏。 3.维持红细胞膜上脂质与血浆脂蛋白中的脂质进行交换红细胞膜的脂质处于不断地更新中,此过程需消耗ATP。缺乏ATP时,脂质更新受阻,红细胞的可塑性降低,易于破坏。 化,此过程需由ATP供能。 (二)红细胞的糖酵解存在2,3-二磷酸甘油酸旁路红细胞内的糖酵解还存在一个特殊途径一2,3-BPG支路(图18-5)。2,3-BPG支路的分支点是1,3-二磷酸甘油酸(1,3-bisphosphoglycerate,1,3-BPG)。正常情况下,2,3-BPG对二磷酸甘油酸变位酶的负反馈作用大于对3-磷酸甘油酸激酶的抑制作用,所以2,葡萄糖}3-BPG旁路占糖酵解的15%-50%;但是由于2,3-BPG磷酸1,3-BPG二磷酸甘油酸变位酶酶的活性较低,2,3-BPG的生成大于分解,造成红细胞内2,3BPG升高。红细胞内2,3-BPG虽然也能供能,但主要功能是2,3-BPG调节血红蛋白的运氧功能。3-磷酸甘油酸2,3-BPGl磷酸酶2,3-BPG是调节Hb运氧功能的重要因素,它是一个电负i性很高的分子,可与血红蛋白结合,结合部位在Hb分子4个乳酸亚基的对称中心孔穴内。2,3-BPG的负电基团与组成孔穴侧图18-52,3-二磷酸甘油酸支路壁的2个B亚基的带正电基团形成盐键(图18-6),从而使血红蛋白分子的T构象更趋稳定,降低Hb与02的亲和力。当血流经过P02较高的肺部时,2,3-BPG的影响不大,而当血流流过P02较低的组织时,红细胞中2,3BPG的存在则显著增加02释放,以供组织需要。在P02相同条件下,随2,3-BPG浓度增大,Hb02释放的02增多。人体能通过改变红细胞内2,3-BPG的浓度来调节对组织的供氧。 (三)磷酸戊糖途径提供NADPH维持红细胞的完整性 红细胞内磷酸戊糖途径的代谢过程与其他细胞相同,主要功能是产生NADPH+H飞NADH和NADPH是红细胞内重要的还原当量,它们能够对抗氧化剂,保护细胞膜蛋白质、血红蛋白和酶蛋白的琉基等不被氧化,从而维持红细胞的正常功能。磷酸戊糖途径是红细胞产生NADPH的唯一途径。红细胞中的NADPH能维持细胞内还原型谷胱甘肤(GSH)的含量(图18-7),使红细胞免遭外源性和内源性氧化剂的损害。某些疾病状态,如葡糖-6-磷酸脱氢酶缺乏症(俗称蚕豆病)病人因红细胞中磷酸戊糖途径关键酶缺乏而导致0018-62,3-二磷酸甘油酸与血红蛋白的结合NADPH量不足,无法维持谷胱甘肤的还原状态,因此在接触强氧化因子时,红细胞细胞膜破裂导致溶血。 冒磷酸戊糖途径` 葡糖6-磷酸y NADp+y2GSH y邸 葡糖-6-磷酸脱氢酶谷胱甘肤还原酶谷胱甘肤过氧化物酶由于氧化作用,红细胞内经常产生少量高铁血红蛋白(methemoglobin, MHb), MHb中的铁为三价,不能带氧。但红细胞内有NADH-高铁血红蛋白还原酶和NADPH-高铁血红蛋白还原酶催化MHb还原成Hb。另外,GSH和抗坏血酸也能直接还原MHb。在上述高铁血红蛋白还原系统中,以NADH高铁血红蛋白还原酶最重要。由千有MHb还原系统的存在,使红细胞内MHb只占Hb总量的1%-2%。 (四)红细胞不能合成脂肪酸 成熟红细胞的脂质几乎都存在千细胞膜。成熟红细胞由千没有线粒体,因此无法从头合成脂肪酸,但膜脂的不断更新却是红细胞生存的必要条件。红细胞通过主动参入和被动交换不断地与血浆进行脂质交换,维持其正常的脂质组成、结构和功能。 (五)高铁血红素促进珠蛋白的合成 血红蛋白由珠蛋白与血红素构成。珠蛋白的合成与一般蛋白质相同,其合成受血红素的调控。血红素的氧化产物高铁血红素能促进珠蛋白的生物合成,其机制见图18-8。cAMP激活蛋白激酶A后,蛋白激酶A能使无活性的elF-2激酶磷酸化。后者再催化eIF-2磷酸化而使之失活。高铁血红素有抑制cAMP激活蛋白激酶A的作用,从而使eIF2保持于去磷酸化的活性状e 态,有利于珠蛋白的合成,进而影响血红蛋白的合成。 eAMP+R,C,上2C«AMP-2R人体白细胞由粒细胞、淋巴细胞和`单核巨噬细胞三大系统组成。主要功elF-磁酶elF-磁酶苞)能是对外来入侵起抵抗作用,白细胞的(无活性)-ATP7(有活性)代谢与白细胞的功能密切相关。白细胞的功能将在免疫学详细介绍,故在此@}ADP只扼要介绍白细胞的代谢特点。`_(-)糖酵解是白细胞主要的获能eIF-2eIF-2包)途径有活性-7无活性由千粒细胞的线粒体很少,故糖酵ATP解是主要的糖代谢途径。中性粒细胞图18-8高铁血红素对起始因子2的调节能利用外源性的糖和内源性的糖原进行糖酵解,为细胞的吞噬作用提供能量。单核巨噬细胞虽能进行有氧氧化,但糖酵解仍占很大比重。在免疫反应中,T淋巴细胞接受复杂的信号后激活、增殖和分化成不同的细胞亚型。研究表明,不同状态和阶段的T淋巴细胞其葡萄糖代谢的特点有所不同,例如,免疫反应中T淋巴细胞激活前主要通过葡萄糖的有氧氧化获能,而激活后则主要通过糖酵解获能。 (二)粒细胞和单核巨噬细胞能产生活性氧,发挥杀菌作用中性粒细胞和单核巨噬细胞被趋化因子激活后,细胞内磷酸戊糖途径被激活,产生大量的NADPH。经NADPH氧化酶递电子体系可使02接受单电子还原,产生大量的超氧阴离子(0;.)。超氧阴离子再进一步转变成H202,·OH等活性氧,起杀菌作用。NADPH氧化酶递电子体系的成分包括NADPH氧化酶、细胞色素b558和两种胞质多肤等。 (三)粒细胞和单核巨噬细胞能合成多种物质参与超敏反应速发型超敏反应(I型超敏反应)中,在多种刺激因子作用下,单核巨噬细胞可将花生四烯酸转变成血栓烧和前列腺素;而在脂氧化酶的作用下,粒细胞和单核巨噬细胞可将花生四烯酸转变成白三烯;同时,粒细胞中的大量组氨酸代谢生成组胺。组胺、白三烯和前列腺素都是速发型超敏反应中重要的生物活性物质。 (四)单核巨噬细胞和淋巴细胞能合成多种活性蛋白质由于成熟粒细胞缺乏内质网,故蛋白质合成量很少。而单核/巨噬细胞的蛋白质代谢很活跃,能合成多种酶、补体和各种细胞因子。在免疫反应中,B淋巴细胞分化为浆细胞,产生并分泌多种抗体蛋白,参与体液免疫。 血液由有形的红细胞、白细胞和血小板以及无形的血浆组成。血浆的主要成分是水、无机盐、有机小分子和蛋白质等。 血浆中的蛋白质浓度为70-75g/L,多在肝合成。其中含量最多的是清蛋白,其浓度为38-48g/L,它能结合并转运许多物质,在血浆胶体渗透压形成中起重要作用。血浆中的蛋白质具多种重要的生理功能。 未成熟红细胞能利用玻珀酰CoA、甘氨酸和Fe2+铁合成血红素。血红素生物合成的关键酶是ALA合酶,受到多种因素的调控。成熟红细胞代谢的特点是丧失了合成核酸和蛋白质的能力,并不能进行有氧氧化,红细胞功能的正常主要依赖无氧氧化和磷酸戊糖旁路。有吞噬功能的白细胞的磷酸戊糖旁路和无氧氧化代谢也很活跃。NADPH氧化酶递电子体系在白细胞的吞噬功能中起重要作用。 ---------------------------·-··-------·-·噜·---------·-·-----------·--------·-·-·---------·----·--·-·--·--····--------·--·-·-····-----------·----·--·-·-·-·".一一1.试述红细胞的氧化还原系统。 2.简述成熟红细胞糖代谢的特点及红细胞中ATP的主要生理功能。3.血红素的合成有何特点? (德伟) 第十九章肝的生物化学 肝是人体最大的实质性器官,也是体内最大的腺体。成人肝组织约重1500g,约占体重的2.5%。独特的结构特点,赋予肝复杂多样的生物化学功能。 肝的结构特点包括:O具有肝动脉和门静脉双重血液供应。既可从肝动脉获得由肺及其他组织运来的氧和代谢物,又可从门静脉中获得由肠道吸收的各种营养物质,为各种物质在肝的代谢奠定了物质基础。@存在肝静脉和胆道系统双重输出通道。肝静脉与体循环相连,可将肝内的代谢中间物或代谢产物运输到其他组织利用或排出体外;胆道系统与肠道相通,将肝分泌的胆汁排入肠道,同时排出一些代谢废物。@具有丰富的肝血窦。肝动脉和门静脉入肝后经反复分支,形成小叶间动脉及小叶间静脉,最后均进入肝血窦。血窦使肝细胞与血液的接触面积扩大,加之血窦中血流速率减慢,为肝细胞与血液进行充分的物质交换提供了时间保证。@肝细胞含有丰富的细胞器(如内质网、线粒体、溶酶体、过氧化物酶体等)和丰富的酶体系,有些甚至是肝所独有的。因此肝细胞除存在一般细胞所具有的代谢途径外,还具有一些特殊的代谢功能。 基于上述特点,肝不仅在机体糖、脂质、蛋白质、维生素、激素等物质代谢中处于中心地位,而且还具有生物转化、分泌和排泄等多方面的生理功能。 第一节肝在物质代谢中的作用 一、肝是维持血糖水平相对稳定的重要器官 正常情况下,血糖的来源与去路处于动态平衡,主要凭借激素的调节,这些激素的主要靶器官是肝。肝细胞主要通过调节糖原合成与分解、糖异生途径维持血糖的相对恒定,以保障全身各组织,尤其是大脑和红细胞的能量供应。 肝细胞膜葡糖转运蛋白2(glucose transport er2, GLUT2)能有效转运葡萄糖,可使肝细胞内的葡萄糖浓度与血糖浓度保持一致。肝细胞含有特异的已糖激酶同工酶W,即葡糖激酶。其Km(lOmmol/L)较肝外组织的已糖激酶(O. lmmol/L)高的多,且不被其产物葡糖-6-磷酸所抑制。这利于肝在饱食状态下血糖浓度很高时,仍可持续将葡萄糖磷酸化成葡糖-6-磷酸,并将其合成肝糖原贮存。饱食后肝糖原总量可达75~100g,约占肝重的5%。血糖高时,葡糖-6-磷酸除氧化供能以及合成糖原储存外,还可在肝内转变成脂肪,并以极低密度脂蛋白(ve1-y low density lipoprotein, VLDL)的形式运出肝外,贮存于脂肪组织。 肝细胞内含有葡糖-6-磷酸酶(该酶不存在于肌组织),在空腹状态下,可将肝糖原分解生成的葡糖-6-磷酸直接转化成葡萄糖以补充血糖。肝细胞还存在一套完整的糖异生酶系,是糖异生最重要的器官。较长时间禁食时,储存有限的肝糖原在12-18小时内几乎耗尽,此时肝通过糖异生将生糖氨基酸、乳酸及甘油等非糖物质转变成葡萄糖,成为机体在长期饥饿状况下维持血糖相对恒定的主要途径。其主要原料生糖氨基酸来自肌组织蛋白质的分解。肝还能将小肠吸收的其他单糖如果糖及半乳糖转化为葡萄糖,作为血糖的补充来源。因此肝细胞严重损伤时,易造成糖代谢紊乱。 肝细胞的磷酸戊糖途径也很活跃,为肝的生物转化作用提供足够的NADPH。此外,肝细胞中的葡萄糖还可通过糖醒酸途径生成UDP-葡糖酪酸(UDPGA),作为肝生物转化结合反应中最重要的结合物质。 二、肝在脂质代谢中占据中心地位 肝在脂质的消化、吸收、分解、合成及运输等代谢过程中均具有重要作用。 肝细胞合成并分泌胆汁酸,为脂质(包括脂溶性维生素)的消化、吸收所必需。肝损伤时,肝分泌胆汁能力下降;胆管阻塞时,胆汁排出障碍,均可导致脂质的消化吸收不良,产生厌油腻和脂肪泻等临床症状。 肝可有效协调脂肪酸氧化供能和酷化合成甘油三酷两条途径。饱食状态下,肝将大量过剩的葡萄糖分解为乙酰CoA并转变成脂肪酸,并进一步合成甘油三酷,这是内源性甘油三醋的主要来源。肝也可将某些氨基酸经乙酰CoA转变成脂肪酸和甘油三酣。肝还可摄取来自消化道的外源性脂肪酸,部分经B-氧化彻底分解,释放能量供肝利用,剩余部分用于合成甘油三醋。肝合成的内源性甘油三酷与来自消化道的外源性和肝自身合成的胆固醇、磷脂一起,组装成VLDL分泌入血,经血液运输至肝外组织摄取和利用。饥饿状态下,机体脂库的脂肪动员增加,释放出脂肪酸和甘油,经血液运输至肝代谢。肝细胞可将脂肪酸B-氧化产生的乙酰CoA,部分经三狻酸循环彻底氧化释放能量供肝利用;其余大部分则在肝细胞内合成酮体。肝是体内产生酮体的唯一器官。酮体则是肝向肝外组织输出脂质能源的一种形式,供肝外组织尤其脑和肌肉氧化利用。饥饿时酮体可占大脑能供的60%~70%。 肝在调节机体胆固醇代谢平衡上起中心作用。肝是合成胆固醇的主要器官,其合成量占全身合成总量的3/4以上。肝又是转化及排出胆固醇的主要器官。胆汁酸的生成是肝降解胆固醇的最重要途径。肝能通过apo E受体、LDL受体和HDL受体,从血液中摄取外源性胆固醇、内源性胆固醇和肝外组织细胞多余胆固醇,将其转化成胆汁酸,经胆道排出;也可将其直接分泌入胆汁,经消化道排出。胆道几乎是机体排出胆固醇及其转化产物的唯一途径,肝几乎是机体排出胆固醇及其转化产物的唯一器官。肝对胆固醇的酕化也具有重要作用。肝合成的卵磷脂:胆固醇脂酰基转移酶(LCAT),在血浆中将胆固醇转化为胆固醇酣以利运输。严重肝损伤时,不仅影响胆固醇合成而且影响LCAT的生成,故除血浆胆固醇含量减少外,血浆胆固醇酷的降低往往出现得更早、更明显。 肝在血浆脂蛋白代谢中亦起重要作用。肝是LDL降解的重要器官,肝细胞膜上有LDL受体,可特异的结合LDL并将其内吞入肝细胞降解。HDL也主要在肝合成,将肝外的胆固醇转移到肝内处理。肝细胞合成的apo err可激活肝外组织毛细血管内皮细胞表面的LPL,在血浆CM和VLDL的甘油三酷分解代谢中具有不可或缺的作用。 肝磷脂的合成非常活跃,尤其是卵磷脂的合成。磷脂合成障碍可影响VLDL的合成和分泌,导致肝内脂肪运出障碍而在肝中堆积,成为脂肪肝发生的机制之一。 三、肝内蛋白质合成及分解代谢均非常活跃 肝在人体蛋白质合成、分解和氨基酸代谢中起重要作用。 肝不仅合成大量蛋白质以满足自身结构和功能的需要,还合成大量蛋白质输出肝,以满足机体一些肝外功能的需要。如肝合成与分泌90%以上的血浆蛋白质(表19-1)。除'Y球蛋白外,几乎所有的血浆蛋白均来自于肝,如清蛋白、凝血酶原、纤维蛋白原、铜蓝蛋白、疑血因子I、lI、V、VI、IX和X等。血浆脂蛋白中的多种载脂蛋白(apoA、B、C、E等)及部分脂蛋白代谢酶也是在肝合成的,在血浆中执行脂质运输和脂蛋白代谢功能。由于凝血因子大部分由肝合成,因此严重肝细胞损伤时,可出现凝血时间延长及出血倾向。 血浆清蛋白几乎均由肝实质细胞合成,是血浆中的主要蛋白质成分。成入肝每日约合成12g清蛋白,几乎占肝合成蛋白质总量的25%。血浆清蛋白除了作为许多脂溶性物质(如游离脂肪酸、胆红素等)的非特异性运输载体外,在维持血浆胶体渗透压方面亦起重要作用。若血浆清蛋白低千30g/L,约有半数病人出现水肿或腹水。正常人血浆清蛋白(A)与球蛋白(G)的比值(A/G)为1.5-2.5。肝功能严重受损时,血浆清蛋白合成减少,可致AIG比值下降,甚至倒置。此种变化临床上可作为严重慢性肝细胞损伤的辅助诊断指标。 蛋白质分子量(亚基数)结合的配基或主要功能含糖(%)血浆浓度.清蛋白69000(1)激素、氨基酸、类固醇、维生素、脂肪4500-5000酸、胆红素等运输载体a1酸性糖蛋白40000(1)参与炎症应答45痕量m抗胰蛋白酶52000(1)丝氨酸蛋白酶抑制剂有糖l.3~1.4甲胎蛋白72000(1)激素、氨基酸3~4胎儿血中存在a2巨球蛋白720000(4)丝氨酸蛋白酶抑制剂8~10150-420抗凝血酶III65000(1)与蛋白酶1:1结合,作为丝氨酸蛋有17-30白酶抑制剂血浆铜蓝蛋白160000(1)6原子铜/分子有15~60C反应蛋白105000(5)补体Clq,参与炎症应答<1纤维蛋白原340000(2)纤维蛋白的前体4200~450结合珠蛋白100000(2)与血红蛋白1:1结合有40-180血色素结合蛋白57000(1)与血红素1•1结合2050~100运铁蛋白80000(l)2原子铁/分子,转运铁63.0-6.5胚胎期肝可合成甲胎蛋白(a-fetoprotein, a-AFP),胎儿出生后其合成受到抑制,正常人血浆中很难检出。原发肝癌细胞中AFP基因的表达失去阻遏,血浆中可再次检出此种蛋白质,是原发性肝癌的重要肿瘤标志物。 肝是体内除支链氨基酸(亮氨酸、异亮氨酸、颌氨酸)以外的所有氨基酸分解和转变的重要器官。肝中转氨基、脱氨基、脱狻基、转甲基等反应均很活跃。当肝细胞损伤时,主要定位于肝细胞的谷丙转氨酶逸出细胞进入血浆使其酶活性升高,临床上据此检测有助于肝病的诊断。 肝的另一重要功能是解氨毒。肝通过鸟氨酸循环将有毒的氨合成无毒的尿素苍。合成中所需的氨基甲酰磷酸合成酶I及鸟氨酸氨基甲酰转移酶只存在于肝细胞线粒体。所以,肝是机体合成尿素的特异器官。其次,肝还可将氨转变成谷氨酰胺。严重肝病病人,肝解氨毒能力下降,导致血氨升高和氨中毒,是导致肝性脑病发生的重要生化机制之一。 肝也是胺类物质的重要生物转化器官。正常人体经肝单胺氧化酶作用,可将芳香族氨基酸脱狻基作用产生的苯乙胺、酪胺等芳香族胺加以氧化而清除。严重肝病病人,这些芳香族胺类得不到及时清除,可通过血脑屏障进入脑组织,经胫化后生成苯乙醇胺和章胺,其化学结构与儿茶酚胺相似,称为假神经递质(false neurotransmitter),可取代正常神经递质,使大脑发生异常抑制,可能是引发肝性脑病的另一重要生化机制。 四、肝参与多种维生素和辅酶的代谢 肝在维生素的吸收、储存、运输及转化等方面起重要作用尽。 肝合成和分泌胆汁酸,可促进脂溶性维生素A、维生素D、维生素E和维生素K的吸收。肝是机体含维生素A、维生素K、维生素B!、维生素B2、维生素B6、维生素B12、泛酸和叶酸较多的器官。人体内维生素A、维生素E、维生素K及维生素B12主要储存千肝,肝中维生素A的含量占体内总量的95%。肝合成和分泌视黄醇结合蛋白,它能与视黄醇结合,在血液中运输视黄醇。肝几乎不储存维生素D,但可合成和分泌维生素D结合蛋白,血浆中85%的维生素D代谢产物与维生素D结合蛋白结合而运输。 肝还参与多种维生素的转化。肝可将胡萝卜素转化为维生素A,将维生素PP转变为辅酶I(NAD+)和辅酶Il(NADP+),将泛酸转变为辅酶A(CoA),将维生素B转变为焦磷酸硫胺素(TPP),将维生素队转化为25-胫维生素队等。维生素K还是肝参与合成凝血因子Il、VII、IX、X不可缺少的物质。 五、肝参与多种激素的灭活 多种激素在发挥其调节作用后,主要在肝中代谢转化,从而降低或失去其活性,此过程称为激素的灭活(inac tivation)包。一些水溶性激素能与肝细胞膜上特异受体结合,通过内吞作用,将激素吞入肝细胞内进行代谢转化。一些类固醇激素则通过扩散作用进入肝细胞,与肝内的葡糖醋酸或活性硫酸等结合后灭活。肝细胞严重损伤时,激素的灭活功能降低,体内的雌激素、酸固酮、抗利尿激素等水平升高,可出现男性乳房女性化、蜘蛛痔、肝掌(雌激素使局部小动脉扩张)及水钠游留等。 第二节肝的生物转化作用 一、肝的生物转化作用是机体重要的保护机制 (一)生物转化的概念 人体内有些物质的存在不可避免,这些物质既不能作为构建组织细胞的成分,又不能作为能源物质,其中一些还对人体有一定的生物学效应或潜在的毒性作用,长期蓄积则对人体有害。机体在排出这些物质之前,需对它们进行代谢转变,使其水溶性提高,极性增强,易千通过胆汁或尿排出,这一过程称为生物转化(biotransformation)。肝是机体内生物转化最重要的器官。皮肤、肺及肾等亦有一定的生物转化作用。需进行生物转化的物质按其来源有内源性和外源性之分。内源性物质包括体内物质代谢的产物或代谢中间物(如胺类、胆红素等)以及发挥生理作用后有待灭活的各种生物活性物质(如激素、神经递质等)。外源性物质系人体在日常生活和(或)生产过程中不可避免接触的异源物(xenobio tics),如药物、毒物、食品添加剂、环境化学污染物等和从肠道吸收的腐败产物。大约超过20万种环境化学物存在,除个别因系水溶性可直接由胆汁或尿排出外,绝大部分因系脂溶性需经生物转化作用才能排出体外。 (二)生物转化的生理意义 生物转化的生理意义在于:一则通过生物转化可对体内的大部分待转化物质进行代谢处理,使其生物学活性降低或丧失(灭活),或使有毒物质的毒性减低或消除(解毒);另则通过生物转化作用可增加这些物质的水溶性和极性,从而易千从胆汁或尿排出体外。应该指出的是,有些物质经过肝的生物转化作用后,虽然溶解性增加,但其毒性反而增强;有的还可能溶解性下降,不易排出体外。如烟草中含有一种多环芳经类化合物一苯并(a)芘[benzo(a)pyrene, BaP],其本身没有直接致癌作用,但经过生物转化后反而成为直接致癌物。有的药物如环磷酰胺、百浪多息、水合氯酸和中药大黄等需经生物转化后才能成为有活性的药物。基此,不能将肝的生物转化作用简单地称为“解毒作用(detoxification)",这显示了肝生物转化作用的解毒与致毒双重性的特点。 二、肝的生物转化作用包括两相反应 肝的生物转化涉及多种酶促反应,但总体上可分为两相反应包。第一相反应包括氧化(oxidation汃还原(reduction)和水解(hydrolysis)。许多物质通过第一相反应,其分子中的某些非极性基团转变为极性基团,水溶性增加,即可排出体外。但有些物质经过第一相反应后水溶性和极性改变不明显,还需要结合极性更强的物质或基团,以进一步增加其水溶性而促进排泄,这些结合反应(conjugation)属千第二相反应。实际上,许多物质的生物转化过程非常复杂。一种物质有时需要连续进行几种反应类型才能实现生物转化目的,这反映了肝生物转化作用的连续性特点。如阿司匹林常先水解成水杨酸后再经与葡糖醒酸的结合反应才能排出体外。此外同一种物质可以进行不同类型的生物转化反应,产生不同的转化产物,这体现了肝生物转化反应类型的多样性特点。例如,阿司匹林先水解生成水杨酸,后者既可与葡糖醋酸结合转化成B-葡糖醒酸昔,又可与甘氨酸结合成水杨酰甘氨酸,还可水解后先氧化成经基水杨酸,再进行多种结合反应。肝内参与生物转化的主要酶类列于表19-2。 酶类辅酶或结合物细胞内定位 第一相反应氧化酶类 单加氧酶系NADPH+H+、02、细胞色素P450内质网 胺氧化酶黄素辅酶线粒体脱氢酶类AD+细胞质或线粒体硝基还原酶NADH+H酰NADPH+W内质网偶氮还原酶NADH+W或NADPH+W内质网葡糖醋酸基转移酶活性葡糖醋酸(UDPGA)内质网硫酸基转移酶活性硫酸(PAPS)细胞质谷胱甘肤S-转移酶谷胱甘肤(GSH)细胞质与内质网乙酰基转移酶乙酰CoA细胞质酰基转移酶甘氨酸线粒体甲基转移酶S-腺昔甲硫氨酸(SAM)细胞质与内质网(一)氧化反应是最多见的生物转化第一相反应1.单加氧酶系是氧化异源物最重要的酶肝细胞中存在多种氧化酶系,最重要的是定位千肝细胞微粒体的细胞色素P450单加氧酶(cytochrome P450monooxygenase, CYP)系包。单加氧酶系是一个复合物,至少包括两种组分:一种是细胞色素P450(血红素蛋白);另一种是NADPH-细胞色素P450还原酶(以FAD为辅基的黄酶)。该酶催化氧分子中的一个氧原子加到许多脂溶性底物中形成轻化物或环氧化物,另一个氧原子则被NADPH还原成水,故该酶又称轻化酶或称混合功能氧化酶(详见第六章生物氧化)。该酶是目前已知底物最广泛的生物转化酶类。迄今已鉴定出57种人类编码CYP的基因。对异源物进行生物转化的CYP主要是CYPl、CYP2和CYP3家族。其中又以CYP3A4、CYP2C9、CYP1A2和CYP2E l的含量最多。单加氧酶系催化的基本反应如下:单加氧酶系的轻化作用不仅增加药物或毒物的水溶性而利千排出,而且还参与体内许多重要物质的轻化过程,如维生素队的经化、胆汁酸和类固醇激素合成过程中的轻化等。然而应该指出的是,有些致癌物质经氧化后丧失其活性,而有些本来无活性的物质经氧化后却生成有毒或致癌物质。例如,发霉的谷物、花生等常含有黄曲霉素Bl,经单加氧酶系作用生成的黄曲霉素2,3环氧化物,可与DNA分子中的鸟嗓呤结合引起DNA突变,成为导致原发性肝癌的重要危险因素。 NADPH+H++02单加氧酶0' 2,3环氧黄曲霉;CH3压NH上`黄曲霉素B l DNA-鸟嗦呤 飞邓0 2单胺氧化酶类氧化脂肪族和芳香族胺类存在于肝细胞线粒体内的单胺氧化酶(monoamine oxidase, MAO)是另一类参与生物转化的氧化酶类。属于黄素酶类,可催化蛋白质腐败作用等产生的脂肪族和芳香族胺类物质(如组胺、酪胺、色胺、尸胺、腐胺等)以及一些肾上腺素能药物如5-胫色胺、儿茶酚胺类等的氧化脱氨基作用生成相应的醒类,后者进一步在胞质中酸脱氢酶催化下进一步氧化成酸,使之丧失生物活性。 RCH2NH2+02+H20:,-RCHO+NH3+H凸胺酰 酸酸 3.醇脱氢酶与酵脱氢酶将乙醇最终氧化成乙酸肝细胞的细胞质存在非常活跃的以NAD十为辅酶的醇脱氢酶(alcohol dehydrogenase,ADH),可催化醇类氧化成醒,后者再由线粒体或细胞质中醒脱氢酶(aldehyde dehydrogenase,ALDH)催化生成相应的酸类。 RCH20H+NAO+醇脱氢酶:,-RCHO+NADH+H+ RCHO+NAO++H20~醒脱氢酶RCOOH+NADH+ff 乙醇(ethanol)作为饮料和调味剂被广为利用。进入体内的乙醇主要在肝进行生物转化。70kg体重的成年入每小时可代谢7~14g乙醇。由ADH与ALDH将乙醇最终氧化成乙酸。长期饮酒或慢性乙醇中毒除经ADH与ALDH氧化外,还可使肝内质网增殖,稳定内质网内CYP2El的活性并诱导其合成,即启动肝微粒体乙醇氧化系统(microsomal ethanol ox心zing system, MEOS)。MEOS是乙醇P450单加氧酶,产物是乙酸,仅在血中乙醇浓度很高时起作用。值得注意的是,乙醇诱导MEOS可增加肝对氧和NADPH的消耗,且还可催化脂质过氧化产生经乙基自由基,后者可进一步促进脂质过氧化,产生大量脂质过氧化物,引发肝细胞氧化损伤。ADH与MEOS的细胞定位及特性见表19-3。 乙醇经上述两种代谢途径氧化均生成乙醒,后者在ALDH的催化下氧化成乙酸。人体肝内ALDH活性最高。ALDH的基因型有正常纯合子、无活性型纯合子和两者的杂合子三型。东方人这三种基因型的分布比例是45:10:45。无活性型纯合子完全缺乏ALDH活性,杂合子型部分缺乏ALDH活性。东方人群大约有30%~40%的人ALDH基因有变异,部分ALDH活性低下,此乃该人群饮酒后乙睦在体内堆积,引起血管扩张、面部潮红、心动过速、脉搏加快等反应的重要原因。此外,乙醇的氧化使肝细胞内细胞质NADH/NAD十比值升高,过多的NADH可将细胞质中丙酮酸还原成乳酸。严重酒精中毒导致乳酸和乙酸堆积可引起酸中毒和电解质平衡紊乱,还可使糖异生受阻引起低血糖。 肝细胞内定位胞质微粒体底物与辅酶乙醇、NAO+乙醇、NADPH、02对乙醇的凡值2mmoVL8.6mmoVL乙醇的诱导作用无有与乙醇氧化相关的能乱变化氧化磷酸化释能耗能(二)硝基还原酶和偶氮还原酶是第一相反应的主要还原酶硝基化合物多见于食品防腐剂、工业试剂等。偶氮化合物常见于食品色素、化妆品、纺织与印刷工业等,有些可能是前致癌物。这些化合物可分别在肝微粒体硝基还原酶(nitroreduc tase)和偶氮还原酶(azoreduc tase)的催化下,以NADH或NADPH为供氢载体,还原生成相应的胺类,从而失去其致癌作用。例如,硝基苯和偶氮苯经还原反应均可生成苯胺,后者再在单胺氧化酶的作用下,生成相应的酸。,又如,百浪多息是无活性的药物前体,经还原生成具有抗菌活性的氨苯磺胺。 H2N勹H;=N勹SO2NH2-比N勹NH2+H2N勹郔NH2 百浪多息氨苯磺胺 (三)酷酶、酰胺酶和糖昔酶是生物转化的主要水解酶肝细胞微粒体和细胞质中含有多种水解酶类,主要有酷酶(esterases)、酰胺酶(amidase)和糖昔酶(glucosidase),可分别催化脂质、酰胺类及糖昔类化合物中酷键、酰胺键和糖昔键的水解反应,以减低或消除其生物活性。应该指出的是,这些水解产物通常还需进一步转化反应才能排出体外。例如,阿司匹林(乙酰水杨酸)的生物转化过程中,首先是水解反应生成水杨酸或水解后先氧化成轻基水杨酸,然后是与葡糖酸酸的结合转化反应。 勹::。H;《厂。OH-三HCOOH-$芦琵 乙酰水杨酸水杨酸胫基水杨酸 (四)结合反应是生物转化的第二相反应第一相反应生成的产物可直接排出体外。如果其水溶性仍不够大,则需再进行第二相反应,生成极性更强的化合物。有些被转化的物质也可不经过第一相反应而直接进入第二相反应。肝细胞微粒体、细胞质或线粒体含有许多催化结合反应的酶类。凡含有轻基、狻基或氨基的化合物,或在体内被氧化成含有轻基、狻基等功能基团的物质均可与某些极性物质结合,掩盖其功能基团,增加水溶性,使其失去生物学活性(或毒性),并促进其排出。常见的结合物或基团有葡糖醋酸、硫酸、乙酰基、甲基、谷胱甘肤及氨基酸等,尤以与葡糖醋酸的结合最为普遍。 1.葡糖醒酸结合是最重要和最普遍的结合反应糖睦酸循环代谢途径产生的尿昔二磷酸葡糖(UDPG)可由UDPG脱氢酶催化生成尿昔二磷酸葡糖醋酸(UDPGA)。 尿音二磷酸葡糖+NAD+UDPG脱氢酶尿昔二磷酸葡糖酰酸+NADH+H+(UDPG)(UDPGA)UDPGA作为葡糖醋酸的活性供体,在肝微粒体的UDP-葡糖醒酸基转移酶(UDP-glucuronosyltransferase, UGT)催化下,可将具有多个经基和可解离狻基的葡糖醋酸基转移到醇、酚、胺、狻酸类化合物的胫基、氨基及狻基上形成相应的13-D-葡糖睦酸背,使其极性增加易排出体外。据研究,有数千种亲脂的内源物和异源物可与葡糖醒酸结合,如胆红素、类固醇激素、吗啡和苯巴比妥类药物等均可在肝与葡糖醋酸结合而进行生物转化,进而排出体外。临床上采用葡睦内酷(肝泰乐)治疗肝病,就是基于其作为葡糖醋酸类制剂以增加肝对被转化物质的生物转化作用。 三言 a-D-UDP-葡糖醒酸异源物 2.硫酸结合也是常见的结合反应肝细胞胞质存在硫酸基转移酶(sulfotransferase, SULT),以3I磷酸腺背5'-磷酰硫酸(PAPS)为活性硫酸供体,可催化硫酸基转移到类固醇、酚或芳香胺类等内、外源待转化物质的胫基上生成硫酸酣,既可增加其水溶性易于排出,又可促进其失活。如雌酮即由此形成硫酸酷而灭活。 雌酮雌酮硫酸酣 3.乙酰化是某些含胺类异源物的重要转化反应肝细胞细胞质富含乙酰基转移酶(acetyltransferase),以乙酰CoA为乙酰基的直接供体,催化乙酰基转移到含氨基或阱的内、外源待转化物质(如异烟阱、磺胺、苯胺等),形成相应的乙酰化衍生物。例如,抗结核病药物异烟阱在肝内乙酰基转移酶催化下经乙酰化而失去活性。该酶表达呈多态性,使得个体有快速或迟缓乙酰化之分,影响诸如异烟阱等药物在血液中的清除速率,迟缓乙酰化个体对异烟阱的某些毒性反应较之快速乙酰化个体敏感。 366第四篇医学生化专题 异烟阱乙酰辅酶A乙酰异烟阱辅酶A 此外,大部分磺胺类药物在肝内也通过这种形式灭活。但应指出,磺胺类药物经乙酰化后,其溶解度反而降低,在酸性尿中易于析出,故在服用磺胺类药物时应服用适量的碳酸氢钠,以提高其溶解度,利千随尿排出。 H2N:—SO2NHR+CH乙3c酰二°AA-CH3CO-NH/二观NHR+H;~:A 4.谷胱甘肤结合是细胞应对亲电子性异源物的重要防御反应肝细胞的细胞质富含谷胱甘肤S-转移酶(glutathione S-transferase, GST),可催化谷胱甘肤(GSH)与含有亲电子中心的环氧化物和卤代化合物等异源物结合,生成GSH结合产物。主要参与对致癌物、环境污染物、抗肿瘤药物以及内源性活性物质的生物转化。亲电子性异源物若不与GSH结合,则可自由地共价结合DNA、RNA或蛋白质导致细胞严重损伤。此外,谷胱甘肤结合反应也是细胞自我保护的重要反应。很多内源性底物受活性氧(ROS)修饰后形成具有细胞毒作用的氧化修饰产物。所以,GSH不仅具有抗氧化作用,还可结合氧化修饰产物,减低其细胞毒性,增加其水溶性易于排出体外。 "OCH3u-....;歹、0CH3黄曲霉素B1-8,9-环氧化物谷胱甘肤结合产物勹COOH+CoASH+ATP-<勹严0-SCoA+ADP+Pi勹CO-SCoA+H2N-CH2.:._COOH-勹CO-NH-CH2-COOH+CoASH胆酸和脱氧胆酸可与甘氨酸结合生成结合胆汁酸的反应步骤与上述相同。 三、生物转化作用受许多因素的调节和影响 肝的生物转化作用受年龄、性别、营养、疾病、遗传和诱导物等体内、外诸多因素的影响包。 (一)年龄、性别、营养、疾病及遗传等因素对生物转化产生明显影响3营养状况对生物转化作用亦产生影响蛋白质的摄入可以增加肝细胞整体生物转化酶的活性,提高生物转化的效率。饥饿数天(7天),肝谷胱甘肤S转移酶(GST)作用受到明显影响,其参加的生物转化反应水平降低。大量饮酒,因乙醇氧化为乙醒及乙酸,再进一步氧化成乙酰CoA,产生NADH,可使细胞内NAD./NADH比值降低,从而减少UDP-葡糖转变成UDP-葡糖醋酸,影响了肝内葡糖酸酸结合转化反应。 4.疾病尤其严重肝病可明显影响生物转化作用肝实质损伤直接影响肝生物转化酶类的合成。例如严重肝病时微粒体单加氧酶系活性可降低50%。肝细胞损害导致NADPH合成减少也影响肝对血浆药物的清除率。肝功能低下对包括药物或毒物在内的许多异源物的摄取及灭活速度下降,药物的治疗剂量与毒性剂量之间的差距减小,容易造成肝损害,故对肝病病人用药应特别慎重。 5.遗传因素亦可显著影响生物转化酶的活性遗传变异可引起个体之间生物转化酶类分子结构的差异或酶合成量的差异。变异产生的低活性酶可因影响药物代谢而造成药物在体内的蓄积。相反,变异导致的高活性酶则可缩短药物的作用时间或造成药物代谢毒性产物的增多。目前已知,许多肝生物转化的酶类存在酶活性异常的多态性,如醒脱氢酶、葡糖醋酸基转移酶、谷胱甘肤S-转移酶等。 (二)许多异源物可诱导生物转化作用的酶类 许多异源物可以诱导合成一些生物转化酶类,在加速其自身代谢转化的同时,亦可影响对其他异源物的生物转化。例如长期服用苯巴比妥可诱导肝微粒体单加氧酶系的合成,使机体对苯巴比妥类催眠药的转化能力增强,是耐药性产生的重要因素之一。临床上可利用其诱导作用增强对其他某些药物的代谢以达到解毒的效果,如用苯巴比妥减低地高辛中毒。苯巴比妥还可诱导肝微粒体UDP-葡糖醋酸基转移酶的合成,临床上用其增加机体对游离胆红素的结合转化反应,治疗新生儿黄疽。有些毒物,如烟草中的苯并芘可诱导肺泡吞噬细胞中隶属于单加氧酶系的芳香经胫化酶的合成,故吸烟者轻化酶的活性明显高于非吸烟者。 由于多种物质在体内转化常由同一酶系的催化,因此同时服用多种药物时可出现药物之间对同一转化酶系的竞争性抑制作用,使多种药物的生物转化作用相互抑制,可导致某些药物药理作用强度的改变。例如保泰松可抑制双香豆素类药物的代谢,两者同时服用时保泰松可增强双香豆素的抗凝,ii)对《}作用易发生出血现象,因此同时服用多种药物时应予注意。 此外,食物中亦常含有诱导或抑制生物转化酶的物质。例如烧烤食物、甘蓝、萝卜等含有肝微粒体单加氧酶系的诱导物,而水田齐则含有该酶的抑制剂。食物中的黄酮类可抑制单加氧酶系的活性。 第三节胆汁与胆汁酸的代谢一、胆汁可分为肝胆汁和胆囊胆汁胆汁(bile)由肝细胞分泌。肝细胞最初分泌的胆汁称肝胆汁(hepatic bile)。肝胆汁进入胆毅后,胆埏壁上皮细胞吸收其中的部分水分和其他一些成分,并分泌黏液渗入胆汁,浓缩成为胆翋胆汁(ga llbladd er bile),经胆总管排入十二指肠参与脂质的消化与吸收。 胆汁的主要固体成分是胆汁酸盐,约占固体成分的50%左右。其次是无机盐、黏蛋白、磷脂、胆固醇、胆色素等。除胆汁酸盐与脂质消化、吸收有关;磷脂与胆汁中胆固醇的溶解状态有关外,其他成分多属排泄物。体内某些代谢产物及进入体内的药物、毒物、重金属盐等异源物,均经肝的生物转化后随胆汁排出体外。因此,胆汁既是一种消化液,亦可作为排泄液。 正常人肝胆汁和胆囊胆汁的部分性质和化学百分组成见表19-4。 肝胆汁胆囊胆汁比重1.009-1.013I.026-1.032pH7.1-8.55.5-7.7水96~9780~86固体成分3~414~20无机盐0.2-0.90.5~1.1黏蛋白0.1-0.91~4胆汁酸盐0.5~2l.5~10胆色素0.05-0.170.2~1.5总脂质0.1-0.51.8-4.7胆固醇0.05-0.170.2-0.9磷脂0.05-0.080.2-0.5二、胆汁酸有游离型、结合型及初级、次级之分正常人胆汁中的胆汁酸(bile ac id)按其结构可分为游离胆汁酸(free bile acid)和结合胆汁酸(co njugated bile acid)两大类。游离胆汁酸包括胆酸(cholic acid)、鹅脱氧胆酸(chenodeoxycholic acid汃脱氧胆酸(deoxycholic acid)和少量石胆酸(lithocholic acid)四种。上述游离胆汁酸的24位狻基分别与甘氨酸或牛磺酸结合生成各种相应的结合胆汁酸,包括甘氨胆酸(glycocholic acid)、牛磺胆酸(taurocholic acid)、甘氨鹅脱氧胆酸(glycochenodeoxycholi c acid)和牛磺鹅脱氧胆酸(taurochenodeoxycholic acid)。胆汁酸按其来源亦可分为初级胆汁酸(primary bile acid)和次级胆汁酸(secondary bile acid)两类。在肝细胞以胆固醇为原料直接合成的胆汁酸称为初级胆汁酸,包括胆酸、鹅脱氧胆酸及其与甘氨酸或牛磺酸的结合产物。初级胆汁酸在肠菌作用下,第7位a胫基脱氧生成的胆汁酸称为次级胆汁酸,主要包括脱氧胆酸和石胆酸及其在肝中分别与甘氨酸或牛磺酸结合生成的结合产物。部分胆汁酸的结构见图19-1。包胆汁中所含的胆汁酸以结合型为主(占90%以上)。其中甘氨胆汁酸与牛磺胆汁酸的比例为3:l。胆汁中的初级胆汁酸与次级胆汁酸均以钠盐或钾盐的形式存在,形成相应的胆汁酸盐,简称胆盐(b ile s alts)。 胆酸鹅脱氧胆酸 脱氧胆酸石胆酸 HO', H-、、OH HO', H、OH甘氨胆酸牛磺胆酸图19-1几种主要胆汁酸的结构式胆汁酸在结构上系24碳的胆烧酸衍生物,初级胆汁酸中的胆酸含有3个经基(3a、7a、12a),鹅脱氧胆酸含有2个轻基(3a、7a)。属于次级胆汁酸的脱氧胆酸和石胆酸的c7位(—)促进脂质的消化与吸收胆汁酸分子内部既含有亲水性的胫基和狻基,又含有疏水性的经核和甲基,而且轻基和狻基的空间配位又全是a型,位于分子的同一侧构成亲水面,而分子的另一侧构成疏水面,所以胆汁酸的立体构型具有亲水和疏水两个侧面(图19-2)。这种结构特点赋予胆汁酸很强的界面活性,成为较强的乳化剂,能降低油/水两相的界面张力,使脂质乳化成3~10µm的细小微团,增加脂质与脂肪酶的附着面积,有利于脂肪的消化。脂质的消化产物又与胆汁酸盐结合,并汇入磷脂等形成直径只有约20µ,m的混合微团,利于通过小肠黏膜的表面水层,促进脂质的吸收。 (二)维持胆汁中胆固醇的溶解状态以抑制胆固醇析出人体内约99%的胆固醇随胆汁经肠道排出体外,其中1/3以胆汁酸形式,2/3以直接形式排出体外。胆汁中的胆固醇难溶于水,与胆汁酸及卵磷脂协同作用,使胆固醇分散形成可溶性的微团,使之不易析出沉淀而经胆道转运至肠道排出体外。胆固醇是否从胆汁中沉淀析出主要取决于胆汁中胆汁酸盐和卵磷脂与胆固醇之间的合适比例。如果肝合成胆汁酸或卵磷脂的能力下降、消化道丢失胆汁酸过多或胆汁酸肠肝循环减少,以及排入胆汁中的胆固醇过多(高胆固醇血症)等均可造成胆汁中胆汁酸和卵磷脂与胆固醇的比例下降(小于10:1),易发生胆固醇析出沉淀,形成胆结石(galls tone)。依据胆固醇含量可将胆结石分为3类:胆固醇结石(cholesterol stone)、黑色素结石(black pigment stone)和棕色素结石(brown pigment stone)。结石中胆固醇含量超过50%的称为胆固醇结石;黑色素结石一般为10%~30%;棕色索结石含胆固醇较少。,叩t§。 亲水面 甘氨胆酸多元环上的3个经基和甘氨酸的狻基位于分子的一侧,形成亲水面;甲基位于分子的另一侧,形成疏水面;该结构赋予其很强的界面活性四、胆汁酸的代谢及胆汁酸的肠肝循环(一)初级胆汁酸在肝内以胆固醇为原料生成肝细胞以胆固醇为原料合成初级胆汁酸,这是胆固醇在体内的主要代谢去路包。正常人每日约合成1~1.5g胆固醇,其中约0.4-0.6g在肝内转化为胆汁酸。肝细胞合成胆汁酸的反应步骤较复杂包,催化各步反应的酶类主要分别分布于微粒体和胞质。胆固醇首先在胆固醇7a-轻化酶(cholesterol7a hydroxy lase)的催化下生成7a-轻胆固醇。后者向胆汁酸的转化包括固醇核的3a(3[3-经基差向异构化为3a-轻基)和12a轻化、加氢还原、侧链氧化断裂、加水等多步复杂酶促反应,首先生成24碳的胆烧酰CoA。后者即可水解生成初级游离胆汁酸即胆酸(3a,7a,12a-三胫-5B-胆烧酸)和鹅脱氧胆酸(3a,7a-二胫-5B-胆烧酸),也可直接与甘氨酸或牛磺酸结合生成相应的初级结合胆汁酸,以胆汁酸钠盐或钾盐的形式随胆汁入肠。胆固醇7a-轻化酶是胆汁酸合成途径的关键酶,受终产物胆汁酸的负反馈调节。临床上采用口服阴离子交换树脂考来烯胺减少肠道胆汁酸的重吸收,从而促进肝内胆固醇向胆汁酸的转化,以降低血浆胆固醇含量。高胆固醇饮食在抑制HMG-CoA还原酶合成的同时,亦可诱导胆固醇7a-轻化酶基因的表达。肝细胞通过这两个酶的协同作用维持肝细胞内胆固醇的水平。糖皮质激素、生长激素也可提高胆固醇7a-轻化酶的活性。甲状腺素可诱导胆固醇7a-轻化酶mRNA合成,故甲状腺功能亢进病人血清胆固醇含量降低。 (二)次级胆汁酸在肠道由肠菌作用生成 进入肠道的初级胆汁酸在发挥促进脂质的消化吸收后,在回肠和结肠上段,由肠菌酶催化胆汁酸的去结合反应和脱7a-胫基作用,生成次级胆汁酸包。胆酸脱去7a-轻基生成脱氧胆酸;鹅脱氧胆酸脱去7a-轻基生成石胆酸。这两种游离型次级胆汁酸还可经肠肝循环被重吸收入肝,并与甘氨酸或牛磺酸结合成为结合型次级胆汁酸。此外,肠菌还可将鹅脱氧胆酸转化成熊脱氧胆酸(ursodeoxycholi c acid),即将鹅脱氧胆酸7a-经基转变成7[3-胫基,亦归属次级胆汁酸。熊脱氧胆酸含量很少,虽对代谢没有重要意义,但有一定的药理学效应。熊脱氧胆酸在慢性肝病治疗时具有抗氧化应激作用,可降低肝内由千胆汁酸湘留引起的肝损伤,改善肝功能以减缓疾病的进程。(三)胆汁酸的肠肝循环使有限的胆汁酸库存循环利用江进入肠道的各种胆汁酸(包括初级和次级、游离型与结合型)约有95%以上可被肠道重吸收,其余的(约为5%石胆酸)随粪便排出。胆汁酸的重吸收有两种方式。结合型胆汁酸在回肠部位被主动重吸收,游离型胆汁酸在小肠各部及大肠被动重吸收。重吸收的胆汁酸经门静脉重新入肝。在肝细胞内,游离胆汁酸被重新转变成结合胆汁酸,与重吸收及新合成的结合胆汁酸一起重新随胆汁入肠。胆汁酸在肝和肠之间的这种不断循环过程称为胆汁酸"肠肝循环”(enterohepatic circulation of bileacid)(图19-3)(动画19-1"胆汁酸肠肝循环”)。机体内胆汁酸储备的总量称为胆汁酸库(bile acid pool)。成人的胆汁酸库共约3~5g,即使全部倾入小肠也难满足每日正常膳食中脂质消化、吸收的需要。人体每天约进行6~l2次肠肝循环,从肠道吸收的胆汁酸总量可达12-32g,借此有效的肠肝循环机制可使有限的胆汁酸库存循环利用,以满足机体对胆汁酸的生理需求。 胆固醇 结合胆汁酸 (合成0.4-0.6g/d 代谢池3~5g) 未被肠道吸收的小部分胆汁酸在肠菌的作用下,衍生成多种胆烧酸并由粪便排出。每日仅从粪便排出约0.4-0.6g胆汁酸,与肝细胞合成的胆汁酸量相平衡。此外,经肠肝循环回收入肝的石胆酸在肝中除了与甘氨酸或牛磺酸结合外,还硫酸化生成硫酸甘氨石胆酸和硫酸牛磺石胆酸。这些双重结合的石胆酸在肠道中不容易去结合,亦不容易被肠道重吸收而从粪便中排出。因此,正常胆汁中石胆酸的含量甚微。 第四节胆色素的代谢与黄疽 胆色素(bile pigment)是体内铁卧琳类化合物的主要分解代谢产物,包括胆绿素(h山verdin)、胆红素(h山ruhin汃胆素原(bilinogen)和胆素(bilin)。这些化合物主要随胆汁排出体外,其中胆红素居千胆色素代谢的中心,是人体胆汁中的主要色素,呈橙黄色(动画19-2"胆红素代谢”)。 —、胆红素是铁卧瞅类化合物的降解产物 (一)胆红素主要源于衰老红细胞的破坏 体内铁卧啾类化合物包括血红蛋白、肌红蛋白、细胞色素、过氧化氢酶和过氧化物酶等。正常人每天可生成250-350mg胆红素,其中约80%以上来自衰老红细胞破坏所释放的血红蛋白的分解。 小部分胆红素来自造血过程中红细胞的过早破坏(无效红细胞生成),还有少量胆红素来自其他各种师4ti含血红素蛋白如细胞色素P450。肌红蛋白由于更新率低,所占比例很小。 (CO)和Fe2+,并将两端的咄咯环胫化,生成线性四咄咯结构的水溶性胆绿素。释出的Fe2+氧化为Fe3+进入铁代谢池,可供机体再利用或以铁蛋白形式储存。胆绿素进一步在胞质活性很强的胆绿素还原酶(b山verdin reductase)催化下,由NADPH供氢,还原生成胆红素(图19-4)。胆红素是由3个次甲基桥连接的4个咄咯环组成,分子量585。虽然胆红素红细胞的平均寿命约120天。生理情况下,正常成年人(70kg)每小时约有(1xl08个红细胞-2)被破坏。衰老的红细胞被肝、脾、骨髓等单核吞噬系统细胞识别并吞噬,每天释放约6g血红蛋白(每克血红蛋白约可产生35mg胆红素)。释出的血红蛋白随后分解为珠蛋白和血红素。珠蛋白可降解为氨基酸供体内再利用。血红素则由单核吞噬系统细胞降解生成胆红素。(二)血红素加氧酶和胆绿素还原酶催化胆红素的生成血红素是由4个咄咯环连接而成的环形化合物,并赘合l个二价铁离子。血红素由单核吞噬系统细胞微粒体的血红素加氧酶(hemeHO)催化在至少3分子氧和3分子NADPH的存在oxygenase,,下,血红素原叶啾IX环上的Q次甲基(—CH=)桥碳原子的两侧氧化断裂,释放出一分子一氧化碳分子中含有2个轻基(醇式)或酮基(酮式)、4个亚氨基和2个丙酸基等亲水基团,但由于这些基团形成比。 HO- \` P 勹- M C — M OH胆绿素)=C---{/II P M CH=CH,胆红素阁式) 血红素原卧啾IX环上的a次甲基(—CH=)桥碳原子被氧化使叶啾环打开,形成胆绿素,进而还原为胆红素,次甲桥的碳转变成CO,鳌合的铁离,6个分子内氢键,使胆红素分子形成脊瓦状内旋的刚性折叠结构,赋予胆红素以疏水亲脂的性质,极易自由透过细胞膜进入血液(图19-5)。 图19-5胆红素的X-线衍射结构图图中C环上的丙酸基与A环的氧原子和A、B环上的氮原子形成氢键;B环上的丙酸基与C环的氧原子和C、D环上的氮原子形成氢键;A和B环在一个平面,C和D环在一个平面,两平面的夹角为98°~100°迄今已发现人体内存在3种血红素加氧酶同工酶:H0-1,H0-2和H0-3。H0-1(32kD)是一种诱导酶,为热激蛋白32(HSP32)。主要存在于肝、脾、和骨髓等降解衰老红细胞的组织器官。H0-2(36kD)是组成型酶,仅受糖皮质激素诱导,主要存在于大脑及睾丸组织内,其功能多认为与co的神经信使作用有关。H0-3(33kD)与H0-2有90%的同源性,亦属组成型表达,其功能尚未明晰。H0-1在血红素代谢中居重要地位,其生物合成可被其底物血红素迅速激活,以及时清除循环系统中的血红素。H0-1亦是迄今所知的诱导物最多的诱导酶。缺氧、高氧、内毒素、重金属、白细胞介素-10(IL-10)、一氧化氮(NO)、促红细胞生成素(EPO)、炎症细胞因子等许多能引发细胞氧化应激(oxidative s tress)的因素均可诱导此酶的表达,从而增加co、胆绿素和继之胆红素的产生。 许多疾病亦表现H0-1的表达增加,例如肿瘤、动脉粥样硬化、心肌缺血、阿尔茨海默病等。H0-1作为一种应激蛋白质,其诱导因素的多样性是对细胞的一种重要保护机制。H0-1在上述诸多有害环境刺激和疾病存在条件下所呈现的对机体保护作用,主要是通过其催化生成的产物来实现的,这些产物主要是co与胆红素。HO氧化血红素时产生的co是机体内源性co的主要来源。co因对Hb有高度亲和力而呈现有害效应。但有研究显示,低浓度co和NO功能相似,可作为信息分子和神经递质。 胆红素过量对人体有害,但适宜水平的胆红素是入体内强有力的内源性抗氧化剂,是血清中抗氧化活性的主要成分,可有效地清除超氧化物和过氧化自由基。氧化应激可诱导H0-1的表达,从而增加胆红素的量以抵御氧化应激状态。胆红素的这种抗氧化作用通过胆绿素还原酶循环伽liverdin reductase cycle)实现:胆红素氧化成胆绿素,后者再在分布广、活性强的胆绿素还原酶催化下,利用NADH或NADPH再还原成胆红素。胆绿素还原酶循环可使胆红素的作用增大10000倍。 二、血液中的胆红素主要与清蛋白结合而运输 胆红素在单核吞噬系统细胞生成以后释放入血。在血浆中主要以胆红素-清蛋白复合体形式存在和运输。血浆清蛋白(albumin)与胆红素的结合,一方面增加了胆红素的水溶性,提高了血浆对胆红素的运输能力;另一方面限制了它自由通透各种细胞膜,避免了其对组织细胞造成的毒性作用。研究证明,每个清蛋白分子有一个高亲和力结合部位和一个低亲和力结合部位,可结合两分子胆红素。正常人血浆胆红素含量为3.4-17.1µmoVL(2-10mg/L),而每100ml血浆清蛋白可结合25mg胆红素,故在正常情况下血浆清蛋白结合胆红素的潜力很大,不与清蛋白结合的胆红素甚微。但必须提及的是,胆红素与清蛋白的结合是非特异性、非共价可逆性的。若清蛋白含量明显降低、结合部位被其他物质占据或降低胆红素对结合部位的亲和力,均可促使胆红素从血浆向组织细胞转移。 某些有机阴离子(如磺胺药、水杨酸、胆汁酸、脂肪酸等)可与胆红素竞争性地结合清蛋白,使胆红素游离。过多的游离胆红素因系脂溶性易穿透细胞膜进入细胞,尤其是富含脂质的脑部基底核的神经细胞,干扰脑的正常功能,称为胆红素脑病(bilirubin encephalopathy)或核黄疽(kernicteru s)。有黄疽倾向的病人或新生儿生理性黄疽期,应慎用上述药物。因此,血浆清蛋白与胆红素的结合仅起到暂时性的解毒作用,其根本性的解毒依赖肝与葡糖醋酸结合的生物转化作用。把这种未经肝结合转化的,在血浆中与清蛋白结合运输的胆红素称为未结合胆红素(unconjugated bilirubin)或血胆红素或游离胆红素。未结合胆红素因分子内氢键存在,不能直接与重氮试剂反应,只有在加入乙醇或尿素等破坏氢键后才能与重氮试剂反应,生成紫红色偶氮化合物,故未结合胆红素又称为间接反应胆红素或间接胆红素(indirect bilirubin)。 三、胆红素在肝细胞中转变为结合胆红素并泌入胆小管(—)游离胆红素可渗透肝细胞膜而被摄取血中的胆红素以胆红素-清蛋白复合体的形式运输到肝后,在被肝细胞摄取前先与清蛋白分离,然后迅速被肝细胞摄取。胆红素可以自由双向通透肝血窦肝细胞膜表面而进入肝细胞。所以,肝细胞对胆红素的摄取量取决千肝细胞对胆红素的进一步处理能力。 胆红素进入肝细胞后,在细胞质中主要与细胞质Y蛋白和Z蛋白两种配体蛋白(ligandin)相结合,其中,以Y蛋白为主。配体蛋白是胆红素在肝细胞质的主要载体,系谷胱甘肤S-转移酶(GST)家族成员,含量丰富,占肝细胞质总蛋白质的3%~4%,对胆红素有高亲和力。配体蛋白可与胆红素1:1结合,以胆红素-Y蛋白或胆红素-Z蛋白形式将胆红素携带至肝细胞滑面内质网。 (二)胆红素在内质网结合葡糖醒酸生成水溶性结合胆红素在滑面内质网UDP-葡糖醋酸基转移酶(UDP-glucuronosyltransferase, UGT)的催化下,由UDPGA提供葡糖醋酸基,胆红素分子的丙酸基与葡糖醋酸以酷键结合,生成葡糖醋酸胆红素(b山rl\bin glucuronide)。由于胆红素分子中含有2个狻基,每分子胆红素可至多结合2分子葡糖醋酸。结果主要生成胆红素葡糖睦酸二酣和少量胆红素葡糖醋酸-酣(图19-6),两者均可被分泌入胆汁。此外,尚有少量胆红素与硫酸结合生成硫酸酷。胆红素与葡糖醒酸的结合是肝脏对有毒性胆红素种根本性的生物转化解毒方式。把这些在肝脏与葡糖醋酸结合转化的胆红素称为结合胆红素(conjugated bilirubin)或肝胆红素。与葡糖睦酸结合的胆红素因分子内不再有氢键,分子中间的亚甲桥不在深埋于分子内部,可以迅速、直接与重氮试剂发生反应,故结合胆红素又称为直接反应胆红素或直接胆红素(如ect b山rubin)。结合胆红素与未结合胆红素不同理化性质的比较见,1记表19-5。 —氓—氓 咡—结构胆红素的生成及其葡糖醒酸图19-6 理化性质未结合胆红素结合胆红素同义名称间接胆红素、游离胆红素、直接胆红素、肝胆红素血胆红素、肝前胆红素与葡糖醋酸结合未结合口透过细胞膜的能力及毒性大小能否透过肾小球随尿排出不能能(三)肝细胞向胆小管分泌结合胆红素结合胆红素水溶性强,被肝细胞分泌进入胆管系统,随胆汁排入小肠。此被认为是肝脏代谢胆红素的限速步骤,亦是肝脏处理胆红素的薄弱环节。肝细胞向胆小管分泌结合胆红素是一个逆浓度梯度的主动转运过程,定位于肝细胞膜胆小管域的多耐药相关蛋白2(multidru g resistance-like protein2, MRP2)是肝细胞向胆小管分泌结合胆红素的转运蛋白质。胆红素排泄一旦发生障碍,结合胆红素就可返流入血。对UDP-葡糖醋酸基转移酶具有诱导作用的苯巴比妥等药物对结合胆红素从肝细胞到胆汁的分泌也同样具有诱导作用,可见胆红素的结合转化与分泌构成相互协调的功能体系。血浆中的胆红素通过肝细胞膜的自由扩散、肝细胞质内配体蛋白的运转、内质网的葡糖睦酸基转移酶的催化和肝细胞膜的主动分泌等联合作用,不断地被肝细胞摄取、结合转化与排泄,从而不断地得以清除。 四、胆红素在肠道内转化为胆素原和胆素 (—)胆素原是结合胆红素经肠菌作用的产物 经肝细胞转化生成的葡糖醒酸胆红素随胆汁进入肠道,在回肠下段和结肠的肠菌作用下,脱去葡糖醋酸基,并被还原生成d-尿胆素原(d-urobilinogen)和中胆素原(mesobilirubinogen, i-urobilinogen)。后者又可进一步还原生成粪胆素原(stercobilinogen,1-urobil inogen),这些物质统称为胆素原。大部分胆素原随粪便排出体外,在肠道下段,这些无色的胆素原接触空气后分别被氧化为相应的d-尿胆素\?Ji](d-urob山n)、1-尿胆素(i-urobilin)和粪胆素(stercobilin,1-urobilin),三者合称胆素(图19-7)。胆素呈。 376第四篇医学生化专题 黄褐色,成为粪便的主要颜色。正常人每日排出总量为40-280mg。胆道完全梗阻时,胆红素不能排入肠道形成胆素原和进而形成粪胆素,因此粪便呈灰白色或白陶土色。婴儿肠道细菌稀少,未被细菌作用的胆红素随粪便排出,可使粪便呈现橘黄色。 `/``广厂厂 胆红素 d-尿胆素原中胆素原(i-尿胆素原) COOH COOH COOH COOH中胆素(i-尿胆素) `H^夕`H H H~义` 粪胆素原(1-尿胆素原) d-尿胆素 H H N H N HH入N粪胆素(1-i尿胆素)图19-7粪胆素和尿胆素的生成(二)少量胆素原可被肠黏膜重吸收,进入胆素原的肠肝循环肠道中生成的胆素原有10%~20%可被肠黏膜细胞重吸收,经门静脉入肝,其中大部分(约90%)以原形随胆汁排入肠腔,形成胆素原的肠肝循环(enterohepatic urobilinogen cycle)(动画19-3"胆素原的肠肝循环”)。只有小部分(10%)胆素原可以进入体循环经肾小球滤出随尿排出,称为尿胆素原(图19-8)。正常人每日随尿排出尿胆素原约0.5-4.0mg。尿胆素原与空气接触后被氧化成尿胆素,成为尿的主要色素。临床上将尿胆素原、尿胆素及尿胆红素合称为尿三胆,是黄疽类型鉴别诊断的常用指标。正常人尿中检测不到尿胆红素。 吞—压 细蛋噬白珠 血液肝细胞 胆红素 Z蛋白胆红素-Z蛋白 胆红素-清蛋白 蛋广 Y蛋白胆红素-Y蛋白 血0花 CF复合物 胆绿素葡糖酸酸胆红素 胆红素 胆气:I I I胆管 肠管 粪胆素__胆素原葡糖酸酸胆红素胆素原(粪便)02尿胆素(尿) 五、高胆红素血症及黄疽 (一)正常人血清胆红素含量甚微 正常成人血清胆红素总量为3.4-17. lµmoVL(2-lOmg/L),其中约80%是未结合胆红素,其余为结合胆红素。单核吞噬系统细胞产生的胆红素是有毒的脂溶性物质,易透过细胞膜尤其对富含脂质的神经细胞可造成不可逆损伤。胆红素与血浆清蛋白的结合(未结合胆红素)仅起到暂时性的解毒作用,肝细胞内胆红素与葡糖睦酸结合(结合胆红素)反应是对胆红素的一种根本性生物转化解毒方式。肝细胞对胆红素有强大的处理能力。正常人每天从单核吞噬细胞系统产生250-350mg胆红素,但正常人肝每天可清除3000mg以上的胆红素,因此正常人血清中胆红素的含量甚微。 (二)黄疽依据病因有溶血性、肝细胞性和阻塞性之分体内胆红素生成过多,或肝细胞对胆红素的摄取、转化及排泄能力下降等均可引起血浆胆红素含星增多。当血浆胆红素含簸超过17. lµmoVL(lOmg/L)称为高胆红素血症(hyperbilirubinemia)。胆红素为橙黄色物质,过量的胆红素可扩散进入组织造成黄染现象,这一体征称为黄疽(jaundi ce)。由于皮肤、巩膜、指甲床下和上颗等含有较多弹性蛋白,对胆红素有较强的亲和力,故易被黄染。黄疽的程度取决千血浆胆红素的浓度。当血浆胆红素浓度超过34.2µmoVL(20mg/L)时,肉眼可见皮肤、黏膜及巩膜等黄染,临床上称为显性黄疽(clinical jaundice)。若血浆胆红素在17.1-34.2µmoVL(1020mg/L)之间时,肉眼观察不到皮肤与巩膜等黄染现象,称为隐性黄疽(occult jaundice)。 临床上常根据黄疽发病的原因不同,将黄疽分为三类。 1溶血性黄疽溶血性黄疽(hemolytic jaundice),又称为肝前性黄疽(prehepatic jaundice)。系各种原因所致红细胞的大址破坏,单核吞噬系统产生胆红素过多,超过了肝细胞摄取、转化和排泄胆红素的能力,造成血液中未结合胆红索浓度显著增高所致。其特征为:O血浆总胆红素、未结合胆红素含批增高;@结合胆红素的浓度改变不大,尿胆红素呈阴性;@因肝对胆红素的摄取、转化和排泄增多,过多的胆红素进入胆道系统,肠肝循环增多,使得尿胆原和尿胆素含量增多,粪胆原与粪胆素亦增加;@伴有其他特征如贫血、脾大及末梢血液网织红细胞增多等。某些药物、某些疾病(如恶性症疾、过敏、锁状细胞贫血、蚕豆病等)及输血不当等多种因素均有可能引起大量红细胞破坏,导致溶血性黄疽。 2肝细胞性黄疽肝细胞性黄疽(hepatocellular jaundice),又称为肝原性黄疽(hepatic jaundice)。由千肝细胞功能受损,造成其摄取、转化和排泄胆红素的能力降低所致的黄疽。一方面肝摄取胆红素障碍,造成血中未结合胆红素升高;另一方面肝细胞受损肿胀,压迫毛细胆管,造成肝内毛细胆管阻塞,而后者与肝血窦直接相通,使肝内部分结合胆红素返流入血,造成血清结合胆红素亦增高。此外,经肠肝循环入肝的胆素原可经损伤的肝细胞进入体循环,并从尿中排出,使尿胆素原升高。其特征为心血清未结合胆红素和结合胆红素均升高。@尿胆红素呈阳性。@尿胆素原升高,但若胆小管堵塞严重,则尿胆素原反而降低。@粪胆素原含量正常或降低。由于肝功能障碍,结合胆红素在肝内生成减少,粪便颜色可变浅。@其他特征如血清谷丙转氨酶(ALT)及谷草转氨酶(AST)活性明显升高。肝细胞性黄疽常见千肝实质性疾病如各种肝炎、肝硬化、肝肿瘤及中毒(如氯仿、四氯化碳)等引发的肝损伤。 3.阻塞性黄疽阻塞性黄疽(obstructive jaundice)又称为肝后性黄疽(posthepatic jaundic e)。由各种原因引起的胆管系统阻塞,胆汁排泄通道受阻,使胆小管和毛细胆管内压力增高而破裂,导致结合胆红素返流入血,使得血清结合胆红素明显升高。其特征为:心结合胆红素明显升高,未结合胆红素升高不明显;@大量结合胆红素可从肾小球滤出,所以尿胆红素呈强阳性,尿的颜色加深,可呈茶叶水色;@由于胆管阻塞排入肠道的结合胆红素减少,导致肠菌生成胆素原减少,粪便中胆素原及胆素含量降低,完全阻塞的病人粪便可变成灰白色或白陶土色;@其他特征如血清胆固醇和碱性磷酸酶(ALP)活性明显升高等。阻塞性黄疽常见于胆管炎、肿瘤(尤其胰头癌)、胆结石或先天性胆管闭锁等疾病。 各种黄疽血、尿、粪胆色素的实验室检查变化见表19-6。 指标正常溶血性黄疽肝细胞性黄疽阻塞性黄疽 血清胆红素浓度10mg/L>lOmg/L>lOmg/L结合胆红素极少f f f未结合胆红素0-8mg/L r r r尿胆红素rf'++++尿胆素原少批不一定L尿胆素少量不一定i变浅或正常完全阻塞时白陶土色注:"-“代表阴性,“++”代表强阳性独特的结构特点,赋予肝复杂多样的生物化学功能。肝不仅是多种物质代谢之中枢,而且还具有生物转化、分泌和排泄等功能。肝通过肝糖原合成与分解、糖异生维持血糖的相对稳定。肝在脂质代谢中占据中心地位。肝将«、心,胆固醇转化为胆汁酸,协助脂质的消化与吸收。肝是体内合成甘油三醋、磷脂与胆固醇的重要器官。 肝能合成VLDL及HDL,参与甘油三酣与胆固醇的转运。LCAT是肝合成的血浆功能性酶,参与血浆胆固醇的酣化。肝是氧化脂肪酸并产生酮体的重要器官。肝的蛋白质合成与分解代谢均非常活跃。除"求蛋白外,几乎所有的血浆蛋白质均来自肝。肝是除支链氨基酸外所有氨基酸分解代谢的重要器官,也是处理氨基酸分解代谢产物的重要场所。氨主要在肝内经鸟氨酸循环合成尿素而解毒。肝在维生素的吸收、储存、运输和代谢转化方面起重要作用。肝也是许多激素灭活的场所。 肝通过生物转化对异源物及某些内源性的代谢产物或生物活性物质进行代谢转变,提高其水溶性和极性,易于从尿或胆汁排出。肝生物转化分两相反应,笫一相反应包括氧化、还原和水解;笫二相反应是结合反应,主要与葡糖酪酸、硫酸和乙酰基等结合。生物转化反应具有连续性、多样性和解毒与致毒的双重性特点。肝生物转化受年龄、性别、营养、疾病、遗传及异源物诱导等因素的影响。 胆汁是肝细胞分泌的兼具消化液和排泄液的液体。胆汁的主要成分是胆汁酸,是肝清除胆固醇的主要形式。胆固醇7et-径化酶是胆汁酸合成的关键调节酶。胆汁酸有初级胆汁酸与次级胆汁酸之分。初级胆汁酸合成于肝,包括胆酸与鹅脱氧胆酸。初级胆汁酸经肠菌作用生成次级胆汁酸,包括脱氧胆酸与石胆酸。胆汁酸还有游离型胆汁酸与结合型胆汁酸之分。结合型胆汁酸是游离胆汁酸与甘氨酸或牛磺酸在肝内结合的产物。胆汁酸的肠肝循环使有限的胆汁酸库存反复利用以满足脂质消化吸收之需。 胆色素是铁叶咏类化合物的分解代谢产物,包括胆绿素、胆红素、胆素原和胆素。胆红素主要源于衰老红细胞血红蛋白释放的血红素的降解。血红素加氧酶和胆绿素还原酶催化血红素经胆绿素生成胆红素。胆红素为亲脂疏水性,在血浆中与清蛋白结合而运输,称为未结合胆红素。胆红素在肝与葡糖酪酸结合生成水溶性的结合胆红素,由肝细胞分泌随胆汁排入肠道。结合胆红素在肠茵作用下,被水解和还原成无色胆素原。胆素原的大部分在肠道下段遇空气被氧化为黄褐色的粪胆素。少量的胆素原则被肠黏膜重吸收入肝,其中的大部分又以原形重新排入肠道,构成胆素原的肠肝循环,有小部分重吸收的胆素原经体循环入肾随尿排出,称为尿胆素原。其被空气氧化后生成尿胆素。尿胆素原、尿胆素和尿胆红素在临床上合称为尿三胆,是黄疽类型鉴别的常用指标。多种原因可致高胆红素血症并引发黄疽体征。黄疽可根据发生原因分为溶血性黄疽、肝细胞性黄疽和阻塞性黄疽三类。各种黄疽均有其独特的血、尿、粪胆色素实验室检查改变。 1.如何理解肝是多种物质代谢的中枢? 2.何谓生物转化作用?生物转化有哪些反应类型,其生理意义及特点是什么? 3.何谓初级、次级胆汁酸及游离、结合胆汁酸?简述胆汁酸的生理功能及胆汁酸的肠肝循环的生理意义。4.何谓游离胆红素和结合胆红素?简述两种胆红素的性质差异。(王明臣) 第二十章 维生素(vitamin)是人体内不能合成,或合成量甚少、不能满足机体的需要,必须由食物供给,以维持正常生命活动的一类低分子量有机化合物,是人体的重要营养素之一。维生素不是机体组织的组成成分,也不是供能物质,然而在调节人体物质代谢、生长发育和维持正常生理功能等方面却发挥着极其重要的作用。虽然人体对维生素的日需要量极少,但如果人体长期摄入不足或吸收障碍,可致维生素缺乏症;若人体长期过量摄取某些维生素,也可导致维生素中毒。按照维生素溶解特性的不同,可分为脂溶性维生素(lip吐soluble vitamin)和水溶性维生素(water-soluble vitamin)两大类。 第一节脂溶性维生素 脂溶性维生素包括维生素A、维生素D、维生素E和维生素K,是疏水性化合物,易溶于脂质和有机溶剂,常随脂质被吸收。脂溶性维生素在血液中与脂蛋白或特异性结合蛋白质结合而运输,不易被排泄,在体内主要储存于肝,故不需每日供给。维生素A、维生素D、维生素E和维生素K的结构不同(图20-1),执行不同的生物化学与生理功能。脂质吸收障碍和食物中长期缺乏此类维生素可引起相应的缺乏症,摄入过多则可发生中毒。 维生素E(生育三烯酚)维生素D(胆钙化醇) —、维生素A (-)—般性质维生素A(vitamin A)是由1分子B-白芷酮环和2分子异戊二烯构成的不饱和一元醇。一般所说的天然维生素A指A l(视黄醇,re tinol),主要存在于哺乳类动物和咸水鱼肝中。维生素A2(3-脱氢视黄醇)则存在于淡水鱼肝中。动物性食品,如肝、肉类、蛋黄、乳制品、鱼肝油等都是维生素A的丰富来源。食物中的维生素A主要以酕的形式存在,在小肠内受酷酶的作用而水解,生成视黄醇进入小肠黏膜上皮细胞后又重新被酷化,并掺入乳糜微粒通过淋巴转运。乳糜微粒中的视黄醇酣可被肝细胞和其他组织摄取,在肝细胞中被水解为游离视黄醇。在血液中,视黄醇与视黄醇结合蛋白(retinol binding protein, RBP)相结合,后者再结合甲状腺素视黄质运载蛋白(transthyretin,TIR),形成视黄醇-RBP-TIR复合体。在细胞内,视黄醇与细胞视黄醇结合蛋白(cellular retinal binding protein, CRBP)结合。肝细胞内过多的视黄醇则转移到肝内星状细胞,以视黄醇酷的形式储存。包植物中无维生素A,但含有被称为维生素A原(prov i tamin A)的多种胡萝卜素(carotene),其中以B-胡萝卜素([3-carotene)最为重要。胡萝卜、红辣椒、疲菜、甘薯、木瓜等均含有丰富的B-胡萝卜素。B-胡萝卜素可在小肠黏膜细胞或肝中被加双氧酶分解生成2分子全反式视黄醇。由于小肠黏膜对B胡萝卜素的分解和吸收能力较低,每分解6分子B-胡萝卜素仅获得1分子视黄醇,即B-胡萝卜素转化为维生素A的转化当量仅为1/6。3在细胞内,一些依赖NADH的醇脱氢酶催化视黄醇和视黄睦(re ti nal)之间的可逆反应。视黄酪在视黄酸脱氢酶的催化下又不可逆的氧化生成视黄酸(reti noic acid)。视黄醇、视黄醒和视黄酸是维生素A的活性形式。 1视黄醒参与视觉传导人视网膜的光受体细胞分为锥状细胞和杆状细胞。锥状细胞是感受亮光和产生色觉的细胞,杆状细胞是感受弱光或暗光的细胞。在人视网膜杆状细胞内,全反式视黄醇在异构酶的作用下生成11-顺视黄醇,并进而氧化为11-顺视黄醒。11-顺视黄醋作为光敏感视蛋白(opsin)的辅基与之结合生成视紫红质(rhodopsin)。弱光可使视紫红质中11-顺视黄醒和视蛋白分别发生构型和构象改变,生成含全反式视黄醒的光视紫红质(photorhodopsin)。光视紫红质再经一系列构象变化,生成变视紫红质II(me tru·hodopsin II),后者引起视觉神经冲动并随之解离释放全反视黄酪和视蛋白。全反视黄醒经还原生成全反视黄醇,从而完成视循环(visual cycle)(图20-2)。可见,视紫红质是暗视觉的基础,人视网膜杆状细胞合成视紫红质时需要维生素A参与,维生素A参与了视觉传导。 2.视黄酸调控基因表达和细胞生长与分化维生素A及其代谢中间产物具有广泛的生理学和药理学活性,在人体生长、发育和细胞分化尤其是精子生成、黄体酮前体形成、胚胎发育全反视黄醒11-顺视黄醒等过程中起着十分重要的调控作用。视黄醇的不可逆氧化产物全反式视黄酸(all-trans retinoic视蛋白aci d,ATRA)和9-)顽视黄酸是执行这一重要功能的关键物质,它们与细胞内核受体结合,通过与变视紫红质1I视紫红质DNA反应元件的作用,调节某些基因的表达,进I(1]-顺视黄醒)而调控细胞的生长、发育和分化。所以,视黄酸'对于维待上皮组织的正常形态与生长具有重要视觉神经冲动(全反视黄醒)的作用。如ATRA可促进上皮细胞生长与分化,图20-2视循环参与上皮组织的正常角化过程,可使银屑病角化过度的表皮正常化而用千银屑病的治疗。 3.维生素A和胡萝卜素是有效的抗氧化剂维生素A和胡萝卜素是机体一种有效的捕获活性氧的抗氧化剂,具有清除活性氧和防止脂质过氧化的作用。 4维生素A及其衍生物可抑制肿瘤生长维生素A及其衍生物有延缓或阻止癌前病变,桔抗化学致癌剂的作用。维生素A及其衍生物ATRA具有诱导肿瘤细胞分化和凋亡、增加癌细胞对化疗药物的敏感性的作用。动物实验表明摄入维生素A及其衍生物ATRA可诱导肿瘤细胞的分化和减轻致癌物质的作用。 382第四筒医学生化专题(三)维生素A缺乏症及中毒若视循环的关键物质ll-顺视黄醒的补充不足,视紫红质合成减少,对弱光敏感性降低,从明处到暗处看清物质所需的时间即暗适应时间延长,严重时会发生“夜盲症"。维生素A缺乏可引起严重的上皮角化,眼结膜黏液分泌细胞的丢失与角化以及糖蛋白分泌的减少均可引起角膜干燥,出现眼千燥症(xerophthalmia)。因此,维生素A又称眼千燥症维生素。此外,视黄酸对于免疫系统细胞的分化具有重要的作用。维生素A缺乏增加机体对感染性疾病的敏感性。 维生素A的摄入量超过视黄醇结合蛋白的结合能力,游离的维生素A可通过破坏细胞膜、核膜以及线粒体和内质网等细胞器造成组织损伤。中国成人男性膳食维生素A的平均需要量(estimated average requirement, EAR)为560µg/d,成人女性为480µg/d。如果长期过量摄入维生素A可出现维生素A中毒表现。其症状主要有头痛、恶心、共济失调等中枢神经系统表现;肝细胞损伤和高脂血症;长骨增厚、高钙血症、软组织钙化等钙稳态失调表现以及皮肤千燥、脱屑和脱发等表现。 二、维生素D (一)一般性质维生素D(vi tamin D)是类固醇(steroid)的衍生物,为环戊烧多氢菲类化合物。维生素D为无色结晶易溶于脂肪和有机溶剂,除对光敏感外,其化学性质较稳定。 天然的维生素D包括队或称胆钙化醇(cholecalciferol)及队或称麦角钙化醇(ergocalciferol)。鱼油、蛋黄、肝富含维生素D3。人体皮肤储存有从胆固醇生成的7-脱氢胆固醇(维生素趴原),在紫外线的照射下,可转变成维生素D3。适当的日光浴足以满足入体对维生素D的需要。植物中含有麦角固醇(维生素队原),在紫外线的照射下,分子内B环断裂转变成维生素D20进入血液的维生素队主要与血浆中维生素D结合蛋白(vitamin D binding protein, DBP)相结合而运输。在肝微粒体25-轻化酶的催化下,维生素队被轻化生成25孚臣维生素D3(25-0H-D3)。25-0H-D3是血浆中维生素队的主要存在形式,也是维生素队在肝中的主要储存形式。25-0H-队在肾小管上皮细胞线粒体l"轻化酶的作用下,生成维生素队的活性形式1,25-二胫维生素D3[1,25-(OH)2-D3]。25-0H-队和1,25-(OH)了队在血液中均与DBP结合而运输。 肾小管上皮细胞还存在24-经化酶,催化25-0H-队进一步轻化生成24,25-(OH)2-D3。1,25(OH)了队通过诱导24-轻化酶和阻遏1贮轻化酶的生物合成来控制其自身的生成量(图20-3)。 (二)生物学功能 1.1,25-(0H)2-D3调节钙、磷代谢1,25-(OH)了且可与靶细胞内特异的核受体结合,进入细胞核,调节相关基因(如钙结合蛋白基因、骨钙蛋白基因等)的表达。1,25-(OH)了队还可通过信号转导系统使钙通道开放,发挥其对钙、磷代谢的快速调节作用。此外,1,25-(OH)了队促进小肠对钙、磷的吸收,影响骨组织的钙代谢,从而维持血钙和血磷的正常水平,促进骨和牙的钙化。 2.1,25-(0H)2-D3影响细胞分化大量研究证明,肾外组织细胞也具有轻化25-0H-趴生成1,25(OH)了队的能力。皮肤、大肠、前列腺、乳腺、心、脑、骨骼肌、胰岛B细胞、单核细胞和活化的T和B淋巴细胞等均存在维生素D受体。1,25-(OH)了队具有调节这些组织细胞分化等功能。1,25-(OH)2-D3促进胰岛B细胞合成与分泌胰岛素,具有对抗1型和2型糖尿病的作用。1,25-(OH)了队对某些肿瘤细胞还具有抑制增殖和促进分化的作用。低日照与大肠癌和乳腺癌的高发病率和死亡率有一定的相关性。 (三)维生素D缺乏症及中毒 中国居民膳食维生素D的平均需要量(estimated average requirement, EAR)为8µg/d。当缺乏维生素D时,儿童可患侚倭病(rickets),成人可发生软骨病(osteomalacia)和骨质疏松症(osteoporosi s)。因此,维生素D又称抗侚倓病维生素。此外,维生素D缺乏也与自身免疫性疾病的发生有关。 长期每日过量摄入维生素D可引起中毒,特别是对维生素D较敏感的人。维生素D中毒的症状主要有异常口渴,皮肤播痒,厌食、嗜睡、呕吐、腹泻、尿频以及高钙血症、高钙尿症、高血压以及软组织钙化等。由于皮肤储存7-脱氢胆固醇有限,多晒太阳不会引起维生素D中毒。 三、维生素E (一)一般性质 维生素E(v itamin E)是苯骈二氢阰喃的衍生物,包括生育酚(tocopherol)和三烯生育酚(tocotri enol)两类,每类又分a、B、订和8四种。天然维生素E主要存在于植物油、油性种子和麦芽等中,以a-生育酚分布最广、活性最高。a-生育酚是黄色油状液体,溶于乙醇、脂肪和有机溶剂,对热及酸稳定,对碱不稳定,对氧极为敏感。在正常情况下,20%-40%的a-生育酚可被小肠吸收。在机体内,维生素E主要存在于细胞膜、血浆脂蛋白和脂库中。 (二)生物学功能 1.维生素E是体内最重要的脂溶性抗氧化剂维生素E作为脂溶性抗氧化剂和自由基清除剂,主要对抗生物膜上脂质过氧化所产生的自由基,保护生物膜及其他蛋白质的结构与功能。维生素E可捕捉过氧化脂质自由基,形成反应性较低且相对稳定的生育酚自由基(氧化型维生素E);后者可在维生素C、GSH或NADPH的作用下,还原生成非自由基产物一—生育酣(还原型维生素E)。维生素E对细胞膜的保护作用使细胞维持正常的流动性。 2.维生素E具有调节基因表达的作用维生素E除具有强的抗氧化剂作用外,还具有调节信号转导过程和基因表达的重要作用。维生素E可以上调或下调生育酚的摄取和降解相关的基因、脂质摄取与动脉硬化的相关基因、表达某些细胞外基质蛋白的基因、细胞黏附与炎症的相关基因以及细胞信号系统和细胞周期调节的相关基因等。因而,维生素E具有抗炎、维持正常免疫功能和抑制细胞增殖的作用,并可降低血浆低密度脂蛋白(LDL)的浓度。维生素E在预防和治疗冠状动脉粥样硬化性心脏病、肿瘤和延缓衰老方面具有一定的作用。 3维生素E促进血红素的合成维生素E能提高血红素合成的关键酶8-氨基-丫-酮戊酸(aminolevulini c acid, ALA)合酶和ALA脱水酶的活性,从而促进血红素的合成。(三)维生素E缺乏症及中毒中国成人膳食维生素E的适宜摄入量(adequ ate intake, AI)为14mg/d的a-生育酚当撮(a-tocopherol equivalent, a-TE)。维生素E一般不易缺乏,在严重的脂质吸收障碍和肝严重损伤时可引起缺乏症,表现为红细胞数量减少,脆性增加等溶血性贫血症。偶尔也可引起神经功能障碍。动物缺乏维生素E时其生殖器官发育受损,甚至不育。人类尚未发现因维生素E缺乏所致的不孕症。临床上常用维生素E治疗先兆流产及习惯性流产。维生素E缺乏病是由于血中维生素E含扯低而引起,主要发生在婴儿,特别是早产儿。早产的新生儿由于组织维生素E的储备较少和小肠吸收能力较差,可因维生素E缺乏引起轻度溶血性贫血。 与维生素A和D不同,人类尚未发现维生素E中毒症。中国成人可耐受的最高摄入批(tolerableupper intake level, UL)是600mg cx.-TE/d。然而,长期大量服用的副作用不能忽略。 384第四篇医学生化专题 四、维生素K (一)一般性质 维生素K(四amin K)是2-甲基-1,4-萦酣的衍生物。广泛存在于自然界的维生素K有K l和K2a维生素Kl又称植物甲萦酣或叶绿酕(phylloquinone),主要存在于深绿色蔬菜(如甘蓝、疲菜、窝笸等)和植物油中。维生素长则由大肠杆菌合成。维生素凡是人工合成的水溶性甲萦酣,可口服及注射。2-甲基-1,4-荼酰是维生素K的活性形式。 维生素K主要在小肠被吸收,随乳糜微粒而代谢。体内维生素K的储存量有限,脂质吸收障碍可引发维生素K缺乏症。(二)生物学功能1.维生素K是凝血因子合成所必需的辅酶血液凝血因子II、VII、IX、X及抗凝血因子蛋白C和蛋白S在肝细胞中以无活性前体形式合成,其分子中4~6个谷氨酸残基需狻化成丫-狻基谷氨酸(-y carboxylglutamic acid)残基才能转变为活性形式。此反应由丫-狻化酶催化,而许多丫-谷氨酰狻化酶的辅酶是维生素K。因此,维生素K是凝血因子合成所必需的。 2维生素K对骨代谢具有重要作用肝、骨等组织中存在维生素K依赖蛋白,如骨钙蛋白(OSteocalcin)和骨基质的丫-狻基谷氨酸蛋白均是维生素K依赖蛋白。研究表明,服用低剂量维生素K的妇女,其股骨颈和脊柱的骨盐密度明显低于服用大剂量维生素K时的骨盐密度。 此外,维生素K对减少动脉钙化也具有重要的作用。大剂量的维生素K可以降低动脉硬化的危险性。.(三)维生素K缺乏症中国成人膳食维生素K的适宜摄入量(AI)为80µg/d。因维生素K广泛分布于动、植物组织,且体内肠菌也能合成,一般不易缺乏。因维生素K不能通过胎盘,新生儿出生后肠道内又无细菌,所以新生儿有可能出现维生素K的缺乏。维生素K缺乏的主要症状是易出血。引发脂质吸收障碍的疾病,如胰腺疾病、胆管疾病及小肠黏膜萎缩或脂肪便等均可出现维生素K缺乏症。长期应用抗生素及肠道灭菌药也有引起维生素K缺乏的可能性。 第二节水溶性维生素 水溶性维生素包括B族维生素(B!、队、PP、泛酸、生物素、凡、叶酸与B12)和维生素C。水溶性维生素在体内主要构成酶的辅因子,直接影响某些酶的活性。水溶性维生素依赖食物提供,体内很少蓄积,过多的水溶性维生素可随尿排出体外,一般不发生中毒现象,但供给不足时往往导致缺乏症。 一、维生素B1 (—)一般性质 维生素B直含氨基的密唗环和含硫的唾嗤环通过亚甲基桥相连而成,因分子中含有"硫”和"氨",又名硫胺素(thiamine)(图20-4)。维生素B主要存在于豆类和种子外皮(如米棣)、胚芽、酵母和瘦肉中。其纯品为白色粉末状结晶,易溶于水,微溶于乙醇。维生素且在酸性环境中较稳定、加热120°C仍不分解;中性和碱性环境中不稳定、易被氧化和受热破坏。硫胺素易被小肠吸收,入血后主要在肝及脑组织中经硫胺素焦磷酸激酶的催化生成焦磷酸硫胺素(如amine pyrophosphate, TPP)。TPP是维生素Bl的活性形式,占体内硫胺素总量的80%。 (二)生物学功能维生素且在体内能量代谢中发挥重要的作用。TPP是a-酮酸氧化脱狻酶多酶复合体的辅酶,参与线粒体内丙酮酸、a-酮戊二酸和支链氨基酸的a-酮酸的氧化脱狻反应。TPP在这些反应中转移醒。 基。TIP嗟嗤环上硫和氮原子之间的碳原子十分活 吼勹 泼易释放W形成负碳离子(carbanion)。负碳离子可与a-酮酸狻基结合,进而使a-酮酸脱狻。TPP也是胞质中磷酸戊糖途径中转酮醇酶的辅酶,参与转酮醇作用(transketolation)。维生素Bl在神经传导中起一定作用。合成乙酰胆碱所需的乙酰辅酶A主要来自千丙酮酸的氧化焦磷酸硫胺素(TPP)脱狻反应。此外,维生素Bl可作为胆碱酷酶的抑制维生素B1缺乏时,糖代谢中间产物丙酮酸的氧化脱狻反应发生障碍,血中丙酮酸和乳酸堆积。由于以糖有氧分解供能为主的神经组织供能不足以及神经细胞膜髓鞘磷脂合成受阻,导致慢性末梢神经炎和其他神经肌肉变性病变,即脚气病(beriberi)。严重者可发生水肿、心力衰竭。维生素B1缺乏时,乙酰辅酶A的生成减少,影响乙酰胆碱的合成。同时,由于维生素B1对胆碱酷酶的抑制减弱,乙酰胆截分解加强,影响神经传导。主要表现为消化液分泌减少,胃蠕动变慢,食欲缺维生素队是核醇与6,7二甲基异咯唉的缩合物。因其呈黄色针状结晶,又名核黄素(riboflavin)。-维生素队在酸性溶液中稳定,在碱性溶液中加热易破坏,但对紫外线敏感,易降解为无活性的产物。奶与奶制品、肝、蛋类和肉类等是维生素队的丰富来源。核黄素主要在小肠上段通过转运蛋白主动mononucleotide,吸收。吸收后的核黄素在小肠黏膜黄素激酶的催化下转变成黄素单核昔酸(flavin adenine dinucleotide, FMN),后者在焦磷酸化酶的催化下进一步生成黄素腺嗦呤二核昔酸(flavin维生素B2异咯嗦环上的第1和第10位氮原子与活泼的双键连接,此2个氮原子可反复接受或释放氢,因而具有可逆的氧化还原性(图20-5)。还原型核黄素及其衍生物呈黄色,于450nm处有吸收FMN及FAD是体内氧化还原酶(如脂酰CoA脱氢酶、唬珀酸脱氢酶、黄嗦呤氧化酶等)的辅基,凶图20-4焦磷酸硫胺素的结构剂,参与乙酰胆碱的代谢调控。 (三)缺乏症 中国成人男性膳食维生素B的平均需要量(EAR)为l.2mg/d,成人女性为l. Omg/d。维生素BI缺乏多见千以精米为主食的地区,任何年龄均可发病。膳食中维生素B1含量不足为常见原因,另外吸收障碍(如慢性消化紊乱、长期腹泻等)和需要量增加(如长期发热、感染、手术后、甲状腺功能亢进等)和酒精中毒也可导致维生素凡的缺乏。 乏,消化不良等症状。 二、维生素B2 (一)一般性质 FAD),FMN及FAD是维生素队的活性形式。 峰,利于此性质可做定量分析。(二)生物学功能\丫。 N10N!人丫。 邸肛 肛肛 R:核糖;P:磷酸基团 FMN(FAD)的结构与递氢作用 386第匹篇医学生化专题 主要起递氢体的作用。它们参与呼吸链、脂肪酸和氨基酸的氧化以及三狻酸循环。 FAD和FMN分别作为辅酶参与色氨酸转变为烟酸和维生素B6转变为磷酸咄哆醒的反应。FAD还可作为谷胱甘肤还原酶的辅酶,参与体内抗氧化防御系统,维待还原型谷胱甘肤的浓度;FAD与细胞色素P450结合,参与药物代谢。 (三)缺乏症 中国成人男性膳食维生素队的平均需要量(EAR)为1.4mg/d,成人女性为1.2mg/d。维生素B2缺乏的主要原因是膳食供应不足,如食物烹调不合理(淘米过度、蔬菜切碎后浸泡等)、食用脱水蔬菜或婴儿所食牛奶多次煮沸等均可导致维生素B2缺乏。 维生素队缺乏时,可引起口角炎、唇炎、阴襄炎、眼脸炎、畏光等症。用光照疗法治疗新生儿黄疽时,在破坏皮肤胆红素的同时,核黄素也可同时遭到破坏,引起新生儿维生素队缺乏症。 三、维生素PP (一)一般性质 维生索PP包括烟酸(nicotinic acid)和烟酰胺(nicotinamide),曾分别称尼克酸和尼克酰胺,两者均属氮杂环咄唗衍生物。烟酸为咄唗-3-狻酸,很容易转变为烟酰胺。烟酸为稳定的白色针状结晶,在酸、碱、光、氧或加热条件下不易被破坏,是维生素中最稳定的一种。 维生素PP广泛存在于自然界。食物中的维生素PP均以烟酰胺腺嗦呤二核昔酸(nicotinamide adenine dinucleotide, NAD十)或烟酰胺腺噤呤二核昔酸磷酸(nicotinamide adenine dinucleotide phosphate, NADP+)的形式存在(图20-6)。它们在小肠内被水解生成游离的维生素PP,并被吸收。运输到组织细胞后,再合成NAD十或NADP+。NAD+和NADP+是维生素PP在体内的活性形式。 HO OR烟酸NAD+:R=-H; NADp+:R=-H2P03 未被利用的烟酸可被甲基化,以N-甲基烟酰胺和2-P比哫酮的形式由尿中排出。体内色氨酸代谢也可生成维生素PP,但效率较低,60mg色氨酸仅能生成1mg烟酸,并且需要维生素Bl、B2和凡的参与。 (二)生物学功能 NA矿和NADP十在体内是多种不需氧脱氢酶的辅酶,分子中的烟酰胺部分具有可逆的加氢及脱氢的特性,常发挥递氢体的作用。如糖酵解和三狻酸循环中的一些脱氢酶是以NAD十为辅酶;磷酸戊糖途径中的G6PD以NADP十为辅酶,该途径生成的5-磷酸核糖,是体内核糖生成的主要来源。 (三)缺乏症 中国成入男性膳食维生素PP的平均需要量(EAR)为12mg/d的烟酸当量(niaci n equivalent, NE),成人女性为10mg NE/d。人类维生素PP缺乏症亦称为糙皮病(pellagra),主要表现有皮炎、腹泻及痴呆。皮炎常对称的出现于暴露部位;痴呆则是神经组织变性的结果。故维生素PP又称抗糙皮病维生素。 抗结核药物异烟阱的结构与维生素PP相似,两者有桔抗作用,长期服用异烟阱可能引起维生素PP缺乏。近年来,烟酸作为药物已用于临床治疗高胆固醇血症。烟酸能抑制脂肪动员,使肝中VLDL的合成下降,从而降低血浆胆固醇。但如果大量服用烟酸或烟酰胺(1~6g/d)会引发血管扩张、脸颊潮红、座疮及胃肠不适等毒性症状。长期日服用量超过500mg可引起肝损伤。 四、泛酸 (一)一般性质 泛酸(pantothen ic acid)又称遍多酸、维生素B5,由二甲基胫丁酸和B-丙氨酸组成,因广泛存在于动、植物组织中而得名。 泛酸在肠内被吸收后,经磷酸化并与半胱氨酸反应生成4-磷酸泛酰琉基乙胺,后者是辅酶A(coenzyme A, CoA)(图20-7)及酰基载体蛋白(acyl carrier protein, ACP)的组成部分。 琉基乙胺泛酸l®-o OH 辅酶A(CoA) (二)生物学功能 CoA和ACP是泛酸在体内的活性形式,CoA及ACP构成酰基转移酶的辅酶,广泛参与糖、脂质、蛋白质代谢及肝的生物转化作用。约有70多种酶,如脱狻酶等需CoA及ACP。 (三)缺乏症 中国居民膳食泛酸的适宜摄入星(AI)是5. Omg/d。泛酸缺乏症很少见。泛酸缺乏的早期易疲劳,引发胃肠功能障碍等疾病,如食欲缺乏、恶心、腹痛、溃疡、便秘等症状。严重时最显著特征是出现肢神经痛综合征,主要表现为脚趾麻木、步行时摇晃、周身酸痛等。若病情继续恶化,则会产生易怒、脾气暴躁、失眠等症状。 五、生物素 (一)一般性质 生物素(biotin)是含硫的嗟吩环与尿素缩合并带有戊酸侧链的化合物(图20-8),又称维生素H、维生素B1、辅酶R。生物素是天然的活性形式,在肝、肾、酵母、蛋类、花生、牛乳和鱼类等食品中含量较多,啤酒里含量较高,人肠道细菌也能合成。生物素为无色针状结晶体,耐酸而不耐碱,氧化剂及高温可使其失活。f(二)生物学功能HN/C\NH生物素是体内多种狻化酶的辅基,在狻化酶全酶合成酶(holocarboxI I ylase synthetase)的催化下与狻化酶蛋白中赖氨酸残基的e-氨基以酰胺键HC—CHI I共价结合,形成生物胞素(biocytin)残基,狻化酶则转变成有催化活性的H2C\/CH(CH2)4COOH@酶。生物素作为丙酮酸狻化酶、乙酰CoA狻化酶等的辅基,参与CO2固定s过程,为脂肪与碳水化合物代谢所必需。图20-8生物素的结构。 (三)缺乏症 六、维生素B6 (一)一般性质 甲基-3-胫基-5-甲基咄唗(图20-9),其活化形式是磷酸11比哆酸和磷酸咄哆胺,两者可相互转变。维生素凡的纯品为白色结晶,易溶于水及乙醇,微溶于有机溶剂,在酸性条件下稳定、在碱性条件下易被破坏。对光较敏感,不耐高温。 。现已鉴定,入基基外,还有其他重要的生理作用近年的研究证明,生物素除了作为狻化酶的辅达。生物信号转导和基因表胞素。生物素参与细2000多个基因编码产物的功能依赖生物因组中有复。DNA损伤的修、基因转录和影响细胞周期化,从而素还可使组蛋白生物素细菌也能素的来源极为广泛,人体肠道。生物量(Al)是40µg/d中国居民膳食生物素的适宜摄入。),生物素与其结合而不能被吸收(avidin新鲜鸡蛋清中有一种抗生物素蛋白。合成,很少出现缺乏症。长期使用抗生素可抑制肠道细菌生长,也可能造成生物去作用蛋清加热后这种蛋白因遭破坏而失。心、呕吐、食欲缺乏、皮炎及脱屑性红皮病素的缺乏,主要症状是疲乏、恶构是2-e),其基本结(pyridoxaminl)和咄哆胺、P比哆醒(pyrido(pyridoxine)凡包括咄哆醇维生素xa。°H3e*B6均是维生素全麦、坚果、豆类、蛋黄和酵母肝、鱼、肉类、。维生素B6广泛分布于动、植物食品中。P比哆醋和。维生素凡的磷酸酷在小肠碱性磷酸酶的作用下水解,以脱磷酸的形式吸收的丰富来源肌组织的形式存在千6以磷酸咄哆酘%的维生素B。体内约80磷酸咄哆酪是血液中的主要运输形式磷酸咄哆醒是体内百余种酶的辅酶,参与氨基酸脱氨基与转氨1.磷酸阰哆酵是多种酶的辅酶。在代谢中发挥着重要作用血红素的合成和糖原分解等基作用、鸟氨酸循环、,床上,故临丫-氨基丁酸的生成哆醒也是谷氨酸脱狻酶的辅酶,可增进大脑抑制性神经递质磷酸咄8氨基。磷酸咄哆醒还是血红素合成的关键酶6治疗小儿惊厥、妊娠呕吐和精神焦虑等常用维生素B--。血红素的生成参与ALA)合酶的辅酶,-酮戊酸(8-aminolevulinic'Y acid,是心血管疾病、血栓生成和高血压的危险(hyperhomocysteinemia)近年发现,高同型半胱氨酸血症。而维-CH3-FI七转甲基酶作用下生成甲硫氨酸外,还可分解生成半胱氨酸N5因子。同型半胱氨酸在。 磷酸咙哆醋磷酸咄哆胺 中,并与糖原磷酸化酶相结合。(二)生物学功能生素凡是催化同型半胱氨酸分解生成半胱氨酸过程中胱硫酪B合成酶的辅酶。已知2/3以上的高同型半胱氨酸血症与叶酸、维生素B12和维生素凡的缺乏有关。维生素B6对治疗上述疾病有一定的作用。 2.磷酸阰哆醒可终止类固醇激素作用的发挥磷酸咙哆醋可以将类固醇激素-受体复合物从DNA中移去,终止这些激素的作用。维生素凡缺乏时,可增加人体对雌激素、雄激素、皮质激素和维生素D作用的敏感性,与乳腺、前列腺和子宫激素相关肿瘤的发生发展有关。 (三)缺乏症与中毒 中国居民膳食维生素B6的平均需要量(EAR)是1.2mg/d。人类未发现维生素B6缺乏的典型病例。然而,维生素B6缺乏时血红素的合成受阻,可造成低血色素小细胞性贫血(又称维生素B6反应性贫血)和血清铁增高。维生素B6缺乏的病人还可出现脂溢性皮炎,以眼及鼻两侧较为明显,重者可扩展至面颊、耳后等部位。故维生素B6又称抗皮炎维生素。 此外,抗结核药异烟阱能与磷酸咄哆醒的睦基结合,磷酸咄哆睦失去辅酶作用,所以在服用异烟阱时,应补充维生素B6o维生素B6与其他水溶性维生素不同,过量服用维生素B6可引起中毒。日摄入量超过20mg可引起神经损伤,表现为周围感觉神经病。 七、叶酸 (—)一般性质 叶酸(folic acid)由蝶酸(pteroic acid)和谷氨酸结合而成,又称蝶酰谷氨酸,因绿叶中含矗十分丰富而得名(图20-10)。植物中的叶酸多含7个谷氨酸残基,谷氨酸之间以丫-肤键相连。仅牛奶和蛋黄中含蝶酰单谷氨酸。酵母、肝、水果和绿叶蔬菜是叶酸的丰富来源。肠菌也有合成叶酸的能力。 瓜矿 蝶酸谷氨酸 叶酸 圈20-10叶酸的结构 食物中的蝶酰谷氨酸多在小肠被水解,生成蝶酰单谷氨酸。后者易被小肠上段吸收,在小肠黏膜上皮细胞二氢叶酸还原酶的作用下,生成叶酸的活性型一5,6,7,8-四氢叶酸(tetrahydrofolic acid, FH4)。含单谷氨酸的N5-CH3-F凡是叶酸在血液循环中的主要形式。在体内各组织中,F凡主要以多谷氨酸形式存在。 (二)生物学功能F凡是体内一碳单位转移酶的辅酶,分子中N5、N”是一碳单位的结合位点。一碳单位在体内参与嗦呤、胸腺瞪唗核昔酸等多种物质的合成。抗癌药物甲氨蝶呤和氨蝶呤因其结构与叶酸相似,能抑制二氢叶酸还原酶的活性,使F凡合成减少进而抑制体内胸腺瞪唗核昔酸的合成,起到抗肿瘤的作用。 (三)缺乏症 中国居民膳食叶酸的平均需要凡(EAR)是320µg/d的膳食叶酸当量(dietary folate equivalent,DFE)。因食物中叶酸含扯丰富,肠道细菌也能合成,一般不发生缺乏症。叶酸缺乏时,DNA合成受到抑制,骨髓幼红细胞DNA合成减少,细胞分裂速度降低,细胞体积变大,造成巨幼细胞贫血(megaloblastic anemia)。叶酸缺乏还可引起高同型半胱氨酸血症,增加动脉粥样硬化、血栓生成和高血压的危险性。每日服用500µg叶酸有益于预防冠心病的发生。叶酸缺乏也可引起DNA低甲基化,增加一些癌症(如结肠、直肠癌)的危险性。富含叶酸的食物可降低这些癌症的风险。 此外,孕妇如果叶酸缺乏,可能造成胎儿脊柱裂和神经管缺陷,故孕妇及哺乳期妇女应适量补充叶酸,以降低发生新生儿疾病的风险。口服避孕药或抗惊厥药能于扰叶酸的吸收及代谢,如长期服用此类药物时应考虑补充叶酸。 八、维生素B12 (—)一般性质 维生素B12含有金属元素钻,又称钻胺素(cobalamin),是唯一含金属元素的维生素(图20-11)。维生素B12仅由微生物合成,酵母和动物肝含量丰富,不存在千植物中。维生素B12分子中的钻能与—CN、—OH、-C凡或5'-脱氧腺昔等基团连接,分别形成氮钻胺素、胫钻胺素、甲钻胺素和5'-脱氧腺昔钻胺素,后两者是维生素B12在体内的活性形式。 CH1 勹11 I '二r江 R=CN…..氛钻胺素 R=OH.…..泾钻胺素 ICONH2盓灯兑氧腺甲:胺素5脱氧腺昔钻胺素 食物中的维生素B12常与蛋白质结合而存在,在胃酸和胃蛋白酶的作用下,维生素B12得以游离并与来自唾液的亲钻蛋白(cobalophilin)结合。在十二指肠,亲钻蛋白-B12复合物经胰蛋白酶的水解作用游离出维生素B12。维生素Bl2需要与由胃黏膜细胞分泌的内因子(intrins ic factor, IF)紧密结合生成B12-IF复合物,才能被回肠吸收。IF是分子量为50kD的糖蛋白,只与活性形式的维生素B l2以1:1结合。当胰腺功能障碍时,因B12-IF不能分解而排出体外,从而导致维生素B l2缺乏症。在小肠黏膜上皮细胞内,B12-IF分解并游离出维生素B12。维生素B12再与转钻胺素Il(tra nscobalamin Il)蛋白结合存在于血液中。B12-转钻胺素Il复合物与细胞表面受体结合,进入细胞,在细胞内维生素B12转变成胫4(1,钻胺素、甲钻胺素或进入线粒体转变成5'-脱氧腺昔钻胺素。肝内还有一种转钻胺素I,可与维生素见结合而贮存千肝内。 (二)生物学功能 维生素见是N5-CH3-F凡转甲基酶(甲硫氨酸合成酶)的辅酶,催化同型半胱氨酸甲基化生成甲硫氨酸,后者在腺昔转移酶的作用下生成活性甲基供体——S-腺昔甲硫氨酸。维生素B12缺乏时,N5-CH3-FH4上的甲基不能转移出去,一是引起甲硫氨酸合成减少,二是影响四氢叶酸的再生。组织中游离的四氢叶酸含量减少,一碳单位的代谢受阻,造成核酸合成障碍。此外,S-腺昔甲硫氨酸作为甲基供体可参与胆碱和磷脂的生物合成。 5'-脱氧腺昔钻胺素是L-甲基丙二酰CoA变位酶的辅酶,催化唬珀酰CoA的生成。当维生素B12缺乏时,L-甲基丙二酰CoA大量堆积。因L-甲基丙二酰CoA的结构与脂肪酸合成的中间产物丙二酰CoA相似,从而影响脂肪酸的正常合成。 (三)缺乏症 中国居民膳食维生素B12的平均需要量(EAR)是2. Oµ,g/d。因维生素B12广泛存在于动物食品中,正常膳食者一般不会缺乏。但萎缩性胃炎、胃全切病人或内因子的先天性缺陷者,可因维生素B12的严重吸收障碍而出现缺乏症。 当维生素B12缺乏时,核酸合成障碍阻止细胞分裂而产生巨幼细胞贫血,即恶性贫血,故维生素B l2也称为抗恶性贫血维生素。同型半胱氨酸的堆积可造成高同型半胱氨酸血症,增加动脉硬化、血栓生成和高血压的危险性。维生素B12缺乏可导致神经疾患,其原因是由于脂肪酸的合成异常,导致髓鞘质变性退化,引发进行性脱髓鞘。所以维生素B12具有营养神经的作用。 九、维生素C (一)一般性质维生素C又称L-抗坏血酸(ascorbic acid),是L-已糖酸内酷,具有不饱和的一烯二醇结构。抗坏血酸分子中c2和C3胫基可以氧化脱氢生成脱氢抗坏血酸,后者又可接受氢再还原成抗坏血酸(图20入类和其他灵长类、豚鼠等动物体内不能合成维生素C,必须由食物供给。维生素C广泛存在于新鲜蔬菜和水果中。植物中的抗坏血酸氧化酶能将维生素C氧化灭活为二酮古洛糖酸,所以久存的水果和蔬菜中维生素C含量会大量减少。干种子中虽然不含维生素C,但其幼芽可以合成,所以豆芽等是维生素C的丰富来源。 维生素C主要通过主动转运由小肠上段吸收进入血液循环。还原型抗坏血酸是细胞内与血液中的主要存在形式。血液中脱氢抗坏血酸仅为抗坏血酸的1/15。(二)生物学功能1.参与体内多种轻化反应维生素C是维持体内含铜轻化酶和a-酮戊二酸-铁胫化酶活性必不可少的辅因子。在含酮轻化酶催化的反应中,C正被氧化生成Cu2•,后者在维生素C的专一作用下,再还原为cu·o(1)苯丙氨酸代谢过程中,对轻苯丙酮酸在对轻苯丙酮酸胫化酶催化下生成尿黑酸。维生素C仇9i}缺乏时,尿中可出现大量对-胫苯丙酮酸。多巴胺B-胫化酶催化多巴胺胫化生成去甲肾上腺素,参与肾上腺髓质和中枢神经系统中儿茶酚胺的合成。维生素C的缺乏可引起这些器官中儿茶酚胺的代谢异常。 (2)维生素C是胆汁酸合成的关键酶7a-轻化酶的辅酶,参与将40%的胆固醇正常转变成胆汁酸。此外,肾上腺皮质类固醇合成过程中的轻化作用也需要维生素C参与。 3.维生素C具有增强机体免疫力的作用维生素C促进体内抗菌活性、NK细胞活性、促进淋巴细胞增殖和趋化作用、提高吞噬细胞的吞噬能力、促进免疫球蛋白的合成,从而提高机体免疫力。临床上用于心血管疾病、感染性疾病等的支待性治疗。 (三)缺乏症 中国居民膳食维生素C的平均需要量(EAR)是85mg/d。因维生素C是胶原蛋白形成所必需的物质,有助于保持细胞间质物质的完整,当严重缺乏时可引起维生素C缺乏病(v itamin C deficiency),又称坏血病(SCUI>IY)。坏血病表现为毛细血管脆性增强易破裂、牙振腐烂、牙齿松动、骨折以及创伤不易愈合等。由千机体在正常状态下可储存—定量的维生素C,坏血病的症状常在维生素C缺乏3~4个月后才出现。 维生素C缺乏直接影响胆固醇转化,引起体内胆固醇增多,是动脉硬化的危险因素之一。此外,人体长期过量摄入维生素C可能增加尿中草酸盐的形成,增加尿路结石的危险。 小结 ...--------······一一·尸啊·一维生素是人体内不能合成或合成量甚少,必须由食物供给的一类小分子有机化合物。维生素在调节人体物质代谢、促进生长发育和维持生理功能等方面发挥重要作用,是人体的重要营养素之一。人体对维生素的日需要量极少,但如果长期缺乏,可致维生素缺乏症;而摄入过多,可引发维生素中毒。按溶解特性可将维生素分为脂溶性维生素和水溶性维生素两大类,前者包括维生素A、维生素D、维生素E和维生素K,后者包括B族维生素(维生素Bl、维生素B2、维生素PP、维生素B6、维生素B12、生物素、泛酸和叶酸)和维生素C。 维生素A的活性形式为视黄醇、视黄酪和视黄酸,其作用包括:心构成视紫红质,参与视觉传导;@调控基因表达和细胞生长与分化;@抗氧化作用;@抗癌作用。维生素A缺乏可致“夜盲症”或者“眼干燥症”,长期过量摄入可中毒。维生素D的活性形式是1,25-(OH)2-D3,具有调节钙、磷代谢和细胞分化的作用。维生素D缺乏可导致儿童侚倭病,成人软骨病和骨质疏松症。维生素E的活性形式为a-生育酚,其作用包括抗氧化、调节基因表达以及促进血红素合成。维生素K有促疑血作用,并参与骨代谢,缺乏时易出血。 B族维生素通常以酶辅因子形式参与和调节物质代谢。维生素B l(硫胺素)的活性形式为焦磷酸硫胺素(TPP),是脱狻酶和转酮醇酶的辅酶。维生素Bl缺乏可引起脚气病。维生素B2(核黄素)的活性形式是FMN及FAD,两者是体内氧化还原酶的辅基,作为递氢体参与糖、氨基酸和脂肪酸等的氧化过程。维生素队缺乏可引起口角炎等症状。维生素PP(烟酸、烟酰胺)的活性形式为NAD十和NADP十,两者是不需氧脱氢酶的辅酶,起传递氢的作用。维生素PP缺乏可引起瘢皮病。泛酸(遍多酸)的活性形式是辅酶A(CoA)及酰基载体蛋白(ACP),是多种酰基转移酶的辅酶。生物素(维生素B7)是天然的活性形式,作为狻化酶的辅基,参与CO2固定过程。维生素B6(抗皮炎维生素)的活性形式为磷酸咄哆酪和磷酸咄哆胺,是氨基转移酶和氨基酸脱狻酶的辅酶,也是ALA合酶的辅酶,参与血红素的生成。维生素B6缺乏可造成低血色素小细胞性贫血以及皮炎,而摄入过量可致中毒。叶酸(蝶酰谷氨酸)的活性形式是FH4,FH4作为一碳单位转移酶的辅酶,是携带和传递一碳单位的载体。维生素B12(钻胺素)是唯一含全属元素的维生素,其活性形式是甲钻胺素和5'-脱氧腺符钻胺素,是N5-CH3-F凡转甲基酶的辅酶,参与甲硫氨酸循环。叶酸或者维生素B12缺乏可造成巨幼细胞贫血以及高同型半胱氨酸血症。维生素C(L-抗坏血酸)是天然的生物活性形式。维生素C参与苯丙氨酸与胆汁酸代谢、胶原合成过程中的多种径化反应;维生素C可作为抗氧化剂,也可增强机体免疫力。维生素C缺乏可致坏血病。 思考题 l简述脂溶性维生素与水溶性维生素的主要区别。2.简述脂溶性维生素的来源、体内活性形式、生化作用及其缺乏症。 (朱月春) 第二十一章钙、磷及微量元素 无机元素对维持人体正常生理功能必不可少,按人体每日需要量的多寡可分为微量元素(trace element, microelement)和常量元素(macroelement)。微量元素在人体中存在量低千人体体重的0.01%、每日需要量在100mg以下。微量元素绝大多数为金属元素,主要包括铁、碟、铜、锌、猛、硒、氛炸且钻、铅、令儿锡、课、硅等。微量元素在体内一般结合成化合物或络合物,广泛分布于各组织中,含量较恒定。微量元素通过参与构成酶活性中心或辅酶、激素和维生素等在体内发挥十分重要的生理功能。 常量元素是指人体含量大于体重的万分之一、且每日需要量在100mg以上的化学元素,主要有钠、钾、氯冉序磷、镁等。本章主要介绍钙、磷代谢,钠、钾、氯的代谢和生理功能等将在病理生理学中详尽介绍。钙、磷主要以无机盐形式存在体内,主要以胫基磷灰石的形式存在千骨骼和牙齿中,骨是人体内的钙、磷储库和代谢的主要场所。钙与磷除了作为骨的主要组成外,还具有许多重要的生理功能。长期缺乏无机元素均可导致相应的缺乏症。 第一节钙、磷代谢 钙(calcium)是人体内含量最多的无机元素之一,仅次千碳、氢、氧和氮。新生儿体内钙总量约为29~30g,随着生长发育体内钙不断积累,成年女性体内钙的含量约为25mol(1000g),成年男性约为3mol(1200g)。磷(phosphorus)在人体内的含量次于碳、氢、氧、氮和钙,约占人体重的1%,成人体内含600-900g的磷。包一、钙、磷在体内分布及其功能(—)钙既是骨的主要成分又具有重要的调节作用人体内99%的钙以轻基磷灰石[hydroxyapatite, Ca10(P04)6(OH)2]的形式存在,少量为无定形钙[Ca2(P04)2],是轻基磷灰石的前体。轻基磷灰石是钙构成骨和牙的主要成分,起着支持和保护作用。 成人血浆(或血清)中的钙含量为2.25-2.75mmo)/L(90-llO mg/L),不到人体钙总量的0.1%,约一半是游离Ca2+;另一半为结合钙。结合钙绝大部分与血浆蛋白质结合,小部分与拧檬酸、重碳酸盐等结合;与血清蛋白质结合的钙主要与清蛋白结合,少量与球蛋白结合。游离钙与蛋白质结合钙在血浆中呈动态平衡状态。血浆pH可影响它的平衡,当血浆偏酸时,蛋白质结合钙解离,血浆游离钙增多;当pH升高时,蛋白质结合钙增多,而游离钙减少。平均每增减l个pH单位,每100ml血浆游离钙浓度相应改变0.42mmol(l.68mg)。血钙的正常水平对千维持骨骼内骨盐的含量、血液凝固过程、调节多种酶的活性、维持细胞膜的完整性和通透性和神经肌肉的兴奋性等方面具有重要的作用。 分布千体液和其他组织中的钙不足总钙量的1%。细胞外液游离钙的浓度为1.12-1.23mmo)/L;细胞内钙浓度极低,且90%以上储存千内质网和线粒体内,胞质钙浓度仅为0.01-0. l mo)/L。胞质钙在启动骨骼肌和心肌细胞的收缩、作为第二信使在信号转导中发挥许多重要的生理作用(见第十七章)。(二)磷是体内许多重要生物分子的组成成分正常成人的磷主要分布千骨(约占85.7%),其次为各组织细胞(约14%),仅少量(约0.03%)分第二十一童钙、磷及微匿元素布于体液。骨磷总量为600-900g,是钙含量的一半。成人血浆中无机磷的含量为1.1-1.3mmol/L(35-40mg/L)。 磷除了构成骨盐成分、参与成骨作用外,还是核酸、核昔酸、磷脂、辅酶等重要生物分子的组成成分,发挥各自重要的生理功能。许多生化反应和代谢调节过程需要磷酸根的参与,ATP和磷酸肌酸等高能磷酸化合物作为能量的载体,在生命活动中起着十分重要的作用。无机磷酸盐还是机体中重要的缓冲体系成分。 正常入血液中钙和磷的浓度相当恒定,每100ml血液中钙与磷含量之积为一常数,即[Ca]x[P]=35-40。因此,血钙降低时,血磷会略有增加。 二、钙、磷的吸收与排泄受多种因素影响 牛奶、豆类和叶类蔬菜是人体内钙的主要来源。十二指肠和空肠上段是钙吸收的主要部位。钙盐在酸性溶液中易溶解,凡使消化道内pH下降和增加钙肠道溶解度的物质均有利于钙的吸收。如乳糖可增加钙的吸收,其原因是乳糖可与钙鳌合形成低分子可溶性钙络合物及其乳糖可被肠道细菌分解发酵产酸。活性维生素D[l,25-(0H)2-D1]能促进钙和磷的吸收。凡能在肠道内与钙形成不溶性复合物的物质均干扰钙的吸收,如碱性磷酸盐、草酸盐和植酸盐可与钙形成不溶解的钙盐,不利千钙的吸收。钙的吸收随年龄的增长而下降。负荷运动等增加了机体对钙的需要,从而间接促进肠道吸收钙。 正常成人肾小球每日滤过约9g游离钙,肾小管对钙的重吸收量与血钙浓度相关。血钙浓度降低可增加肾小管对钙的重吸收率,而血钙高时吸收率下降。肾对钙的重吸收受甲状旁腺激素的严格调控。 成人每日进食l.0~1.5g磷,食物中的有机磷酸酷和磷脂在消化液中磷酸酶的作用下,水解生成无机磷酸盐并在小肠上段被吸收。钙、镁、铁可与磷酸根生成不溶性化合物而影响其吸收。肾小管对血磷的重吸收也取决于血磷水平,血磷浓度降低可增高磷的重吸收率。血钙增加可降低磷的重吸收。pH降低可增加磷的重吸收。甲状旁腺激素抑制血磷的重吸收,增加磷的排泄。 三、骨是人体内的钙、磷储库和代谢的主要场所 由于体内大部位钙和磷存在于骨中,所以骨内钙、磷的代谢成为体内钙、磷代谢的主要组成。血钙与骨钙的相互转化对维持血钙浓度的相对稳定具有重要意义。 骨的组成中水占10%;有机物质占20%,主要的有机基质是I型胶原;无机盐占70%,主要是胫基磷灰石。骨形成的初期,成骨细胞分泌胶原,胶原聚合成胶原纤维,并进而形成骨的有机基质。钙盐沉积于其表面,逐渐形成胫基磷灰石骨盐结晶。少量无定形骨盐与经基磷灰石结合疏松,可与细胞外液进行钙交换,与体液钙形成动态平衡。碱性磷酸酶可以分解磷酸酣和焦磷酸盐,使局部无机磷酸盐浓度升高,有利于骨化作用。因此,血液碱性磷酸酶活性增高可作为骨化作用或成骨细胞活动的指标。 人体内钙、磷代谢与动态平衡见图21-1。 四、钙、磷代谢主要受三种激素的调节 调节钙和钙代谢的主要激素有活性维生素D、甲状旁腺激素和降钙素。主要调节的靶器官有小(一)活性维生素D促进小肠钙的吸收和骨盐沉积1,25-(OH)了队对钙、磷代谢作用的主要靶摇官是小肠和骨。1,25-(OH)了队与小肠黏膜细胞特异的细胞内受体结合后,进入细胞核,刺激钙结合蛋白的生成。后者作为载体蛋白促进小肠对钙的吸收。同时磷的吸收也随之增加。`生理剂量的1,25-(OH)了队可促进骨盐沉积,同时还可剌激成骨细\,心份}食物:钙15mg/(kg. d)磷20mg/(kg. d)jL小肠吸收:钙6mg/(kg•d)肾小管重吸收:磷16mg/(kg·d)磷87mg/{kg·d)消化液分泌:钙3mg/(kg·d)磷3mg/(kg. d)胞分泌胶原,促进骨基质的成熟,有利于成骨。 (二)甲状旁腺激素具有升高血钙和降低血磷的作用甲状旁腺激素(para th yro id hormon e,PTH)是甲状旁腺分泌的由84个氨基酸残基组成的蛋白质,其主要作用靶器官是骨和肾。PTH刺激破骨细胞的活化,促进骨盐溶解,使血钙增高与血磷下降。PTH促进肾小管对钙的重吸收,抑制对磷的重吸收。同时PTH还可刺激肾合成1,25-(OH)2-D3,从而间接地促进小肠对钙、磷的吸收。PTH的总体作用是使血钙升高。(三)降钙素是唯一降低血钙浓度的激素降钙素(calci tonin,CT)是甲状腺C细胞合成的由32个氨基酸残基组成的多肤,其作用靶器官为骨和肾。CT通过抑制破骨细胞的活性、激活成骨细胞,促进骨盐沉积,从而降低血钙与血磷含量。CT还抑制肾小管对钙、磷的重吸收。CT的总体作用是降低血钙与血磷。 血钙与血磷在1,25-(0H)2-D3、PTH和CT的协同作用下维持其正常的动态平衡,总结于表21-1。 •P'l'H:甲状旁腺激素(parathyroid hormone);·•CT:降钙素(calcitonin)五、钙、磷代谢紊乱可引起多种疾病维生素D缺乏可引起钙吸收障碍,导致儿童侚倭病和成入骨软化症。骨基质丧失和进行性骨骼脱盐可导致中、老年人骨质疏松症(osteoporosis)。甲状旁腺功能亢进与维生素D中毒可引起高血钙症(hypercalcemia汃尿路结石等。甲状旁腺功能减退症可引起低钙血症(hypocalcemia)。 高磷血症常见千慢性肾病病入,与冠状动脉、心瓣膜钙化等严重心血管并发症密切相关;是引起继发性甲状旁腺功能亢进、维生素D代谢障碍、肾性骨病等的重要因素。维生素D缺乏也可减少肠乃,腔磷酸盐的吸收,是引起低磷血症的原因之一。 第二十一章钙、磷及微量元素397 第二节微量元素 微蜇元素绝大多数为金属元素。在体内一般结合成化合物或络合物,广泛分布千各组织中,含量较恒定。微量元素主要来自食物,动物性食物含量较高,种类也较植物性食物多。 微量元素通过形成结合蛋白、酶、激素和维生素等在体内发挥多种多样作用。其主要生理作用为心参与构成酶活性中心或辅酶:人体内一半以上酶的活性部位含有微量元素。有些酶需要微量元素才能发挥最大活性,有些金属离子构成酶的辅基,如细胞色素氧化酶中有Fe2+,谷胱甘肤过氧化物酶(GSH-Px)含硒。@参与体内物质运输:如血红蛋白含Fe2+参与02的送输,碳酸酐酶含锌参与CO2的送输。@参与激素和维生素的形成:如碳是甲状腺素合成的必需成分,钻是维生素B12的组成成铁(iron)是人体含量、需要量最多的微量元素,约占体重的0.0057%,总量为4~5g。成年男性平均含铁量为50mg/kg体重,女性为30mg/kg体重。成年男性和绝经后妇女每日约需铁10mg,生育期妇女每日约需15mg,儿童在生长发育期、妇女在妊娠哺乳期对铁的需要量增加。肉类、乳制品、豆类等食物含有丰富的铁。尽(一)运铁蛋白和铁蛋白分别是铁的运输和储存形式75%的铁存在于铁卧啾化合物中,25%存在于非铁叶啾含铁化合物中,主要有含铁的黄素蛋白、铁硫蛋白、铁蛋白和运铁蛋白等。 铁的吸收部位主要在十二指肠及空肠上段。络合物中的铁的吸收大于无机铁。无机铁仅以Fe2+形式被吸收,Fe“难以吸收。食物中的铁可分为血红素铁和非血红素铁,主要是Fe3+,需经胃酸的作用使其游离并还原成Fe”后被吸收。凡能将Fe”还原为Fe2+的物质如维生素C、谷胱甘肤、半胱氨酸等以及能与铁离子络合的物质如氨基酸、拧檬酸、苹果酸等均有利千铁的吸收,是临床补铁药研制和应用的原理。 吸收的铁(Fe2+)在小肠黏膜细胞中被氧化为Fe3+,进入血液与运铁蛋白(transfenin)结合而运输,运铁蛋白是运输铁的主要形式。当细胞内铁浓度较高时诱导细胞生成脱铁蛋白(apoferritin),并与其结合成铁蛋白(ferri tin)而储存。铁也与血黄素结合成含铁血黄素。铁蛋白和含铁血黄素是铁的储存形式,主要储存于肝、脾、骨髓、小肠黏膜等器官。铁蛋白由24个亚基组成,可结合多达450个Fe3+o80%的功能铁存在于红细胞中。衰老的红细胞被网状内皮细胞吞噬后,血红蛋白降解过程中产生的铁约有85%以转铁蛋白或铁蛋白的形式重新被释放进入机体重新利用。 小肠黏膜上皮细胞的生命周期为2~6天,储存于细胞内的铁蛋白铁随着细胞的脱落而排泄于肠腔。这几乎是体内铁的唯一排泄途径。妇女由千月经失血可排出铁,尿、汗、消化液、胆汁中均不含铁。 铁吸收的效率是有限的,大量铁被运输至骨髓参与血红蛋白的合成。衰老的红细胞释放的铁被重新利用等过程是铁在体内代谢的主要过程(图21-2)。 (二)体内铁主要存在于铁叶瞅化合物和其他含铁化合物中体内的铁可分为储存铁和功能铁。储存铁为铁蛋白和含铁血黄素。而功能铁参与组成多种具有生物学活性的蛋白质。铁是血红蛋白、肌红蛋白、细胞色素系统、铁硫蛋白、过氧化物酶及过氧化氢酶等的重要组成部分,在气体运输、生物氧化和酶促反应中均发挥重要作用。体内铁约75%存在千铁卧琳化合物中,25%存在于其他含铁化合物(如含铁的黄素蛋白、铁硫蛋白、运铁蛋白等)中。 (三)铁的缺乏与中毒均可引起严重的疾病 铁缺乏是一种常见的营养缺乏病,特别是在婴幼儿、孕妇和哺乳期妇女中更易发生。当急性大量1飞0肌红蛋白、(::了含铁蛋白卜乏立(丿5;:/<~(1000mg)出血、慢性小量出血(如消化道溃疡、妇女月经失调出血等)以及儿童生长期和妇女妊娠、哺乳期等情况下,铁得不到额外的补充,机体对铁的需求与供给失衡,导致体内贮存铁耗尽均会引起体内缺铁。由于铁的缺乏,血红蛋白合成受阻,导致小细胞低血色素性贫血(small cell low hemoglobin anemia),即缺铁性贫血(iron deficiency anemia)的发生。贫血的严重程度取决于血红蛋白(hemoglobin)减少的程度。缺铁性贫血能引起患儿的心理活动和智力发育的损害及其行为的改变等,严重时可增加婴幼儿的死亡率。成人因缺铁导致的缺铁性贫血也可出现诸如乏力、易倦、头晕、心脖、气短、心率增快等一系列症状。 持续摄入铁过多或误服大量铁剂,可发生铁中毒(iron poisoning)。体内铁沉积过多可引起肺、肝、肾、心、胰等处的含铁血黄素沉着而出现血色素沉积症(hemochromatosis),并可导致栓塞性病变和纤维变性,出现肝硬化、肝癌、糖尿病、心肌病、皮肤色素沉着、内分泌紊乱、关节炎等。 二、锌 锌(zinc)在人体内的含量仅次于铁,约占体重的0.0033%,为1.5~2.5g。成人每日需锌15~20mg。肉类、豆类、坚果、麦胚等含锌丰富。 (一)清蛋白和金属硫蛋白分别参与锌的运输和储存许多组织含有较多锌,60%在肌肉、22%~30%在骨髓,8%在皮肤和毛发等。因此可以通过检测毛发中的锌含量分析人体是否缺锌。每日需锌10~20mg,不同年龄人群锌的需要量不同,1~9岁需lOmg,10岁以上为15mg,孕妇和哺乳期女性为20mg。锌主要在小肠中吸收,但不完全。某些地区的谷物中含有较多的能与锌形成不溶性复合物的6-磷酸肌醇,从而影响锌的吸收。肠腔内有与锌特异结合的因子,能促进锌的吸收。肠黏膜细胞中的锌结合蛋白能与锌结合并将其转动到基底膜一侧,锌在血中与清蛋白结合而运输。血锌浓度为0.1~0.15mmol/L。锌与金属硫蛋白(metallothionein)结合是锌在体内储存的主要形式。锌主要随胰液、胆汁排泄入肠腔。由粪便排出,部分锌可从尿及汗排出。 (二)锌是含锌金属酶和锌指蛋白的组成成分 锌是80多种含锌酶的组成成分或激动剂。如DNA聚合酶(DNA polymerase)、RNA聚合酶(RNA polymerase)、金属酶(metalloenzyme)、碱性磷酸酶(alkaline phosphatase)、碳酸酐酶(cru·bonic anhydrase)、乳酸脱氢酶(lactate dehydrogenase)、谷氨酸脱氢酶(glutamate dehydrogenase)、超氧化物歧化酶(superoxide dismutase)等,参与体内多种物质的代谢,在促进生长发育和组织再生、免疫调节、抗氧化、抗细胞凋亡和抗炎中起着十分重要的作用。锌也是合成胰岛素所必需的元素。催化视网膜和肝细胞中维生素A还原的醇脱氢酶含锌。当缺锌时此酶活性降低,肝中的维生素A动员下降,导致维生素A的利用障碍。 人类基因组可编码300余种锌指蛋白。许多蛋白质,如反式作用因子、类固醇激素和甲状腺素受体的DNA结合区,都有锌参与形成的锌指结构。锌指结构在转录调控中起重要作用。已知锌是重要的免疫调节剂、生长辅因子,在抗氧化、抗细胞凋亡和抗炎症中均起重要作用。 (三)缺锌可导致多种代谢障碍 锌的补充依赖体外摄入,如果各种原因引起锌的摄入不足或吸收困难,均可引起锌的缺乏。锌缺乏可引起消化功能紊乱、生长发育滞后、智力发育不良,皮肤炎、伤口愈合缓慢、脱发、神经精神障碍等;儿童可出现发育不良和睾丸萎缩。 三、铜 成人体内铜(copper)的含量约占体重的1.4x10-4%,为80~ll0mg,骨骼肌中约占50%,10%存在于肝。成人每日需铜l~3mg,孕妇和成长期的青少年可略有增加。动植物食物均含不同量的铜。贝壳类、甲壳类动物含铜量较高,动物内脏含铜较多,其次为坚果、干豆、葡萄干等。 (一)铜参与铜蓝蛋白的组成铜主要在十二指肠吸收。血液中约60%的铜与铜蓝蛋白(ceruloplasmin)紧密结合,其余的与清蛋白疏松结合或与组氨酸形成复合物。肝脏是涸节体内铜代谢的主要器官。铜主要随胆汁排泄,极少部分由尿排出。(二)铜是体内多种含铜酶的辅基铜是体内多种酶的辅基,含铜的酶多以氧分子或氧的衍生物为底物。如细胞色素氧化酶、多巴胺归经化酶、单胺氧化酶、酪氨酸酶、胞质超氧化物歧化酶等。铜蓝蛋白可催化Fe2+氧化成Fe“,后者转入运铁蛋白,有利于铁的运输。已知铜通过增强血管生成素对内皮细胞的亲和力,增加血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor, VEGF)和相关细胞因子的表达与分泌,促进血管生成。铜的络合剂有助于癌症的治疗。(三)铜缺乏可导致小细胞低色素性贫血等疾病铜缺乏的特征性表现为小细胞低色素性贫血、白细胞减少、出血性血管改变、骨脱盐、高胆固醇血症和神经疾患等。铜摄入过多也会引起中毒现象,如蓝绿粪便、唾液以及行动障碍等。体内铜代谢异常的遗传病目前除肝豆状核变性(hepatolenticu如degeneration, Wilson di sease)外,还发现有门克斯病(Me nkes disease)表现为铜的吸收障碍导致肝、脑中铜含量降低,组织中含铜酶活力下降,机体代谢紊乱。 四、令孟 正常入体内含猛(manganese)约占体重的30xlO-5%,为12-20mg。成人每日需2~5mg。猛存在于多种食物中,以荼叶中含量最丰富。(—)大部分猛与血浆中丫球蛋白和清蛋白结合而运输猛在体内主要储存千骨、肝、胰和肾。在细胞内则主要集中千线粒体中。猛主要从小肠吸收,猛在肠道中吸收与铁吸收机制类似,吸收率较低。入血后大部分与血浆中丫球蛋白和清蛋白结合而运输。少量与运铁蛋白结合。猛主要从胆汁排泄,少量随胰液排出,尿中排泄很少。(二)猛是多种酶的组成部分和激活剂体内猛主要是多种酶的组成成分和激活剂。猛金属酶有精氨酸酶、谷氨酰胺合成酶、磷酸烯醇式丙酮酸脱狻酶、Mn-超氧化物歧化酶、RNA聚合酶等。体内猛对多种酶的激活作用可被镁所代替。体内正常免疫功能、血糖与细胞能量调节、生殖、消化、骨骼生长、抗自由基等均需要猛。缺猛时生长发育会受到影响。 吓岔 400第四篇医学生化专题 (三)过量摄入韦孟可引起中毒 猛的缺乏较少发生。过量摄入猛可引起中毒,主要原因是生产及生活中防护不善,以粉尘形式进入人体所致。猛是一种原浆毒,可引起慢性神经系统中毒,表现为锥体外系的功能障碍,并可引起眼球集合能力减弱,眼球震颤、脸裂扩大等。猛可抑制呼吸链中复合物1和ATP酶的活性,造成氧自由基的过量产生。猛干扰多巴胺的代谢,导致精神病和帕金森神经功能障碍(猛疯狂)。 五、硒 人体含硒(selenium)所占体重小于2x l0-7%,为14-21mg。成人日需要量在30-50µg。肉类、奶制品和蔬菜中均含硒。但食物中硒的含量随地域不同而异,而植物中硒含量受种植的土壤含硒量的影响。 (一)大部分硒与0:和p球蛋白结合而运输硒在十二指肠吸收入血后与a和6球蛋白结合,小部分与VLDL结合而运输。硒广泛分布于除脂肪组织以外的所有组织中。主要以含硒蛋白质形式存在。主要随尿及汗液排泄。(二)硒以硒代半胱氨酸形式参与多种重要硒蛋白的组成硒在体内以硒代半胱氨酸(selenocysteine)的形式存在于近30种蛋白质中。这些含硒半胱氨酸的蛋白质称为含硒蛋白质(selenoprotein)。谷胱甘肤过氧化物酶(glutathione peroxidase, GPx汃硒蛋白P(se lenoprotein P, Se-P)、硫氧还蛋白还原酶(thioredoxin reductase, Trx)、碟甲腺原氨酸脱碟酶(iodothy ronine deiodinase)均属此类。 硒蛋白P是血浆中的主要硒蛋白,可表达千各种组织,如动脉内皮细胞和肝血窦内皮细胞。硒蛋白P是硒的转运蛋白,也是内皮系统的抗氧化剂。硫氧还蛋白还原酶参与调节细胞内氧化还原过程,刺激正常和肿瘤细胞的增殖,并参与DNA合成的修复机制。磺甲腺原氨酸脱碳酶是一种含硒酶,可激活或去激活甲状腺激素。这是硒通过调节甲状腺激素水平来维持机体生长、发育与代谢的重要途径。此外,硒还参与辅酶Q和辅酶A的合成。 (三)硒缺乏可引发多种疾病 缺硒可引发很多疾病,如糖尿病、心血管疾病、神经变性疾病、某些癌症等。世界上不同地区的土壤中含硒量不同,影响食用植物中硒的含量,从而影响人类硒的摄取量。克山病[也称地方性心肌病(e ndemic cardiomyopathy, ECD)]和大骨节病都被认为是由千地域性生长的农作物中含硒量低引起的地方病。 由千硒的抗氧化作用,服用硒(如200µg/d)或含硒制剂可以明显降低某些癌症(如前列腺癌、肺癌、大肠癌)的危险性。硒过多也会引起脱发、指甲脱落、周围性神经炎、生长迟缓及生育力降低等中毒症状。 六、磺 正常成人体内碟(iodi ne)约占体重的4.3xl0-5%,为25-50mg,成入每日需殡100-300µg。大多数食物含碟量较低,而海产品含碟量较高,其原因是海产动植物可富集海水中的碳。(一)磺在甲状腺中富集人体内的姨约30%集中在甲状腺内,用于合成甲状腺激素。60%-80%以非激素的形式分散于甲状腺外。殡主要由食物中摄取,吸收部位主要在小肠吸收率可高达100%。碟主要随尿排出,尿碟约占总排泄量的85%,其他由粪便、汗腺和毛发排出。(二)磺是甲状腺激素的组成成分碳在人体内的一个主要作用是参与甲状腺激素的合成。碟的另一重要功能是抗氧化作用。在含殡细胞中有H202和脂质过氧化物存在时,碳可作为电子供体发挥作用。殡可与活性氧竞争细胞成分吓I.,和中和经自由基,防止细胞遭受破坏。 (三)磺缺乏可引起地方性甲状腺肿成人缺碳可引起甲状腺肿大,称甲状腺肿。严重可致发育停滞、痴呆,如胎儿期缺碟可致呆小病、智力迟钝、体力不佳等严重发育不良。常用的预防方法是食用含姨盐或殡化食油等。若摄入碟过多可导致高碟性甲状腺肿,表现为甲状腺功能亢进及一些中毒症状。 七、钻 正常人体钻(cobalt)的含量所占体重小于2. Oxl0-8%,为1.1mg。人体对钻的需要量小于1哆g/d。 绿叶蔬菜含钻量较高,而奶和奶制品含钻量较低。小麦精加工钻的损伤较大。(—)钻在小肠的吸收形式是维生素B12来自食物中的钻必需在肠内经细菌合成维生素B12后才能被吸收利用,主要以维生素B12和维生素B12辅酶形式储存于肝。钻主要从尿中排泄,且排泄能力强,很少出现钻蓄积过多的现象。(二)钻是维生素B12的组成成分钻的作用主要以维生素见和维生素B12辅酶形式发挥其生物学作用。钻可激活很多酶,如能增加人体唾液中淀粉酶的活性,能增加胰淀粉酶和脂肪酶的活性等。(三)钻缺乏常表现为维生素B12缺乏的一系列症状钻参与造血,在胚胎时期就参与造血过程,钻的缺乏可使维生素B12缺乏,而维生素B12缺乏可引起巨幼细胞贫血。钻可以治疗巨幼红细胞贫血,当通过补钻不能得到纠正时,需增加肠道对维生素见的吸收才能有效。 八、氮 成入体内含氛(fluorine)约占体重的3. Oxl0-8%,为2~6g,其中90%分布于骨、牙中,少量存在千指甲、毛发、神经、骨骼肌中。策的生理需要量每日为0.5-1.0mg。颌的主要来源是饮用水。(—)氮主要与球蛋白结合而运输氮主要经胃肠道吸收,氛易吸收且迅速。吸收后与球蛋白结合而运输,少量以氪化物形式运输。 体内氛约80%从尿排出。(二)氮与骨、牙的形成及钙、磷代谢密切相关氮能与轻磷灰石吸附,取代其轻基形成氮磷灰石,从而加强对龋齿的抵抗作用。此外,熊还可直接刺激细胞膜中G蛋白,激活腺昔酸环化酶或磷脂酶C,启动细胞内cAMP或磷脂酰肌醇信号系统,引起广泛生物效应。(三)体内氮缺乏或过多均可引起疾病缺氮时,由于牙釉质中不能形成氛磷灰石,牙釉质易被微生物、有机酸和酶侵袭而发生龋齿。氛对铁的吸收、利用有促进作用。缺佩可致骨质疏松,易发生骨折;牙釉质受损易碎。颌过多可引起骨脱钙和白内障,并可影响肾上腺、生殖腺等多种器官的功能。一些地方因环境、土壤、水源等原因导致长期摄入过量须而引起被称地方性瓶中毒的一种慢性全身性疾病,主要表现为氛斑牙和氯骨症。 九、络 铭(chromium)在成人中总蓝所占体重小于1. l X10-6%,为6mg左右,每日需要量为30~40µg。 谷类、豆类、海藻类、啤酒酵母、乳制品和肉类是铭的最好来源,尤以肝含量丰富。(一)细胞内铭主要存在于细胞核中人体对无机辂的吸收很差,约为0.5%-1%,并取决于铭的摄入量和机体的状态。六价铭比三价恪吸收好。95%以上摄入的铭从尿中排出。细胞内的铭50%存在于细胞核内,23%存在于胞质,其余部分均分布在线粒体和微粒体中。头发中的恪能提示个体铭的营养状况。 402第四篇医学生化专题 (二)络与胰岛素的作用密切相关 铭是铭调素(chromodulin)的组成成分。恪调素是一种低分子量的寡肤,由甘氨酸、半胱氨酸、谷氨酸和天冬氨酸等4种氨基酸残基组成,每分子可紧密结合4个铭离子(C产)。辂调素通过促进胰岛素与细胞受体的结合,增强胰岛素的生物学效应。辂是葡萄糖耐量因子(glucose tolerance factor, GTF)的重要组成成分,GTF是由三价辂、烟酸、谷氨酸、甘氨酸和含硫氨基酸组成的活性化合物,它能增强胰岛素的生物学作用,可通过活化葡糖磷酸变位酶而加快体内葡萄糖的利用,并促使葡萄糖转化为脂肪。动物实验证明,铭还具有预防动脉硬化和冠心病的作用,并为生长发育所需要。 (三)络过量对人体具有危害 因膳食因素所致辂摄取不足而引起的缺乏症未见报道。若铭缺乏,主要表现为胰岛素的有效性降低,造成葡萄糖耐量受损,血清胆固醇和血糖上升。但过量可出现辂中毒。六价铭的毒性比三价辂高约100倍,但不同化合物毒性不同。临床上铭及其化合物主要侵害皮肤和呼吸道,出现皮肤黏膜的刺激和腐蚀作用,如皮炎、溃疡、咽炎、胃痛、胃肠道溃疡,伴有周身酸痛、乏力等,严重者发生急性肾衰竭。 十、钢 钮(vanadium)约占体重的1.4xl0-6%,总量为25mg左右,每日需要量为60µg。日常食用的蔬菜韭菜、西红柿、茄子等含比较丰富的钮,坚果和海产品等钮含量次之,而肉类和水果中的饥含量则比较少。 (一)钢以离子状态与转铁蛋白结合而运输 环境中的帆可经皮肤和肺吸收入体中。血液中约95%的钮以离子状态(vo2+)与转铁蛋白结合而运输,因此钮与铁在体内可相互影响。吸烟会降低钥的吸收。吸收入体内的矶主要储存在脂肪组织中,少量分布于肝、肾、甲状腺和骨等部位。大部分钠由尿排出,也可通过胆汁排出。 (二)钢可能通过与磷酸和Mg2+竞争结合配体干扰细胞的生化反应过程铣的主要形式为vo-3,经离子转运系统或自由进入细胞,在胞内被还原型谷胱甘肤还原成VO气vo-3与磷酸结构相似,vo2+与M忙的离子半径大小相当,因而两者就有可能通过与磷酸和M矿竞争结合配体千扰细胞的生化反应过程。如抑制核糖核酶、磷酸果糖激酶、磷酸甘油醒激酶、葡糖-6-磷酸酶、蛋白质酪氨酸激酶。所以,饥进入细胞后具有广泛的生物学效应。 (三)钢可作为多种疾病治疗的辅助药物 钮对哺乳动物的造血功能有促进作用,可增加铁对红细胞的再生作用,给出血后贫血及患败血症的人补充钮,对造血功能有促进作用。饥离子在牙釉质和牙质内可增加轻基磷灰石的硬度,可置换到磷灰石分子中,可以预防龋齿。钮因其胰岛素样效应,因此具有降血糖作用。另外,钮有抑制胆固醇合成的作用,使血浆磷酸酷和胆固醇水平降低以及主动脉胆固醇浓度下降等。 十一、硅 硅(s山con)是人体必需的微量元素之一,占体重小于1.4X10-6%,约18mg。每日需要量为20~50mg。燕麦、惹米、玉米、稻谷等天然谷物含有丰富的硅,动物肝、肉类、蔬菜以及水果也含有硅。(—)血液中的硅以单晶硅的形式存在硅不易吸收,膳食硅的形式对硅的吸收影响很大,稳定的胶体硅吸收较好。血液中的硅不与蛋白质结合,几乎全部以非解离的单晶硅的形式存在。吸收入血的硅迅速被转移至细胞或从尿液中排出。(二)硅参与结缔组织和骨的形成硅是胶原组成成分之一,在胶原形成过程中脯氨酸的胫基化需脯氨酰轻化酶,而此酶具有最大活性时则需要硅的存在;硅可使黏多糖互相连接,连接的黏多糖可与蛋白质结合形成纤维结构,可增加1飞结缔组织的弹性和强度,并维持其结构的完整性;食物中的硅能增加钙化的速度,尤其当钙摄入量低第二十一章钙、磷及微量元素时效果更为明显,在钙化初始阶段起作用,因此硅参与骨的钙化作用。 (三)长期吸入大量含硅的粉尘可引起硅沉着病 长期吸入大量含有游离二氧化硅粉尘可引起肺部广泛的结节性纤维化病变,微血管循环受到障碍,是硅沉着病发病的主要原因。硅摄入不足也可导致一些疾病的发生,如血管壁中硅含量与人和动物粥样硬化程度呈反比。 十二、镶 正常成年人体内含镌(nickel)占体重小于1.4xl0-5%,为6~10mg,每日生理需要量为25~35µg。丝瓜、蘑菇、大豆以及茶叶等锦的含量较高,肉类和海产类镌含量较多,植物性食品锦的含量比动物性食品高。 (一)镖主要与清蛋白结合而运输 吸收入血的银主要与清蛋白结合而运输。镌主要分布千肾、肺、脑、脊髓、软骨、结缔组织,皮肤等部位。一小部分锦可与组氨酸、天冬氨酸、CX2巨球蛋白结合。组氨酸可以从清蛋白中转移出镌,并介导其进入细胞。 (二)镶与多种酶的活性有关 镌可激活多种酶,当镌缺乏时,肝内葡糖-6-磷酸脱氢酶、乳酸脱氢酶、异拧檬酸脱氢酶、苹果酸脱氢酶和谷氨酸脱氢酶等合成减少、活性降低,影响NADH的生成、糖的无氧酵解、三狻酸循环等代谢。铢参与激素作用和生物大分子的结构稳定性及新陈代谢。镌还参与多种酶蛋白的组成,并具有刺激造血、促进红细胞生成的作用。 (三)镁是最常见的致敏性金属 铢是一种潜在的致敏因子,可引起皮肤过敏。约有20%左右的人对铢离子过敏,女性高于男性,锦离子可通过毛裂和皮脂腺渗入皮肤而引起皮肤过敏,临床表现为皮炎和湿疹。碳基银以蒸气形式迅速由呼吸道吸收,也能由皮肤少噩吸收,具有很强的毒性。贫血病人血铢含量减少,伴有铁吸收减少,而给予锦增加造血功能。缺银还可引起糖尿病、贫血、肝硬化、尿毒症、肝脂质和磷脂代谢异常等。 十三、铝 一个体重70kg的健康人,铝(molybdenum)占体重小于7. Ox10-6%,约9mg。成人适宜摄入量为每日60µ,g;最高可耐受摄入量为每日350µ,g。动物肝、绿豆、纳豆、蛋、牛奶、糙米和肉类等食物均含有铝。 (一)铝以铝酸根的形式与血液中的红细胞松散结合而转运铝酸盐被吸收后可与血液中的红细胞松散结合而转运,血液中的铝大部分被肝、肾摄取。一部分铝在肝中参与含钥酶的合成,也可与蝶呤结合形成含铝的辅基储存于肝。人体主要通过调节肾脏排泄速率维持体内铝平衡。 (二)铝是三种含铝酶的辅基 黄嗦呤氧化酶、酸氧化酶和亚硫酸盐氧化酶的辅基为钜,催化一些底物的轻化反应。黄嗦呤氧化酶催化次黄嗦呤转化为黄嗦呤;睦氧化酶催化啥唗、嗦呤、蝶唗等的氧化;亚硫酸盐氧化酶可催化亚硫酸盐向硫酸盐的转化。 (三)铝缺乏与多种疾病的发生发展有关 铝缺乏可导致儿童和青少年生长发育不良、智力发育迟缓,并与克山病、肾结石和大骨节病等疾病的发生有关。一些低铝地区食管癌发病率高,补铝后能降低食管癌的发病率,缺铝使得亚硝酸还原成氧降低,与亚硝酸在体内富集有关。 十四、锡人体锡(tin)约占体重的4.3xl0-5%,每日需要消耗的锡蜇非常少,约需3.5µ,g。正常饮食的食物中所含锡能满足人体的需要。动物内脏和谷类是锡的良好来源。 (—)锡主要由胃肠道和呼吸道进入人体 锡除了胃肠道吸收外,也可通过呼吸道进入人体,皮肤及眼结膜等也是锡进入人体的途径。当体内锡不缺乏时,即使补锡也不容易被吸收。锡主要从粪便和尿液中排出。(二)锡可促进蛋白质和核酸的合成体内锡的作用主要为促进生长发育、影响血红蛋白的功能和促进伤口的愈合。这些作用与锡促进蛋白质和核酸的合成有关。 (三)缺锡可导致蛋白质和核酸代谢的异常 缺锡引起的症状少而不明显,且迄今尚未有人体锡缺乏病的报告。当人体明显缺锡将导致蛋白质和核酸的代谢异常,从而阻碍生长发育,若严重缺锡发生在儿童,有可能导致侁儒症的发生。食用锡污染的水果罐头,可出现恶心、呕吐、腹泻等急性胃肠炎症状。锡冶炼工人在高锡烟尘浓度环境中工作,可能发生锡尘肺。长期接触四氯化锡的工人可有呼吸道刺激症状和消化道症状。四氯化锡尚可引起皮肤溃烂和湿疹。锡中毒可引起血清中钙含揽降低。 钙、磷主要以无机盐形式存在体内,约99%以上的钙与85.7%以上的磷以胫磷灰石的形式存在于骨骼和牙齿中,骨是人体内的钙、磷储库和代谢的主要场所。钙与磷除了作为骨的主要组成外,还具有许多重要的生理功能,钙、磷代谢受PTH、CT和I,25~二径维生素队调控,并维持血钙与血磷浓度的相对恒定。 微量元素在人体中存在量低于人体体重0.01%、每日需要量在100mg以下。绝大多数为全属元素。在体内一般结合成化合物或络合物,广泛分布于各组织中,含量较恒定。微量元素通过形成结合蛋白、酶、激素和维生素等在体内发挥着参与构成酶活性中心或辅酶、参与体内物质运输、参与激素和维生素的形成等重要生理作用。铁是血红蛋白、呼吸链的主要复合物等的重要组成部分。锌是含锌全属酶和许多锌指蛋白的组成成分。铜是体内多种酶的辅基。钻是多种酶的组成成分和激活剂。硒在体内以硒半胱氨酸的形式存在于硒蛋白中。碟参与甲状腺激素的合成。钻主要以维生素B12的形式发挥作用。氯与骨、牙的形成及钙、磷代谢密切相关。辂是辂调素的组成成分。钗可能通过与磷酸和M矿竞争结合配体干扰细胞的生化反应过程。硅参与结缔组织和骨的形成。铢参与多种酶蛋白的组成,与多种酶的活性有关。铝是三种含铝酶(黄啋呤氧化酶、酪氧化酶和亚硫酸盐氧化酶)的辅基。锡可促进蛋白质和核酸的合成。长期缺乏微量元素可导致相应的缺乏症。 1.钙、磷在人体内的主要作用有哪些?钙、磷代谢如何调控?钙、磷代谢紊乱与哪些疾病的发生发展有关?2.什么是微量元素?简述微量元素发挥生理作用的主要形式和机制。 3.哪些微量元素的缺乏可引起贫血?引起的贫血类型有哪些?发病机制是什么?(汪渊) 第二十二章癌基因和抑癌基因 正常机体内,各种细胞的新生、生长、增殖、分化、衰老和死亡受到多种基因的严格调节和控制,从而确保正常生命活动的有序进行。肿瘤发生的关键正是这些基因异常所导致的细胞增殖失去控制,这也是癌细胞区别于正常细胞的一个显著特征。与肿瘤发生密切相关的基因,可分为三类:心细胞内正常的原癌基因(proto-oncogene),其作用通常是促进细胞的生长和增殖,阻止细胞分化,抵抗凋亡;@抑癌基因,或称肿瘤抑制基因(tumor suppresso r gene),通常抑制增殖,促进分化,诱发凋亡;@基因组维护基因(genome maintenan ce gene),参与DNA损伤修复,维持基因组完整性(见第十三章)。当细胞受到各种致癌因素的作用时,可引起原癌基因或抑癌基因的结构或表达调控异常,导致原癌基因活化或抑癌基因失活,直接导致细胞生长增殖的失控而形成肿瘤。而基因组维护基因的编码产物则不直接抑制细胞增殖,这类基因在致癌因素的作用下发生突变失活后,可导致基因组不稳定,从而间接地通过增加基因突变频率、使原癌基因或抑癌基因突变来引发肿瘤发生。因此,基因组维护基因也可归属千抑癌基因。 本章主要阐述原癌基因、癌基因和抑癌基因的基本概念,并介绍原癌基因激活和抑癌基因失活的机制及其在肿瘤发生发展中的作用。 第一节癌基因 癌基因(oncogene)是能导致细胞发生恶性转化和诱发癌症的基因。绝大多数癌基因是细胞内正常的原癌基因(proto-oncogene)突变或表达水平异常升高转变而来,某些病毒也携带癌基因。 一、原癌基因是人类基因组中具有正常功能的基因原癌基因及其表达产物是细胞正常生理功能的重要组成部分,原癌基因所编码的蛋白质在正常条件下并不具致癌活性,原癌基因只有经过突变等被活化后才有致癌活性,转变为癌基因。在20世纪70年代中期,研究人员提出,肿瘤发生是由于细胞中的原癌基因在致癌因素的作用下激活或突变为致癌基因而引起。 原癌基因在进化上高度保守,从单细胞酵母、无脊椎生物到脊椎动物乃至人类的正常细胞都存在着这些基因。原癌基因的表达产物对细胞正常生长、增殖和分化起着精确的调控作用。在某些因素(如放射线、有害化学物质等)作用下,这类基因结构发生异常或表达失控,转变为癌基因,导致细胞生长增殖和分化异常,部分细胞发生恶性转化从而形成肿瘤。 许多原癌基因在结构上具有相似性,功能上亦高度相关。故而可据此将原癌基因和癌基因区分为不同的基因家族,重要的有SRC、RAS和MYC等基因家族。 SRC家族包括SRC和LCK等多个基因。SRC最初是在引起肉瘤(罗竺oma)的劳斯肉瘤病毒(Rous sarcoma virus, RSV)中发现的,病毒癌基因名为v-src。该基因家族的产物具有酪氨酸激酶活性(见第十七章),在细胞内常位于膜的内侧部分,接受受体酪氨酸激酶(如PDGF受体)的活化信号而激活,促进增殖信号的转导。这些酶因突变而导致的待续活化是其促进肿瘤发生的主要原因。 RAS家族包括H-RAS、K-RAS、N-RAS等成员。H-RAS和K-RAS最初分别在Harvey大鼠肉瘤病毒(旦arvey些t包arcoma virus)和Kirsten鼠科肉瘤病毒(~irsten murine s釭coma virus)中克隆,分别称为v-Hras和v-Kras。原癌基因K-RAS突变是恶性肿瘤中最常见的基因突变之一,在81%的胰腺癌病人的肿瘤组织可检测到。RAS基因编码低分子量G蛋白(见第十七章),在肿瘤中发生突变后,往往造成其GTP酶活性丧失,RAS始终以GTP结合形式存在,即处于待续活化状态,导致细胞内的增殖信号通路持续开放。MYC家族主要包括C-MYC、N-MYC和L-MYC。MYC最初在禽骨髓细胞瘤病毒(avian!!!YeloQytomatosis virus, AMV)被发现,并因而得名为v-myc。MYC基因家族编码转录因子,有直接调节其他基因转录的作用。原癌基因C-MYC编码的49kD的MYC与MAX蛋白形成异二聚体,与特异的顺式作用元件结合,活化靶基因的转录。MYC的靶基因多编码细胞增殖信号分子,故细胞内MYC蛋白可促进细胞的增殖。 二、某些病毒的基因组中含有癌基因 一些病毒能导致肿瘤发生,称为肿瘤病毒(tumor virus)。肿瘤病毒大多为RNA病毒,且目前发现的RNA肿瘤病毒都是逆转录病毒,如前述的RSV、AMV、Harvey大鼠肉瘤病毒和Kirsten鼠科肉瘤病毒等。DNA肿瘤病毒常见的有人乳头瘤病毒(Human papillomavirus, HPV)和乙型肝炎病毒(Hepati tis B virus,HBV)等。RNA肿瘤病毒和DNA肿瘤病毒的致癌机制不同。 事实上,癌基因最早发现于RNA肿瘤病毒。1910年,Rous F首次发现病毒可导致鸡肉瘤,提出病毒导致肿瘤的观点。该病毒后来被命名为劳斯肉瘤病毒(Rous sarcoma virus, RSV)。在深入研究RSV的致癌分子机制时,研究人员比较了具备转化和不具备转化特性的RSV的基因组,发现了一个特殊的基因src,将这一基因导入正常细胞可使之发生恶性转化。以后又在其他逆转录病毒中陆续发现了一些使宿主患肿瘤的基因。 1976年,Varmus HE和Bishop JM发现,逆转录病毒RSV携带的癌基因v-src在进化过程中来源千宿主细胞的原癌基因C-SRC,进而提出:RNA肿瘤病毒携带的癌基因来源于细胞原癌基因。关于其起源进化的分子机制,目前认为,逆转录病毒感染宿主细胞后,在逆转录酶作用下,以病毒RNA基因组为模板合成双链DNA即前病毒DNA(provirus),并整合于宿主细胞基因组的原癌基因附近,在后续的病毒复制和包装过程中,经过复杂而巧妙的删除、剪接、突变、重组等过程,逆转录病毒最终将细胞原癌基因"劫待”并改造为具有致癌能力的病毒癌基因,成为新病毒基因组的一部分。 目前已发现的病毒癌基因有几十种。需要注意的是,病毒有致癌能力并不意味着其一定含有病毒癌基因。有致癌特性的逆转录病毒可区分为急性转化逆转录病毒和慢性转化逆转录病毒两类。前者含有癌基因,能迅速在几天内诱发肿瘤,后者则不含有癌基因,而是通过将其基因组插入至宿主细胞的原癌基因附近,从而激活原癌基因而诱发肿瘤,故其致癌效应较慢,常需数月甚至数年,有较长的潜伏期。 逆转录病毒的癌基因也可以视为是原癌基因的活化或激活形式,它有利于病毒在肿瘤细胞中的复制,但对病毒复制包装无直接作用,对逆转录病毒基因组不是必需的。与之不同,已知的DNA病毒的癌基因则是其基因组不可或缺的部分,对病毒复制是必需的,目前也没有证据表明其有同源的原癌基因,如HPV基因组中的癌基因E6和E7。通常可将RNA肿瘤病毒的癌基因的名称冠以前缀v-,写为小写斜体,如v-src,而将正常人类细胞中的原癌基因则冠以前缀C-,写为大写斜体,如C-SRC,以示区分。其编码的蛋白质则通常写为正体,如v-src和C-SRC。 三、原癌基因有多种活化机制 原癌基因在物理、化学及生物因素的作用下发生突变,表达产物的质和量的变化,表达方式在时间及空间上的改变,都有可能使细胞脱离正常的信号控制,获得不受控制的异常增殖能力而发生恶性转化。从正常的原癌基因转变为具有使细胞发生恶性转化的癌基因的过程称为原癌基因的活化,这种转.1,L变属于功能获得突变(gain-of-function mutation)。原癌基因活化的机制主要有下述四种(图22-1)。 1基因突变i i3.染色体易位 蛋断 白裂 140kD ABL蛋白 K-RAS突变失去GTP酶活性以GTP结合方式持续活化 录转 染色体9—ABL 染色体22—BCR 勹中BCR-AB氓因融合 ”“i n,员眉'n 因录、翻译!转JL______________________义点突变,导致基因编码的蛋白质中的关键氨基酸残基改变,造成突变蛋白质的活性呈现持续性激12位甘氨酸突变为绷氨的第RAS,使得表达产物GTC胱癌中突变为,在膀中的GGCH-RAS活。如。结合的活性形式存在GTP始终以RASGTP酶活性,酸,结果使其丧失甚至上千倍不等,发生扩增使基因拷贝数升高几十amplification)(ge原癌基因可通过基因扩增ne MYCC。例如小细胞肺癌中。基因扩增可致编码产物过量表达,细胞发生转化目前尚不清楚的机制-。瘤发生中具有重要作用HER2的扩增都在肿的扩增和乳腺癌中(三)染色体易位导致原癌基因表达增强或产生新的融合基因染色体易位使原癌基因易位至强的启动子或增强子的第一致癌。机制染色体易位可通过两种,基因移C-MYC8号染色体上的瘤细胞中,位于itt淋巴Brk例如,人。附近,导致其转录水平大大提高u量表基因在该增强子的控制下过CMYC14号染色体的免疫球蛋白重链基因的增强子附近,使位到-leukemia,(chronic myelogenous。例如,慢性髓性白血病第二,染色体易位导致产生新的融合基因达。ABL基因发生染色体易位9号染色体的基因与region)point cluster(break BCR22号染色体的中,CML)2.基因扩增I70kD BCR+140kD ABL t---------------------」I甘基因I:`T.. 随机插人强启动子 I..正常1号神经母细胞瘤的I1仁亘二1LTR_L R2[l3D染色体1号染色体I I L____________________基因表达持续增加__. I IL----------------------i(一)基因突变常导致原癌基因编码的蛋白质的活性持续性激活各种类型的基因突变如碱基替换、缺失或插入,都有可能激活原癌基因。较为常见和典型的是错(二)基因扩增导致原癌基因过量表达产生融合基因BCR-ABL,进而表达为融合蛋白BCR-ABL,导致ABL的蛋白酪氨酸激酶活性持续增高。该易位产生的较小的异常22号染色体,最早千1960年在美国费城发现,故又称费城染色体(Philadel伽a chromosome)或Ph染色体(Ph chromosome),是CML的标志染色体。 (四)获得启动子或增强子导致原癌基因表达增强如前所述,染色体易位可使原癌基因获得增强子而被活化。此外,逆转录病毒的前病毒DNA的两个末端是特殊的长末端重复序列(LTR),含有较强的启动子或增强子元件。如果前病毒DNA恰好整合到原癌基因附近或内部,就会导致原癌基因的表达不受原有启动子的正常调控,而成为病毒启动子或增强子的控制对象,往往导致该原癌基因的过量表达。如鸡的白细胞增生病毒引起的淋巴瘤,就是因为该病毒的LTR序列整合到宿主的C-MYC基因附近,LTR中的强启动子可使C-MYC的表达比正常高出30~100倍。 不同的癌基因有不同的激活方式,一种癌基因也可有几种激活方式。例如C-MYC的激活就有基因扩增和染色体易位等方式,但很少见到C-MYC的点突变;而RAS的激活方式则主要是点突变。 两种或更多的原癌基因活化可有协同作用,抑癌基因的失活也会产生协同作用。在肿瘤细胞中常发现两种或多种细胞癌基因的活化。例如,白血病细胞株HL-60中有C-MYC和N-RAS的同时活化。实验也证明癌基因的协同作用可使细胞更易发生恶性转化。例如原代培养的大鼠胚胎成纤维细胞传代50次左右就会死亡,如仅导入重排的C-MYC可使它永生化,但细胞表型无恶性行为;如仅导入活化的突变RAS基因,细胞形态发生改变,但不能无限传代及形成肿瘤。只有同时导入C-MYC和N-RAS,细胞才会发生恶性变,并在动物中成瘤。 四、原癌基因编码的蛋白质与生长因子密切相关 生长因子(growth factor)是一类由细胞分泌的、类似于激素的信号分子,多数为肤类或蛋白质类物质,具有调节细胞生长与分化的作用。在体外培养细胞时,培养基中除了含有氨基酸、维生素和无机盐等一系列必需营养物质外,还必须添加含有多种生长因子的胎牛血清,细胞才能保持良好的生长、增殖状态。生长因子在肿瘤、心血管疾病等多种疾病的发生发展过程中发挥重要作用,不少生长因子巳经应用千临床治疗。目前已知,原癌基因编码的蛋白质参与调控细胞增殖、分化与生长等各个环节,与生长因子密切相关。 (一)生长因子主要有三种作用模式 目前已发现的肤类生长因子有数十种,而且还在不断增加。生长因子可以根据其来源进行分类和命名,也可以依据其作用方式分类。 生长因子来源于多种不同组织,其靶细胞亦各不相同(表22-1)。有的生长因子作用的细胞比较单一,如EPO及VEGF,分别主要作用于红细胞系和血管内皮细胞;也有的生长因子作用的细胞谱型比较广,如成纤维细胞生长因子(fibroblast growth factor, FGF)对间充质细胞、内分泌细胞和神经系统细胞者眸i作用。 生长因子名称组织来源功能 表皮生长因子(EGF)唾液腺、巨噬细胞、血小板等促进表皮与上皮细胞的生长,尤其是消化道上皮细胞的增殖肝细胞生长因子(HGF)间质细胞促进细胞分化和细胞迁移促红细胞生成素(EPO)肾调节成红细胞的发育类胰岛素生长因子(IGF)血清促进硫酸盐掺入到软骨组织,促进软骨细胞的分裂、对多种组织细胞起胰岛素样作用神经生长因子(NGF)颌下腺含最高营养交感和某些感觉神经元,防止神经元退化血小板源生长因子(PDGF)血小板、平滑肌细胞促进间质及胶质细胞的生长,促进血管生成转化生长因子a(TGF仅)肿瘤细胞、巨噬细胞、神经作用类似于EGF,促进细胞恶性转化转化生长因子~(TGF-~)肾、血小板对某些细胞的增殖起促进和抑制双向作用血管内皮生长因子(VEGF)低氧应激细胞促进血管内皮细胞增殖和新生血管形成EGF:epidermal growth factor表皮生长因子;HGF:hepatocyte growth factor,肝细胞生长因子;EPO:erythropoietin,促红细胞生成素;IGF:insulin-like growth factor,类胰岛素生长因子;NGF:nerve growth factor,神经生长因子;PDGF:platelet-derived growth factor,血小板源生长因子;TGF-a:transforming growth factor a,转化生长因子-a; TGF-f3:transforming growth factor f3,转化生长因子书;VEGF:vascular endothelial growth factor,血管内皮生长因子NGF是最早被发现的生长因子。1948年,E. Bueker等发现将小鼠肉瘤组织植入胚胎体壁可使移植区神经节增加。随后,R. Levi-Montolcini等发现肉瘤组织的植入不仅可使局部神经节增加,而且可使远隔部位的神经节增加。由此设想肉瘤组织释放了一种可扩散因子作用千远隔部位。后来证实这种因子就是神经生长因子,它有刺激神经元生长以及神经纤维延长的功能。1959年S. Cohen又发现了EGF。R. Levi-Montolcini和S. Cohen由千在这一领域的成就荣获了1986年诺贝尔生理学或医学奖。 与其他细胞外信号分子一样(见第十七章),根据产生细胞与靶细胞间的关系,生长因子的作用模式可分为3种:O内分泌方式:生长因子从细胞分泌出来后,通过血液运输作用于远端靶细胞。如源于血小板的PDGF可作用于结缔组织细胞;@旁分泌方式:细胞分泌的生长因子作用于邻近的其他类型细胞,对合成、分泌生长因子的自身细胞不发生作用,因为其缺乏相应受体;@自分泌方式:生长因子作用于合成及分泌该生长因子的细胞本身。生长因子以后两种的作用方式为主,经细胞分泌后在胞外运送,最终作用千自身细胞或者其他细胞,传递它们独特的生物学信息。生长因子将组织内的细胞连接成为一个有机整体网络,相互之间进行着持续不断的交流沟通。 (二)生长因子的功能主要是正调节靶细胞生长目前对大部分生长因子的结构与功能了解得相当清楚。大多数生长因子具有促进靶细胞生长的功能,少数具有负调节功能,还有一些具有正、负双重调节作用。 生长因子的生物学效应主要表现在促进细胞生长、分化、促进个体发育等方面。但是有些生长因子具有双重调节作用或负调节作用。例如,NGF对神经系统的生长具有促进作用,但对成纤维细胞的DNA合成却有微弱的抑制作用。TGF-(3也是这样,对成纤维细胞有促进生长的作用,但对其他多种细胞具有抑制作用。其具体作用取决千与其他生长因子的相互作用和环境条件。 同一生长因子对不同细胞的作用有所不同,如肝细胞生长因子(hepatocyte growth factor, HGF)对正常肝细胞的生长起促进作用,但对肝癌细胞的增殖则有抑制作用。一种细胞也可受不同生长因子调节,如胚胎时属千间充质细胞的成纤维细胞可被EGF、I GF和多种FGF所调节,但不被HGF调节。还有一些以前认为作用比较单一的生长因子,近来发现对其他细胞也有作用。如内皮素(endothelin, ET)除了对内皮细胞的作用外,可能对脑、垂体的神经内分泌也有作用。 具有负调节作用的生长因子比较少,人们通常把这种负调节因子(negative growth factor)称为细胞生长抑制因子。抑素(chalone)是最早被确认的生长抑制因子,以后又发现TGF-(3、干扰素(interferon)和肿瘤坏死因子(tumor necrosis factor, TNF)等也具有抑素的某些特征,但它们实际上都是双重调节,只不过以负调节为主。目前对生长抑制因子尚无统一的标准或定义,也没有明确的学说阐明其作用机制,但是其在肿瘤、心血管疾病等疾病防治方面的潜在应用前景是不可否认的。因此对负调节因子的研究,始终是生物医学界的一个热点领域。 (三)生长因子通过细胞内信号转导而发挥其功能生长因子的作用通过受体介导的细胞信号转导而实现(见第十七章)。生长因子的受体多位于靶细胞膜,为一类跨膜蛋白,多数具有蛋白激酶特别是酪氨酸蛋白激酶活性,也有少数具有丝/苏氨酸蛋白激酶活性。最近发现细胞核也存在EGF等生长因子的受体样蛋白质。有些生长因子受体(如EGF受体)与原癌基因产物有高度同源性。对生长因子受体的研究不仅有助于了解细胞的增殖分化,而且对了解肿瘤的发生、发展及治疗也具有重要意义。 大部分生长因子的受体属千受体酪氨酸激酶家族,如EGF受体、FGF受体、PDGF受体、HGF受体、VEGF受体等,胰岛素受体也属于受体酪氨酸激酶。位于膜表面的受体是跨膜受体蛋白质,包含具有酪氨酸激酶活性的胞内结构域。当生长因子与这类受体结合后,受体所包含的酪氨酸激酶被活化,使胞内的相关蛋白质被直接磷酸化。另一些膜上的受体则通过胞内信号传递体系,产生相应的第二信使,后者使蛋白激酶活化,活化的蛋白激酶同样可使胞内相关蛋白质磷酸化。这些被磷酸化的蛋白质再活化核内的转录因子,引发基因转录,达到调节生长与分化的作用。 410第四篇医学生化专题 另一类生长因子受体定位于细胞质,当生长因子与胞内相应受体结合后,形成生长因子-受体复合物,后者亦可进入胞核活化相关基因促进细胞生长。 原癌基因表达产物有的属千生长因子或生长因子受体;有的属千胞内信息传递体亦或核内转录因子。发生突变的原癌基因可能生成上述产物的变异体,后者的生成及过量表达会导致细胞生长、增殖失控,进而引起癌变。 (四)原癌基因编码的蛋白质涉及生长因子信号转导的多个环节目前已知,原癌基因编码的蛋白质涉及生长因子信号转导的多个环节。依据它们在细胞信号转导系统中的作用分为四类(表22-2)。 类别癌基因名称作用 细胞外生长因子SIS PDGF-2 INT-2FGF同类物,促进细胞增殖 跨膜生长因子受体EGFR EGF受体,促进细胞增殖 HER2EGF受体类似物,促进细胞增殖 FMS CSF-1受体,促进增殖 KIT SCF受体,促进增殖TRK NGF受体 细胞内信号转导分子SRC、ABL与受体结合转导信号 RAF MAPK通路中的重要分子 RAS MAPK通路中的重要分子 核内转录因子MYC促进增殖相关基因表达FOS、JUN促进增殖相关基因表达EGFR:epidermal growth factor recep tor,表皮生长因子受体;CSF-1:colony stimulating factor1,集落刺激因子I; SCF:stem cell factor,干细胞因子1细胞外生长因子生长因子是细胞外增殖信号,它们作用千膜受体,经各种信号通路,如MAPK通路等,引发一系列细胞增殖相关基因的转录激活。这些因子的过度表达,势必连续不断作用于相应的受体细胞,造成大量生长信号的待续输入,从而使细胞增殖失控。 已知人的原癌基因C-SIS编码PDGF的B链,作用于PDGF受体,激活PLC-IP/DAG-PKC途径(见第十七章),促进肿瘤细胞增殖。此外,C-SIS表达产物还能促进肿瘤血管的生长,为肿瘤进展提供有利环境。目前已知与恶性肿瘤发生和发展有关的生长因子有PDGF、EGF、TGF-13、FGF、IGF-1等。 2跨膜生长因子受体第二类原癌基因的产物为跨膜受体,它们接受细胞外的生长信号并将其传入细胞内。跨膜生长因子受体的膜内侧结构域,往往具有酪氨酸特异的蛋白激酶活性。这些受体型酪氨酸激酶通过多种信号通路,如MAPK通路、PI3K-AKT通路等,加速增殖信号在胞内转导。许多恶性肿瘤如非小细胞型肺癌、乳腺癌等均出现EGF/EGFR的过度表达,EGF/EGFR的过度表达或者异常活化常能引起细胞恶性转化,而这与多种肿瘤的发生发展、恶性程度以及预后具有密切相关性。另外,表皮生长因子还参与了肿瘤的血管生成作用,因此其过表达或异常活化会促进肿瘤进展。 3细胞内信号转导分子生长信号到达胞内后,借助一系列胞内信号转导体系,将接受到的生长信号由胞内传至核内(见第十七章),促进细胞生长。这些转导体系成员多数是原癌基因的产物,或者通过这些基因产物的作用影响第二信使,如cAMP、DAG、Ca正等。作为胞内信号转导分子的癌基因产物包括:非受体酪氨酸激酶SRC、ABL等,丝/苏氨酸激酶RAF等,低分子量G蛋白RAS等。 4.核内转录因子另外一些癌基因表达的蛋白质属千转录因子,通过与靶基因的顺式作用元件相结合,直接促进细胞增殖靶基因的转录。EGF促肿瘤的一个重要机制就是通过活化MAPK通路(见第十七章)而使原癌基因FOS活化,FOS蛋白增加。FOS蛋白可与JUN蛋白结合形成AP-1,而第二十二章癌基因和抑癌基因411AP-1是一种广泛存在的高度活化的异源二聚体转录因子,能促进肿瘤的发生发展。 五、癌基因是肿瘤治疗的重要分子靶点 在许多人类肿瘤中都存在某些癌基因的过度活化,从而在肿瘤的发病机制中扮演着重要的角色,也为肿瘤治疗提供了靶位,此处仅以下述3个基因为例进行简要介绍。 (-)BRAF是黑素瘤治疗的重要分子靶点 原癌基因BRAF所编码的蛋白质属于丝/苏氨酸激酶,是MAPK信号通路的重要组成分子,在调控细胞增殖、分化等方面发挥重要作用。人类肿瘤中,BRAF基因存在不同比例的基因突变,其中约60%的黑素瘤中BRAF发生突变,其第600位氨基酸从颌氨酸突变为谷氨酸(V600E)最为常见,导致B-RAF的持续激活。已有针对这类V600E突变的分子靶向药物威罗菲尼(vemurafenib)用于临床,该药可阻断突变B-RAF的活性,从而抑制肿瘤生长。 (二)HER2是乳腺癌治疗的重要分子靶点 HER2是表皮生长因子受体家族成员,具有蛋白酪氨酸激酶活性,能激活下游信号通路,从而促进细胞增殖和抑制细胞凋亡。在30%的乳腺癌中HE应基因发生扩增或者过度表达,其表达水平与治疗后复发率和不良预后显著相关。针对其过度表达的单克隆抗体药物赫赛汀(herceptin)已在临床使用。 (三)BCR-ABL是慢性髓性白血病治疗的重要分子靶点慢性髓性白血病(CML)病人的9号染色体与22号染色体之间发生易位,从而融合产生了癌基因BCR-ABL,编码的蛋白质BCR-ABL具有持续活化的蛋白酪氨酸激酶活性,能促进细胞增殖,并增加基因组的不稳定性。在95%的CML病人中都伴随有BCR-ABL融合基因的产生,在一些急性淋巴白血病病人中也有发现。针对BCR-ABL融合蛋白的药物伊马替尼(imatinib)2001年被FDA批准用于临床治疗。 第二节抑癌基因 抑癌基因也称肿瘤抑制基因(tumor suppressor gene),是防止或阻止癌症发生的基因。与原癌基因活化诱发癌变的作用相反,抑癌基因的部分或全部失活可显著增加癌症发生风险。抑癌基因对细胞增殖起负性调控作用,包括抑制细胞增殖、调控细胞周期检查点、促进凋亡和参与DNA损伤修复等。 —、抑癌基因对细胞增殖起负性调控作用 抑癌基因的发现源于20世纪60年代H. Harri s的杂合细胞致癌性研究。他将癌细胞株与正常细胞融合得到的杂合细胞接种动物,发现并不产生肿瘤,提示正常细胞中有能抑制肿瘤发生的基因,即抑癌基因。用化学物质诱发的肿瘤及自发发生的肿瘤的细胞与正常细胞制备杂合细胞也可重复出上述结果,并且与肿瘤的组织起源无关,表明上述结果有普遍意义。将不具致癌性的杂合细胞体外培养传代,可从中分离出具有致癌性的子代细胞。比较两种杂合细胞,发现致癌性的子代杂合细胞丢失了来自正常细胞的一条或几条染色体。将正常人类细胞的单条染色体逐一融合在肿瘤细胞中,也可分离到无致癌性的杂合细胞。这些结果说明细胞中含有各种不同的抑癌基因,分布在不同的染色体上,可以分别抑制不同组织起源的癌细胞的致癌作用。 随着20世纪70年代基因克隆技术的建立,RB、TP53等一系列抑癌基因得以克隆和鉴定。必须指出,最初在某种肿瘤中发现的抑癌基因,并不意味其与别的肿瘤无关;恰恰相反,在多种组织来源的肿瘤细胞中往往可检测出同一抑癌基因的突变、缺失、重排、表达异常等,这正说明抑癌基因的变异构成某些共同的致癌途径。抑癌基因产物的功能多种多样,目前已鉴定的一些抑癌基因产物及其功能如表22-3。总体来说,抑癌基因对细胞增殖起负性调控作用,其编码产物的功能有:抑制细胞增殖;抑制细胞周期进程;调控细胞周期检查点;促进凋亡;参与DNA损伤修复。 TP53:tumor protein p53,肿瘤蛋白p53基因;APC:adenomalouspolyposis co l),腺瘤性结肠息肉病基因;DCC:deleted m colorectal carcinoma,结肠癌缺失基因;NF:neurofibromalosis,神经纤维瘤;VHL:von Hippel-Lindau tumor suppressor, VHL肿瘤抑制基因;WT:趴lms lumo),肾母细胞瘤二、抑癌基因有多种失活机制抑癌基因的失活与原癌基因的激活一样,在肿瘤发生中起着非常重要的作用。但癌基因的作用是显性的,而抑癌基因的作用往往是隐性的。原癌基因的两个等位基因只要激活一个就能发挥促癌作用,而抑癌基因则往往需要两个等位基因都失活才会导致其抑癌功能完全丧失。1971年,KnudsonA以视网膜母细胞瘤(retinoblastoma)为模型进行统计学分析研究,发现散发性单侧视网膜母细胞瘤的发病需要抑癌基因(即后来命名为RB的基因)的两次体细胞突变,从而提出二次打击假说(two-hithypothesis)。 但也有一些抑癌基因只失活其等位基因中的一个拷贝就会引起肿瘤发生,即其一个正常的等位基因拷贝不足以完全发挥其抑癌功能,称为单倍体不足型抑癌基因(haploinsufficient tumor suppr essorgene),如p27凡/'基因。还有一些抑癌基因,如TP53基因,当其一个等位基因突变失活后,其表达的p53突变蛋白则能抑制另一个正常等位基因产生的野生型即正常p53蛋白的功能,这种基因突变称为显性负效突变(dominant negat ive mutation)。 抑癌基因失活的方式常见有以下三种。 (一)基因突变常导致抑癌基因编码的蛋白质功能丧失或降低抑癌基因发生突变后,会造成其编码的蛋白质功能或活性丧失或降低,进而导致癌变。这种突变属千功能失去突变(loss-of-function mutation)。最典型的例子就是抑癌基因TP53的突变,目前已经发现TP53基因在超过一半以上的人类肿瘤中发生了突变。 (二)杂合性丢失导致抑癌基因彻底失活 杂合性(heterozygosity)是指同源染色体在一个或一个以上基因座存在不同的等位基因的状态。杂合性丢失(loss of heterozygosity, LOH)则是指一对杂合的等位基因变成纯合状态的现象。杂合性丢失是肿瘤细胞中常见的异常遗传学现象,发生杂合性丢失的区域也往往就是抑癌基因所在的区域。杂合性丢失导致抑癌基因失活的经典实例就是抑癌基因RB的失活。1986年,将视网膜母细胞瘤的RB基因成功克隆后就发现,RB等位基因的一个拷贝往往是通过生殖细胞突变遗传给后代,也就是说,此时后代的体细胞中RB等位基因就呈现为杂合子状态,即:一个为突变失活的不具有抑癌功能的RB等位基因,另一个为仍具有抑癌功能的正常RB等位基因。而当因为某些原因导致正常的邸等位基因丢失即杂合性丢失时,抑癌基因RB则彻底失活,失去其抑癌作用,从而导致视网膜母细胞瘤。 (三)启动子区甲基化导致抑癌基因表达抑制 真核生物基因启动子区域CpG岛的甲基化修饰对于调节基因转录活性至关重要,甲基化程度与基因表达呈负相关。很多抑癌基因的启动子区CpG岛呈高度甲基化(hypermeth ylation)状态,从而导致相应的抑癌基因不表达或低表达。例如,约70%的散发肾癌病人中存在抑癌基因VHL启动子区甲基化失活现象;在家族性腺瘤息肉所致的结肠癌中,APC基因启动子区因高度甲基化使转录受到抑制,导致APC基因失活,进而引起仕连环蛋白在细胞内的积累,从而促进癌变发生。 三、抑癌基因在肿瘤发生发展中具有重要作用 抑癌基因的失活在肿瘤发生发展中发挥着重要作用,此处以TP53、RB、PTEN三个抑癌基因为例,简要介绍抑癌基因的作用机制。 (-)RB主要通过调控细胞周期检查点而发挥其抑癌功能RB基因失活不仅与视网膜母细胞瘤及骨肉瘤有关,在许多散发性肿瘤,如50%-85%的小细胞性肺癌、10%~30%乳腺癌、膀胱癌和前列腺癌中都发现有RB基因失活。 RB基因位于染色体13q14,有27个外显子,mRNA长4.7kb,编码的蛋白质为105kD。RB蛋白的磷酸化状态及其与其他蛋白质结合,与它的功能密切相关。去磷酸化(或低磷酸化)形式为活性型,能促进细胞分化,抑制细胞增殖。实验表明,将RB基因导入视网膜母细胞瘤细胞或成骨肉瘤细胞,这些恶性细胞的生长受到抑制。 RB的磷酸化程度受细胞周期中增殖调控蛋白质的直接控制,包括随着细胞周期不同时相的转换,其浓度也随之发生变化的细胞周期蛋白(cyclin),以及受到这些蛋白质调节的蛋白激酶。这些蛋白激酶被称为细胞周期蛋白依赖性激酶(cycli n-dependent kinase, CDK)。细胞进入GI期时RB处于低磷酸化状态,而低磷酸化的RB使得细胞不能通过Gl/S期检查点(checkpoint)。该检查点是哺乳动物细胞周期的重要检查点,只有通过该检查点后,细胞周期才能进入下一步运转,进行DNA合成和细胞分裂,故又称为限制点(restri ction poin t),以符号“R”表示。只有在细胞增殖信号通过依赖于cyclin DI的激酶CDK4的活化导致RB磷酸化后,高磷酸化的RB方允许细胞跨过Gl/S期检查点。因此,低磷酸化的RB在GI期特异的磷酸化是细胞从GI期进入S期的关键。 低磷酸化RB对细胞周期的负调节作用是通过与转录因子E2F-l的结合而实现的(图22-2)。低磷酸化RB的口袋结构域能结合E2F-l并使之失活,S期必需的基因产物如二氢叶酸还原酶、胸甘激酶、DNA聚合酶a等的合成因而受限,细胞周期的进展受到抑制。而高磷酸化的RB不能与E2F-l结合,将导致这些基因的开放,促进细胞通过Gl-S关卡。RB基因的缺失使得细胞丧失了该关卡的“守卫",细胞周期进程失控,细胞异常增殖。 (二)TP53主要通过调控DNA损伤应答和诱发细胞凋亡而发挥其抑癌功能TP53基因是目前研究最多的、也是迄今发现在入类肿瘤中发生突变最广泛的抑癌基因。50%~60%的人类各系统肿瘤中发现有TP53基因突变。 人的TP53基因定位千17pl3,全长16-20kb,含有11个外显子,转录2.8kb的mRNA,编码蛋白为p53,具有转录因子活性。TP53基因是迄今为止发现的与人类肿瘤相关性最高的基因。过去一直把它当成一种癌基因,直至1989年才知道起癌基因作用的是突变的p53,后来证实野生型p53是一种抑癌基因。 TP53基因的表达产物p53蛋白由393个氨基酸残基构成,在体内以四聚体形式存在。p53蛋白RB蛋白t凡端@气A仁 气 sss -巳遗.l基因组细胞增殖相关基因关闭细胞增殖相关基因开放图22-2RB磷酸化与细胞周期控制T:苏氨酸(Thr);S:丝氨酸(Ser);I飞磷酸化修饰;D:周期蛋白D;A:周期蛋白A;E:周期蛋白E;E2F蛋白与RB蛋白的A结构域和B结构域结合属千转录因子,包含有典型的转录激活结构域、DNA结合结构域、寡聚结构域、富含脯氨酸区和核定位序列等多个结构域或序列,这也是p53发挥其生物学功能的分子结构基础。多数TP53基因突变都发生在编码其DNA结合结构域的序列中。 正常情况下,细胞中p53蛋白含量很低,因其半衰期只有20~30分钟,所以很难检测出来,但在细胞增殖与生长时,可升高5~100倍以上。野生型p53蛋白在维持细胞正常生长、抑制恶性增殖中起着重要作用,因而被冠以“基因组卫士”称号。当细胞受电离辐射或化学试剂等作用导致DNA损伤时,p53表达水平迅速升高,同时p53蛋白中包含的一些丝氨酸残基被磷酸化修饰而被活化。活化的p53从细胞质移位至细胞核内,调控大量下游靶基因的转录而发挥其生物学功能。例如,p53的靶基因之一p21可阻止细胞通过Gl/S期检查点,使其停滞千GI期;另一靶基因GADD45的产物是DNA修复蛋白。这就使DNA受损的细胞不再分裂,并且修复损伤以维持基因组的稳定l.~_~—____._====己—_=l性。如果修复失败,p53蛋白就会通过激'转录激活结构域DN灶吉合结构域寡聚结构域活一些靶基因如BAX的转录而启动细胞L-—-—-—-—-—-—-—-—「_____-— l , 凋亡,阻止有癌变倾向突变细胞的生成。 p53突变后,则DNA损伤不能得到有效修DNA i损伤i i DNA i损伤!复并不断累积,导致基因组不稳定,进而五玉]基因尸变-巨三五三] 导致肿瘤发生(图22-3)。(三)PTEN主要通过抑制Pl3K/, p2f~ax!功能失活AKT信号通路而发挥其抑癌功能I细胞周期阻滞细胞凋亡!DNA损伤不断累积ten gene,第10号j DNA损伤修复,基因组不稳定染色体缺失的磷酸酶及张力蛋白同源基l细胞周期_____重启_________,____ PTEN基因(phosphataseand tensin hornolog deleted on啦omosome i+I-~~}因)是继TP53基因后发现的另一个与肿i+I'}瘤发生关系密切的抑癌基因。人的PTEN图22-3p53的结构及其功能基因定位于10q23.3,共有9个外显子和8个内含子,编码5.15kb的mRNA,PTEN蛋白由403个氨基酸残基组成,分子量约为56kD。PTEN主要包括3个结构功能域。 1. N端磷酸酶结构区由N端1~185位氨基酸残基组成,第5外显子编码,与蛋白酪氨酸磷酸酶及蛋白质丝/苏氨酸磷酸酶催化区的核心模体(HCXXGXGRXG)同源,是PTEN发挥肿瘤抑制活性的主要功能区。PTEN的N-端175个氨基酸序列可与整合素、酪氨酸激酶、黏着斑激酶(focal adhesion kinase,FAK)等形成复合物,共同参与细胞生长的调节。此外,PTEN还能与肌动蛋白纤维细丝局部黏附,在肿瘤浸润、转移、血管生成中也起一定作用。 2. C2区由186~351位氨基酸残基构成,介导蛋白质与脂质的结合。PTEN通过C2区结合于膜磷脂,参与PTEN在胞膜的有效定位和胞内细胞信号转导。与其他信号蛋白不同,这一结合过程不需要Ca“参与。磷酸酶区和C2区之间有广泛的相互作用界面,提示C2区可能具有催化作用。已有实验证实,对C2区进行诱变,可导致PTEN的肿瘤抑制活性降低。 3. C端区由狻基端的50个氨基酸残基组成,包括PDZ(PSD-95/Dlg/ZOI同源区)结合序列(Thr/Ser-X-Val-COOH)和2个PEST序列(350~375,376~396),对于调节自身的稳定性和酶活性具有重要作用。研究表明PEST序列与蛋白质降解有关,PDZ结合位点与细胞生长调控有关。PDZ区在肿瘤的发生中也可以缺失突变,虽不影响磷酸酶功能,但对肿瘤细胞铀定非依赖性生长的抑制作用显著降低。 PTEN是迄今发现的第一个具有双特异(dual specificity)磷酸酶活性的抑癌基因,其编码产物PTEN具有磷脂酰肌醇-3,4,5-三磷酸3-磷酸酶活性,催化水解磷脂酰肌醇-3,4,5-三磷酸(PIP3)的3磷酸成为PIP2,而PIP3是胰岛素、表皮生长因子等细胞生长因子的信号转导分子,从而抑制PI3K/AKT信号通路,起到负性调节细胞生长增殖的作用(图22-4)。PTEN也能催化黏着斑激酶(focal adhesion kinase,FAK)的去磷酸化反应,而抑制由整联蛋白(integrin)介导的细胞铺展和迁移,因而PTEN的失活也与肿瘤细胞的转移密切相关。 生长因子等细胞外信号 细胞膜 •♦♦•••/、.,,--、胞生长增殖等四、肿瘤发生发展涉及癌基因和抑癌基因的共同参与目前普遍认为肿瘤的发生、发展是多个原癌基因和抑癌基因突变累积的结果,经过起始、启动、促进和癌变几个阶段逐步演化而产生。 (—)肿瘤发生发展涉及多种相关基因的改变 在基因水平上,或通过外界致癌因素,或由于细胞内环境的恶化,突变基因数目增多,基因组变异逐步扩大;在细胞水平上则要经过永生化、分化逆转、转化等多个阶段,细胞周期失控细胞的生长特性百{t:逐步得到强化。结果是相关组织从增生、异型变、良性肿瘤、原位癌发展到浸润癌和转移癌。例如,结肠癌的发生发展过程涉及数种基因的变化(图22-5):心上皮细胞过度增生阶段:涉及家族性腺瘤性息肉基因FAP(familial adenomatous polyposis)、结肠癌突变基因MCC(mutated in colorectal carcinoma)的突变或缺失;@早期腺瘤阶段:与DNA的低甲基化有关;@中期腺瘤阶段:涉及K-RAS基因突变;@晚期腺瘤阶段:涉及结肠癌缺失基因DCC的丢失;@腺癌阶段:涉及TP53基因缺失;@转移癌阶段:涉及NM23(nonmetastatic protein23)基因的突变、血管生长因子基因表达增高等。 APC基因K-RAS DC嘎因 双拷贝失活基因突变双拷贝丢失TP53丢失其他改变 正常结肠早期腺瘤中期腺瘤晚期腺瘤肿瘤转移 上皮细胞(仍为良性)昙 (二)细胞周期和细胞凋亡的分子调控是肿瘤进展的关键1.原癌基因和抑癌基因是调控细胞周期进程的重要基因细胞周期调控体现在细胞周期驱动和细胞周期监控两个方面,后者的失控与肿瘤发生发展的关系最为密切。细胞周期监控机制由DNA损伤感应机制、细胞生长停滞机制、DNA修复机制和细胞命运决定机制等构成。细胞一旦发生DNA损伤或复制错误,将会启动DNA损伤应激机制(见第十三章),经由各种信号转导途径使细胞停止生长,修复损伤的DNA。如果DNA损伤得到完全修复,细胞周期可进入下一个时相,正常完成一个细胞分裂周期;倘若DNA损伤修复失败,细胞凋亡机制将被启动,损伤细胞进入凋亡,从而避免DNA损伤带到子代细胞,维持了组织细胞基因组的稳定性,避免肿瘤发生的潜在可能。 肿瘤细胞的最基本特征是细胞的失控性增殖,而失控性增殖的根本原因就是细胞周期调控机制的破坏,包括驱动机制和监控机制的破坏。监控机制破坏可发生在损伤感应、生长停滞、DNA修复和凋亡机制的任何一个环节上,结果将导致细胞基因组不稳定,突变基因数量增加,这些突变的基因往往就是癌基因和抑癌基因。同时,很大一部分的原癌基因和抑癌基因又是细胞周期正常细胞调控机制的组成部分。因此,在肿瘤发展过程中,监控机制的异常会使细胞周期调控机制进一步恶化,并导致细胞周期驱动机制的破坏,细胞周期的驱动能力异常强 DNA修复DNA损伤 A修复DNA修复缺陷化,细胞进入失控性生长状态,从而细胞出基因失活失败千——-抑癌基因缺陷体细胞基因突变 现癌变性生长。2.原癌基因和抑癌基因还是调控细 -l-`胞凋亡的重要基因细胞除了生长、增殖`和分化等之外,还存在细胞死亡现象,如程序性细胞死亡或凋亡。有些抑癌基因的过量表达可诱导细胞发生凋亡,而与细胞生l存相关的原癌基因的激活则可抑制凋亡,细胞增殖>细胞死亡细胞凋亡异常与肿瘤的发生发展密切相关肿瘤细胞(图22-6)。现已明确,细胞凋亡在肿瘤发吓己生、胚胎发育、免疫反应、肿瘤免疫逃逸、神图22七促进正南细胞向肿瘤细胞转化的因素经系统发育、组织细胞代谢等过程中起重要作用。 值得注意的是,近年来的研究也发现,一些非编码RNA,如miRNA,在肿瘤发生过程中也具有重要作用。总之,肿瘤分子生物学的进展已经深刻地改变了人们对肿瘤发生和生命现象的认识,并使肿瘤研究从以揭示肿瘤病因和寻找肿瘤治疗方法为目的的单项研究,转变为以研究整个生命现象和全面揭示生命分子机制为目的的综合性系统研究。肿瘤分子生物学必将在整个生命医学研究中发挥越来越重要的作用。 癌基因是能导致细胞发生恶性转化和诱发癌症的基因。绝大多数癌基因是细胞内正常的原癌基因突变或表达水平异常升高转变而未,某些病毒也携带癌基因。在物理、化学及生物因素的作用下,从原癌基因转变为具有促进细胞恶性转化(癌变)的致癌基因的过程称为原癌基因活化。原癌基因活化主要有基因突变、基因扩增、染色体易位、启动子或增强子获得等机制。生长因子是一类由细胞分泌的、类似于激素的信号分子,主要为肤类或蛋白质类,通过受体跨膜信号转导途径调节细胞的生长与分化,与多种生理及病理状态(如肿瘤、心血管疾病等)有关。不少生长因子已经应用于临床疾病的治疗。原癌基因编码的蛋白质涉及生长因子信号转导的多个环节。抑癌基因,也称肿瘤抑制基因,是防止或阻止癌症发生的基因,抑癌基因的部分或全部失活可显著增加癌症发生风险。抑癌基因对细胞增殖起负性调控作用,包括抑制细胞增殖、调控细胞周期栓查点、促进凋亡和参与DNA损伤修复等。抑癌基因的失活机制包括基因突变、杂合性丢失和启动子甲基化等。肿瘤的发生发展是多个原癌基因和抑癌基因突变累积的结果,经过起始、启动、促进和癌变几个阶段逐步演化而产生。 l.什么是癌基因?原癌基因的活化方式有哪些? 2.什么是生长因子?简述原癌基因与生长因子信号转导的关系? 3什么是抑癌基因?抑癌基因的失活方式有哪些? (卜友泉) 第五篇 医学分子生物学专题 本篇介绍几项与医学相关的重要分子生物学技术原理和作为目前研究热点的组学。包括DNA重组和重组DNA技术、常用分子生物学技术、疾病相关基因检测、基因诊断和基因治疗以及组学和医学,共五章。 疾病和基因的关系始终是医学最为关注的问题。20世纪40年代,L. Pauling提出了“分子病”的概念,1956年,V. Ingram发现血红蛋白B链第六位的谷氨酸突变为继氨酸是导致锁状细胞贫血的原因,J. Lejeune发现Down综合征是由于21号染色体三倍体异常所致,此后,一系列染色体疾病的病因得到解析。随着人类基因组计划的完成,新的DNA标记的发现,使研究常见病的遗传因素成为了可能。2005年,首次用全基因组关联分析(GWAS),确定了老年性黄斑变性的相关基因,此后,一系列的常见多发疾病基因的GWAS研究,丰富了人们对常见疾病病因和发病机制的认识,同时也为分子诊断、分子靶向干预提供了靶点。 疾病和基因关系的确定,依赖于分析基因结构和功能的方法。F. Sanger分别在1958年和1980年,建立了蛋白质氨基酸序列和DNA核昔酸序列的测定技术,开启了对蛋白质和基因一级结构的认识过程。1975,E. Southern建立了印迹技术,随后衍生出了多种定性和定量的印迹技术、杂交技术和芯片技术等。1983年,E. Mullis建立了聚合酶链反应技术,解决了难以获得大量特异目的DNA的技术瓶颈。1972年,P. Berg获得了第一个重组DNA分子,此后,分子克隆技术得到了广泛的应用。 精准诊断、精准治疗和精准预防依赖于分子水平的诊治。1961年,R. Guthrie建立新生儿苯丙酮尿症的诊断方法,由于早期的确定诊断,避免了苯丙氨酸摄入,使患儿可以健康成长。1978年,华裔科学家简悦威(Kan YW)应用DNA多态性的标记,成功地在产前诊断了锁状细胞贫血,开启了基因诊断的先河。1990年,F. Anderson将正常腺昔脱氨酶(ADA)基因,以逆转录病毒为载体导入到患儿的淋巴细胞中,回输患儿,免疫功能得到持续的恢复,成为真正意义的基因治疗。随着对基因治疗载体等深入了解,加之诸如以CRISPR/Cas9为代表基因编辑技术的发展,人们对基因治疗寄予厚望。 (吕社民) 第二十三章DNA重组和重组DNA技术 DNA重组(DNA recombination)是指DNA分子内或分子间发生的遗传信息的重新共价组合过程,包括同源重组、位点特异性重组和转座重组等类型,广泛存在千各类生物,构成了生物的基因变异、物种进化或演变的遗传基础;体外通过人工DNA重组可获得重组体DNA,是基因工程中的关键步骤。重组DNA技术(recombinant DNAtechnology)是指通过体外操作将不同来源的两个或两个以上DNA分子重新组合,并在适当细胞中扩增形成新的功能分子的技术。重组DNA技术可组合不同来源的DNA序列信息,从而创造自然界以前可能从未存在过的遗传修饰生物体,为在分子水平上研究生物奥秘提供了可操作的活体模型。 第一节自然界的DNA重组和基因转移 DNA重组是两个或两个以上DNA分子重新组合形成一个DNA分子的过程;而自然界中的基因转移泛指DNA片段或基因在不同生物个体或细胞间的传递过程,其中通过繁殖使DNA或基因在亲代和子代间的传递称作基因纵向转移,打破亲缘关系以直接接触、主动摄取或病毒感染等方式使基因在不同生物个体或细胞间、细胞内不同细胞器间的传递称作基因横向(水平)转移。自然界不同物种或个体之间的DNA重组和基因转移是经常发生的,这增加了群体的遗传多样性,也通过优化组合积累了有意义的遗传信息。 DNA重组和基因转移的方式有多种,包括同源重组、位点特异性重组、转座重组、接合、转化和转导等,其中前三种方式在原核和真核细胞中均可发生,后三种方式通常发生在原核细胞。新近研究发现细菌还有一种DNA整合机制,称作成簇规律间隔短回文重复(clustered-regulru·ly interspaced palindromic repeats, CRISPR)I Cas系统。 —、同源重组是最基本的DNA重组方式 同源重组(homologous recombination)是指发生在两个相似或相同DNA分子之间核昔酸序列互换的过程,又称基本重组(general recombination)。在哺乳动物配子发生的减数分裂过程中,同源重组可产生DNA序列的新重组,标示着后代的遗传变异;不同种属的细菌和病毒也在水平基因转移中用同源重组互换遗传物质。具有同源序列的两条DNA链通过断裂和再连接引起DNA单链或双链片段的交换。同源重组的缺陷与人类癌症高度相关,例如,两个相似的抑癌基因brcal和brca2编码的蛋白质BRCA l和BRCA2与同源重组的发生有关,BRCA2的功能是帮助同源重组的起始,缺乏brcal和brca2的细胞同源重组率减少,对电离辐射的敏感性增加,因此,缺乏brcal和brca2的个体易于患乳腺癌和卵巢癌等。利用同源重组的原理进行基因敲除或基因敲入(也称基因打靶),是将遗传改变引入靶生物体的一种有效方式。为了便于读者理解基本的同源重组原理,下面主要介绍Holliday模式的同源重组,并以细菌的RecBCD同源重组作为Holliday同源重组的例子。 (—)Holliday模型是最经典的同源重组模式 同源重组作为自然界最基本的DNA重组方式,不需要特异DNA序列,而是依赖两分子之间序列的相同或相似性。R. Holliday于1964年提出Holliday模型,对于认识同源重组起着十分重要的作用。在这一模型中,同源重组主要经历四个关键步骤(图23-1):CD两个同源染色体DNA排列整齐;@-个DNA的一条链断裂,与另一个DNA对应链连接,在这个过程中形成了十字形结构,称作Holliday连接(Holl iday j u nction);@通过分支移动(branch migration)产生异源双链DNA(heteroduplex DNA),也称Holliday中间体(inter-mediate);@)将Holliday中间体切开并修复,形成两个双链重组体DNA。Holliday中间体切开方式不同,所得到的重组产物也不同:如果切开的链与原来断裂的是同一条链,重组体含有一段异源双链区,其两侧来自同一亲本DNA,称为片段重组体(patch recombinant);如果切开的链并非原来断裂的链,重组体异源双链区的两侧来自不同亲本DNA,称为拼接重组体(splice recombinant)。 \"口}两个同源 DNA分子 j切除正5'-端DNA序列 断裂口3'-端侵入正常同源双链中Holliday连接 a j DNA连接酶封口 Holliday中间体 水平分离垂直分离I 片段重组体拼接重组体 422第五篇医学分子生物学专题 (二)RecBCD模式是大肠埃希菌的Holliday同源重组目前对大肠埃希菌(E. coli)的DNA同源重组分子机制了解最清楚。参与细菌DNA同源重组的酶有数十种,其中最关键的是RecA蛋白、RecBCD复合物和RuvC蛋白。1参与细菌RecBCD同源重组的酶细菌的RecBCD同源重组由以下酶和酶复合物催化完成2. E coli的RecBCD同源重组过程E. co li的RecBCD同源重组过程如图23-2:RecBCD复合物识别双链断裂的断裂口平端或近似平端,然后向上游边移行边解链;当遇到C加位点时,在3I单链上切开产生单链切口;RecA蛋白催化3仁单链DNA对另一双链DNA的侵入,并与其中的一条链交叉,继而交叉分支移动,待相交的另一链在RecBCD内切酶活性催化下断裂后,由DNA连接酶交换连接缺失的远末端,形成Holliday中间体;此中间体再经RuvC切割和DNA连接酶的连接,最后完成重组。 二、位点特异性重组是发生在特异位点间的DNA整合位点特异性重组(si te specific recombinati on)是指发生在至少拥有一定程度序列同源性片段间DNA链的互换过程,也称保守的位点特异性重组(conservative site-specific recombination)。位点特异性重组酶(site-specific recombinase, SSR)通过识别和结合DNA短序列(位点)使DNA片段发生重排。该类重组广泛存在于各类细胞中,起着十分重要的作用,如某些基因表达的调节、发育过程中程序性DNA重排以及有些病毒和质粒DNA复制循环过程中发生的整合和切除等。以下是位点特异性重组的例子。 (-)入噬菌体DNA可与宿主染色体DNA发生整合 入噬菌体DNA的整合是在入噬菌体的整合酶催化下完成的,是入噬菌体DNA与宿主染色体DNA特异靶位点之间的选择性整合(图23-3)心噬菌体DNA的重组位点att P与大肠埃希菌基因组DNA的重组位点att B之间有15bp核心序列相同,在整合酶(In t)和整合宿主因子(IHF)作用下可发生整合,由Xis参与切除过程。通常这种由整合酶催化的DNA整合是十分特异而有效的。逆转录病毒整合酶可特异地识别、整合逆转录病毒cDNA的长末端重复序列(lo n g terminal repeat, LTR)。 (二)基因片段倒位是细菌位点特异性重组的一种方式以鼠伤寒沙门菌H抗原编码基因中H片段重组为例。鼠伤寒沙门菌的H抗原有两种,分别为H1和H2鞭毛蛋白。在单菌落的沙门菌中经常出现少数另一种含H抗原的细菌,这种现象称为鞭毛相转变。遗传分析表明,这种抗原相位的改变是由基因中一段995bp的H片段发生倒位所致。如图23-4所示,H片段的两端为14bp的特异性重组位点(h ix),其方向相反,发生重组后可使H片段倒位。 H片段上有两个启动子(P),其一驱动hin基因表达,另一个驱动H2和rHl基因表达,倒位后H2和!RecBCD结合到断裂口的断端(钝端或近似钝端)5'—--·衄iRecBDC向上滑行,DNA解旋,双链打开i解旋后的DNA单链末蜘且火,单链区形成“loop"RecA核蛋白丝iRec战支载到3'-单链上千了?孟饮同源染色体DNA的双链(Rec2:已勹om)/\Non-:巴亡copy)亏. 二入-噬菌体DNA gaJ+-attB hio+E. coli染色体DNA j入-噬菌体DNA整合到宿玉色体中 一I叫一 溶源噬菌体图23-3入噬菌体DNA与大肠埃希菌基因组DNA的位点特异性重组图23-4沙门菌H片段倒位决定鞭毛相转变hix为14bp的反向重复序列;rHl为Hl阻遏蛋白编码基因;P代表启动子rHJ基因不表达。加n基因编码特异的重组酶,即倒转酶(invertase)Hin,该酶为同源二聚体,分别结合在两个h ix位点上,并由辅因子凡s(factor for inversion stimul ation)促使DNA弯曲而将两个hix位点连接在一起,DNA片段经断裂和再连接而发生倒位。rHl表达产物为Hl阻遏蛋白,当H2基因表达时,rHl也表达,从而使HJ基因被阻遏;反之,H2基因不表达时,rHJ也不表达,HJ基因阻遏被解除。 (三)免疫球蛋白基因以位点特异性重组发生重排免疫球蛋白编码基因V-(D)-J重排及T细胞受体基因V-(D)-J重排都是利用位点特异性重组的原理。 三、转座重组可使基因位移 转座重组(transpos山onal recombination)或转座(transposition)是指由插入序列和转座子介导的基因移位或重排。(-)插入序列是最简单的转座元件插入序列(insertion sequence, IS)是指能在基因(组)内部或基因(组)间改变自身位置的一段DNA序列。通常是转座子的一种,只携带与自身转座有关的编码基因,具有独特的结构特征:两端是反向重复序列(inverted repeat, IR),中间是一个转座酶(transposase)编码基因,后者的表达产物可引起IS转座。典型的IS两端各一个9~4lbp的反向重复序列,反向重复序列侧翼连接有短的(4~12bp)、不同的IS所特有的正向重复序列。IS发生的转座有保守性转座(conservative transposition)和复制性转座(duplicative transposition)两种形式,前者是IS从原位迁至新位(图23-5),后者是IS复制后的一个复制本迁至新位。 白蛋 424第五篇医学分子生物学专题H片段 Hin倒转酶H濂毛蛋白 归一 j重组位点靠近 插入序列: j转座 正向重复序列 反向重复序列反向重复序列 间之 列点列 重两重五 向的向 芦正 形复后到制入复插列列 妇三 (IS),除有与转座有关的编码基两边侧翼序列是插入序列一个中心区域itTn)即有转座子(cosempo,,囚! 转座子(transposon, Tn)是指能将自身或其拷贝插入基因组新位置的DNA序列,一般属于复合型因外,还携带其他基因如抗生素抗性基因等(图23-6)。Tn普遍存在于原核和真核细胞中,不但可以在一条染色体上移动,也可以从一条染色体跳到另一条染色体上,甚至从一个细胞进入另一个细胞。 Tn在移动过程中,DNA链经历断裂及再连接的过程,可能导致某些基因开启或关闭,引起插入突变、新基因生成、染色体畸变及生物进化。 转座酶基因国 IR"转座酶基因l阻遏蛋白I P-内酰胺酶I IR Fef-R基因产.................A.....--------------,曰ISIO叫jemA盐必兰l lemB|jemC巳IS10曰(a)IS:转座酶编码基因两侧连接反向重复序列(IR);(b)转座子Tn3:含有转座酶、B-内酰胺酶及阻遏蛋白编码基因;(c)转座子TnlO:有两个1S10,其中只有一个编码有功能的转座酶;ISIO之间有5个基因(简称Fej-R基因),其中位于TnlO中间tetA和tetR是四环素抗性基因,另外3个基因jemA、jemB和jemC的功能尚不清楚四、原核细胞可通过接合、转化和转导进行基因转移或重组原核细胞(如细菌)可通过细胞间直接接触(接合作用)、细胞主动摄取(转化作用)或噬菌体传递(转导作用)等方式进行基因转移或重组。(—)接合作用是质粒DNA通过细胞间相互接触发生转移的现象接合作用(conjugation)是指细菌的遗传物质在细菌细胞间通过细胞-细胞直接接触或细胞间桥样-. 426第五篇医学分子生物学专题 连接的转移过程。当细菌通过鞭毛相互接触时,质粒DNA就可以从一个细菌转移至另一细菌,但并非任何质粒DNA都有这种转移能力,只有某些较大的质粒,如F因子(F facto1),方可通过接合作用从一个细胞转移至另一个细胞。F因子决定细菌表面鞭毛的形成,当含有F因子的细菌(F细菌)与没有F因子的细菌(F细菌)相遇时,在两细菌间形成性鞭毛连接桥,接着质粒双链DNA中的一条链会被酶切割,产生单链切口,有切口的单链DNA通过鞭毛连接桥向F细胞转移,随后,在两细胞内分别以单链DNA为模板合成互补链。 (二)转化作用是受体细胞自主摄取外源DNA并与之整合的现象转化作用(transformation)是指受体菌通过细胞膜直接从周围环境中摄取并掺入外源遗传物质引起自身遗传改变的过程,受体菌必须处千敏化状态,这种敏化状态可以通过自然饥饿、生长密度或实验室诱导而达到。例如,当溶菌时,裂解的DNA片段作为外源DNA被另一细菌(受体菌)摄取,受体菌通过重组机制将外源DNA整合至其基因组上,从而获得新的遗传性状,这就是自然界发生的转化作用。然而,由于较大的外源DNA不易透过细胞膜,因此,自然界发生转化作用的效率并不高,染色体整合概率则更低。 (三)转导作用是病毒将供体DNA带入受体并与之染色体发生整合的现象转导作用(transduction)是指由病毒或病毒载体介导外源DNA进入靶细胞的过程。自然界中常见的例子是噬菌体介导的转导,包括普遍性转导(generalized transduction)和特异性转导(speci alized transduction),后者又称为限制性转导(restricted transduction)。 1.普遍性转导的基本过程当噬菌体在供体菌内包装时,供体菌自身的DNA片段被包装入噬菌体颗粒,随后细菌溶解,所释放出来的噬菌体通过感染受体菌而将所携带的供体菌DNA片段转移至受体菌中,进而重组千受体菌的染色体DNA上。 2特异性转导的基本过程当噬菌体感染供体菌后,噬菌体DNA以位点特异性重组机制整合千供体菌染色体DNA上;当整合的噬菌体DNA从供体菌染色体DNA上切离时,可携带位千整合位点侧翼的DNA片段,随后切离出来的噬菌体DNA被包装入噬菌体衣壳中;供体菌裂解,所释放出来的噬菌体感染受体菌,继而,携带有供体菌DNA片段的噬菌体DNA整合于受体菌染色体DNA的特异性位点上。这样,位于整合位点侧翼的供体菌DNA片段重组至受体菌染色体DNA上。 五、细菌可通过CRISPR/Cas系统从病毒获得DNA片段作为获得性免疫机制CRISPR/Cas系统(CRISPR/Cas system)是原核生物的一种获得性免疫系统,用于抵抗存在于噬菌体或质粒的外源遗传元件的入侵。关于细菌的CRISPR/Cas系统的发现过程可参看数字扩展相关内容。(-)CRISPR序列的结构特征成簇规律间隔短回文重复(cluste red regularly interspaced palindromic repeats, CRISPR)座CRISPR loci)是指细菌基因组上成簇排列的、由来自噬菌体DNA的间隔序列(spacer)和宿主菌基因组的重组序列所形成的特殊重复序列-间隔序列阵列,与Gas基因(CRISPR-associated gene, Cas gene)相邻(图23-7)。CRISPR存在千已测序的40%细菌基因组和90%古细菌(archaea)基因组中。 重复序列 尸一一一一一一一一一一一一一一一一1 固23-7CRISPR座结构特征 (二)外源DNA可插入宿主基因组的CRISPR座 以噬菌体感染为例。当噬菌体感染宿主菌后,噬菌体DNA进入宿主细胞并复制,复制所产生的DNA片段可以被宿主细胞的Casl-Cas2复合物捕获。然后,Casl-Cas2复合物将所捕获的DNA片段插入到宿主基因组CRISPR座位的第一个位点,Casl在此过程中协调切割-连接反应,即在重复序列5I端切开,然后与DNA片段的3'-端连接(图23-8)。这种机制在跨越插入的DNA片段两端的重复序列上产生两个单链DNA缺口,最后由DNA聚合酶将缺口封闭。 53,l-\35/,'/__靶向性复合物 病毒复制时产生的DNA片段= Casl-Cas2复合物-DNA片段靶向CRISPR座位的第一个位点,Cas劝:重复序列-1(Rl)的5'-端Casl-Cas2/z-\切开单链复合物/,切\/引导序列点,,,,/5'3'\、-./'3'5'间隔序列(S)的:'-端与重妞列(R)的5'端连y了』新间隔序列(新S)插入CRISP瞳醴分位点,重复序列按另一条单链上的模板序列复制补齐,并在新S前5,复制出新的重复序列(新R),缺口由DNA聚合酶封闭35',3呵引导序列....——-鲁新S S1R2(Leader)(三)CRISPR/Cas系统是细菌的获得性免疫机制CRISPR/Cas系统是指由Cas基因编码的Cas蛋白催化CRISPR形成,以及CRISPR转录产物与Cas蛋白相配合介导入侵DNA切割的机制,并成为细菌抵抗病毒感染的一种获得性免疫机制。根据Cas蛋白的功能可将其分为三型,即I型、Il型和III型,其中Il型CRISPR/Cas9系统是目前应用最多的。 以Il型CRISPR/Cas9系统为例介绍CRISPR/Cas系统的工作原理(图23-9)=n型系统中由重复序列及间隔序列(spacer)组成的CRISPR座位经转录产生CRISPR-RNA(crRNA)前体(pre-crRNA)和tracrRNA(trans-encoded crRNA); tracrRNA与pre-erRNA的重复序列区互补配对产生局部双链RNA(dsRNA);RNase III识别并切割dsRNA产生向导crRNA(g uide crRNA, gcrRNA);宿主细胞表达的Cas9核酸酶与gcrRNA结合形成Cas9-crRNA复合物;当含有相同间隔序列的噬菌体或质粒再次入侵时,Cas9-crRNA复合物与入侵DNA上的原间隔序列(protospacer)互补配对形成由protospacer/crRNA组成的R-环双链结构,Cas9识别并切割R-环,从而在入侵者的基因组上产生切口。Cas9切割的靶序 列下游有一个紧邻原间隔序列基序(protospacer-adjacentmotif, PAM),可能对于Cas9寻找靶序列有一定作用。CRISPR/Cas9系统是一种细菌防御病毒和质粒攻击的获得性免疫机制,目前已经被开发成 \一种应用最多的高效率、低脱靶率的基因组编辑(genome editing)技术。 428第五篇医学分子生物学专题 引导序列tracrRNA Cas9(leader)CRISPR座 基因 --~一--·-.一一、、、、l gcrRNA-Cas9复合物靶向 人侵DNA的靶序列 R-环\义 gcrRNA-Cas9复合物 靶序列;、---j-"'PAM`割后的靶序列出现缺口重组DNA技术又称分子克隆(molecular cloning)、DNA克隆(DNA cloning)或基因工程(genetic engineering),是指通过体外操作将不同来源的两个或两个以上DNA分子重新组合,并在适当细胞中扩增形成新功能DNA分子的方法,其主要过程包括:在体外将目的DNA片段与能自主复制的遗传元件(又称载体)连接,形成重组DNA分子,进而在受体细胞中复制、扩增及克隆化,从而获得单一DNA分子的大量拷贝。在克隆目的基因后,还可针对该基因进行表达产物蛋白质或多肤的制备以及基因结构的定向改造已。自1972年成功构建第一个重组DNA分子以来,重组DNA技术得到了快速发展,人们几乎可以随心所欲地分离、分析、切割-连接等操作基因。另外,该技术在生物制药、基因诊断、基因治疗等诸多方面都得到了广泛应用。 一、重组DNA技术中常用的工具酶 在重组DNA技术中,常需要一些工具酶用于基因的操作。例如,对目的DNA(target DNA)进行处理时,需利用序列特异性限制性核酸内切酶(restri ction endonuclease, RE), RE在准确的位置切割DNA,使较大的DNA分子成为一定大小的DNA片段;构建重组DNA分子时,必须在DNA连接酶催化下才能使DNA片段与载体共价连接。此外,还有一些工具酶也是重组DNA时所必不可少的。 (一)常用工具酶具有各自功能为了方便快速浏览重组DNA技术中一些常用工具酶及其基本功能,我们将一些常用工具酶概括flt~il.于表23-1。在所有工具酶中,RE具有特别重要的地位,因此,有关RE的内容单独介绍。 工具酶功能RE识别特异序列,切割DNA DNA连接酶催化DNA中相邻的5'-磷酸基团和3'-胫基末端之间形成磷酸二酣键,使DNA切口封合或使两个DNA分子或片段连接起来DNA聚合酶I具有5'-+3'聚合、3'一5'外切及5'-+3'外切活性,用于合成双链cDNA分子或片段连接;缺口平移法制作高比活性探针;DNA序列分析;填补3'末端Klenow片段又名DNA聚合酶I大片段,具有完整DNA聚合酶I的5'-+3'聚合及3'-+5'外切活性,但缺乏5'-+3'外切活性。常用于cDNA第二链合成、双链DNA的3'-端标记等逆转录酶是以RNA为模板的DNA聚合酶,用于合成cDNA,也用于替代DNA聚合酶I进行缺口填补、标记或DNA序列分析等多聚核昔酸激酶催化多聚核昔酸5'-胫基末端磷酸化或标记探针等末端转移酶在3仁胫基末端进行同质多聚物加尾碱性磷酸酶切除末端磷酸基团(二)限制性核酸内切酶是最重要的工具酶限制性核酸内切酶(RE)简称为限制性内切酶或限制酶,是一类核酸内切酶,能识别双链DNA分子内部的特异序列并裂解磷酸二酷键。除极少数RE来自绿藻外,绝大多数来自细菌,与相伴存在的甲基化酶共同构成细菌的限制-修饰体系(restriction mod山cation system), RE对甲基化的自身DNA分子不起作用,仅对外源DNA切割,因此对细菌遗传性状的稳定具有重要意义。 3'方向的序列完全一致。例如,EcoR I的识别序列,在两条链上的5I----+3'序列均为GAAITC。 RE识别位点RE识别位点Apa I GGGCC'C Sma I CCC'GGG C'CCGGG GGG'CCC BamH I G'GATCC Sau3A I GATC'CCTAG'G CTAG Pst I CTGCA'G Not I GC'GGCCGC G'ACGTC CGCCGG'CG EcoR I G'AAITC Sfi I GGCCNNN'NGGCC CTIAA'G CCGGN'NNNCCGG'代表切割位点,N代表任意碱基\(?e@430第五篇医学分子生物学专题二、重组DNA技术中常用的载体载体(vector)是为携带目的外源DNA片段、实现外源DNA在受体细胞中无性繁殖或表达蛋白质所采用的一些DNA分子,按其功能可分为克隆载体和表达载体两大类,有的载体兼有克隆和表达两种功能。 (一)克隆载体用于扩增克隆化DNA分子 克隆载体(cloning vector)是指用于外源DNA片段的克隆和在受体细胞中扩增的DNA分子,一般应具备的基本特点:O至少有一个复制起点使载体能在宿主细胞中自主复制,并能使克隆的外源DNA片段得到同步扩增;@至少有一个选择标志(selection marker),从而区分含有载体和不含有载体的细胞,如抗生素抗性基因、B-半乳糖昔酶基因(lacZ汃营养缺陷耐受基因等;@有适宜的RE单一切点,可供外源基因插入载体。常用克隆载体主要有质粒、噬菌体DNA等。 1.质粒克隆载体质粒克隆载体是重组DNA技术中最常用的载体,可以是天ampR然质粒,更多是人工改造的质粒。质粒是Hind1ll细菌染色体外的、能自主复制和稳定遗传Sph I的双链环状DNA分子,具备作为克隆载体Pstl的基本特点包。例如,pUC18质粒载体,Sa II,Ace I,Hine II具有一个复制起点ori,一个选择标志——Xbal氨茉青霉素抗性基因ampR,多个单一酶切BamHJ位点,也称多克隆酶切位点(multiple Sma I,Xmal cloning sites, MCS)(图23-10)。Kpn I2.噬菌体DNA载体入和M13噬Sac I菌体DNA常用作克隆载体。稍早经入噬EcoR I菌体DNA改造的载体系统有入gt系列(插入型载体,适用于cDNA克隆)和EMBL系图23-10pUC18质粒克隆载体图谱列(置换型载体,适用于基因组DNA克隆);经改造的M13载体有M13mp系列和pUC系列,它们是在M13的基因间隔区插入了大肠埃希菌(E. coli)的一段调节基因及B-半乳糖昔酶(LacZ)N-端146个氨基酸残基编码基因,其编码产物为B-半乳糖昔酶的Q片段。突变的E.coli宿主(lac-)仅表达该酶的Q片段(酶的C-端)。单独存在B-半乳糖昔酶的Q片段或o片段都没有酶的活性,只有携带Q片段基因的Ml3进入宿主细胞,宿主细胞才能同时表达Q和Q片段,产生有活性的B-半乳糖昔酶,使特异性底物变为蓝色化合物,这就是所谓的a互补(ex complementation)。当外源基因的插入位点设计在LacZ基因内部时,外源基因的插入则会干扰LacZ的表达,利用lacz-菌株为宿主细胞,在含Lacz底物X-gal和诱导剂IPTG的培养基上生长时会出现白色菌落;如果在lacZ基因内无外源基因插入,则有Lacz表达,转化菌在同样条件下呈蓝色菌落,这就是蓝白筛选。现在,很多质粒载体也构建了蓝白筛选系统。 3.其他克隆载体为增加克隆载体携带较长外源基因的能力,还设计有柯斯质粒(cosmid)载体(又称黏粒载体)、细菌人工染色体(bacterial artificia l chromosome, BAC)载体和酵母人工染色体(yeast artific ial chromosome, YAC)载体等。柯斯质粒是人工构建的含入DNA Cos序列和质粒复制子的特殊类型质粒载体,自身分子量一般只有5~7kb,但能携带的外源DNA片段最大可达45kb。BAC是以大肠埃希菌性因子F质粒为基础构建的克隆载体,可携带的外源DNA片段在50-300kb之间。YAC是含酵母染色体上必需的端粒、着丝点和复制起始序列的入工构建载体,能携带400kb左右的DNA片段。 (二)表达载体能为外源基因提供表达元件 表达载体(expression vec tor)是指用来在宿主细胞中表达外源基因的载体,依据其宿主细胞的不同可分为原核表达载体(proka1-yotic express ion vector)和真核表达载体(eukaryotic expression vector),它们的区别主要在千为外源基因提供的表达元件。利用表达载体提供的表达元件也可在体外建立无细胞表达体系(cell-free expression system),根据表达载体上的表达元件决定提供原核细胞提取物或真核细胞提取物,其基本工作原理相同于在细胞内。下面简介原核表达载体和真核表达载体的结构特点。 1.原核表达载体该类载体用于在原核细胞中表达外源基因,由克隆载体发展而来,除了具有克隆载体的基本特征外,还有供外源基因有效转录和翻译的原核表达调控序列,如启动子、核糖体结合位点即SD序列(Sh ine-Dalgarno sequ ence汃转录终止序列等。原核表达载体的基本组成如图23-11所示。目前应用最广泛的原核表达载体是E. coli表达载体。 转录方向, 编码序列 二二二GTC/'ITGTAAffG二 -35区-10区起始密码子终止密码子 图23-11原核表达载体的基本框架注:R:调节序列;P:启动子;SD:SD序列;TI:转录终止序列;amp\氨某青霉素抗性基因2.真核表达载体该类载体用于在真核细胞中表达外源基因,也是由克隆载体发展而来的,除了具备克隆载体的基本特征外,所提供给外源基因的表达元件是来自真核细胞的。质粒真核表达载体一般具备的特点包括:心含有必不可少的原核序列,如复制起点、抗生素抗性基因、多克隆酶切位点(MCS)等,用于真核表达载体在细菌中复制及阳性克隆的筛选;@真核表达调控元件,如真核启动子、增强子、转录终止序列、poly(A)加尾信号等;@真核细胞复制起始序列,用于载体或基因表达框架在真核细胞中的复制;@真核细胞药物抗性基因,用千载体在真核细胞中的阳性筛选包。图23-12显示的是真核表达载体的基本组成。根据真核宿主细胞的不同,真核表达载体可分为酵母表达载体、昆虫表达载体和哺乳类细胞表达载体等。 三、重组DNA技术的基本原理及操作步骤 完整DNA克隆过程包括五大步骤(图23-13):心目的DNA的分离获取(分);@载体的选择与准备(选);@目的DNA与载体的连接(连);@重组DNA转入受体细胞(转);@重组体的筛选及鉴定432第五篇医学分子生物学专题原核选压orf uk择标记on真核选择标记P MCS图23-12真核表达载体的基本组成注:0产:原核复制起始序列;P:启动子;MCS:多克隆位点;TT:转录终止序列;ori'气真核复制起始序列。注意不是所有真核表达载体都有整合序列(-)目的DNA的分离获取是DNA克隆的第一步分离获取目的DNA的方法主要有以下几种:载体外源重组DNA分子1.化学合成法该方法可直接合成目的|DNA片段,通常用于小分子肤类基因的合成,转化或转染其前提是已知某基因的核昔酸序列,或能根据。 氨基酸序列推导出相应核昔酸序列。一般先合细菌成两条完全互补的单链,经退火形成双链,然后克隆于载体。 2.从基因组文库和cDNA文库中获取目 今二-, 的DNA关于两种文库的构建和从文库中筛 选目的DNA/cDNA的方法已经基本商业化了, -----------、细菌在培养液 可以根据具体需求从公司订购。 //$彗已[固 3. PCR法PCR是一种高效特异的体外扩增DNA的方法(见第二十四章)国。使用PCR法的前提是:已知待扩增目的基因或DNA筛选含重组片段两端的序列,并根据该序列合成适当引物。 质粒的细菌4.其他方法除上述方法外,也可采用酵母单杂交系统克隆DNA结合蛋白的编码基因,或用酵母双杂交系统克隆特异性相互作用蛋白图23-13以质粒为载体的DNA克隆过程质的编码基因。 (二)载体的选择与准备是根据目的DNA片段决定的进行DNA克隆的目的主要有二:一是获取目的DNA片段,二是获取目的DNA片段所编码的蛋白质。针对第一种目的,通常选用克隆载体;针对第二种目的,需选择表达载体。另外,选择载体时还要考虑目的DNA的大小、受体细胞的种类和来源等因素(表23-3)。除了上述需要考虑的因素外,选择载体时还需要注意载体内应有适宜的单一酶切位点或MCS,以便根据目的DNA片段,对载体进行适当的酶切处理。总之,在重组DNA技术中,载体的选择、准备和改进极富技术性,目的不同,操作基因的性质不同载体的选择和改建方法也不同。 载体插入DNA片段的适宜长度宿主细胞 质粒<5-lOkb----•·',.细菌,酵母入噬菌体DNA载体~20kb----—---------晨门•----细菌黏粒~50kb细菌贮—---一---·咖l-----___---..虹•--..._--」,一·l.擘----千一-..,__--厚_.. YAC~3Mb酵母妇1,注:BAC:bacterial artificial chromosome,细菌人工染色体;YAC:yeast rutificial chromosome,酵母人工染色体(三)目的DNA与载体连接形成重组DNA依据目的DNA和线性化载体末端的特点,可采用不同的连接策略岱。主要连接策略如下:(四)重组DNA转入受体细胞使其得以扩增重组DNA转入宿主细胞后才能得到扩增。理想的宿主细胞通常是DNA/蛋白质降解系统和(或)重组酶缺陷株,这样的宿主细胞称为工程细胞。工程细胞具有较强的接纳外源DNA的能力,可保证外源DNA长期、稳定地遗传或表达。将重组DNA导入宿主细胞的常用方法有如下几种:1.转化转化(transforma tion)是指将外源DNA直接导入细菌、真菌的过程,例如,重组质粒导入大肠埃希菌。然而,只有细胞膜通透性增加的细菌才容易接受外源DNA,这样的细菌称作感受态细胞(competent cells)。实现转化的方法包括化学诱导法(如氯化钙法)、电穿孔(electroporation)法等。此外,将质粒DNA直接导入酵母细胞以及将黏粒DNA导入细菌的过程也称作转化。 434第五篇医学分子生物学专题 2转染转染(transfection)是指将外源DNA直接导入真核细胞(酵母除外)的过程。常用的转染方法包括化学方法(如磷酸钙共沉淀法、脂质体融合法等)和物理方法(如显微注射法、电穿孔法等)。此外,将噬菌体DNA直接导入受体细菌的过程也称作转染。 3.感染感染(infection)是指以病毒颗粒作为外源DNA运载体导入宿主细胞的过程。例如,以噬菌体、逆转录病毒、腺病毒等DNA作为载体构建的重组DNA分子,经包装形成病毒颗粒后进入宿主细胞。 (五)重组体的筛选与鉴定 重组DNA分子导入宿主细胞后,可通过载体携带的选择标记或目的DNA片段的序列特征进行筛选和鉴定,从而获得含重组DNA分子的宿主细胞。筛选和鉴定方法主要有遗传标志筛选法、序列特异性筛选法、亲和筛选法等。 1.借助载体上的遗传标志进行筛选载体上通常携带可供重组体筛选的遗传标志,如抗生素抗性基因等,据此可对含重组DNA的宿主细胞进行筛选。 (1)利用抗生素抗性标志筛选:将含有某种抗生素抗性基因的重组载体转化宿主细胞,然后在含相应抗生素的培养液中培养此细胞,若细胞能在这种条件下生长,则说明细胞中至少应含有导入的载体,但是否是插入目的DNA的载体,还需要进一步鉴定。若细胞中没有载体,则被抗生素杀死。 (2)利用基因的插入失活/插入表达特性筛选:针对某些带有抗生素抗性基因的载体,当目的DNA插入抗性基因后,可使该抗性基因失活。如果还以这种抗生素抗性进行筛选,不能生长的细胞应该是含重组DNA的细胞。以这种方式筛选时,通常载体上携带一个以上筛选标志基因。例如pBR322质粒含有氨茉青霉素抗性基因(ampR)和四环素抗性基因(tet11),如将目的DNA插入tetR中,tetR失活,含重组DNA的细胞只能在含氨苯青霉素的培养基中生长,而不能在含四环素的培养基中生长(图23-14)。 (3)利用标志补救筛选:标志补救(marker rescue)是指当载体上的标志基因在宿主细胞中表达时,宿主细胞通过与标志基因表达产物互补弥补自身的相应缺陷,从而在相应选择培养基中存活。利用该策略可初步筛选含有载体的宿主细胞。例如,S. cere'Visiae酵母菌株,因trpl基因突变而不能在缺少色氨酸的培养基上生长,当转入带有功能性trpl基因(主平板)用ampR和LetR标志筛选含外源DNA的重组子的重组载体后,转化菌则能在色氨酸缺陷的培养基上生长。标志补救也可用于外源基因导入哺乳类细胞后阳性克隆的初筛,例如,当将带有二氢叶酸还原酶(DHFR)基因(dhfr)的真核表达载体导入dhfr缺陷的哺乳类细胞后,则可使细胞在无胸腺晓唗的培养基中存活,从而筛选出带有载体的克隆(DHFR可催化二氢叶酸还原成四氢叶酸,后者可用千合成胸腺啼唗)。 利用a互补筛选携带重组质粒的细菌也是一种标志补救筛选方法。关千a互补原理在本节”重组DNA技术中常用载体”部分已有介绍,在此仅以图23-15概括说明将外源基因插入载体lacZ基因扣I., N-端序列时是如何进行筛选的。 a片段的编码序列被分割 ampR外源DNA MCS 0片段的编码序列被分割 导人细菌 空载体 (4)利用噬菌体的包装特性进行筛选:入噬菌体的一个重要遗传特性就是其在包装时对入DNA大小有严格要求,只有当心NA的长度达到其野生型长度的75%~105%时,方能包装形成有活性的噬菌体颗粒,进而在培养基上生长时呈现清晰的噬斑,而不含外源DNA的单一噬菌体载体DNA因其长度太小而不能被包装成有活性的噬菌体颗粒,故不能感染细菌形成噬斑。根据此原理可初步筛出带有重组入噬菌体载体的克隆。 2.序列特异性筛选根据序列特异性筛选的方法包括RE酶切法、PCR法、核酸杂交法、DNA测序法等。 具体序列和可读框的正确性;针对未知DNA片段,可揭示其序列,为进一步研究提供依据。沁qi}436第五篇医学分子生物学专题.... ....-三三尸膜 依据硝酸纤维素膜上的阳性斑点,在琼脂平板上挑出对应的阳性菌落或噬斑3亲和筛选法亲和筛选法的前提是重组DNA进入宿主细胞后能够表达出其编码产物。常用的亲和筛选法的原理是基于抗原-抗体反应或配体-受体反应。一般做法与上述菌落或噬斑核酸原位杂交相似,只是被检测的靶分子换成吸附于硝酸纤维素膜上的蛋白质,检测探针换成标记的抗体/抗原或配体/受体。 (六)克隆基因的表达 采用重组DNA技术还可进行目的基因的表达,实现生命科学研究、医药或商业目的,这是基因工程的最终目标。基因表达涉及正确的基因转录、mRNA翻译、适当的转录后及翻译后的加工过程,这些过程对于不同的表达体系是不同的。克隆目的基因,进而大量地表达出有特殊意义的蛋白质,已成为重组DNA技术中一个专门的领域,这就是重组蛋白质表达。在蛋白质表达领域,表达体系的建立包括表达载体的构建、宿主细胞的建立及表达产物的分离、纯化等技术和策略。基因工程中的表达系统包括原核和真核表达体系。 (2)重组蛋白质的表达策略:在实际工作中,蛋白质表达策略颇不一致。有时表达目的是为了获得蛋白质抗原,以便制备抗体,此时要求表达的蛋白质或多肤具有抗原性,同时要求表达产物易于分离、纯化。较好的策略是为目的基因连上一个编码标签肤的序列,从而表达为融合蛋白(fusion protein)。在有些情况下,表达的蛋白质多为不溶性的包含体(inclusion body),极易与细菌蛋白质分离。如果在设计融合基因时,在目的基因和标签序列之间加入适当的裂解位点,则很容易从表达的融合分子中去除标签序列。巧妙地设计标签序列还可大大方便表达产物的分离纯化。如果表达的蛋白“4质是为了用千生物化学、细胞生物学研究或临床诊断或基因防治,除分离纯化方便,更重要的是考虑蛋白质的功能和生物学活性。此时,表达可溶性蛋白质往往具有特异的生物学功能;如果表达的是包含体形式,还需要在分离纯化后进行复性或折叠。 2.真核表达体系真核表达体系除与原核表达体系有相似之处外,一般还常有自己的特点。真核表达载体通常含有供真核细胞用的选择标记、启动子、转录和翻译终止信号、mRNA的poly(A)加尾信号或染色体整合位点等。关于真核表达载体的基本组成见图23-12。 真核表达体系有酵母、昆虫、哺乳类细胞等,不仅可以表达克隆的cDNA,也可表达从真核基因组DNA扩增的基因。哺乳类细胞表达的蛋白质通常总是被适当的修饰,而且表达的蛋白质会恰当地分布在细胞内一定区域并积累。因此,采用真核表达体系的优势是:CD具有转录后加工机制;@具有翻译后修饰机制;@表达的蛋白质不形成包含体(酵母除外);@表达的蛋白质不易被降解。当然,操作技术难、费时、费钱是其缺点。 第三节重组DNA技术在医学中的应用 目前,重组DNA技术已广泛应用于生命科学和医学研究、疾病诊断与防治、法医学鉴定、物种的修饰与改造等诸多领域,对医学临床及医学研究的影响日益增大。 一、重组DNA技术广泛应用于生物制药 利用重组DNA技术生产有应用价值的药物是当今医药发展的一个重要方向,有望成为21世纪的支柱产业之一。该技术一方面可用于改造传统的制药工业,如利用该基因可改造制药所需要的工程菌种或创建新的工程菌种,从而提高抗生素、维生素、氨基酸等药物的产量;另一方面利用该技术生产有药用价值的蛋白质/多肤及疫苗抗原等产品,重组人胰岛素是利用该技术生产的世界上第一个基因工程产品。目前上市的基因工程药物已百种以上,表23-4中仅列出部分药物和疫苗。 产品名称主要功能组织纤溶酶原激活剂抗凝血,溶解血栓凝血因子Vlll/IX促进凝血,治疗血友病粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子刺激白细胞生成促红细胞生成素促进红细胞生成,治疗贫血多种生长因子刺激细胞生长于分化生长激素治疗侁儒症胰岛素治疗糖尿病多种白细胞介素调节免疫,调节造血肿瘤坏死因子杀伤肿瘤细胞,调节免疫,参与炎症骨形态形成蛋白修复骨缺损,促进骨折愈合人源化单克隆抗体利用其结合特异性进行临床诊断,肿瘤靶向治疗重组乙肝疫苗(HBsAg VLP)预防乙型肝炎重组HPV疫苗(L1VLP)预防HPV感染重组B亚单位霍乱菌苗口服预防霍乱注VLP:类病毒颗粒;HBsAg:乙肝病毒表面抗原;LI HPV:人乳头瘤病毒衣壳蛋白V`”,"438第五篇医学分子生物学专题利用重组DNA技术,可以让细菌、酵母等低等生物成为制药工厂,也使基因工程细菌成为各类生物基因的储藏所;可以将小鼠杂交瘤细胞人源化,让其产生人源化抗体;可以制造基因工程病毒,使病毒保留免疫原性,缺乏感染性或变成不含核酸的类病毒颗粒(virus-like pm廿cle, VLP)。 二、重组DNA技术是医学研究的重要技术平台 重组DNA技术可用于医学研究的很多方面,诸如遗传修饰动物模型的建立、遗传修饰细胞模型的建立、基因获得或丧失对生物功能的影响等。 1.遗传修饰动物模型的医用研究重组DNA技术可用于遗传修饰动物模型的研制,从而建立人类疾病的动物模型。目前已经建立了诸多人类疾病的遗传修饰动物模型,用于研究癌症、糖尿病、肥胖、心脏病、老化、关节炎等;遗传修饰猪模型的应用,可望增加从猪到人器官移植(pig to human organ ti·ansplantation)的成功率;改造蚊子的基因组,使其产生对疤疾的免疫反应,可望消灭症疾。 2遗传修饰细胞模型在医学研究中的应用重组DNA技术也可用千遗传修饰细胞模型的建立,从而用于基因替代治疗/靶向治疗,或体内示踪。体细胞基因治疗(somatic gene th erapy)已经在X连锁联合免疫缺陷病(X-linked SCID汃慢性淋巴细胞白血病(chronic lyrnphocytic leuke m团,CLL)和帕金森病进行了临床研究,这是在人体上进行遗传工程的研究。改造T淋巴细胞,让其携带嵌合抗原受体(chimeric antigen receptor, CAR),从而达到靶向治疗疾病的CAR-T细胞也是采用重组DNA技术实现的。例如,人T细胞经基因操作成为靶向CD19的CAR-T,用于治疗难治性慢性B淋巴瘤。将绿色荧光蛋白(green fluorescent protein, GFP)与细胞内的某些蛋白相融合,可使细胞变成具有示踪作用的发光细胞。 3.基因及基因功能的获得及丧失的研究基因工程生物或细胞模型可用来发现一些基因的新功能,或发现新基因,一般可通过基因的获得(如转基因)或丧失(如基因敲除)进行研究,也可通过示踪实验(如GFP融合蛋白)研究基因表达产物的定位或相互作用信息等,或通过报告基因(如GFP或催化特定底物的酶)与不同启动子相融合的方法实现对基因表达调控的研究。 三、重组DNA技术是基因及其表达产物研究的技术基础重组DNA技术已经成为基因或基因功能获得或丧失研究的技术基础,也是基因表达产物相互作用研究的技术基础。 1在基因组水平上干预基因重组DNA技术是基因打靶(包括基因敲除和基因敲入)及基因组编辑等的技术基础。例如,基因敲除(gene knock-out),传统的方法是利用同源重组的原理,用目的基因替换基因组上的特定基因,要实现这一目标,需要将目的基因克隆到合适的载体上,并在其两侧加上待敲除基因上的部分序列,使重组DNA进入细胞后能通过同源重组替换基因组的目标基因。条件性基因打靶(conditional gene targeting)是在目的基因两侧构建了Cre重组酶的切割位点。基因组编辑(genome edi ting)是指一类能定向地在基因组上改变基因序列的技术,其中CRISPR/C as9系统是目前应用最多的、脱靶最少的基因组编辑技术,也是细菌抵抗病毒感染的一种获得性免疫机制。利用CRISPR/Cas9基因组编辑技术对特定基因进行改造,也需要在体外构建含导向crRNA(gu ide crRNA, gcrRNA)和Cas9编码基因的重组载体,然后将这种重组载体导入受体细胞,才能实现在基因组水平定向地改变特定基因的目的。 2.在RNA水平上干预基因的功能RNA干扰(RNA interference, RNAi)是通过干扰小RNA(s mall interference RNA, siRNA)与靶RNA结合,从而阻止基因表达的方法。siRNA可以直接采用化学法合成,也可以利用DNA克隆技术构建干扰小发夹RNA,即将编码siRNA反向互补序列和间隔序列(l i nker)克隆入合适的载体,在细胞内转录合成干扰小发夹RNA,实现RNA干扰目的。 3研究蛋白质的相互作用重组DNA技术也是蛋白质相互作用研究的技术基础。例如,酵母.1,L双杂交系统(yeas t two-hybrid system)是利用分别克隆转录因子DNA结合结构域(DNA bindingdomain, DBD)和转录激活结构域(transcription activating domain, TAD)的融合基因,对DBD-融合蛋白和TAD融合蛋白的融合部分的潜在相互作用能力进行研究。 DNA重组是指DNA分子内或分子间发生的遗传信息的重新共价组合过程,包括同原重组、位点特异性重组和转座重组等类型,广泛存在于各类生物。自然界DNA重组方式主要有同原重组、位点特异性重组和转座重组。此外,原核生物还可以接合、转化和转导等作为基因转移的方式。噬菌体在感染细菌后在宿主基因组上留下短序列,从而组成CRISPR(clustered regularly interspaced short pal皿dromic repeats)序列簇,成为细菌防御病毒感朵的重要荻得性免疫机制。 重组DNA技术是指通过体外操作将不同来源的两个或两个以上DNA分子重新组合,并在适当细胞中扩增形成新的功能DNA分子的方法。基本操作包括五步:心荻取目的DNA;@选择和准备栽体;@目的DNA与载体连接;@重组DNA导入受体细胞;@重组体的筛选、鉴定及克隆化。依据载体的不同,重组的目的基因可在原核或真核细胞中表达。限制性核酸内切酶、DNA连接酶等是重组DNA技术常用的重要工具酶。 拟克隆的基因称为目的基因。荻取目的基因的方法包括化学合成、从基因组文库或cDNA文库钓取或PCR扩增等。载体是指能携带目的基因在受体细胞中复制或表达的DNA分子,可分为克隆载体和表达载体。克隆载体应至少具备复制位点、供目的基因插入的单一酶切位点或多克隆酶切位点和筛选标志,表达载体除了具备克隆栽体的一般特征外,还应具备供目的基因在受体细胞中表达的转录单位及必要元件,如真核表达载体的poly(A)加尾信号。筛选和鉴定重组体的方法主要有遗传标志筛选法、序列特异性筛选法、亲和筛选法等。 表达目的基因的体系包括原核表达体系和真核表达体系,两者各具优势和不足。常用的原核表达体系是大肠埃希菌表达体系,操作简便,但缺乏对基因表达产物的加工修饰;常用的真核表达体系有酵母表达体系、昆虫表达体系和哺乳细胞表达体系。 重组DNA技术已经成为基因工程制药的重要技术平台,包括重组蛋白质、重组多肤、重组病毒或类病毒颗粒、人原化单克隆抗体等多种药物都是采用重组DNA技术完成的;重组DNA技术也是医学研究的重要平台技术,遗传修饰的各种模式生物已经成为人类疾病研究的重要模型;重组DNA技术也是基因及其功能研究的技术基础,包括基因打靶、基因组编辑、RNA干扰及蛋白质相互作用等的技术都是以重组DNA技术为基础的。 1.自然界DNA重组无论采用哪种方式,都涉及DNA链的断裂和再连接。从DNA分子的角度思考,链断裂和再连接与DNA分子哪个化学键有关?这个化学键的解离和形成为什么需要酶的参与? 2.设想一下,生物体基因组DNA自发地频繁发生重组,无论是同源重组、位点特异性重组或转座重组,会对生物体产生哪些潜在的影响? 3.生物体基因组可以摄取外源DNA留作已用(如细菌的CRISPR阵列),并进化成为自身的防御机制。请思考一下,细菌利用CRISPR/Cas系统作为荻得性免疫机制,人等哺乳动物是否也需要类似的机制,为什么? 4.重组DNA技术为操作DNA提供了技术平台,针对人基因组中的一个基因序列,如何能成功地用大肠埃希菌表达系统将其编码产物表达出来?(需要考虑原核表达体系的特点、真核基因的结构特点、构建重组DNA的优化方式等。) (王丽颖) 第二十四章常用分子生物学技术的原理及其应用 分子生物学理论研究的突破无一不与分子生物学技术的产生和发展息息相关,可以说两者是科学与技术相互促进的最好例证,即理论上的发现为新技术的产生提供思路,而新技术的产生又为证实原有理论和发展新理论提供有力工具。因此,了解分子生物学技术原理及其用途,对于加深理解现代分子生物学的基本理论和研究现状、深入认识疾病的发生和发展机制、理解和应用新的基于分子生物学而发展起来的诊断治疗策略和药物具有极为重要的意义。为此本章概括介绍目前分子生物学中的一些常用技术及其在医学上的应用。 第一节分子杂交和印迹技术 分子杂交技术利用DNA变性与复性这一基本理化性质,结合印迹技术和探针技术,可进行DNA和RNA的定性或定量分析。 —、分子杂交和印迹技术的原理 分子杂交的概念在第二章已有详细描述,这里仅介绍印迹和探针技术。 (一)印迹技术 1975年,E. Southern将经琼脂糖电泳分离的DNA片段在胶中变性使其成为单链,然后将硝酸纤维素(nitrocellulose, NC)膜平铺在胶上,膜上放置一定厚度的吸水纸巾,利用毛细作用使胶中的DNA分子转移到NC膜上,使之固相化已。将载有DNA单链分子的NC膜放在核酸杂交反应溶液中,溶液中具有互补序列的DNA或RNA单链分子就可以结合到存在于NC膜上的DNA分子上。这一技术类似于用吸墨纸吸收纸张上的墨迹,因此称之为“blotting",译为印迹技术。目前这种技术已广泛用于DNA、RNA和蛋白质的检测。除靠毛细作用将DNA转移至NC膜外,后来又建立了电转移印迹技术和真空吸引转移印迹技术。这些新的方法缩短了转移所需的时间。另外亦有一些新的材料用千转移膜制备而改善待测分子的转移效率和样品承载能力。 (二)探针技术 探针(probe)指的是带有放射性核素、生物素或荧光物质等可检测标志物的核酸片段,它具有特定的序列,能够与待测的核酸片段依据碱基互补原理结合,因此可以用于检测核酸样品中存在的特定核酸分子。核酸探针既可以是人工合成的寡核昔酸片段,也可以是基因组DNA片段、cDNA全长或片段,还可以是RNA片段。在NC膜杂交反应中,标记探针的序列如果与NC膜上的核酸存在碱基序列互补,就可以结合到膜上的相应DNA或RNA区带,经放射自显影或其他检测手段就可以判定膜上是否有互补序列的核酸分子存在。 二、印迹技术的类别及应用 印迹技术可以分为DNA印迹、RNA印迹和蛋白质印迹三大类。它们的基本流程如图24-1所示。 第二十四章常用分子生物学技术的原理及其应用 芦盓笃/RNA样品/岁蛋白质样品/ 转移到NC膜后与转移到NC膜或尼龙膜转移到NC膜或PVDF标记探针杂交后与标记探针杂交膜后与抗体反应DNA印迹(DNA blotting)为E. Southern首次应用,因而命名为Southern blotting。DNA样品经限制性内切酶消化后行琼脂糖凝胶电泳分离DNA片段,将含有不同大小DNA片段的凝胶在变性溶液中处理,然后将胶中的变性DNA分子转移到NC膜上,转移完成后,将含DNA片段的NC膜在80°C真空条件下加热或在紫外交联仪内处理,使DNA固定于NC膜上,即可用于杂交反应已。DNA印迹技术主要用千基因组DNA的定性和定量分析,例如对基因组中特异基因的定位及检测、基因组中转基因和基因剔除的分析,此外亦可用千分析重组构建的质粒和噬菌体。 (二)RNA印迹 利用与DNA印迹相类似的技术来分析RNA就称为RNA印迹(RNA blotting)。相对于Southern blotting,有人将RNA印迹称为Northern blotting,其技术原理与Southern blotting相同卤。RNA分子较小,在转移前无需进行限制性内切酶切割,而且变性RNA的转移效率也比较高。RNA印迹技术目前主要用于检测特定组织或细胞中已知的特异mRNA和非编码RNA的表达水平,也可以比较不同组织和细胞中的同一基因的表达情况。尽管用RNA印迹技术检测RNA的敏感性较PCR法(见本章第二节)低,但是由于其特异性强,假阳性率低,仍然被认为是最可靠的mRNA和非编码RNA定量分析方法之一。 (三)蛋白质印迹印迹技术不仅可用于核酸的分子杂交,而且也可用于蛋白质的分析。人们发现蛋白质在电泳之后也可以从胶中转移并固定到膜型材料上,再依靠与溶液中相应的蛋白质分子相互结合来进行定性定量分析,其中最常用的是用抗体来检测,因此亦被称为免疫印迹(immunoblotting)。相对应于DNA的Southern blotting和RNA的Northern blotting,蛋白质印迹被称为Western blotting。包蛋白质印迹需先将混合蛋白质用聚丙烯酰胺凝胶电泳按分子大小分开,再将蛋白质转移到NC膜或其他膜上包。蛋白质的转移只有靠电转移方可实现。蛋白质的分析主要靠抗体来进行。特异性抗体(称为第一抗体)首先与转移膜上相应的蛋白质分子结合,然后用碱性磷酸酶、辣根过氧化物酶标记或放射性核素标记的第二抗体与之结合。反应之后用底物显色或放射自显影来检测蛋白质区带的信号,底物亦可与化学发光剂相结合以提高敏感度。蛋白质印迹技术用千检测样品中特异性蛋白质的存在、细胞中特异蛋白质的半定量分析以及蛋白质分子的相互作用研究等。 除上述三种基本印迹技术外,还有一些方法可用千核酸和蛋白质的分析。例如,可以不经电泳分离而直接将样品点在NC膜上用于核酸杂交分析,这种方式被称为斑点印迹(dot blotting);组织切片或细胞涂片可以直接用于杂交分析,称为原位杂交(msituhybr心zatIOn, ISH心;可以将多种已知序列442第五篇医学分子生物学专题的DNA排列在一定大小的尼龙膜或其他支持物上用千检测细胞或组织样品中的核酸种类,这种技术称为DNA芯片技术包(见本章第五节)。 第二节PCR技术的原理与应用 20世纪70年代末,随着DNA重组技术的产生和发展,如何快速获得目的基因(待检测或待研究的特定基因)片段已经成为瓶颈问题。1983年K. Mullis发明了聚合酶链反应(polymerase chain reaction, PCR)技术。该技术可将微量DNA片段大量扩增,使微量DNA或RNA的操作变得简单易行。PCR技术的高敏感、高特异、高产率、可重复、快速简便等优点使其迅速成为分子生物学研究中应用最为广泛的方法,许多以往无法解决的分子生物学研究难题得以解决。PCR技术的发明是分子生物学的一项革命,极大地推动了分子生物学以及生物技术产业的发展,成为分子生物学与医学的支撑技术。近年来,PCR技术不断改进,从手工操作发展到自动化仪器,从定性分析发展到定量测定。该方法与其他分子生物学技术相结合,其用途日益广泛。新的PCR技术类型层出不穷。 —、PCR技术的工作原理 PCR的基本工作原理是在体外模拟体内DNA复制的过程。以待扩增的DNA分子为模板,用两条寡核昔酸片段作为引物,分别在拟扩增片段的DNA两侧与模板DNA链互补结合,提供3'-0H末端;在DNA聚合酶的作用下,按照半保留复制的机制沿着模板链延伸直至完成两条新链的合成。不断重复这一过程,即可使目的DNA片段得到扩增(图24-2)(动画24-1"PCR原理及实验步骤示意”)。PCR反应的特异性依赖于与模板DNA两端互补的寡核昔酸引物。组成PCR反应体系的基本成分包括模板DNA、特异引物、耐热性DNA聚合酶(如Taq DNA聚合酶)、dNTP以及含有M忙的缓冲液。 =三一3'5' 了,r.飞屯王子.立.五.···寸,,一 DNA模板变性5'-心~___ 3'-_亡石可可芯霄霖=一5'3'一芷....平哼5'5'-磁磁部讼础磁姬磁吵磁珈.?.,一3'5,一',令吟.充盒激磁芍兹松呻怼恋恋妘····—3'正向引物Taqpol I5'-让三罕丑:a:ct-3'5'-·涨巡恋伽x妞悴咖怼磁磁敛纵王.一一I3'Taqpol汇[说书”·5'µllll入卞七」心九岁心严,从斗,,,唱进人第二轮循环',王.中研叫吟\甲几小L心也数十次反应步骤的循环产生大蜇短片段DNA终产物图24-2PCR技术原理示意图PCR扩增产物可分为长产物片段和短产物片段两部分。在第一轮反应周期中,以两条互补的DNA为模板,引物附上模板的3'-端,即新生链的5'-端是固定的,其3仁端则没有固定的止点,产生“长产物片段"。进入第二轮循环,新延伸片段的起点和终点都限定于引物扩增序列以内,形成长短一致的"短产物片段"。短产物片段的长度严格地限定在两个引物链5'-端之间,是需要扩增的特定片段。"短产物片段”按指数倍数增加,而“长产PCR的基本反应步骤包括:心变性:将反应体系加热至95°C,使模板DNA完全变性成为单链,同时引物自身以及引物之间存在的局部双链也得以消除;@退火:将温度下降至适宜温度(一般较兀低汽)使引物与模板DNA结合;@延伸:将温度升至72°C,DNA聚合酶以dNTP为底物催化DNA的合成反应。上述3个步骤称为1个循环,新合成的DNA分子继续作为下一轮合成的模板,经多次循环(25~30次)后即可达到扩增DNA片段的目的。 二、PCR技术的主要用途 (—)获得目的基因片段 PCR技术为在重组DNA过程中获得目的基因片段提供了简便快速的方法。在人类基因组计划完成之前,PCR是从cDNA文库或基因组文库中获得序列相似的新基因片段或新基因的主要方法。 目前,该技术是从各种生物标本或基因工程载体中快速获得已知序列目的基因片段的主要方法。 (二)DNA和RNA的微量分析 PCR技术敏感性高,对模板DNA的量要求很低,是DNA和RNA微量定性和定量分析的最好方法。理论上讲,只要存在1分子的模板,就可以获得目的片段。实际工作中,1滴血液、1根毛发或1个细胞已足以满足PCR的检测需要,因此在基因诊断方面具有极广阔的应用前景。 (三)DNA序列分析 将PCR技术引入DNA序列测定,使测序工作大为简化,也提高了测序的速度,是实现高通量DNA序列分析的基础(见本章第三节)。待测DNA片段既可克隆到特定的载体后进行序列测定,也可直接测定。 (四)基因突变分析 PCR与其他技术的结合可以大大提高基因突变检测的敏感性,例如单链构象多态性分析、等位基因特异的寡核昔酸探针分析、基因芯片技术、DNA序列分析等。(五)基因的体外突变在PCR技术建立以前,在体外对基因进行各种突变是一项费时费力的工作。现在,利用PCR技术可以随意设计引物在体外对目的基因片段进行插入、嵌和、缺失、点突变等改造。 三、几种重要的PCR衍生技术 PCR技术自身的发展及其与已有分子生物学技术的结合形成了多种PCR衍生技术,提高了PCR反应的特异性和应用的广泛性。本章仅举例介绍部分与医学研究密切相关的PCR衍生技术。(一)逆转录PCR技术逆转录PCR(reverse transcription PCR, RT-PCR)是将RNA的逆转录反应和PCR反应联合应用的一种技术。首先以RNA为模板,在逆转录酶的作用下合成cDNA,再以cDNA为模板通过PCR反应来扩增目的基因。RT-PCR可检测到单个细胞中少于10个拷贝的特异的RNA,是目前从组织或细胞中获得目的基因以及对已知序列的RNA进行定性和半定量分析的最有效方法,也是最广泛使用的PCR方法。国原位PCR(in situ PCR)是利用完整的细胞作为一个微小的反应体系来扩增细胞内的目的基因片段。PCR反应在甲酸溶液(福尔马林)固定、石蜡包埋的组织切片或细胞涂片上的单个细胞内进行。PCR反应后,再用特异性探针进行原位杂交,即可检出待测DNA或RNA是否在该组织或细胞中存在。由于常规PCR或RT-PCR技术的产物不能在组织细胞中直接定位,因而不能与特定的组织细胞特征表型相联系,而原位杂交技术虽有良好的定位效果,但灵敏度不高。原位PCR方法弥补了PCR技术和原位杂交技术的不足,将目的基因的扩增与定位相结合,既能分辩鉴定带有靶序列的细胞,又能标出靶序列在细胞内的位置,在分子和细胞水平上研究疾病的发病机制和临床过程有重大的实用价值。\,环i}444第五筒医学分子生物学专题常规PCR反应是在反应终点检测产物含量,然而在反应过程中产物是以指数形式增加的,多次循环反应后的产物堆积将影响对原有模板含量差异的准确判断,故常规PCR反应只能作为半定量手段。实时PCR(real-time PCR)技术通过动态监测反应过程中的产物量,消除了产物堆积对定量分析的干扰,亦被称为定量PCR(quantitative PCR, qPCR)。定量PCR技术实现了mRNA、miRNA及其他非编码的RNA快速而准确的定量分析,已在临床应用于基因诊断。 1.实时PCR的基本技术原理实时PCR的基本原理是在PCR反应体系中加入荧光基团,利用荧光信号积累实时监测整个PCR进程,故也被称为实时荧光定量PCR或荧光定量PCR。实时定量PCR需要采用专用PCR仪,自动在每个循环的特定阶段对反应体系的荧光强度进行采集,实时记录荧光强度的改变,可以做到PCR每循环一次就收集一个数据,建立实时扩增曲线。由于反应起始的模板DNA量与循环过程的指数期的扩增产物量之间存在着定量关系,利用荧光信号的实时监测和计算,可以准确地确定起始DNA拷贝数,从而对样品的浓度进行精确定量。 2.实时PCR技术的分类荧光标记是实现PCR反应实时定量的化学基础。实时荧光定量PCR的化学原理包括引物探针类和非引物探针类两种。非引物探针类是利用非特异性的插入双链DNA的荧光染料来指示扩增的增加,引物探针类则是利用可与靶DNA序列特异杂交结合的引物,标记荧光报告基团作为探针,来指示扩增产物的增加。 (1)非引物探针类实时PCR:非引物探针类实时PCR加入的是能与双链DNA结合的荧光染料,由此来实现对PCR过程中产物量的全程监测,并不使用荧光来标记引物。最常用的是能结合到DNA双螺旋小沟区域的荧光染料SYER Green。该染料处千游离状态时,荧光信号强度较低,一旦与双链DNA结合之后,荧光信号强度大大增强(约为游离状态的1000倍)。荧光信号的强度与反应体系中的双链DNA(代表合成产物)的量成正比(图24-3)。因此,该荧光染料可用来实时监测PCR产物量的多少。由于非探针类实时PCR成本低廉,简便易行,近年来得到很快的发展,技术日趋完善,从而在基因表达的定量分析方面广泛应用。 (1)退火反应液中游离的SYBRGreen染料分子 引物 (2)DNA链延伸,SYER Green结合到新合成的DNA双链上 (3)合成完毕,更多的SYBRGreen结合到DNA双链上 5'引物 31|1}111叫}11d飞飞日厂 SYBRGreen只可以结合在双链DNA上,结合后产生荧光。荧光信号强度与产物最正相关。在PCR反应过程中,实时测定荧光强度即可得知产物撒,并据此计算出样本中的初始模板含量(2)引物探针类实时PCR:与非引物探针类实时PCR相比,引物探针类实时PCR是通过使用荧光标记的引物为探针来产生荧光信号。探针除了能产生荧光信号用于监测PCR进程之外,还能和模板DNA待扩增区域结合,因此提高了PCR的特异性。目前,常用的探针类实时PCR包括TaqMan探针法、分子信标(molecular beacons)探针法包和荧光共振能量转移(fluorescence resonance energy transfer,FRET)探针法包等。荧光探针由千增加了探针的互补识别步骤,特异性更高,且可采用多色荧光探针,可在一个反应中实现对数种不同基因表达水平的同时检测。 3实时PCR的应用实时定量PCR技术具有定量、特异、灵敏和快速等特点,是目前检测目的核酸拷贝数的可靠方法,是DNA定量技术的一次飞跃。目前实时荧光PCR技术已经被广泛应用于基础科学研究、临床诊断、疾病研究及药物研发等领域。这些应用将改变以往对疾病的表型认识和表型诊断,而是从本质上认识疾病和诊断疾病。 (1)实时PCR在肿瘤领域的应用:实时定量PCR不但能有效地检测基因的突变、重排、易位等,而且能准确检测癌基因表达量,可用于肿瘤早期诊断、鉴别、分型、分期、治疗及预后评估。 实时荧光定量PCR可运用特异性荧光探针检测基因突变。可设计跨越疑似突变位点的荧光探针,进行基因扩增,然后对扩增产物进行缓慢加热获得熔解曲线,根据熔解曲线特征判断有无突变。也可使用双色标记探针进行突变检测,一个检测野生型,另一个标记的探针检测突变体。 第三节DNA测序技术 DNA测序(DNA sequencing)的目的是确定一段DNA分子中4种碱基(A、G、C、T)的排列顺序。DNA测序技术是阐明和理解基因结构、基因功能、基因变异、基因表达调控的基础,也是实现在分子层次预测、预防、诊断和治疗疾病的个体化医学的最重要的支撑技术。 分子生物学发展的初期,采用部分酶解等方法仅能测定RNA的序列,且费时费力。1977年,MaxamAM和Gilbert W合作创立了化学降解法,又称Maxam-Gilbert测序法;同年,Sanger F创建了双脱氧测序法或称Sanger法。这两种方法的建立实现了DNA测序技术的第一次飞跃,三位科学家也因此分享了1980年的诺贝尔化学奖。40余年来,DNA测序技术发展迅速,从手工操作到自动化仪器分析、从单一短片段到高通量平行分析,尤其是在人类基因组计划的推进和带动下,已经实现了高速和低价的目标,人全基因组30亿碱基对的测序目前已经成为常规技术。快速测序技术极大推动了生物学和医学多个领域的理论突破和应用研究。 一、双脱氧法和化学降解法是经典DNA测序方法 早期的DNA测序只能在实验室内手工完成,故基本上是用于分子生物学研究工作,采用的是双446第五篇医学分子生物学专题Sanger双脱氧测序(dideoxy sequencing)法亦称为链终止(chain-termination method)法,基于对引物的延伸合成反应。如图24-4所示,用DNA聚合酶来延伸结合在待测序列DNA模板上的寡脱氧核昔酸引物,直到在新合成的DNA链的31习末端掺入了4种放射性核素标记的2',3'-双脱氧核昔三磷酸(ddNTP)底物的其中一种。由千ddNTP脱氧核糖的3'-位碳原子上缺少胫基而不能与下一位核昔酸的5'-位磷酸基之间形成3',5'-磷酸二酷键,从而使得正在延伸的DNA链在该ddNTP处终止。因此,在4种不同反应体系中分别加入4种不同的ddNTP底物(A、G、C、T),就可得到终止于相应特定碱基的一系列不同长度DNA片段。 这些片段具有共同的起点(即引物的5'-末端),而有不同的终点(即ddNTP掺入的位置),其长度取决千ddNTP掺入的位置与引物5'-末端之间的距离。经可分辨1个核昔酸差别的变性聚丙烯酰胺凝胶电泳分离这些片段,再借助片段的放射性核素或荧光标记,即可读出一段DNA序列。(动画24-2"DNA序列测定原理”)I I I l l I I I I I I I I I I I l l I I I I I I I I I I l I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I双链DNA片段ACGTAAATCGATACGTAATddATP l I I I. I I I l l I I I I I I I I I I I I I l单链模板DMA ddATP I I I I I I I I l I I. ACGTAAATCGATACGTAATddATP||||||||||||I. CATTA||||||·标记引物A}电泳T_DNA聚合酶+®--®-®-CH20碱基(A.C.G.T)E·1jl(二)化学降解法DNA测序技术Maxam-Gilbert化学降解测序(chemical degradation sequencing)法则首先对待测序的DNA片段的末端进行放射性核素标记,然后用专一性化学试剂将该片段DNA进行特异性降解,从而产生4套含有长短不-DNA片段的混合物,再通过其所带的标记读出序列。这一方法的建立在分子生物学发展早期发挥了重要作用,但因其费用高且难以实现自动化而被其他方法取代。 二、第—代全自动激光荧光DNA测序仪器基千双脱氧法Sanger方法和Maxam-Gilbert化学降解法的手工操作对技术人员的经验和技术熟练程度要求很高,实验失败概率高,难以在普通实验室推广普及,更难以满足分子生物学的迅速发展及其在医学等领域应用的需求,因而催生了自动化分析仪己的发明。 早期的全自动DNA序列分析仪的工作原理主要是基于Sanger法,采用四色荧光标记ddNTP而制作的。目前,自动激光荧光DNA测序仪(又称第一代测序仪)的应用巳十分普遍,它可实现制胶、进样、电泳、检测、数据分析全自动化。第一代测序技术的读长可以超过lOOObp,原始数据的准确率可高达99,999%。 在四色荧光法分析中,采用4种不同荧光染料标记4种不同的可终止DNA延伸反应的底物ddNTP,经Sanger法反应后,赋予所合成的DNA片段4种不同的颜色。待测DNA样品的4个反应产物在同一个泳道内依照片段大小电泳分离,由仪器自动连续采集荧光数据并完成分析,最后直接显示待测DNA的碱基序列。 人类基因组计划的第一个人类基因组草图的绘制采用的就是Sanger法。美国、英国、日本、法国、德国、加拿大、中国等7个国家的科学家合作,用了众多自动激光荧光DNA测序仪,以集成式工厂化运行模式而完成的。 三、高通星DNA测序技术使基因测序走向医学实用 要将人类基因组序列分析的研究成果用于各种复杂疾病的机制研究、诊断、预警、治疗监测以及法医学鉴定等医学实践,需要对入群及个体进行全基因组序列分析。为此必须首先实现DNA测序技术的微量、快速和低成本化,而标准的Sanger法及第一代测序仪的高成本很难满足这一需求,新的高通量DNA测序技术及其分析仪器因此应运而生。这些新技术被冠以新一代测序(next generation sequencing, N GS)之称,并先后有第二代、第三代甚至第四代之分,其共同特点都是实现了微量化、高通量并行化和低成本。 所有的NGS都是在一次反应中同时分析多个DNA小片段,因而可快速获得所有序列,再经生物信息学整合分析,得出个体的基因组序列。在超高通量测序时,甚至可并行百万个测序反应。需要指出的是,每一种新的高通量测序技术都是伴随相应的新仪器而诞生的,否则无法进入生物学和医学领域。 一些NGS技术需要首先进行待测DNA片段的PCR扩增。这些技术和仪器主要包括:g凶54基因组测序仪利用焦磷酸测序,检测DNA合成产生的焦磷酸。综合运用了乳液PCR、微流控芯片、焦磷酸检测等技术。®Solexa/Illumina测序仪检测DNA合成反应中掺入的荧光标记单核昔酸,利用桥式PCR、微流控芯片、荧光标记基团和终止基团检测等技术。@SOLiD测序仪基于寡核昔酸连接反应,利用乳液PCR、微流控芯片,检测DNA连接酶催化的荧光标记寡核昔酸探针连接到DNA链过程中释放出的光学信号。 更新一代的测序技术则无需PCR扩增反应,直接针对DNA单分子进行序列分析,亦称为第三代测序技术。这些技术包括HeliScope测序技术、单分子实时技术(single molecule real time technology, SMRT)以及基于荧光共振能量转移(FRET)的测序技术等区。 高通量DNA测序技术的快速进步极大促进了人全基因组测序(whole genome sequencing, WGS)、转录组测序(RNA-seq)、全外显子测序(Exome-seq)、DNA-蛋白质相互作用,即染色质免疫共沉淀测序(ChIP-seq)、病原微生物全基因组测序等在医学研究和实践中的应用(见第二十七章),为医学进入大数据时代提供了核心技术支撑。 四、DNA测序在医学领域具有广泛应用价值 DNA测序技术在医学领域的使用日益广泛和深入。DNA测序在医学研究和临床实践中的主要用途是:心通过人群大样本分析,确定单基因遗传病和多基因变异相关疾病的SNP位点、基因结构变异、基因拷贝数变异等,鉴定出可用于复杂性疾病易感性预警或早期诊断的疾病标志物,并将这些单一基因或多个基因的变异检测用千临床诊断。这些变异的发现还将指导治疗靶点的确认和药物研发;@检测肿瘤组织的染色体畸变癌基因和抑癌基因突变位点、融合基因、染色体拷贝数变化等,为肿瘤分子分型和治疗敏感性监测提供依据;@进行个人基因组分析,在大数据平台发展的基础上,建,,飞i}448第五篇医学分子生物学专题立个人SNP位点与疾病易感性、药物敏感性和耐受性以及其他诸多表型之间的联系;@用于病原微生物检测,确定病原微生物的分子分型,为抗病毒或细菌感染治疗提供依据。DNA测序在法医学领域具有特殊意义。该技术极大提高了DNA鉴定的敏感性和准确性,在各类案件中作为司法证据的重要性越加凸显。DNA测序在亲子鉴定中亦具有重要价值。 第四节生物芯片技术 生物芯片技术是在20世纪末发展起来的一项新的规模化生物分子分析技术,目前已被应用千生命科学的众多领域。这些应用包括基因表达检测、基因突变检测、基因诊断、功能基因组研究、基因组作图等多个方面。 基因芯片 —、基因芯片 基因芯片(gene chip)是指将许多特定的DNA片段有规律地紧密排列固定于单位面积的支待物上,然后与待测的荧光标记样品进行杂交,杂交后用荧光检测系统等对芯片进行扫描,通过计算机系统对每一位点的荧光信号作出检测、比较和分析,从而迅速得出定性和定量的结果。该技术亦被称作DNA微阵列(DNA microarray)。基因芯片可在同一时间内分析大量的基因,高密度基因芯片可以在lcm2面积内排列数万个基因用于分析,实现了基因信息的大规模检测。 基因芯片特别适用于分析不同组织细胞或同一细胞不同状态下的基因差异表达情况,其原理是基于双色荧光探针杂交。该系统将两个不同来源样品的mRNA逆转录合成cDNA时用不同的荧光分子(如正常用红色、肿瘤用绿色)进行标记(图24-5),标记的cDNA等量混合后与基因芯片进行杂交,在两组不同的激发光下检测,获得两个不同样品在芯片上的全部杂交信号。呈现绿色荧光的位点代表该基因只在肿瘤组织表达,呈现红色信号的位点代表该基因只在正常组织表达,呈现两种荧光互补色一—黄色的位点则表明该基因在两种组织中均有表达。 正常细胞的mRNA肿瘤细胞的mRNA -尸已/ 荧光标记 立\^一/-\^~ 红色荧光{Cy3浙而已的cDNA片段绿色荧光{Cy5浙面记的cDNA片段---等批混合•••o••.0··....•••••.... !激光扫描 Cy5图像(绿色) 重叠图像(黄色)Cy3图像(红色)计算机读取 图24-5基因芯片工作流程示意图不同标本(如正常组织和肿瘤组织)抽提的RNA经RT-PCR后分别以不同的荧光染料标记,等量混合后在芯片上进行杂交,最后进行扫描和读片。右下为双色荧光重叠图像,绿色荧光者表示正常组织高表?记达,而红色荧光者表示肿瘤组织高表达蛋白质芯片(protein chip)是将高度密集排列的蛋白质分子作为探针点阵固定在固相支待物上,当与待测蛋白质样品反应时,可捕获样品中的靶蛋白质,再经检测系统对靶蛋白质进行定性和定量分析的一种技术。蛋白质芯片的基本原理是蛋白质分子间的亲和反应,例如抗原-抗体或受体-配体之间的特异性结合。最常用的蛋白质探针是抗体。在用蛋白质芯片检测时,首先要将样品中的蛋白质标记上荧光分子,经过标记的蛋白质一旦结合到芯片上就会产生特定的信号,通过激光扫描系统来检测信号。 蛋白质芯片技术具有快速和高通量等特点,它可以对整个基因组水平的上千种蛋白质同时进行分析,是蛋白质组学研究的重要手段之一,已广泛应用于蛋白质表达谱、蛋白质功能、蛋白质间的相互作用的研究。在临床疾病的诊断和新药开发的筛选上也有很大的应用潜力。 第五节蛋白质的分离、纯化与结构分析 蛋白质是生物大分子,具有胶体性质、沉淀、变性和凝固等特点。人体的细胞和体液中存在成千上万种蛋白质,要分析其中某种蛋白质的结构和功能,需要从混合物分离纯化出单一蛋白质。蛋白质分离通常是利用其特殊理化性质,采取盐析、透析、电泳、层析及超速离心等不损伤蛋白质空间构象的物理方法,以满足研究蛋白质结构与功能的需要。 一、蛋白质沉淀用于蛋白质浓缩及分离 蛋白质在溶液中一般含量较低,需要经沉淀浓缩,以利进一步分离纯化。 1.有机溶剂沉淀蛋白质丙酮、乙醇等有机溶剂可以使蛋白质沉淀,再将其溶解在小体积溶剂中即可获得浓缩的蛋白质溶液。为保持蛋白质的结构和生物活性,需要在0~4"C低温下进行丙酮或乙醇沉淀,沉淀后应立即分离,否则蛋白质会发生变性。 2.盐析分离蛋白质盐析(salt precipitation)是将硫酸按、硫酸钠或氯化钠等加入蛋白质溶液,使蛋白质表面电荷被中和以及水化膜被破坏,导致蛋白质在水溶液中的稳定性因素去除而沉淀。各种蛋白质盐析时所需的盐浓度及pH均不同,可据此将不同的蛋白质予以分离。例如血清中的清蛋白和球蛋白,前者可溶于pH7.0左右的半饱和硫酸按溶液中,而后者在此溶液中则发生沉淀。当硫酸按溶液达到饱和时,清蛋白也随之析出。所以盐析法可将蛋白质初步分离,但欲得纯品,尚需用其他方法。许多蛋白质经纯化后,在盐溶液中长期放置逐渐析出,成为整齐的结晶。 3.免疫沉淀分离蛋白质蛋白质具有抗原性,将某种纯化蛋白质免疫动物可获得抗该蛋白质的特异抗体。利用特异抗体识别相应抗原并形成抗原抗体复合物的性质,可从蛋白质混合溶液中分离获得抗原蛋白。这就是可用于特定蛋白质定性和定量分析的免疫沉淀法。在具体实验中,常将抗体交联至固相化的琼脂糖珠上,易千获得抗原抗体复合物。进一步将抗原抗体复合物溶于含十二烧基硫酸钠和二琉基丙醇的缓冲液后加热,使抗原从抗原抗体复合物分离而得以纯化,并用于分析。 二、透析和超滤法去除蛋白质溶液中的小分子化合物利用透析袋将大分子蛋白质与小分子化合物分开的方法称为透析(dialysis)已。透析袋是用具有超小微孔的膜,如硝酸纤维素膜制成,一般只允许分子量为lOkD以下的化合物通过。将蛋白质溶液装在透析袋内置千水中,硫酸按氯化钠等小分子物质可透过薄膜进入水溶液,由此可对盐析浓缩后的蛋白质溶液进行除盐。如果透析袋外放放置吸水剂如聚乙二醇,则袋内水分伴同小分子物质透出袋外,高分子量的蛋白质留在袋内,可达到浓缩目的。同样,应用正压或离心力使蛋白质溶液透过有一定截留分子量的超滤膜,达到浓缩蛋白质溶液的目的,称为超滤法闷。此法简便且回收率高,是常用的浓缩蛋白质溶液方法。 三、电泳分离蛋白质 蛋白质在高于或低于其pI的溶液中成为带电颗粒,在电场中能向正极或负极方向移动。这种通\IITF,450第五篇医学分子生物学专题过蛋白质在电场中泳动而达到分离各种蛋白质的技术称为电泳(electrophoresis)。根据支撑物的不同有纤维薄膜电泳、凝胶电泳等。薄膜电泳是将蛋白质溶液点样于薄膜上,薄膜两端分别加正、负电极,此时带正电荷的蛋白质向负极泳动;带负电荷的蛋白质向正极泳动;带电多,分子量小的蛋白质泳动速率快;带电少,分子量大的则泳动慢,千是蛋白质被分离。凝胶电泳的支撑物为琼脂糖、淀粉或聚丙烯酰胺凝胶。凝胶置千玻璃板上或玻璃管中,凝胶两端分别加上正、负电极,蛋白质混合液即在凝胶中泳动。电泳结束后,用蛋白质显色剂显色,即可看到多条巳被分离的蛋白质色带。 1SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳分离蛋白质若蛋白质样品和聚丙烯酰胺凝胶系统中加入带负电荷较多的十二烧基硫酸钠(SDS),使所有蛋白质颗粒表面疫盖一层SDS分子,导致蛋白质分子间的电荷差异消失,此时蛋白质在电场中的泳动速率仅与蛋白质颗粒大小有关,加之聚丙烯酰胺凝胶具有分子筛效应,因而此种称之为SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-polyac1ylarnide gel eiectrophoresis, SDS-PAGE)已。 2.等点聚焦电泳分离蛋白质如果在聚丙烯酰胺凝胶中加入系列两性电解质载体,在电场中可形成一个连续而稳定的线性pH梯度,即pH从凝胶的正极向负极依次递增。在这种介质中电泳时,被分离的蛋白质处在偏离其等电点的pH位置时带有电荷而移动,当蛋白质泳动至与其自身的pI值相等的pH区域时,其净电荷为零而不再移动,这种通过蛋白质等电点的差异而分离蛋白质的电泳方法称为等电聚焦电泳(isoelectric equilibri um electrophoresis, IEE)已。 3双向凝胶电泳分离蛋白质人类基因组计划完成后迎来了后基因组时代,其中蛋白质组学的研究颇受重视。双向凝胶电泳(two-dimensional gel electrophoresis,2-DE)是蛋白质组学研究的重要技术之一。双向凝胶电泳的第一向是蛋白质的IEE,第二向为SDS-PAGE,利用被分离蛋白质等电点和分子量的差异,将复杂蛋白质混合物在二维平面上分离(见第二十七章)已。 四、层析分离蛋白质 层析(chromatography)是分离、纯化蛋白质的重要手段之一。一般而言,待分离蛋白质溶液(流动相)经过一个固态物质(固定相)时,根据溶液中待分离的蛋白质颗粒大小、电荷多少及亲和力等,使待分离的蛋白质组分在两相中反复分配,并以不同速度流经固定相而达到分离蛋白质的目的。层析种类很多,有离子交换层析、凝胶过滤和亲和层析等。其中离子交换层析和凝胶过滤应用最广。 蛋白质和氨基酸一样,是两性电解质,在某一特定pH时,各蛋白质的电荷量及性质不同,故可以通过离子交换层析得以分离岱。图24-6介绍的是阴离子交换层析,将阴离子交换树脂颗粒填充在层析管内,由于阴离子交换树(a)样品全部交换并吸附到树脂上;(b)负电荷较少的分子用较稀的Cl一或其他负离子溶液洗脱;(c)电荷多的分子随Cl一浓度增加依次洗脱;(d)洗脱图A280表示为280nm的吸光度脂颗粒上带正电荷,能吸引溶液中的阴离子(图24-6a)。然后再用含阴离子(如Cl-)的溶液洗柱。含负电量小的蛋白质首先被洗脱下来(图24-6b);增加Cl一浓度,含负电量多的蛋白质也被洗脱下来(图24-6c),于是两种蛋白质被分开。 凝胶过滤(gel filtration)又称分子筛层析。层析柱内填满带有小孔的颗粒,一般由葡聚糖制成。蛋白质溶液加于柱之顶部,任其往下渗漏,小分子蛋白质进入孔内,因而在柱中滞留时间较长,大分子蛋白质不能进入孔内而径直流出,因此不同大小的蛋白质得以分离(图247)包。 五、蛋白质颗粒沉降行为与超速离心分离 超速离心法(ultracentrifugation)既可以用来分离纯化蛋白质也可以用作测定蛋白质的第二十四章常用分子生物学技术的原理及其应用(a)大球是葡聚糖凝胶颗粒;(b)样品上柱后,小分子进入凝胶微孔,大分子不能进入,故洗脱时大分子先洗脱下来;(c)小分子后洗脱出来分子量。蛋白质在高达500OOOg(g为gravity,即地心引力单位)的重力作用下,在溶液中逐渐沉降,直至其浮力(buoyant force)与离心所产生的力相等,此时沉降停止。不同蛋白质其密度与形态各不相同,因此用上述方法可将它们分开。蛋白质在离心力场中的沉降行为用沉降系数(sedimentation coefficient, S)表示,沉降系数(S)使用Svedberg单位(lS=l0-13秒)。S与蛋白质的密度和形状相关(表24-1)。 蛋白质细胞色素c(牛心)肌红蛋白(马心)糜蛋白酶原(牛胰)B-乳球蛋白(羊奶)血红蛋白(人)血清清蛋白(人)过氧化氢酶(马肝)脉酶(刀豆)纤维蛋白原F. Sanger耗时多年才在1953年基本完成了胰岛素的一级结构测定,现今由于方法学改进及自动化分析仪器的产生,已有越来越多蛋白质的氨基酸序列问世。 1.离子交换层析分析蛋白质的氨基酸组分首先分析已纯化蛋白质的氨基酸残基组成。蛋白质经盐酸水解后成为个别氨基酸,用离子交换树脂将各种氨基酸分开,测定它们的噩,算出各氨基酸在蛋白质中的百分组成或个数(图24-8)。 452第五篇医学分子生物学专题 天冬 慧郢 洗脱体积L___pH3.50.2mo讥拧檬酸钠----'c___pH4.250.2mo旧拧檬酸钠2.测定多肤链的氨基端和狻基端的氨基酸残基第二步测定多肤链的氨基端与狻基端为何种氨基酸残基。F. Sanger最初用二硝基氛苯与多肤链的a-氨基作用生成二硝基苯氨基酸,然后将多肤水解,分离出带有二硝基苯基的氨基酸。目前多用丹酰氯使之生成丹酰衍生物,该物质具强烈荧光,更易鉴别。狻基端氨基酸残基可用狻肤酶将其水解下来进行鉴定。 3.肤链序列的测定第三步是将肤链水解成片段,分别进行分析。常用者有胰蛋白酶法、胰凝乳蛋白酶法、澳化氛法等。胰蛋白酶能水解赖氨酸或精氨酸的狻基所形成的肤键。所以如果蛋白质分子中有4个精氨酸及赖氨酸残基,则可得5个片段。胰凝乳蛋白酶水解芳香族氨基酸(苯丙氨酸、酪氨酸及色氨酸)狻基侧的肤键,澳化氮水解甲硫氨酸狻基侧的肤键。 蛋白质水解生成的肤段,可通过层析和电泳及质谱将其分离纯化并鉴定,得到的图谱称为肤图(peptide map),由此可明确肤段的大小和数量。各肤段的氨基酸排列顺序一般采用Edman降解法进行分析。将待测肤段先与异硫氮酸苯酣反应,该试剂只与氨基端氨基酸的游离a-氨基作用。再用冷稀酸处理,氨基端残基即自肤链脱落下来,成为异硫氖酸苯酣衍生物,用层析可鉴定为何种氨基酸衍生物。残留的肤链可继续与异硫氖酸苯酣作用,依次逐个鉴定出氨基酸的排列顺序(图24-9)。对分析出的各肤段中的氨基酸顺序,进行组合排列对比,最终得出完整肤链中的氨基酸排列顺序。 吼-NCS+NH2-CH-g-NH-R迦座►C6比一甘CS-NH-CH—C—NH—R 异硫氖酸苯酣肤(I)苯氨基硫甲酰基肤(PIC-肤) 飞c6比—NH—C=NH子烟-NH-CS-NH-9H-COOH 肤(II)\/[-5-嗟嗤琳酮PTC-氨基酸SC-NH+H+11苯乙内酰硫脉衍生物(PIH氨基酸)I、层析质谱法鉴定近年来,由于核酸研究在理论上及技术上的迅猛发展,尤其是人全基因组测序的完成,各种蛋白质的氨基酸序列已经可以通过核酸序列来推演。然而,蛋白质组学研究、生物制药产品的鉴定等仍需要进行高效而准确的蛋白质的部分一级结构分析。 七、蛋白质的空间结构分析 大量生物体内存在的蛋白质空间结构的解析,对于研究蛋白质结构与功能的内在关系至关重要,也为蛋白质或多肤药物的结构改造以致增强作用减弱副作用提供了理论依据。由千蛋白质的空间结构十分复杂,因而其测定的难度也较大,而且还需昂贵的仪器设备和先进的技术。随着结构生物学的发展,蛋白质二级结构和三维空间结构的测定也已普遍开展已。 冷冻电镜(cryo-electron microscopy)技术的发明极大提高了蛋白质三维结构的解析速度和分辨率,而且可以分析蛋白质在相对天然状态下的结构,当前已经成为结构生物学的主要研究手段。3生物信息学预测蛋白质空间结构由于蛋白质空间结构的基础是一级结构,参照已经完成的各种蛋白质的三维结构数据库,已经可以初步预测各种蛋白质的三维空间结构。 第六节生物大分子相互作用研究技术 生物大分子之间可相互作用并形成各种复合物,所有的重要生命活动,包括DNA的复制、转录、蛋白质的合成与分泌、信号转导和代谢等,都是由这些复合物所完成。研究细胞内各种生物大分子的相互作用方式,分析各种蛋白质、蛋白质-DN八蛋白质-RNA复合物的组成和作用方式是理解生命活动基本机制的基础。有关研究技术发展迅速,本节选择性介绍部分方法的原理和用途。 一、蛋白质相互作用研究技术 目前常用的研究蛋白质相互作用的技术包括酵母双杂交、各种亲和分离分析(亲和色谱、免疫共沉淀、标签蛋白沉淀等)、FRET效应分析、噬菌体显示系统筛选等包。本部分简要介绍标签蛋白(tagged protein)沉淀和酵母双杂交技术(yeast two-hybrid system)。 (—)标签蛋白沉淀 标签融合蛋白结合实验是一个基千亲和色谱原理的、分析蛋白质体外直接相互作用的方法。该方法利用一种带有特定标签(tag)的纯化融合蛋白作为钓饵,在体外与待检测的纯化蛋白质或含有此待测蛋白质的细胞裂解液温育,然后用可结合蛋白标签的琼脂糖珠将融合蛋白沉淀回收,洗脱液经电泳分离并染色。如果两种蛋白质有直接的结合,待检测蛋白质将与融合蛋白同时被琼脂糖珠沉淀(pull-down),在电泳胶中见到相应条带已。 标签融合蛋白结合实验可用于证明两种蛋白质分子是否存在直接物理结合、分析两种分子结合的具体结构部位及筛选细胞内与融合蛋白相结合的未知分子。该方法亦常用于重组融合蛋白的纯化。 目前最常用的标签是谷胱甘肤S-转移酶(glutathion eS-tran sferases, GST),有各种商品化的载体用于构建GST融合基因,并在大肠杆菌中表达为GST融合蛋白(图24-10)。利用GST与还原型谷胱甘肤(glutathione, GSH)的结合作用,可以用共价偶联了GSH的琼脂糖珠进行标签蛋白沉淀实验(GST454第五篇医学分子生物学专题pull-down assay)。另一个常用的易于用常规亲和色谱方法纯化的标签分子是可以与锦离子琼脂糖珠结合的6个连续排列组氨酸(6xHis)标签。 GSH-琼脂糖珠GST-蛋白X融合蛋白琼脂糖珠 ••.GST>蛋白X> GS瑾码序列蛋白X编码序列 蛋白质琼脂融合蛋白X —二三 分子量糖珠蛋白与蛋白标准对照对照Y复合物 图24-10标签融合蛋臼沉淀实验流程示意图如蛋白X和蛋白Y间存在相互作用,可用GST标签蛋白沉淀实验予以证明。将蛋白X的编码基因插到GST编码序列的下游,表达为GST-蛋白X融合蛋白;该融合蛋白的GST部分可以与偶联在琼脂糖珠上的GSH结合;蛋白Y可以与蛋白X相互作用,被琼脂糖珠间接沉淀下来;经洗涤去除未结合的蛋白质,再用含游离GSH的缓冲液将GST-蛋白X融合蛋白竞争洗脱下来,经电泳染色即可证明两者的相互作用酵母双杂交系统目前已经成为分析细胞内未知蛋白质相互作用的主要手段之一。该技术的建立是基于对酵母转录激活因子GAIA分子的认识。GAIA分子的DNA结合区(binding domain, BD)和促进转录的活性区(activation domain, AD)被分开后将丧失对下游基因表达的激活作用,但是如果BD和AD分别融合了具有配对相互作用的两种蛋白质分子后,就可以依靠所融合的蛋白质分子之间的相互作用而恢复对下游基因的表达激活作用卤。 酵母双杂交系统可以用于:心证明两种已知基因序列的蛋白质可以相互作用;©分析已知存在相互作用的两种蛋白质分子的相互作用功能结构域或关键氨基酸残基;@将待研究蛋白质的编码基因与BD基因融合成为"诱饵”表达质粒,可以筛选AD基因融合的"猎物“基因的cDNA表达文库,获得未知的相互作用蛋白质。 二、DNA蛋白质相互作用分析技术 蛋白质与DNA相互作用是基因表达及其调控的基本机制。分析各种转录因子所结合的特定DNA序列及基因的调控序列所结合的蛋白质是阐明基因表达调控机制的主要研究内容。这里介绍两种目前常用的研究DNA与蛋白质相互作用的技术。 (一)电泳迁移率变动分析电泳迁移率变动分析(electrophoretic mobility shift assay, EMSA)或称凝胶迁移变动分析(gel shift assay)最初用于研究DNA结合蛋白与相应DNA序列间的相互作用,可用于定性和定量分析,已经成为转录因子研究的经典方法。目前这一技术也被用千研究RNA结合蛋白和特定RNA序列间的相互作用包。 DNA结合蛋白与特定DNA探针片段的结合会增大其分子扯,在凝胶中的电泳速度慢于游离探针,即表现为条带相对滞后。在实验中预先用放射性核素或生物素标记待检测的DNA探针,再将标记好的探针与细胞核提取物温育一定时间,使其形成DNA-蛋白质复合物,然后将温育后的反应液进行非变性(不加SDS,以免形成的复合物解离)聚丙烯凝胶酰胺电泳,最后用放射自显影等技术显示出标记DNA探针的条带位置。 (二)染色质免疫沉淀技术 真核生物的基因组DNA以染色质的形式存在。因此,研究蛋白质与DNA在染色质环境下的相互作用是阐明真核生物基因表达机制的重要途径。染色质免疫沉淀技术(chromatin immunoprecipitation assay, ChIP)是目前可以研究体内DNA与蛋白质相互作用的主要方法。它的基本原理是在活细胞状态下,用化学交联试剂固定蛋白质-DNA复合物,并将其随机切断为一定长度范围内的染色质小片段,然后通过免疫学方法沉淀此复合体,再利用PCR技术特异性地富集目的蛋白质结合的DNA片段,从而获得蛋白质与DNA相互作用的信息包。 近年来,人们将ChIP和芯片技术结合在一起,建立了ChIP芯片(ChIP社1ip)技术。该方法是在全基因组范围筛选与特定蛋白质相结合的DNA序列,即鉴定特定核蛋白的DNA结合靶点的一项新技术。 本章概括介绍了目前医学分子生物学中有关的部分常用技术。 印迹技术可以将在凝胶中电泳分离的生物大分子转移到固相介质上并加以检测分析,包括DNA印迹技术、RNA印迹技术和蛋白质印迹技术。在DNA和RNA印迹技木中,使用核酸探针进行检测;在蛋白质印迹技术中,使用特异性抗体进行梒测。 PCR的技术原理是以待扩增的DNA分子为模板,用两条寡核菩酸片段作为引物,分别与模板DNA链互补结合;在DNA聚合酶作用下完成两条新链的合成。不断重复这一过程,即可使目的DNA片段得到扩增。PCR的基本反应步骤包括变性、退火和延伸。以PCR为基础,衍生出RT-PCR、原位PCR、实时PCR等多种技术。PCR及其衍生技术主要用于目的基因的克隆、基因突变分析、DNA和RNA的微量分析、DNA序列测定和基因的体外突变等。 确定一段DNA分子中的4种碱基的排列顺序的技术称为DNA测序。双脱氧法和化学降解法是经典的DNA测序方法。笫一代全自动DNA测序技术基于双脱氧法而建立。新一代高通量DNA测序技术实现了微量化、并行化和低成本,为医学大数据时代提供了核心技术支撑。DNA测序在医学中用于鉴定各种复杂性疾病的易感性预警或早期诊断的疾病标志物和治疗靶点;建立个人SNP位点与疾病易感性、药物敏感性和耐受性以及其他诸多表型之间的联系;用于病原微生物的分子分型。DNA测序在法医学领域具有特殊价值。 生物芯片包括基因芯片和蛋白质芯片。基因芯片主要用于基因表达检剧、基因突变检测、功能基因组学研究、基因组作图和新基因的发现等多个方面。蛋白质芯片广泛应用于蛋白质表达谱、蛋白质功能、蛋白质间的相互作用等研究。 分离纯化蛋白质是研究单一蛋白质结构与功能的先决条件。通常利用蛋白质的理化性质,采取盐析、透析、电泳、层析及超速离心等不损伤蛋白质结构和功能的物理方法来纯化蛋白质。通过肤图分析和肤段的Edman降解法可以获得蛋白质的一级结构。X射线衍射、核磁共振和冷冻电镜是解析蛋白质三维结构的主要技术。 分析蛋白质-蛋白质、蛋白质-DNA、蛋白质-RNA复合物的组成和作用方式是理解生命活动的基础。酵母双杂交技术和标签蛋白沉淀是目前分析细胞内蛋白质相互作用的主要手段。EMSA和ChIP456第五篇医学分子生物学专题是目前最常用的在体外和体内分析DNA与蛋白质相互作用的方法。 1.核酸分子杂交在医学领域有哪些应用价值。 理和社会问题。5.简要叙述蛋白质理化性质在蛋白质分离、纯化中的应用。6.研究蛋白质相互作用的意义是什么,如何能够分离到细胞内的蛋白质复合体,设想可以动态实时分离鉴定研究细胞内生物大分子复合体的方式。(药立波) 第二十五章基因结构功能分析和疾病相关基因鉴定克隆人类几乎所有的疾病都与基因结构和表达变化有关,都是遗传因素和环境因素相互作用的结果,因此分析基因的结构与功能、鉴定疾病相关基因是医学分子生物学重要的研究领域,具有重大的理论和实践意义。 要解析疾病发生发展过程中遗传因素的作用及其分子机制,开展精准的诊断、治疗和预防,首先需要揭示基因的结构与功能。DNA序列测定可用于解析基因一级结构的变化;基因顺式作用元件的鉴定是了解基因表达的关键;基因拷贝数和表达产物的分析,了解基因时空表达特性,有助于揭示基因功能及功能改变的原因。 基因作为遗传信息携带分子,其功能实际是基因产物的功能,即基因编码的蛋白质和RNA的功能。对基因产物不同水平的研究,需要采用不同的研究手段。生物信息学序列比对,可预测基因的功能;蛋白质与蛋白质相互作用,蛋白质与DNA/RNA等的相互作用可用于了解基因产物的生物学途径;细胞水平上,高表达或者沉默某种基因,观察细胞生物学行为的改变,以了解基因的功能;构建转基因或基因敲除的动物模型,可在整体水平观察基因功能。 依据基因变异在疾病发生、发展中的作用,疾病相关基因可区分为致病基因和疾病易感基因。如果一种疾病的表型和一个基因型呈直接对应的因果关系,即该基因结构或表达的异常是导致该病发生的直接原因,那么该基因就属于致病基因。这类疾病主要是单基因病,即传统的遗传性疾病,环境因素的影响较小。在复杂性疾病,诸如肿瘤、心血管疾病、代谢性疾病、自身免疫性疾病等,环境因素和遗传因素均起着一定作用,表现为两个以上基因的“微效作用”的相加,或者多基因间的相互作用,故此类疾病亦称为多基因病。若单一基因变异仅增加对疾病的易感性,其基因可称之为疾病易感基因。我们可以将影响疾病发生发展的基因,笼统地称为疾病相关基因(disease related gene),甚至直接称为疾病基因(disease gene)。需要特别注意的是不要被痰性纤维化基因、糖尿病基因等基因名称所误导。许多人类基因首先是通过研究该基因突变导致的疾病时发现的,故以疾病来命名,实际上这些基因正常时,均具有重要的生物学功能。 鉴定疾病相关基因,不但可以详尽地了解疾病的病因和发病机制,开发新的诊断和干预技术,而且有利于了解基因的功能,因而一直是生物医学工作者研究的重点。鉴定新基因或称克隆新基因也具有重大的商业价值,各大生物药物公司纷纷加入这一基因发现的大战中。人类基因组计划的完成为疾病相关基因的发现提供了有利的契机。后基因组时代生物医学领域的主要任务之一就是诠释基因的功能,而鉴定疾病相关基因与确定基因功能两者有着密不可分的联系,并可相互促进。 第一节基因结构分析 大部分基因实质上就是一段特定的DNA序列,通常由编码序列和非编码序列组成。解析基因一级结构的DNA测序技术见第二十四章,本节主要介绍分析基因编码序列和两种非编码序列(转录起点和启动子)的技术、分析基因拷贝数和基因表达产物的常用技术。 458第五篇医学分子生物学专题 一、鉴定基因的顺式元件是了解基因表达的关键 对基因结构的了解,除获得DNA的核昔酸序列外,还必须确定基因功能区域,这些功能区域包括基因编码区、启动子区和转录起始点等顺式作用元件区域。(—)编码序列的确定主要通过生物信息学、cDNA文库和RNA剪接分析法编码序列是对应着成熟mRNA的核昔酸序列,分析基因编码序列的主要技术如下。 1.用数据库分析基因编码序列在基因数据库中,对各种方法所获得的cDNA片段的序列进行同源性比对,通过染色体定位分析、内含子/外显子分析、可读框(open reading frame, ORF)分析及表达谱分析等,可以初步明确基因的编码序列,并可对其编码产物的基本性质,如跨膜区、信号肤序列等进行分析。由于基因数据库的信息量不断增大,利用有限的序列信息即可通过同源性搜索获得全长基因序列,然后,利用美国国立生物技术信息中心(Nation al Center for Biotechnology Information, NCBI)的ORF Finder软件或EMBOSS中的getorf软件进行ORF分析,并根据编码序列和非编码序列的结构特点,便可确定基因的编码序列。 2.用cDNA文库法分析基因编码序列对cDNA进行克隆测序或构建cDNA文库是最早分析基因编码序列的方法。全长cDNA文库一般可以通过mRNA的结构特征进行判断,因为尽管细胞中各mRNA的序列互不相同,但基本上都由3部分组成,即5'-UTR、编码序列和3'-UTR,其中编码序列含有以起始密码子开头、终止密码子结尾的ORF。 以cDNA文库作为编码序列的模板,利用PCR法即可将目的基因的编码序列钓取出来,如果按基因的保守序列合成PCR引物,即可从cDNA文库中克隆未知基因的编码序列;还可通过分析PCR产物来观察mRNA的不同拼接方式。 cDNA末端快速扩增(rap吐amplification of cDNA end, RACE)技术(包括5'-和3'-RACE)是高效钓取未知基因编码序列的一种方法,该方法可以利用mRNA内很短的一段序列来扩增与其互补的cDNA末端序列,以此为线索,经过多次扩增及测序分析,最终可以获得基因的全部编码序列。 此外,采用核酸杂交法可从cDNA文库中,获得特定基因编码序列的cDNA克隆,该方法为寻找同源编码序列提供了可能,其做法是:根据其他生物的基因序列合成一段DNA探针,然后以核酸杂交法筛选所构建的cDNA文库,进而对阳性克隆的cDNA片段进行序列分析,也将此方法称为动物园杂交(zoo hybrization)。 3.用RNA剪接分析法确定基因编码序列通常情况下,选择性剪接的转录产物可以通过基因表达序列标签(expression sequence tag, EST)的比较进行鉴定,但这种方法需进行大量的EST序列测定;同时由于大多数EST文库来源于非常有限的组织,故组织特异性剪接变异体也很可能丢失。目前,高通量分析RNA剪接的方法主要有3种:心基于DNA芯片的分析法:常用的是代表外显子的DNA芯片或外显子/外显子交界的DNA片段芯片;@交联免疫沉淀法:用紫外线将蛋白质和RNA交联在一起,然后用特异性抗体将蛋白质-RNA复合物沉淀,通过分析蛋白质结合的RNA序列,便可确定RNA的剪接位点;@体外报告基因测定法:即将报告基因克隆到载体中,使RNA剪接作为活化报告基因的促进因素,通过分析报告基因的表达水平,即可推测克隆片段的RNA剪接情况,以此为线索便可分析基因的编码序列。 (二)启动子的确定主要采用生物信息学、启动子克隆法和核酸蛋白质相互作用法分析启动子结构对于研究基因表达调控具有重要意义。研究启动子结构的方法首先可利用生物信息学方法预测启动子,其次可采用传统的启动子克隆法,还可以采用核酸与蛋白质相互作用的方法进行研究。 1.用生物信息学预测启动子采用生物信息学方法预测启动子结构特征为后续的启动子克隆及深入研究提供理论支撑。(1)用启动子数据库和启动子预测算法定义启动子:由千启动子通常涉及基因的上游区域,含有第二十五章基因结构功能分析和疾病相关基因鉴定克隆459调控基因适度活化或抑制的信息,因此,在定义启动子或预测分析启动子结构时应包括启动子区域的3个部分:CD核心启动子(core promoter);@近端启动子(proximal promoter):含有几个调控元件的区域,其范围一般涉及转录起点(transcription start site, TSS)上游几百个碱基;@远端启动子(如tal promoter):范围涉及TSS上游几千个碱基,含有增强子和沉默子等元件。 (2)预测启动子的其他结构特征:启动子区域的其他结构特征包括GC含量、CpG比率、转录因子结合位点、碱基组成及核心启动子元件等。大约70%以上哺乳类动物基因5'-区都含有CpG岛,常与启动子序列重叠或交叉覆盖,故可用千鉴定启动子。也可以根据始祖启动子与mRNA转录本之间的相似性鉴定启动子。用于启动子预测的数据库有多个,例如,真核启动子数据库(eukaryotic promoter database, EPD)主要预测真核RNA聚合酶11型启动子,数据库中的所有启动子数据信息都经过实验证实;转录调控区数据库(transcription regulatory region database, TRRD)的数据来源千已发表的科学论文。这些数据库主要通过计算机识别、判断及分析,在数据库中寻找启动子的特异性特征结构。 2.用PCR结合测序技术分析启动子结构该方法最为简单和直接,即根据基因的启动子序列,设计一对引物,然后以PCR法扩增启动子,经测序分析启动子序列结构。 3.用核酸-蛋白质相互作用技术分析启动子结构足迹法(footprinting)用千分析启动子中潜在的调节蛋白结合位点,利用DNA电泳条带连续性中断的图谱特点判断与蛋白质结合的DNA区域,它是研究核酸-蛋白质相互作用的方法,而不是专dsDNA门用千研究启动子结构的方法,足迹法需要对被检DNA进行切割,根据切割DNA试剂的不同,足迹法可分为酶足迹法和化学足迹法。谦I单链末端标记(1)用核酸酶进行足迹分析:酶足迹法澡(enzymatic footprinting)是利用DNA酶处理DNA结合蛋白DNA-蛋白质复合物,然后通过电泳分析蛋白质结合序列。常用的酶有DNA酶I(DNase I)和核酸外切酶III。jDNaseI切割(控制反应时间)DNase I足迹法的基本原理如图25-1。将谦__:::::,可能含有目的启动子序列的双链DNA片段进谦_二====谦=一二-—-二===长短不同的片段行单链末端标记,然后与细胞核抽提物进行体谦===二—I蛋白质结合区不被酶切外结合反应,进而经DNase I随机切割,从而谦谦==<二—二-勹产生一系列长短不同的DNA片段,最后经变谦谦性聚丙烯酰胺凝胶电泳分离,形成仅相差一个l变性凝胶电泳核昔酸的一系列DNA条带。由千DNA结合蛋M无蛋白蛋白-DNA白可保护其结合的DNA序列不受DNase I的酶切消化,从而在凝胶电泳的感光胶片上出现无条带的空白区域,该现象类似蛋白质在DNA上留下的足迹。通过对空白区域相应的DNA进行克隆和测序,并对照未经结合反应的DNA序列标志,即可鉴定蛋白质结合区的DNA之精确序列。 核酸外切酶皿足迹法的基本原理类似 DNase I足迹法,即利用核酸外切酶III的3'~对空白区域相应的DNA进行克隆和测序,并对照未经结合5'外切酶活性,从3'-末端切割双链DNA,从而反应的DNA序列标志,即可鉴定蛋白质结合区的DNA序列确定蛋白质在DNA上的结合位点。图25-1DNase I足迹法的原理460第五篇医学分子生物学专题(2)用化学试剂进行足迹分析:化学足迹法(chemical footprinting)是利用能切断DNA骨架的化学试剂处理DNA-蛋白质复合物,由于化学试剂无法接近结合了蛋白质的DNA区域,因此在电泳上形成空白区域的位置就是DNA结合蛋白的结合位点。最常用的化学足迹法是经自由基足迹法(hydroxyl radica l footprinting)。 轻自由基足迹法利用轻自由基攻击DNA分子表面的脱氧核糖骨架,若DNA结合蛋白将脱氧核糖遮盖,则自由轻基无法靠近,于是便可在凝胶电泳中出现缺失条带的现象。由千轻自由基分子量小,不受本身空间位阻的影响,相对于DNase I和核酸外切酶皿足迹法而言,轻自由基足迹法产生的足迹更小,更有利于确定蛋白质在DNA上的结合位点。 还可用电泳迁移率变动分析和染色质免疫沉淀技术鉴定启动子,电泳迁移率变动分析(electrophoretic mob山ty shift assay, EMSA)和染色质免疫沉淀(chromatin immuno-pre cipitation, ChIP)技术的原理见第二十四章。由于EMSA和ChIP均只能确定DNA序列中含有核蛋白结合位点,故尚需结合DNA足迹实验和DNA测序等技术来确定具体结合序列。 (三)转录起始点的确定采用生物信息学、直接克隆测序法和5'-RACE法在原核或真核生物,RNA聚合酶通过识别和结合启动子而在基因的转录起点(TSS)启动基因的转录。此处主要介绍分析真核生物基因TSS的技术。 1.用数据库搜索TSS目前,数据库巳成为搜索TSS的重要工具。利用对寡核昔酸帽法构建的全长cDNA文库5'-末端测序所得的数据信息建立了一个TSS数据库(database of trans cription start sites, DBTSS),并在此基础上,通过将寡核昔酸帽法和大量平行测序技术相结合开发了一种TSS测序法,从而实现了一次测试可产生1xl07个TSS的数据。由此可见,利用数据库资源可以为基因TSS的鉴定提供重要参考。 2.用cDNA克隆直接测序法鉴定TSS最早对TSS的鉴定方法就是直接对cDNA克隆进行测序分析。以mRNA为模板,经逆转录合成cDNA第一链,同时利用逆转录酶的末端转移酶活性,在cDNA第一链的末端加上polyC尾,并以此引导合成cDNA第二链。将双链cDNA克隆千适宜载体,通过对克隆cDNA的5'-末端进行测序分析即可确定基因的TSS序列。该方法比较简单,尤其适于对特定基因TSS的分析。但该方法依赖于逆转录合成全长cDNA,一旦cDNA的5'-末端延伸不全,或在逆转录之前或过程中mRNA的5'-末端出现部分降解,便可导致5'-末端部分缺失,从而影响对TSS的序列测定。 3.用5'-cDNA末端快速扩增技术鉴定TSS5'-cDNA末端快速扩增技术(5'-rapid amplification of cDNA end,5'-RACE)是一种基于PCR从低丰度的基因转录本中快速扩增cDNA5'-末端的有效方法。以下简要介绍一种利用高特异性5'-RACE法鉴定TSS的技术(图25-2):心用碱性磷酸酶去掉总RNA中裸露的5'-磷酸基团;@用烟草酸焦磷酸酶去掉mRNA的5'-帽子结构,保留一个磷酸基团;@用T4RNA连接酶将5'-RACE适配体(5'-RACE adapter)连接到去帽mRNA的5'-末端;@以上述带有5'-RACE适配体的mRNA为模板,用逆转录酶和随机寡核昔酸引物进行逆转录合成cDNA;@巢式PCR反应:先用下游外侧基因特异性引物(gene specific primer1, GSPl)和5'-RACE外侧引物进行外侧PCR反应;然后再使用下游内侧基因特异性引物(GSP2)和5'-RACE内侧引物进行内侧PCR反应;@通过对最终的PCR产物直接进行DNA测序或先进行DNA克隆后再测序,从而明确特定基因的TSS序列。 在5'-RACE的基础上,通过在转录本5'-末端引入特殊的II型限制性内切酶识别位点,可将多个5'-末端短片段串联在一起,进而通过对串联片段的一次测序可获得多个基因的TSS序列信息。常用的技术包括5'-末端基因表达系列分析(5'-end seria l analysis of gene expression,5'-SAGE)和帽分析基因表达(cap analysis gene expression, CAGE)技术。RNA5'm7G-p-p-p AAA...3'全长mRNA5'3'降解的mRNA,rRNA,tRNA和DNA5'p t用TAP处理AAA...3'去帽的全长mRNA5'5'RACE接头卜连接AAA...3'去帽的mRNA与5'RACE接头结合5'AAA...3'cDNA随机9核昔酸引物(四)其他顺式作用元件的确定顺式作用元件(cis-acting element)指存在于基因非编码序列中,能影响编码基因表达的序列。除上文所描述的顺式作用元件外,增强子、沉默子、绝缘子等都可以参与基因表达调控,因发挥重要的调控作用而被广泛关注。 增强子指能增加同它连锁的基因转录效果的DNA序列。增强子是通过启动子来增加转录的。有效的增强子可以位于基因的5'-端,也可位于基因的3'-端,有的还可位于基因的内含子中。增强子的效应很明显,一般能使基因转录效果增加l0~200倍,有的甚至可以高达上千倍。例如,人珠蛋白基因的表达水平在巨细胞病毒(cytomegalovirus, CMV)增强子作用下可提高600-1000倍。增强子的作用同增强子的方向(5'-+3'或3'-+5')无关,甚至远离靶基因达几于kb也仍有增强作用。常用于鉴定增强子的方法包括染色质免疫共沉淀技术(ChIP)结合测序技术(ChIP-seq)和位点特异性整合荧光激活细胞分选测序技术(site-specific integration fluorescenc e-activated cell sorting followed by sequencing, SIF-seq)分析法。 沉默子是基因的负调控元件。真核细胞中沉默子的数量远远少于增强子。沉默子的DNA序列被调控蛋白质结合后阻断了转录起始复合物的形成或活化,使基因表达活性关闭。绝缘子(insulator)是一类特殊的顺式作用元件,它不同千增强子,其功能是阻止激活或阻遏作用在染色体上的传递,使染色质的活性限定于结构域之内。如果将一个绝缘子置于增强子和启动子之间,它能阻止增强子对启动子的激活。另外,如果一个绝缘子在活性基因和异染色质之间,则可以保护该基因免受异染色质化而失活。这些性质说明绝缘子可能影响染色质的组织结构。 近几年来,利用染色质免疫共沉淀技术、染色体构象捕获(chromosome conformation capture,3C)等表观遗传学技术,结合芯片或新一代测序技术等高通量技术平台,以及生物信息学分析手段来鉴定这些具有调节基因表达的顺式作用元件,已经成为后基因时代的研究热点和发展趋势。 二、检测基因的拷贝数是了解基因表达丰度的重要因素分析某种基因的种类及拷贝数,实质上就是对基因进行定性和定量分析,常用的技术包括DNA印迹(Southern印迹)、实时定量PCR技术等(见第二十四章)。DNA印迹是根据探针信号出现的位置和次数判断基因的拷贝数。一般情况下,DNA印迹可以准确地检测位于基因组不同位置上的相同拷贝基因,但如果基因的多个拷贝成簇地排列在基因组上,则应配合DNA测序进行分析。DNA印迹除462第五篇医学分子生物学专题了作为基因拷贝数的检测方法外,还常用于基因定位、基因酶切图谱、基因突变和基因重排等分析。实时定量PCR是通过被扩增基因在数量上的差异推测模板基因拷贝数的异同。DNA测序是最精确的鉴定基因拷贝数的方法。 三、分析基因表达的产物可采用组学方法和特异性测定方法基因表达产物包括RNA和蛋白质/多肤,因此分析基因表达可以从RNA和蛋白质/多肤水平上进行。在1968年中心法则确立前后的数年间,只能通过测定代谢酶活性,或采用核素标记结合原位杂交、凝胶电泳、放射自显影分析基因表达。20世纪70年代中期以后,RNA印迹(1977年)和蛋白质印迹(1979年)成为分析特异基因表达的常规技术。DNA克隆技术的诞生(1973年)推动了基因组DNA和cDNA的分离与鉴定;1980—1990年间,积累了大量EST;1990年代初,各种DNA、EST、mRNA数据库应运而生。随后,PCR(1986年),特别是实时定量PCR与数据库检索相结合,通过合成特异引物检测基因表达几乎取代了先前的RNA印迹。随着人类基因组测序的完成,为了满足基因功能诠释和从“组学“水平揭示基因表达谱的需要,各种生物芯片(包括核酸和蛋白质芯片)技术应运而生,结合20世纪80~90年代建立的转基因、基因敲除/敲入技术,基因表达及功能分析技术日趋成熟。 (一)通过检测RNA在转录水平分析基因表达 根据分析方法的原理和功能特性,可将基因转录水平分析分为封闭和开放性系统研究方法。封闭性系统研究方法(如DNA芯片、R NA印迹、实时RT-PC R等)的应用范围仅限于巳知基因。开放性系统研究方法(如差异显示P C R、双向基因表达指纹图谱、分子索引法、随机引物PCR指纹分析等)可用于发现和分析未知基因。此处主要介绍常用的针对已知基因的转录水平分析技术。 1.用核酸杂交法检测RNA表达水平核酸分子杂交法是目前生物化学及分子生物学研究领域应用非常广泛的技术之一,是定性或者定量特异性检测RNA序列片段的有效工具。 (1)用RNA印迹分析RNA表达:RNA印迹,也称Northern印迹,被广泛应用于RNA表达分析,并作为鉴定RNA转录本、分析其大小的标准方法。尽管RNA印迹并不适合高通量分析,但对于那些通过差异显示RT-PCR或DNA芯片等技术获得的差异表达的RNA,可用RNA印迹来确证;对于新发现的cDNA序列,以其为探针对组织或细胞的RNA样品进行RNA印迹分析,可确定与之互补的RNA真实存在。 (2)用核糖核酸酶保护实验分析RNA水平及其剪接情况:RNA酶保护实验(ribonuclease protection assay, RP A)是一种基于杂交原理分析RNA的方法,既可进行定量分析,又可研究其结构特征。RPA的原理如图25-3:用含特定DNA序列的质粒为模板,经体外转录,制备RNA探针;将标记的RNA探针与样品RNA杂交后,经只水解单链RNA的RNA酶处理,即可去除游离探针及双链RNA中的单链区域,而使杂交双链RNA受到保护不被消化。回收杂交双链并进行变性聚丙烯酰胺凝胶电泳后,通过检测探针标记物便可显示对应千探针大小的RNA片段。 RPA技术可对RNA分子的末端以及外显子/内含子的交界进行定位,确定转录后RNA的剪接途径。此外,RPA还可用于特定RNA的丰度分析。与RNA印迹相比,RPA的灵敏度和分析效率更高,该方法可在一次实验中同时分析几种mRNA,但因每一个探针的实验条件需认真优化,因此这一方法不适于高通量分析。 (3)用原位杂交进行RNA区域定位:原位杂交(in situ hybridization, ISH)是通过设计与目标RNA碱基序列互补的寡核昔酸探针,利用杂交原理在组织原位检测RNA的技术,其可对细胞或组织中原位表达的RNA进行区域定位,同时也可作为定量分析的补充。 2用PCR技术检测RNA表达水平PCR技术是目前生物化学与分子生物学领域应用最为便捷、广泛的技术,可快速对RNA分子进行定量或者定性检测。 5'~待克隆目的片段3'T7或SP6 ,一.......,··一 限制性内切酶 使载体线性化」 _5'.产3'T7或SP6 依赖DNA的5'总RNA池3' RNA聚合酶l标记的单核昔酸 杂交反应 3◄标记的反义RNA探针5'』5'3' 变性电泳检测 RNA探针工l RNA杂交片段/~_ 固25-3核糖核酸酶保护实验的原理 3.用基因芯片和高通量测序技术分析RNA表达水平基因芯片和高通量测序技术的应用大大加速了揭示基因组、转录组结构与功能的步伐,是目前宏观分析RNA表达的有效技术手段。 (I)基因芯片已成为基因表达谱分析的常用方法:目前,基因芯片(见第二十四章)技术巳广泛应用于基因表达谱分析,主要采用cDNA芯片,其便于对不同状态(如生理和病理条件)下的基因表达谱进行比较,揭示转录组差异表达的规律,对探索发病机制、评价治疗效果、筛选药物靶标具有重要意义。 (2)用循环芯片测序技术分析基因表达谱:运用循环芯片测序技术(即第二代测序技术),可对基因表达谱进行高通最分析,一次可完成几十万到几百万个DNA分子片段的序列测定,从而快速获得转录组或基因组的全貌。除用千DNA测序外,循环芯片测序技术还广泛应用千基因组分析的各个方面:在DNA水平上,可以大规模地分析基因组甲基化、筛选突变基因、检测基因多态性;在RNA水平上,可以对RNA片段进行扫描、定量与鉴定,对全基因组进行广谱表达研究等。循环芯片测序技术的另一个广泛应用领域是小分子RNA或非编码RNA的研究。 (二)通过检测蛋白质/多肤而在翻译水平分析基因表达蛋白质/多肤是结构基因表达的最终产物,其质和量的变化直接反映了基因的功能。以下简要介绍几种检测蛋白质/多肤的技术。 1.用蛋白质印迹技术检测蛋白质/多肤蛋白质印迹技术的原理见第二十四章。该技术需要将蛋白质/多肤转移到固相支待物上进行检测。 2用酶联免疫吸附实验分析蛋白质/多肤与蛋白质印迹相似,酶联免疫吸附实验(ELISA)也是\mfi464第五篇医学分子生物学专题一种建立在抗原-抗体反应基础上的蛋白质/多肤分析方法,其主要用于测定可溶性抗原或抗体,该方法需要将已知抗原或抗体吸附于固相载体(如聚苯乙烯微量反应板)表面,使抗原-抗体反应在固相表面进行。常用的ELISA方法包括双抗体夹心法、间接法、酶联免疫斑点实验(ELISPOT)以及生物素亲和素系统-ELISA(b iotin avidin system ELISA, BAS-ELISA)。 5.用蛋白质芯片分析蛋白质/多脓表达水平用蛋白质芯片分析蛋白质/多肤的表达谱:运用蛋白质芯片可高通量分析蛋白质/多肤的表达和功能。根据制作方法和用途不同,可将其分为蛋白质检测和功能芯片两大类。蛋白质检测芯片包括抗体芯片、抗原芯片、配体芯片等,它是将具有高亲和力的特异性探针分子(如单克隆抗体)固定在基片上,用以识别生物样品溶液中的目标多肤;蛋白质功能芯片可用来研究蛋白质修饰、蛋白质-蛋白质/蛋白质-DNA/蛋白质-RNA,以及蛋白质与脂质、蛋白质与药物、酶与底物、蛋白质-小分子等的相互作用。 与基因芯片类似,蛋白质芯片可用于检测组织/细胞来源的样品中蛋白质的表达谱;其精确程度、信息范畴取决于芯片上已知多肤的信息多寡。由于多肤合成昂贵,蛋白质来源受限,加之蛋白质操作技术难,使蛋白质芯片的应用受到限制。 6.双向电泳高通量分析蛋白质表达谱用双向电泳分析蛋白质/多肤表达谱:双向电泳可同时分离成百上千的蛋白质(见第一章)。电泳结果经染色后,既可对不同样品中蛋白质的表达谱进行比较;还可以从凝胶中将特定的蛋白质点切下,经胰蛋白酶消化后得到短肤片段,利用质谱技术进行定性分析,对差异表达的蛋白质进行鉴定。 第二节基因功能研究 基因的功能就是基因产物的功能,也就是编码基因的蛋白质功能和非编码基因RNA的功能,前者是本节讨论的重点。非编码RNA,如miRNA、lncRNA等所谓的调节RNA功能,最近引起了广泛的关注,可参考基因表达调控的相关章节内容。基因产物的功能可以从三个不同水平来描述:心生物化学水平,主要描述基因产物参与了何种生化过程,如蛋白激酶、转录因子等;@细胞水平,主要论述基因产物在细胞内的定位和参与的生物学途径,例如,某蛋白质定位于核内,参与DNA的修复过程,有可能并不了解确切的生物化学功能;@整体水平,主要包括基因表达的时空性及基因在疾病中的作用。对人类基因功能的研究是后基因组时代生命科学领域中的重大命题。通过基因功能的研究可以阐明人体细胞的增殖、分化、衰老、死亡和通讯等方面的分子机制,确定人类疾病发生发展及转归的机制,进而研发新的诊断技术及治疗干预措施,提供药物开发的靶标分子,是开展精准医疗的基础包。 一、生物信息学全面了解基因已知的结构和功能 江在以往的研究中,已经对大量的基因功能产物的功能有了详尽的了解,获得了足够多的信息,建立了共享资源数据库,其中最为著名的就是美国的GenBank。这些数据库是进行基因序列比对,诠释基因功能的基础。依据分子进化的理论,核酸或氨基酸序列相似的基因,应表现出类似的功能。这些序列相似的基因称之为同源基因。基本的方法是基因序列比对分析。 两个或多个符号序列按字母比较、尽可能确切地反映它们之间的相似和差异,称为序列比对,又称序列联配。通常所讲的序列比对包括核酸序列比对和蛋白质序列比对。根据每次参与比对的序列数又可分为双序列比对和多序列比对。常用的生物信息数据库网址见表25-1。 数据库名称数据库服务器网址 EBI http:II吓w. ebi. ac. uk/GenBank.恤··••一一~恤----.--~. http:llww..v. ncbi. nlm. nih. govlGSDB(Genome Sequence Database)http:II=叩.ncgr. org:801gsdbNCBI http:II叭叩.ncbi. nlm. nih. govlSWISS-PROT http:lh'vWlv. ebi. ac. uk. swissprot/二、基因发挥作用的本质是其编码产物的生物化学功能人类基因组DNA有3xl09bp,包括2万个蛋白质编码基因,决定了人类作为高等动物及其复杂的生物学性状。编码基因表达的蛋白质分子包括:转录因子,是一类能与基因调控区域专一性结合的蛋白质分子,调控基因表达的时空性;核骨架蛋白质,是由纤维蛋白构成的网架结构,维待细胞核的基本结构;信号分子,一类参与胞内信号转导的蛋白质分子;酶,是一类生物催化剂,支配着生物的新陈代谢参与营养和能量转换等许多催化过程,与生命过程关系密切的反应大多是酶催化反应;细胞骨架蛋白质,是由蛋白质与蛋白质搭建的骨架网络结构,主要作用是维待细胞的一定形态;细胞膜受体,位千细胞质膜上,用千识别和结合小的非脂溶性信号分子;离子通道蛋白质,是横跨质膜的亲水性通道,允许适当大小的离子顺浓度梯度通过;转运体,是一类具有从胞外向胞内转运物质的蛋白质分子;激素,是一类由分泌细胞合成的信号分子,可调节机体的代谢、生长、发育、繁殖、性别、性欲等重要生命活动;细胞因子,是一类由免疫细胞(如单核、巨噬细胞、T细胞、B细胞、NK细胞等)和某些非免疫细胞(内皮细胞、表皮细胞、纤维母细胞等)经刺激而合成、分泌的一类具有广泛生物学活性的小分子蛋白质,可调节细胞生长、分化,调控免疫应答;抗体,是一种由浆细胞(效应B细胞)分泌,被免疫系统用来鉴别与中和外来物质如细菌、病毒等的大型Y形蛋白质;凝血因子,是一类参与血液凝固过程的蛋白质组分;载体蛋白,是血浆中可与一些不溶或难溶于水的物质,以及一些易被细胞摄取或易随尿液排出的物质结合的蛋白质;细胞外基质蛋白,是由细胞合成并分泌到细胞外、分布在细胞表面或细胞之间的大分子,主要是胶原蛋白或蛋白聚糖,支持并连接组织结构、调节组织的发生和细胞的生理活动。 在一些情况下,即使对基因的序列、结构和表达模式有清楚的认识,但仍然难以阐明基因所表达的蛋白质的功能。此时通过研究该蛋白质与已知功能蛋白质的相互作用,无疑将非常有助于对该蛋白质功能的了解。例如,某一未知功能的新蛋白质与另一参与RNA剪接的蛋白质存在相互作用,极有可能该蛋白质也参加了RNA的剪接过程。研究蛋白质相互作用的方法包括遗传学、生物化学和物理学方法。遗传学方法仅用千如果蝇、酵母等模式生物,而生化和物理的方法可直接用千人类细胞。常用的生化方法是亲和层析和免疫共沉淀。常用的高通掀筛查蛋白质间相互作用的方法是酵母双杂交技术(见第二十四章)和噬菌体展示技术。 噬菌体展示(phage display)是将外源性DNA插入到噬菌体衣壳蛋白编码基因中的一种表达克隆师466第五篇医学分子生物学专题技术。重组基因以融合蛋白的形式,掺入病毒颗粒中,展示在噬菌体的表面。融合噬菌体可与表面展示的外源蛋白质相互作用的蛋白质结合,以筛查蛋白质的相互作用。噬菌体展示的缺点在千其本身是一种体外分析系统,另外,只有短肤可以展示在噬菌体表面。噬菌体展示也可用千抗体工程和普通的蛋白质工程。 三、利用工程细胞研究基因在细胞水平的功能 在细胞水平研究基因功能,除了观察细胞在实验条件下该基因表达的改变,更重要的是人为地导入外源基因或干预正常基因的表达,以观察细胞生物学行为的改变。(一)采用基因重组技术建立基因高表达工程细胞系采用基因重组技术,将外源基因导入宿主细胞,使其表达目的基因,进而观察细胞的生物学特征改变。根据外源基因在宿主细胞表达的待续时间,可区分为瞬时转染和稳定转染细胞。稳定转染细胞是一种最常用的细胞水平的转基因模型,外源基因通过转基因过程插入到细胞的染色体中,或以游离基因(episome)的形式存在于细胞中稳定表达。稳定表达外源蛋白的转染细胞可以用作基因功能研究的细胞模型,也可以利用这种方法获得外源基因产物,目前被广泛应用于细胞模型的建立。 (二)基因沉默技术抑制特异基因的表达 在细胞水平沉默研究基因的表达,进而观察基因沉默后细胞的生物学行为改变,是基因功能研究的有力工具。可以利用RNA干扰技术、反义技术以及基因组编辑(genome editing)技术等来实现对特定基因表达的抑制。其中利用成簇规律间隔短回文重复(clustered regulatory interspaced short palindromic repeat, CRISPR)技术进行基因敲除,近年来发展迅猛并广泛应用于细胞、动物水平的特定基因沉默。 四、利用基因修饰动物研究基因在体功能 人类基因组计划虽然解析了基因序列,但绝大多数基因的功能尚不清楚。因此,利用各种技术手段研究基因的功能将是”后基因组时代”的主要内容之一。基因功能的确定必须通过实验来验证。通常采用基因功能获得和(或)基因功能缺失的策略,观察基因在细胞或生物个体中所导致的细胞生物学行为或个体表型遗传性状的变化,从而从正反两方面对基因的功能进行鉴定。此外,基于正向遗传学的随机突变筛选技术也成为揭示基因功能的重要手段。由于基因的功能必须在完整的生物个体及其生命过程中才能得到完整的体现,因此,从整体水平研究基因的功能是必然的选择国。 (一)用功能获得策略鉴定基因功能 基因功能获得策略的本质是将目的基因直接导入某一细胞或个体中,使其获得新的或更高水平的表达,通过细胞或个体生物性状的变化来研究基因功能。常用的方法有转基因技术和基因敲入技术。 1.用转基因技术获得基因功能转基因技术(transgenic technology)是指将外源基因导入受精卵或胚胎干细胞(embryonic stem cell),即ES细胞,通过随机重组使外源基因插入细胞染色体DNA,随后将受精卵或ES细胞植入假孕受体动物的子宫,使得外源基因能够随细胞分裂遗传给后代。 转基因动物(transgenic animal)是指应用转基因技术培育出的携带外源基因,并能稳定遗传的动物,其制备步骤主要包括转基因表达载体的构建、外源基因的导入和鉴定、转基因动物的获得和鉴定、转基因动物品系的繁育等。在转基因动物中,以转基因小鼠最为常见。建立转基因小鼠的常用方法有两种,一是直接将目的DNA显微注射到受精卵的雄性原核,然后植入假孕母鼠体内,使之发育成幼仔;二是将带有目的基因的ES细胞注射到猴胚,然后在小鼠体内发育成幼仔。在出生的动物中即含有在一个等位基因的位点进行了DNA整合的小鼠,即转基因杂合子。经子代杂合子交配,在其后代中可筛选到纯合子(图25-4)。 `1,3利用转基因动物模型研究外源基因,能够接近真实地再现基因表达所导致的结果及其在整体水第二十五章基因结构功能分析和疾病相关基因鉴定克隆467检测子代是否存在植入假孕转移基因或基因1。“O O O O O O'/0|的ES 过杂合子后代,获得纯合子转 同源重组将筛选的或基因敲除/敲动物胚胎干细胞(ES)敲除/敲人ES注人细胞平的调控规律,把复杂的系统简单化,具有系统性和独立性。利用转基因技术建立的疾病动物模型具有遗传背景清楚、遗传物质改变简单、更自然更接近疾病的真实症状等优点。 然而,转基因动物模型仍存在一些亟待解决的问题,如外源基因插入宿主基因组是随机的,可能产生插入突变,破坏宿主基因组功能;外源基因在宿主染色体上整合的拷贝数不等;整合的外源基因遗传丢失而导致转基因动物症状的不稳定遗传等。为解决上述问题,可以在转基因动物利用组织特异性启动子实现外源基因的时空特异性表达,或用化学或生物分子作为诱导剂,实现对外源基因表达时间及水平的精确控制。 2.用基因敲入技术获得基因的功能基因敲入(gene knock-in)是通过同源重组的方法,用某一基因替换另一基因,或将一个设计好的基因片段插入到基因组的特定位点,使之表达并发挥作用。通过基因敲入可以研究特定基因在体内的功能;也可以与之前的基因的功能进行比较;或将正常基因引入基因组中置换突变基因以达到靶向基因治疗的目的。 基因敲入是基因打靶(gene targetin g)技术的一种。基因打靶是一种按预期方式准确改造生物遗传信息的实验手段。该技术的巧妙之处在千将ES细胞技术和DNA同源重组技术结合起来,实现对染色体上某一基因的定向修饰和改造,从而深入地了解基因的功能。基因打靶的原理如图25-4:心从小鼠巍胚(受精卵分裂至8个细胞左右即为毅胚,此时受精卵只分裂不分化)分离出未分化的ES细胞;@然后利用细胞内的染色体DNA与导入细胞的外源DNA在相同序列的区域内发生同源重组的原理,用含有筛选标记的打靶载体,对ES细胞中的特定基因实施“打靶”;@将“中靶"的ES细胞移植回小鼠襄胚,进而与壺胚一起分化发育成相应的组织和器官,最后产生出具有基因功能改变的"嵌合鼠"。由于“中靶"的ES细胞保持分化的全能性,因此它可以发育成为嵌合鼠的生殖细胞,使得经过定向改造的遗传信息可以代代相传。 除基因敲入外,基因打靶还包括基因敲除、点突变、缺失突变、染色体大片段删除等。基因打靶与转基因技术均可用于基因功能研究,但两者的最大区别就是基因打靶能去除和(或)替换生物体内的固有基因,而转基因技术则未去除或替换固有基因。目前,基因打靶巳成为研究基因功能最直接和最468第五篇医学分子生物学专题(二)用功能失活策略鉴定基因功能基因功能失活策略的本质是将细胞或个体的某一基因功能部分或全部失活后,通过观察细胞生物学行为或个体遗传性状表型的变化来鉴定基因的功能。常用的方法主要有基因敲除和基因沉默技术。 1.用基因敲除技术使基因功能完全缺失基因敲除(gene knock-out)属于基因打靶技术的一种(见图25-4),其利用同源重组的原理,在ES细胞中定点破坏内源基因,然后利用ES细胞发育的全能性,获得带有预定基因缺陷的杂合子,通过遗传育种最终获得目的基因缺陷的纯合个体。 然而,基因被完全敲除之后使得表型分析受到很多限制,例如,有些重要的靶基因被敲除后会引起胚胎早期死亡,使得无法分析该基因在胚胎发育晚期和成年期的功能;某些基因在不同的细胞类型中执行不同的功能,完全敲除会导致突变小鼠出现复杂的表型,使研究者很难判断异常的表型是由一种细胞引起的,还是由几种细胞共同引起的。为了克服以上不足,条件性基因敲除(conditional gene knock-out)技术应运而生,该技术可以更加明确地在时间和空间上操作基因靶位,敲除效果更加精确可靠,理论上可达到对任何基因在不同发育阶段和不同器官、组织的选择性敲除。 Cre/loxP系统的条件敲除的原理:如图25-5, Cre重组酶属于位点特异性重组酶,能介导两个34bp的loxP位点之间的特异性重组,使loxP位点间的序列被删除。重组酶介导的条件性基因敲除通常需要两种小鼠,一种是在特定阶段、特定组织或细胞中,表达Cre重组酶的转基因小鼠;另一种是在基因组中引入了loxP位点的小鼠,即靶基因或其重要功能域片段被两个loxP位点错定的小鼠。两种小鼠交配后,Cre基因表达产生的Cre重组酶就会介导靶基因两侧的loxP间发生切除反应,结果将一个loxP和靶基因切除。由千可以控制Cre重组酶在特定阶段、特定组织或细胞中表达,使得Cre介导的重组可以发生在特定的阶段、组织或细胞中,导致这些组织或细胞中的靶基因在特定的阶段被敲除,而其他组织或细胞中因不表达Cre而使得靶基因不被敲除。 交配 靶基因被两个loxP位点连接在组织/细胞特异性启动子P之后,描定的转基因小鼠表达Cre重组酶的转基因小鼠Cre重组酶以组织/细胞特异的方式介导靶基因两侧的loxP间发生切除暑特异组织/细胞的中靶基因被敲除条件性基因敲除的优势在千克服了重要基因被敲除所导致的早期致死,并能客观、系统地研究基因在组织器官发生、发育以及疾病发生、治疗过程中的作用和机制。但这一技术亦存在一些缺点,如心L费用太高、周期较长,而且许多基因在敲除后,可能是这些基因的功能被其他基因代偿,并未产生明显第二十五章基因结构功能分析和疾病相关基因鉴定克隆469的表型改变。 2.用基因沉默技术可使基因功能部分缺失基因沉默策略通常是利用反义技术,在转录或翻译水平特异性阻断(或封闭)某些基因的表达(即沉默相应基因),然后通过观察细胞生物学行为或个体遗传性状表型的变化来鉴定基因的功能。以下简要介绍几种常用的基因沉默技术。 (1)用RNA干扰(RNA interference, RN Ai)技术研究基因功能:利用RNAi能在短时间内高效特异地抑制靶基因表达的特点,可以很方便地研究基因的功能。用于基因沉默的干扰小RNA(smal l interfering RNA, siRNA)既可以在体外进行化学合成或体外转录生成,也可以基于具有合适启动子的载体或转录元件,在哺乳类动物或细胞中转录生成。 研究者既可以将siRNA导入特定细胞,在细胞水平上研究基因的功能;也可以通过转基因的方法,在动物体内实现特异、稳定、长期地抑制靶基因的表达,从而在整体水平上研究基因的功能。与基因敲除相比,RN扣技术具有简单、易操作、周期短等优势,因此已被作为一种简便和有效的工具而广泛用于基因功能的研究。然而,该技术可能对靶基因的相似序列发生作用,导致脱靶(off-targeting)效应。 (三)用随机突变筛选策略鉴定基因功能 尽管利用转基因、基因敲入/敲除、基因沉默等技术,从特定基因的改造到整体动物表型分析的“反向遗传学”研究大大推动了功能基因组学的进展,但是也存在明显的局限性:首先,由于生物体的代偿机制,使得基因敲除动物常常观察不到异常表型;其次,由于“反向遗传学”只能对已知基因进行研究而人类基因组中尚有90%以上的非编码序列处于未知状态;第三,由于“功能缺失”和“功能获得“小鼠常出现胚胎期死亡,而目前可用于条件性基因改造的启动子还很少,从而阻碍了特定基因在成体动物中的功能分析;第四,由于一个蛋白质有多个不同的功能域,特定基因在不同位点上的突变可能产生不同的表型,应用单一的”功能缺失”方法,显然不可能发现这些不同的异常表型。因此,只应用“反向遗传学”不足以完成功能基因组学的任务,而基千“正向遗传学”的、从异常表型到特定基因突变的随机突变筛选策略逐渐受到青眯。 随机突变筛选策略的第一步是通过物理诱变、化学诱变或生物技术产生大量的基因组DNA突变。其中乙基亚硝基脉(ethyl nitrosourea, ENU)诱变是近年来发展起来的研究基因功能的新手段。ENU是一种化学诱变剂,它通过对基因组DNA碱基的烧基化修饰,诱导DNA在复制时发生错配而产生突变。它主要诱发单碱基突变,造成单个基因发生突变(双突变的情况非常少),更接近于人类遗传性疾病的基因突变情况。同时,ENU的突变效率非常高,可以达到0.2%,是其他突变手段的10倍左右。例如,经ENU处理可使雄鼠精子基因组发生点突变,进而使得后代小鼠有可能出现突变表型,经筛选及遗传试验即可得到突变系小鼠。通过对突变小鼠的深入研究、对突变基因定位以及位置候选法克隆突变序列,就会得到突变基因的功能信息。 另外,基因捕获(gene trapping)技术也是一种产生大规模随机插入突变的便利手段,对于揭示基因序列所对应的基因功能具有重要的应用价值。基因捕获技术的基本过程是:将一个含报告基因的DNA载体随机插入基因组,产生内源基因失活突变,通过报告基因的表达,提示插入突变的存在以及内源基因的表达特点。利用基因捕获可以建立一个携带随机插入突变的ES细洲ji}470第五篇医学分子生物学专题胞库,每一种ES细胞克隆中含有不同的突变基因,ES细胞克隆经燥胚注射发育为基因突变动物模型,通过对动物模型的表型分析鉴定突变基因的功能。基因捕获技术可节省大量构建特异打靶载体以及筛选基因组文库的工作和费用,成为可同时对基因的序列、基因的表达以及基因的功能进行研究的高效技术。 随机突变筛选策略能够获得研究基因功能的新材料以及人类疾病的新模型,这种”表型驱动”的研究模式有可能成为功能基因组学研究最有前景的手段和捷径之一。(四)利用基因编辑技术鉴定基因功能近几年来,越来越多专注千基因功能的研究取得了成功,同时,基因功能研究过程中所面临的诸多技术瓶颈也愈加凸显,以基因敲除/敲入等技术为中心的试验愈加不能满足功能研究与临床技术转化的需要。在过去一段时间中,以锌指核酸酶(zinc-finger nuclease, ZFN)和转录激活样效应因子核酸酶(transcription activator-like effector nuclease, TALEN)技术为代表的序列特异性核酸酶技术,以其能够高效率地进行定点基因组编辑,在基础研究、基因治疗和遗传改良等方面展示出了巨大的潜力。然而,由千ZFN和TALEN技术本身所存在的多种技术瓶颈,这两种技术并不能实现快速发展并满足各种科研和临床需求。令人振奋的是,最新问世的成簇规律间隔短回文重复(clustered regulatory interspaced short palindromic repeat, CRISPR)技术拥有其他基因编辑技术无可比拟的优势。通过不断的技术改进,CRISPR技术被认为能够在活细胞中最有效、最便捷地“编辑“任何基因。同时,基于CRISPR技术相对较低的实验成本和高成功率,该技术有望应用于临床药物研究与基因治疗,并巳在目前的商业化和临床转化过程中取得了令人瞩目的成就。 CRISPR是一种来自细菌降解入侵的病毒DNA或其他外源DNA的免疫机制。CRISPR系统共分成3类,其中I类和皿类需要多种CRISPR相关蛋白质即Cas蛋白,共同发挥作用,而II类系统只需要一种Cas蛋白即可,因此目前CRISPR/Cas9系统应用最为广泛。 Cas9蛋白含有两个核酸酶结构域,可以分别切割DNA两条单链。Cas9首先与crRNA及tracrRNA结合成复合物,然后通过PAM序列结合DNA,形成RNA-DNA复合结构,进而对目的DNA双链进行切割,使DNA双链断裂。优化和改造后的CRISPR/Cas9系统仅包括两个元素:Cas9蛋白和sgRNA(single guide RNA)。CRISPR/Cas9通过对预设的DNA位点进行切割,造成DNA双链断裂(doub le strand break, DSB),细胞内的修复机制随即启动,主要包括两种修复途径:一是非同源末端连接途径(non-homologous end joining, NHEJ),此修复机制非常容易发生错误,导致修复后发生碱基的缺失或插入,从而造成移码突变,最终达到基因敲除的目的。NHEJ是细胞内主要的DNA断裂损伤修复机制。利用靶向核酸酶可以在受精卵水平高效的实现移码突变,从而制备基因敲除模式动物。 二是DNA断裂修复途径为同源介导的修复(homology-direct ed repair, HR),这种基于同源重组的修复机制保真性高,但是发生概率低。在提供外源修复模板的情况下,靶向核酸酶对DNA的切割可以将同源重组发生的概率提高约1000倍。利用这种机制可以实现基因组的精确编辑,如:条件性基因敲除、基因敲入、基因替换、点突变等。 第三节疾病相关基因鉴定和克隆原则 确定疾病相关基因是一个艰巨复杂的系统工程,耗时耗钱,有的疾病基因的最终鉴定历时数十年。尽管人类基因组计划的完成,为疾病相关基因的鉴定提供了诸多的便利,但明确地解析疾病和某种基因的关系仍非易事,掌握鉴定疾病相关基因鉴定和克隆的原则,无疑将起到事半功倍作用,有助于鉴定疾病相关基因研究工作高效有序的开展。首先,确定疾病表型和基因实质联系是关键;其次,采用多途径、多种方法鉴定克隆疾病相关基因是手段;最终,确定候选基因,明晰基因序列的改变和疾病表型的关系,以了解基因致病的本质,是鉴定和克隆疾病相关基第二十五章基因结构功能分析和疾病相关基因鉴定克隆因的核心包。 —、鉴定克隆疾病相关基因的关键是确定疾病表型和基因间的实质联系疾病作为一种遗传性状,要确保其专一性和同质性。正确的疾病诊断非常重要。在一些复杂性疾病中,对疾病表型有必要进行进一步的分类,确保疾病的同质性,以减少临床的异质性。其次,需要确定疾病的遗传因素,即通过家系分析、李生子分析、领养分析和同胞罹患率分析等,确定遗传因素是否在疾病发病中的作用及其作用程度(遗传度)。在遗传因素作用较小的疾病中,鉴定并最终克隆疾病相关基因成功的可能性很小。一旦确定了遗传因素在疾病中的重要作用,就可进而确定存在千人类基因组中决定疾病表型的基因,确定该基因在基因组中的位置(位点)以及该位点和基因组其他位点的联系。 二、鉴定克隆疾病相关基因需要多学科多途径的综合策略鉴定疾病相关基因是一项艰巨的系统工程,需要多学科的紧密配合,针对不同疾病采用不同的策略。如图25-6所示,这些不同策略和方法互为补充,方可达到最终克隆疾病基因的目的。首动物模型病例家系数据库先通过对不同疾病家系的连锁分析,可粗略地将疾病的基因定位于某个染色体上。这些位点被称之为疾病的位点(locus),此时确切的基因尚不明了。随着对某些疾病发病机制的了解,可以进一步阐明疾病相关的蛋白质的生物化学和细胞生物学特征,以此为切入点,寻找基因结构的异常,确定基因DNA碱基序列突变及其导致蛋白质结构或表达异常的分子机图25-6疾病相关基因鉴定克隆策略示意图制,最终克隆疾病的基因。疾病动物模型对千疾病相关基因的克隆具有重要帮助。对不同的疾病动物模型的研究,可以确定导致实验动物异常表型的基因,进而鉴定人类的同源基因在疾病中的作用。借助生物信息数据库中有关待定基因的信息,也可极大地促进疾病相关基因克隆的效率。 三、确定候选基因是多种克隆疾病相关基因方法的交汇有许多途径能够达到最终鉴定疾病相关基因的目的,这些方法最终将交汇在候选基因上。一旦候选基因被鉴定,即可筛检病人中该基因的突变。候选基因可不依赖其在染色体位置而予以鉴定,但常用的策略仍然是首先找出候选染色体区域,然后在此区域内鉴定候选基因。人类基因组计划的完成提供了人类所有基因的信息。尽管从众多的候选基因中寻找基因突变,仍然是一项耗时的工作,但鉴定候选基因较以往还是相对容易。这是由于位置信息从2万个的基因降低到候选区域的10~30个基因。在候选区域内预测可能的候选基因并非易事,目前仍然缺乏这样的能力。需要的是大量重复、逐个排除,最终确定候选基因的突变以及这种突变和疾病的联系。 第四节疾病相关基因鉴定克隆的策略和方法 鉴定和克隆疾病相关基因的策略和方法主要包括,不依赖染色体定位的疾病相关基因克隆策略、定位克隆法、常见病的基因需要全基因组关联分析和全外显子测序法,以及生物信息数据库贮藏丰富的疾病相关基因信息检索法。 472第五篇医学分子生物学专题 —、疾病相关基因鉴定和克隆可采用不依赖染色体定位的策略不依赖染色体定位的疾病相关基因克隆策略包括功能克隆、表型克隆及采用位点非依赖的DNA序列信息和动物模型来鉴定和克隆疾病基因。 (-)从已知蛋白质的功能和结构出发克隆疾病基因在掌握或部分了解基因功能产物蛋白质的基础上,鉴定蛋白质编码基因的方法,称之为功能克隆(funct ional cloning)。这是相对于利用基因位置克隆基因的定位克隆而言的。该方法采用的是从蛋白质到DNA的研究路线,针对的是一些对影响疾病的功能蛋白具有一定了解的疾病,如血红蛋白病、苯丙酮尿症等出生缺陷引起的分子病可以采用这个方法定位和克隆疾病基因。 1.依据蛋白质的氨基酸序列信息鉴定克隆疾病相关基因如果疾病相关的蛋白质在体内表达丰富,可分离纯化得到一定纯度的足量蛋白质,就可用质谱或化学方法进行氨基酸序列分析,获得全部或部分氨基酸序列信息。在此基础上设计寡核昔酸探针,用于筛查cDNA文库,可筛选出目的基因。使用这种策略时,必须考虑到密码子的简并性特点,即除了甲硫氨酸和色氨酸仅有1个密码子外,其余氨基酸均有2个或2个以上的密码子。设计探针时应尽量避开有简并密码子的区域,但实际上往往难以做到。为此可以设计1套可能含有全部简并密码子信息的寡核背酸探针,用此混合探针去筛查cDNA文库,"钓出“目的基因克隆。除cDNA文库筛查技术外,目前还可采用部分简并混合寡核昔酸作为PCR引物,采用多种的PCR引物组合,以获得候选基因的PCR产物。 上述方法曾成功地用于锄状细胞贫血的基因克隆。首先,免疫电泳等方法已经显示出锦状细胞贫血病入的珠蛋白异常,获得部分氨基酸残基序列后,设计了简并寡核昔酸探针,筛选有核红细胞系的cDNA文库,得到了a珠蛋白基因的cDNA,与正常入的cDNA比较,发现了a珠蛋白基因变异。进而找出cDNA探针与染色体DNA序列间的同源互补关系,将人的a珠蛋白基因定位于第16号染色体上,并在此基础上,提出了分子病(molecular disease)的概念。 2.用蛋白质的特异性抗体鉴定疾病基因有些疾病相关的蛋白质在体内含量很低,难以纯化得到足够纯度的蛋白质用于氨基酸序列测定。但是少量低纯度的蛋白质仍可用于免疫动物获得特异性抗体,用以鉴定基因。获得的抗体一方面可用于直接结合正在翻译过程中的新生肤链,此时会获得同时结合在核糖体上的mRNA分子,最终克隆未知基因;另外,特异性抗体也可用来筛查可表达的cDNA文库,筛选出可与该抗体反应的表达蛋白质的阳性克隆,进而可获得候选基因。 功能克隆仍然是单基因疾病基因克隆的常用策略。其缺点是特异功能蛋白质的确认、鉴定及其纯化都相当困难,微量表达的基因产物在研究中难以获得,因而几乎不能用于多基因疾病的基因分离。 (二)从疾病的表型差异出发发现疾病相关基因 表型克隆(phenotype cloning)是疾病相关基因克隆领域中一个新的策略。该策略的原理是基千对疾病表型和基因结构或基因表达的特征联系已经有所认识的基础上来分离鉴定疾病相关基因。依据DNA或mRNA的改变与疾病表型的关系,可有几种策略:第一种策略是从疾病的表型出发,比较病人基因组DNA与正常人基因组DNA的不同,直接对产生变异的DNA片段进行克隆,而不需要基因的染色体位置或基因产物的其他信息。例如,在一些遗传性神经系统疾病中,病人基因组中含有的三联重复序列的拷贝数可发生改变,并随世代的传递而扩大,称为基因的动态突变。此时,采用基因组错配筛选(genome mismatch scannin g)、代表性差异分析(represen tative difference analysis, RDA)等技术即可检测病人的DNA是否有三联重复序列的拷贝数增加,从而确定患病原因。 第二种策略是针对已知基因。如果高度怀疑某种疾病是由千某个特殊的已知基因所致,可通过比较病人和正常对照间该基因表达的差异,来确定该基因是否为该疾病相关基因。常用分析方法有Northern印迹法、RNA酶保护试验、RT-PCR及实时定量RT-PCR等。 第三种策略是针对未知基因的,可通过比较疾病和正常组织中的所有mRNA的表达种类和含量间的差异,从而克隆疾病相关基因。这种差异可能源千基因结构改变,也可能源于表达调控机制的改变。常用的技术有mRNA差异显示(mRNA differential display, mRNA-DD)、抑制消减杂交(suppress i vesubtractive hybridization, SSH)基因表达系列分析(SAGE)、cDNA微阵列(cDNA microarray)和基因鉴定集成法(integrated procedure for gene id entification)等。这里仅分别介绍RDA和mRNA-DD技术。 1. RDA技术是建立在核酸差异杂交基础上的PCR技术RDA是通过对正常和疾病组织的cDNA差异片段(即代表性片段)的扩增,从而使其被检测和捕获的技术。基本原理是,首先用PCR方法从拟比较的疾病和正常组织获得足够量的DNA或cDNA片段;然后进行差异杂交,杂交后再用不同引物进行第二次PCR反应;在第二次PCR反应中,只有两个样品中结构或表达量有差异的DNA片段可以得到扩增(图25-7)。 检测DNA检测mRNA驱动DNA驱动mRNA t酶切i逆转录,酶切酶切i t逆转录,酶切 -~或cDNA片段DNA或cDNA片段====== 炉u接头亏t加接头宫 t第一次PCR扩增第一次PCR扩增i Il1-=}检测扩增子驱动扩增子'I,II}}'IIIIII+切去旧接头=t切去接头其基本步骤是:(j)DNA片段制备:分别提取正常人基因组DNA(检测DNA)和病人基因组DNA(驱动DNA),用限制性内切酶消化DNA,获得长度在150-lOOObp之间的片段;@获得扩增子:在两组的所有DNA片段上加上接头,以接头的互补序列为引物,进行第一步PCR扩增,所获得扩增产物称扩增子(amplicon);@更换接头:切去所有扩增子的接头,仅在检测扩增子上加上新的接头;@筛选扩增产物:按1:100的比例混合检测扩增子和驱动扩增子,进行液相杂交。取少量杂交反应物为模板,以新的接头为引物再进行第二次PCR扩增,即可筛选出两组DNA样品间的差异片段。 检测DNA和驱动DNA间片段在第二次PCR反应中依据两者间是否有差异,主要可以出现两种情况:(j)两组间相同的DNA片段不会得到大量扩增。这是因为在杂交反应中,驱动DNA片段的数目远大于检测DNA,将优先结合检测DNA,使得检测DNA分子间几乎没有机会形成同源复性双链。因此,利用新接头进行的二次PCR反应过程将不会有扩增产物。@两者的差异片段可得到扩增。如果检测DNA中存在的某一片段在驱动DNA中缺失,或由于突变而失去了互补结合能力,在杂交反应中就不存在来自驱动DNA中的同源片段的竞争,检测DNA自身可以发生复性,且由于复性的双链DNA两端都具有新接头,因而可以实现PCR的大凰扩增。该片段即为候选的疾病相关DNA序列。虽然反应中无差异片段还会存在一些被扩增的可能,但产物量较小,可以被排除。 RDA也可用于mRNA差异表达基因的克隆,只是需要先将mRNA逆转录成cDNA片段。RDA技术对正常和异常的DNA片段区分能力强、富集效率高、对起始材料要求低,利用RDA人们已经发现了多个疾病相关新基因。`叩f}474第五篇医学分子生物学专题2. mRNA-DD是RT-PCR技术和聚丙烯酰胺凝胶电泳技术的结合mRNA-DD又称为差异显示逆转录PCR(mRNA differential display reverse transcription PCR,DDRT-PCR)方法。该法利用可以扩增所有哺乳类生物mRNA的几条5'-端随机引物和几条3'-端铀定引物组合,用PCR的方法扩增正常人和患病个体的相应组织的cDNA。用聚丙烯酰胺凝胶电泳分离扩增产物,比较两组间产物的差异(图25-8)。依据理论计算,该方法所设计的组合引物可以与所有mRNA的poly(A)尾匹配,因而对于种类和含量相同的cDNA样品,PCR产物的种类多少和分布应该是完全一样的。如果在正常和病人的cDNA标本中扩增出一些不同长度的cDNA片段,它们所代表的cDNA就有可能与疾病状态相关。这一方法的优点在于所需mRNA量少、较快速、可同时显示多种生物性状的差异、可同时获得高表达和低表达的基因等。这种方法同时也存在许多严重的缺陷,如假阳性率高达70%、获得的片段太短等,很难直接判断其功能和意义。尽管有上述缺陷,但因其步骤较简单,可获得较大量信息,在实际工作中该法应用仍较多。 检测mRNA对照mRNA NM(T11)引物逆转录 差异条带 (三)采用动物模型鉴定克隆疾病相关基因 人类的部分疾病,已经有相应的动物模型。如果动物某种表型的突变基因定位于染色体的某一部位,而具有相似人类疾病表型的基因很有可能存在于人染色体的同源部位已。另外,当疾病基因在动物模型上已完成鉴定,还可以采用荧光原位杂交来定位分离人的同源基因。肥胖相关的瘦蛋白(leptin)基因的克隆就是一个成功例证。利用突变的肥胖近交系小鼠通过定位克隆分离得到了位千小鼠6号染色体的瘦蛋白基因,依据小鼠瘦蛋白基因侧翼标记,将人的瘦蛋白基因定位千人染色体7q31区。小鼠和人的瘦蛋白基因有84%的同源性,编码167个氨基酸残基的分泌性蛋白一瘦蛋白,其主要功能是控制食物的摄入,促进能量的消耗。肥胖小鼠和一些遗传性肥胖症病人均具有该基因的缺损,导致基因功能丧失。 二、定位克隆是鉴定疾病相关基因的经典方法 仅根据疾病基因在染色体上的大体位置,鉴定克隆疾病相关基因,称之为定位克隆(positional cloning)。定位克隆的起点是基因定位,即确定疾病相关基因在染色体上的位置,然后根据这一位置信息,应用DNA标记将经典的遗传学信息转换为遗传标记所代表的特定基因组区域,再以相关基因组区域的相连重叠群(contig)筛选候选基因,最后比较病人和正常人这些基因的差异,确定基因和疾病的关系已。人类基因组计划后所进行的定位候选克隆,是将疾病相关位点定位千某一染色体区域后,根据该区域的基因、EST或模式生物对应的同源区的已知基因等有关信息,直接进行基因突变筛查,通过多次重复,最终确定疾病相关基因。 (-)基因定位的方法有多种 基因定位(gene location)是基因分离和克隆的基础,目的是确定基因在染色体的位置以及基因在染色体上的线性排列顺序和距离。可从家系分析、细胞、染色体和分子水平等几个层次进行基因定位,由千使用手段的不同可派生出多种方法,不同方法又可联合使用,相互补充。 3.染色体异常有时可提供疾病基因定位的替代方法从基因定位克隆的角度来看,对于任何巳知与染色体异常(chromosome abnormalities)直接相关的疾病来说,染色体的异常本身就成为疾病定位基因克隆的一个绝好的位置信息。染色体的异常有时可替代连锁分析,用于定位疾病基因。在一些散发性、严重的显性遗传病,染色体变异分析是获得候选基因的唯一方法。有时可直接获得基因的正确位置,而无需进行连锁分析,例如染色体的平衡易位和倒位等。诸如多嵌肾、巨肠症、假肥大型肌营养不良基因的定位在很大程度上借助千染色体的异常核型表现。 如果细胞学观察的染色体异常与某一基因所表达的异常同时出现,即可将该基因定位千这一染色体的异常区域内。例如对一具有6号染色体臂间倒位的家系分析表现,凡是有此倒位者,同时也都有某-H队等位基因的表达;而家族中无此倒位者,也无该等位基因的表达,因此将该H且基因定于6号染色体短臂的远侧区。 染色体非整倍体分析中,可通过基因剂量法进行基因定位。在Down综合征(核型47,+21)的病人中过氧化物歧化酶-1的活性比正常人高I.5倍,因此将该酶基因定位于21号染色体上。但是并非所有基因的拷贝数都有明显的剂量效应作用。 4.连锁分析是定位疾病未知基因的常用方法基因定位的连锁分析(linkage analysis)是根据基因在染色体上呈直线排列,不同基因相互连锁成连锁群的原理,即应用被定位的基因与同一染色体上另一基因或遗传标记相连锁的特点进行定位。如果待定基因与标记基因呈连锁遗传,即可推断待定基因与标记基因处千同一染色体上,并且依据和多个标记基因连锁的程度(用两者间的重组率度量),可确定待定基因在染色体的排列顺序以及和标记基因间的遗传距离(用cM表示)。例如已知血炕」i}476第五篇医学分子生物学专题型基因Xs定位于X染色体上,普通鱼鳞病和眼白化病基因与其连锁,因此判定这两个基因也在X染色体上,计算病人子代的重组率,即可确定这些基因间的相对距离。(二)定位克隆疾病相关基因的过程包括三大步骤定位克隆疾病相关基因是鉴定遗传性疾病基因的主要手段,在早期的疾病基因鉴定工作中发挥了不可替代的作用,也获得了巨大的成功。随着人类基因组计划的完成,采用定位克隆疾病基因的方法,更加容易实施,其主要的过程包括三个步骤。 1.尽可能缩小染色体上的候选区域定位克隆疾病基因困难的大小取决于染色体候选区域的宽窄。为此要尽可能地缩小疾病相关基因在染色体上的候选区域。在单基因疾病基因的遗传制图时,需要选择更多的遗传标记,找出遗传距离最近的标记,增加更多的家系、建立所有个体的单倍体型等,以增加发现重组机会,结合寻找更多连锁不平衡,精确疾病相关基因的候选区域。 2.构建目的区域的基因列表由于入类基因组计划的完成,各种DNA分子水平上物理图谱的建立,已经使得疾病相关基因的克隆变得较为容易。现在已无需建立DNA重叠群,直接使用人类基因组的数据库,如基因组阅览器Ensembl(http:ll www. ensemble. org)或者the Santa Cruz阅览器(http:II genome. cse. ucsc. edu)就可直接显示候选区域巳肯定或可能的基因,但也不能完全依赖这些信息,要仔细检查重叠的拼装是否正确。当然,还要结合ENCODE计划的结果、非编码序列、选择性转录本等表达谱,获得更多候选区域的基因信息。 3.候选区域优先考虑基因的选择及突变检测为了鉴定突变,对无血缘关系的病人要进行DNA测序。可以测定候选区域所有的外显子,也可测定优先考虑基因的外显子,取决于研究策略、人力和财力的投入。可根据下列清况考虑该基因为优先考虑的基因:CD合适的表达:一个好的候选基因的表达模式应该和疾病表型相一致,该基因不一定特征性表达于病变组织,但至少在疾病发生前或发生时,疾病组织表达该基因,如神经管缺损的基因应该在神经管闭锁前,即人胚胎发育的3~4周表达。@合适的功能:候选区域的基因功能,如果已知,就易于作出决定。如fibrilli n和结缔组织疾病Marfan综合征的关系。一个新基因序列的分析提示有某种功能,如有跨膜基序或酪氨酸激酶基序等,就可和疾病的发病机制联系起来,作出判断。@同源性和功能关系:如果候选区域一个基因和已知的基因同源,不管是与入的间接同源(paralog),还是与其他种的直接同源(orthol og),而且也知道同源基因突变引起的相类似表型,该基因就有可能是疾病基因。候选基因的确定也可基于密切的功能关系,如受体和配体的关系,同一代谢或发育途径的组分等。近年来,对模式生物基因功能的认识,更多的同源基因的表型被鉴定,极大地促进了人类致病基因的鉴定克隆工作。 (三)假肥大型肌营养不良基因的克隆是定位克隆的成功例证采用定位克隆策略鉴定的第一个疾病相关基因是X连锁慢性肉芽肿病基因。而假肥大型肌营养不良(Duchenne muscular dystrophy, D MD)基因的成功克隆,更彰显了基因定位克隆的优势。这项工作主要分两个阶段。首先,根据患病女性X染色体与第21号常染色体的易位,以及男患儿发生小的Xp21.2缺失并伴发三种其他X连锁隐性遗传病,再运用RFLP连锁分析将DMD基因定位于Xp21。然后,分别克隆得到了基因的2个不同的片段,分别命名为XJ系列探针和pERT87系列探针,根据两片段的比较,证明DMD基因约为2300kb,占X染色体的1%以上,该基因编码肌营养不良蛋白(dystrophin),影响横纹肌和心肌的结构和收缩功能。 三、确定常见病的基因需要全基因组关联分析和全外显子测序基因连锁分析在定位克隆遗传性疾病的基因取得了成功,尽管鉴定复杂性疾病的易感基因采用了如罹患姊妹对(affec ted sib pa江,ASP)分析方法,也取得一些成功的例子,但总体来说,并不理想。从2005年以来,基于连锁不平衡(linkage disequilibrium)理论发展而来的全基因组关联研究(genomewide association study, GWAS),在复杂疾病的基因定位克隆中,发挥了巨大的作用。GWAS方法是一种在无假说驱动的条件下,通过扫描整个基因组观察基因与疾病表型之间关联的研究手段尽。具体操作中,通常收集成千上万个病人和对照的DNA标本,利用高通量芯片进行SNP的基因定型,进一步通过统计学分析,确定分子SNP位点和疾病表型的关系。该方法已成功鉴定了常见多发病的多种基因位点,不仅有效简化了常见病的相关基因鉴定过程,而且为研究疾病的发病机制和干预靶点提供了极有价值的信息。不过该技术对研究团队的经济实力,合作性,生物信息学水平以及庞大假阳性数据排查能力都有很高的要求,且只涉及常见等位基因的变异。 全外显子测序(whole exon sequencing)技术则可对全基因组外显子区域DNA富集从而进行高通量测序,它选择性地检测蛋白质编码序列,可实现定位克隆,对常见和罕见的基因变异都具有较高灵敏度,仅对约1%的基因组片段进行测序就可覆盖外显子绝大部分疾病相关基因变异,其高的性价比使其在复杂疾病易感基因的研究中颇受推崇。 四、生物信息数据库贮蔽丰富的疾病相关基因信患入类基因组计划和多种模式生物基因组测序的完成,生物信息学的发展,计算机软件的开发应用和互联网的普及,人们通过已获得的序列与数据库中核酸序列及蛋白质序列进行同源性比较,或对数据库中不同物种间的序列比较分析、拼接,预测新的全长基因等,进而通过实验证实,从组织细胞中克隆该基因,这就是所谓的电子克隆(in silica cloning)。 人类新基因克隆大都是从同源EST分析开始的。应用同源比较,在人类EST数据库中,识别和拼接与已知基因高度同源的人类新基因的方法包括:O以已知基因cDNA序列对EST数据库进行搜索分析,即BLAST(Basic Local Alignment Se釭ch Tool),找出与已知基因cDNA序列高度同源的EST;@用Seqlab的Fragment Assembly软件构建重叠群,并找出重叠的一致序列;@比较各重叠群的一致序列与已知基因的关系;@对编码区蛋白质序列进行比较,并与已知基因的蛋白质的功能域进行比较分析,推测新基因的功能;@用新基因序列或EST序列对序列标签位点(sequence-tagged site, STS)数据库进行BLAST分析,如果某一EST(非重复序列)与某一种STS有重叠,那么,STS的定位即确定了新基因的定位。电子克隆充分利用网络资源,可大大提高克隆新基因的速度和效率。由于数据库的不完善、错误信息的存在及分析软件的缺陷,电子克隆往往难以真正地克隆基因,而是一种电子辅助克隆。 结构基因编码区的确定、启动子、转录起始点确定和其他顺式元件的确定是了解基因表达的关键。分析编码序列的技术包括数据库搜索法、cDNA文库法、RNA剪接法等;研究启动子结构的技术包括生物信息学预测法、启动子克隆法、核酸-蛋白质相互作用分析法等;研究真核生物结构基因转录起点序列的技术包括数据库搜索法、cDNA克隆直接测序法、5'-cDNA末端快速扩增法、连续分析法等。其他顺式作用元件主要包括增强子、沉默子、绝缘子等,都可以参与基因表达调控。分析基因表达丰度的技术包括Southern印迹、PCR和DNA测序法等。分析基因表达的产物可采用组学方法和特异性测定方法。通过检测RNA和蛋白质/多肤可分别揭示基因在转录水平和翻译水平的表达特征。栓测RNA的技术包括RNA印迹、原位杂交、核糖核酸酶保护实验、cDNA芯片等;梒测蛋白质/多肤的技术包括蛋白质印迹、酶联免疫吸附实验、免疫组化、流式细胞术、蛋白质芯片等。 基因的功能由基因表达产物体现,也就是编码基因的蛋白质功能和非编码基因RNA的功能。基因产物的功能可以从三个不同水平来描述,即生物化学水平、细胞水平和整体水平的功能。生物信息学的同源序列比对、细胞水平高表达或低表达基因(反义技术、RNA干涉和基因编辑)技术、蛋白质与蛋白质相互作用技术和整体水平的转基因技术、基因敲除小鼠动物模型等,都是目前进行基因功能研究的有效手段。由于基因的功能必须在完整的生物个体及其生命过程中才能得到完整的体现,因此,从整体水平研究基因的功能是必然的选择。鉴定基因功能的策略包括功能荻得策略(如转基因、基因敲入技术)、功能失活策略(如基因敲除、基因沉默技术)、随机突变筛选策略及基因编辑技术等。基\(',1i478第五篇医学分子生物学专题因编辑技术近年来发展迅猛,主要ZFN、TALEN技术以及CRISPR技术,其中CRISPR技术通过不断的技术改进,被认为能够在活细胞中最有效、最便捷地“编辑“任何基因。 疾病相关基因的鉴定和克隆,可采取非染色体定位的基因功能鉴定和定位克隆两类策略。前者包括功能克隆、表型克隆及采用位置非依赖的DNA序列信息和动物模型来鉴定和克隆疾病基因;后者则是先进行基因定位作图,确定疾病相关基因在染色体上的位置,然后寻找来自该区的基因并进行克隆,采用包括体细胞杂交法、原位杂交法、连锁分析及染色体异常定位来克隆疾病相关基因。假肥大肌营养不良基因的克隆是定位克隆策略应用的成功范例。 1.简述分析基因TSS、启动子、编码序列以及拷贝数的主要方法及原理。 第二十六章基因诊断和基因治疗 人类大多数疾病都与基因变异相关。人体自身基因结构与功能发生异常,以及外源性病毒、细菌的致病基因在人体的异常表达,都可以引起疾病。从基因水平检测和分析疾病的发生,确定发病原因及疾病的发病机制,评估个体对疾病的易感性,进而采用针对性的手段矫正疾病紊乱状态,是现代医学发展的新方向。基因诊断(gene diagnosis)和基因治疗(gene therapy)已成为现代分子医学的重要内容之一。 第一节基因诊断 基因诊断最早的医学实践始于1976年,美国加州大学旧金山分校的华裔科学家Y. W. Kan博士利用DNA片段多态性分析技术,对嫌状细胞贫血这一遗传性血红蛋白病进行了特异性产前诊断,开创了基因诊断的历史先河。伴随着临床手段的不断进步,基因诊断技术已经逐步地从实验研究进入临床应用阶段,作为一种新的诊断模式,基因诊断在许多重大疾病的早期诊断、鉴别诊断、分期分型、疗效判断、预后的预测等方面显示了独特的优势,广泛地应用于遗传性疾病、感染性疾病及肿瘤等疾病的诊断,使基因诊断技术在临床应用方面的作用逐步得到凸显。 —、基因诊断的概念及特点 (一)基因诊断是针对DNA和RNA的分子诊断 人类遗传病的基因诊断是分析遗传信息携带分子的序列,从而在分子水平上确定疾病的病因所在。从广义上说,凡是用分子生物学技术对生物体的DNA序列及其产物(如mRNA和蛋白质)进行的定性、定量分析,都称为分子诊断(molecular diagnosis)。从技术角度讲,目前的分子诊断方法主要是针对DNA分子的,涉及功能分析时,还可定量检测RNA(主要是mRNA)和蛋白质等分子。通常将针对DNA和RNA的分子诊断称为基因诊断(gene diagnosis)。 因为绝大部分疾病的表型是由基因结构及其功能异常或外源性病原体基因的异常表达造成的,这也是疾病发生的根本原因。因此以遗传物质作为诊断目标,可以在临床症状和表型发生改变前作出早期诊断,属于病因诊断,并且基因诊断的结果还能够提示疾病发生的分子机制。大多数疾病的发生过程都存在基因结构和表达水平的改变。单基因病主要由病人某种基因突变,致使其编码的蛋白质的生物学功能发生改变。如迪谢内肌营养不良(Duchenne muscul狙.dystrophy, DMD)是X染色体隐性遗传疾病,抗肌萎缩蛋白(dystrophin)基因突变所致肌萎缩蛋白缺乏或功能异常是导致疾病发生的根本原因;心血管疾病、糖尿病、高血压、阿尔茨海默病等疾病不具有典型的孟德尔遗传模式,这一类疾病具有明显的家族遗传倾向,与某些遗传标记有显著的关联性,其致病原因尚未清楚,可能与基因组多个较微弱的基因效能累加有关,称为遗传学疾病或多基因病,肿瘤的发生发展具有多因素和多阶段性,在每一个阶段可能发生基因结构与功能的改变;而对于感染性疾病来说,病原体的侵入必定使病人体内存在病原体的遗传物质。基因诊断正是通过检测与分析基因结构与功能(包括外源病原体基因)及基因表达的异常改变,从而对疾病进行诊断。 (二)基因诊断在疾病诊断上具有独特的优势 早期医学诊断是根据病人的临床症状和体征来进行判断,随着检验技术手段的提升,逐步发展为480第五篇医学分子生物学专题以疾病的表型改变为依据,而大部分疾病的表型改变缺乏特异性,并且往往是在疾病的中晚期才出现,常常不能作出及时准确的诊断。相比之下基因诊断不依赖疾病表型改变,直接以致病基因、疾病相关基因、外源性病原体基因或其表达产物为诊断对象,具有特异性强、灵敏度高、可早期诊断、应用性广的独特优势。1.特异性强基因诊断是以基因结构(包括病人自身基因和外源性病原体基因)及其表达产物(RNA或蛋白质)为检测对象,而不是疾病表型。由于基因的突变及其功能异常、外源性病原体基因的存在是疾病发生的根本原因,因此,基因诊断属于病因诊断,具有高度的特异性。采用分子生物学技术能够检测出这些特异的碱基序列,从而判断病人是否发生与携带某些基因突变,以及是否存在外源性病原体基因,从而作出特异性诊断。 2.灵敏度高基因诊断常利用PCR和核酸杂交的技术手段。PCR技术可将待测核酸样品进行特异性高效扩增达百万倍,亦可以对极其微量的几个细胞、一根头发、一滴血迹、组织切片和石蜡包埋组织块中的DNA进行高效扩增。而核酸杂交技术利用核酸杂交的特异性,由于使用了具有生物催化活性的酶、放射性核素标记或荧光素标记的高灵敏度探针来检测,因此,具有很高的灵敏度。目前临床上,常常把核酸杂交技术与PCR技术联合使用,用千检测微量的病原体基因及其拷贝数极少的各种基因突变,具有较高的灵敏度。 二、基因诊断的样品来源广泛 临床上可用于基因诊断的样品有血液、组织块、羊水和绒毛、精液、毛发、唾液和尿液等。在选择被测样品时,可根据材料来源和分析目的提取其基因组DNA或各种RNA,后者可经逆转录形成cDNA。RNA的分析必须用新鲜样品。在开展胎儿DNA诊断时,除传统的羊水、绒毛和肪带血样品外,从母亲外周血中提取胎儿细胞或胎儿DNA的先进技术已经初步应用千临床实践。 进行基因诊断的前提是疾病表型与基因型的关系已被阐明(见第二十五章)。人类遗传病的表型是由个体基因型决定的,故对遗传病的诊断也可理解为进行个体的基因分型。 三、基因诊断的基本技术日趋成熟 基因诊断包括检测个体的基因序列特征、基因突变、基因的拷贝数以及是否存在病原体基因等。基因诊断技术可分为定性和定证分析两类技术。基因分型和检测基因突变属于定性分析,测定基因拷贝数及基因表达产物量则属千定量分析。在检测外源感染性病原体基因时,定性分析可诊断其在人体存在与否,而定蜇分析则可确定其含量。从理论上来讲,所有检测基因表达水平或基因结构的方法都可用千基因诊断。基因诊断的基本方法几乎全部基于核酸分子杂交和PCR技术,或上述两种技术的联合应用。常用于基因诊断的基本方法主要有核酸分子杂交技术、PCR、DNA测序和基因芯片技术等。 (一)核酸分子杂交技术是基因诊断的基本方法 核酸分子杂交技术是基因诊断的最基本的方法之一。不同来源的DNA或RNA在一定的条件下,通过变性和复性可形成杂化双链。因此通过选择一段已知序列的核酸片段作为探针(见第二十四章),对其放射性核素、生物素或荧光染料进行标记,然后与目的核酸进行杂交反应,通过标记信号的检测就可以对未知的目的核酸进行定性或定量分析。 1. DNA印迹法Southern印迹(Southern blotting)又称DNA印迹(见第二十四章),是最为经典的基因分析方法,不但可以检测特异的DNA序列,还能用于进行基因的限制性内切核酸酶图谱和基因定位,可以区分正常和突变样品的基因型,并可获得基因缺失或插入片段大小等信息。DNA印迹一般可以显示50-20OOObp的DNA片段,片段大小的信息是该技术诊断基因缺陷的重要依据包。DNA印迹实验结果可靠,但操作繁琐,费时费力,而且要使用放射性核素,这些因素使其难以作为一种常规的临床诊断手段得以广泛开展。 2. Northern印迹法Northern印迹法(Northern blotting)是通过标记的DNA或RNA探针与待测样本RNA杂交,能够对组织或细胞的总RNA或mRNA进行定性或定量分析,及基因表达分析。N01them印迹杂交对样品RNA纯度要求非常高,限制了该技术在临床诊断中的应用。 3.斑点杂交斑点杂交(dot blot hybridization)是核酸探针与支待物上的DNA或RNA样品杂交,以检测样品中是否存在特异的基因或表达产物,该技术可用千基因组中特定基因及其表达产物的定性与定量分析。斑点杂交方法应用于基因诊断具有简便、快速、灵敏和样品用量少的优点。不足之处在于无法测定目的基因的大小,特异性较低,有一定比例的假阳性。 (二)PCR技术是特异、快速的基因诊断方法 PCR技术(见第二十四章)能够极其快速、特异性地在体外进行基因或DNA片段的扩增,具有较高的灵敏度。近年来,以PCR为基础的相关实验技术发展迅速,RT-PCR、QRT-PCR、FQ-PCR及in situ PCR等技术广泛地应用于致病基因的发现、核酸序列分析、DNA多态性分析、遗传疾病及感染性疾病的基因诊断、法医鉴定及个体识别等领域。在临床上,应用PCR技术可以对已知序列或已知部分序列的基因进行检测,或采用PCR技术扩增出已知DNA片段后与其他技术联合应用,衍生出了多种基因诊断技术。 1.直接采用PCR技术进行基因诊断PCR技术可以直接用于检测待测特定基因序列的存在与缺失。分析疾病相关基因的缺失或突变,或者据此确定病原体基因存在与否。如跨越基因缺失或插入部位的PCR技术,又称裂口PCR(gap-PCR),因其简便灵敏而更适用于临床诊断。该方法的思路是:设计并合成一组序列上跨越突变(缺失或插入)断裂点的引物,将待测DNA样本进行PCR扩增,叩482第五篇医学分子生物学专题然后进行琼脂糖凝胶电泳,从扩增片段的大小直接判断是否存在缺失或插入突变。又如多重PCR是一种实用可靠的检测DNA缺失的常用方法,其基本原理是在一次PCR反应中加入多种引物,对一份DNA样本中的不同系列片段进行扩增,每对引物扩增的产物长度不一。可以根据电泳图谱上不同长度DNA片段存在与否,判断某些基因片段是否发生缺失或突变。 2. PCR-等位基因特异性寡核苦酸分子杂交检测点突变的有效技术是等位基因特异性寡核昔酸(allele specific oligonucleotide, ASO)分子杂交。采用PCR-ASO杂交技术可以检测基因上已知的点突变、微小的缺失或插入。首先使用PCR扩增受检者的目标DNA片段,然后用设计好的ASO探针进行杂交,检测受检者是否存在基因突变及基因突变是杂合子还是纯合子。图26-1显示以B地中海贫血珠蛋白基因的第17个密码子(CD17)的点突变检测为例的ASO原理示意图。首先,设计合成包含突变位点在内的正常和突变的寡核昔酸探针。将这两个探针进行标记,再分别与待检DNA样品的PCR扩增产物进行杂交和检测。正常人只能与正常序列的ASO探针杂交,突变纯合子只能与突变序列的ASO探针杂交,而突变杂合子则能与两种探针产生杂交信号。 常变正突 因基 图26-113地中海贫血CD17点突变的ASO分子杂交l.正常探针检测孔;2.突变探针检测孔。每一纵行排列的两个点样斑代表一个样品,杂交时沿上下中线剪成两张膜条,分别与正常(上半部分)和突变(下半部分)探针杂交。三个样品的检测结果分别为正常(A)、突变纯合子(B)和突变杂合子(C)反向点杂交(reverse dot blot, RDB)是改进的ASO技术。ASO分子杂交虽然可以准确地进行已知突变的基因分型,但由于一种突变需要对应一个探针和一组实验,对于突变类型较少的遗传病的诊断较为快速简便。当一种遗传病是由多种点突变所引起,且其频率分散时,ASO技术就显得很繁琐。为了能够同时检测多种突变,可以将针对各种突变和正常序列的ASO探针固定在杂交膜上,而将原来在ASO杂交体系中固定在膜上的PCR产物改为液相进行杂交,这种方法称为RDB。利用这一方法,一次检测可以同时筛查多种突变,大大提高了基因诊断效率,已在一些常见遗传病,如B地中海贫血和襄性纤维化的基因诊断中得以应用苍。 3. PCR-限制性片段长度多态性是将PCR与限制性片段长度多态性(restriction fragment length polymorphism, RFLP)结合起来的技术,可以快速简便地对已知突变进行基因诊断。用一种或几种限制性内切核酸酶对某一段DNA序列进行消化,就会产生大小不同的DNA片段,称为限制性片段。而对千同种生物来说,不同个体间出现不同长度限制性片段类型称为限制性片段长度多态性。如果基因突变导致的基因组成或序列改变使DNA分子中原有的某种限制性内切核酸酶识别位点发生改变,可能导致基因结构中产生新的限制性内切核酸酶位点或使原有的酶切位点消失。首先是将突变基因PCR扩增,然后经过相应的内切酶消化后,进行含有澳化乙锭的琼脂糖凝胶电泳分离,在紫外线灯下即可分辨各种限制性片段的大小或位置,或者将限制性酶切产物与核素标记探针进行杂交,进行放射自显影,从而区分各种片段,解读出目标样品之间DNA分子水平的实际差异,这种方法就是PCRRFLP。 引物介导的限制性分析PCR(PCR-primer introduced restriction analysis, PCR-PIRA)是PCR-RFLP技术的延伸。其原理是在设计引物时引入错配碱基,从而消除或产生新的酶切位点,该错配的结果最终表现在酶解的限制性片段长度的差异。PCR-PIRA主要的分析对象是已知基因,用相应的计算机软件可以分析基因上可能产生的酶切位点的错配,从而产生人的RFLP。PCR-RFLP和PCR-PIRA的主要区别在于后者的引物设计时人工地引入酶切位点,而在实验材料和方法上没有区别。 巢式PCR-限制性片段多态性(nested PCR-RFLP)是将RFLP与巢式PCR(nes ted PCR)技术相结合通过设计高度保守序列的引物对待检测物种DNA进行PCR扩增,对PCR产物进行RFLP分析。该方法省时,可应用于流行病学调查和临床常规检测。 PCR-DHPLC技术的基本原理是利用待测样品DNA在PCR扩增过程的单链产物可以随机与互补链相结合而形成双链的特性,依据最终产物中是否出现异源双链来判断待测样品中是否存在点突变。如果不存在点突变,在PCR反应中产生的双链DNA都是一致的,即只产生一种同源双链。如果存在点突变,就会产生4种不同的DNA双链分子,2种为异源双链,另2种为同源双链。在给定的部分变性洗脱条件下,这些异源双链DNA片段可以在液相色谱柱中呈现出不同的滞留时间,出现“变异“洗脱峰的样品可进一步通过DNA直接测序确定样品的突变位点和性质。这一技术依赖自动化操作的分析仪完成,目前已成为临床遗传学诊断的重要工具。 (三)DNA序列分析是基因诊断最直接的方法 分离出病人的有关基因,测定其碱基排列顺序,找出变异所在是最为直接和确切的基因诊断方法。由于PCR技术和DNA序列分析技术的迅速发展和推广,序列分析已经在技术上和经济上成为最佳的诊断方法,代替了传统的限制性内切酶酶谱分析法。此法主要用于基因突变类型已经明确的遗传病的诊断及产前诊断。但由千DNA测序的成本很高,将其作为一种临床上常规的检测方法尚无法实现。 (四)基因芯片技术可用于大规模基因诊断 基因芯片技术可以进行微量化、大规模、自动化处理样品,特别是适用于同时检测多个基因、多个位点,精确地研究各种状态下分子结构的变异,了解组织或细胞中基因表达情况,用以检测基因的突变多态性表达水平和基因文库作图等。目前利用基因芯片技术可以早期、快速地诊断地中海贫血、异常血红蛋白病苯丙酮尿症、血友病、迪谢内肌营养不良症等常见的遗传性疾病。在肿瘤的诊断方\I们所[}484第五篇医学分子生物学专题面基因芯片技术也广泛地应用千肿瘤表达谱研究、突变、SNP检测、甲基化分析、比较基因组杂交分析等领域。基因芯片提供了从整体观念研究有机体的全新技术,必将改变生命科学研究的方式,对复杂疾病的诊断与治疗将带来革命性的变化。 四、基因诊断的医学应用 当人类基因组的信息与人类疾病的关系完全明确以后,从理论上讲,基因诊断可以提供所有直接或间接涉及基因结构/功能改变的诊断、预警和疗效预测。虽然目前距离这一目标仍有很长的路要走,但基因诊断在遗传病的临床和预防医学实践上已经获得了较广泛的应用。 (—)基因诊断可用千遗传性疾病诊断和风险预测遗传性疾病的诊断性检测和症状前检测预警是基因诊断的主要应用领域。对于遗传性单基因病,基因诊断可提供最终确诊依据。与以往的细胞学和生化检查相比,基因诊断耗时少、准确性高。对千一些特定疾病的高风险个体、家庭或潜在风险人群,基因诊断还可实现症状前检测(pre symptomatic tes ting),预测个体发病风险提供预防依据。 基因诊断目前可用于遗传筛查和产前诊断。通过遗传筛查检测出的高风险夫妇需给予遗传咨询和婚育指导,在“知情同意”的原则下于适宜的妊娠期开展胎儿的产前诊断,若胎儿为某种严重遗传病的受累者,可在遗传咨询的基础上由受试者决定”选择“终止妊娠,从而在人群水平实现遗传性疾病预防的目标。例如基千RFLP的连锁分析技术,曾成功地用于包括锻状细胞贫血、B-地中海贫血等多种人类单基因遗传病在内的遗传分析。 在欧美发达国家,遗传病的基因诊断,尤其是单基因遗传病和某些恶性肿瘤等的诊断,已成为医疗机构的常规项目,并已形成在严格质量管理系统下的商业化服务网络。目前已列入美国华盛顿大学儿童医院和区域医学中心主持的著名基因诊断机构--GENETests网站(http:ll www. genetests. org/)为超过3000种遗传性疾病提供分子遗传、生化和细胞生物学检测。 我国基因诊断的研究和应用始于20世纪80年代中期,目前主要开展针对一些常见单基因遗传病的诊断性检测,如地中海贫血、血友病A、迪谢内肌营养不良等,表26-1列举了在我国开展的一些代表性常见单基因病基因诊断及其方法学案例。 疾病致病基因突变类型诊断方法 a地中海贫血Q珠蛋白缺失为主Gap-PCR、DNA杂交、DHPLC B地中海贫血B珠蛋白点突变为主反向点杂交、DHPLC 血友病A凝血因子VIII点突变为主PCR-RFLP 血友病B凝血因子IX点突变、缺失等PCR-STR连锁分析苯丙酮尿症苯丙氨酸轻化酶点突变PCR-STR连锁分析、ASO分子杂交马方综合征原纤蛋白点突变、缺失PCR-VNTR连锁分析、DHPLCRFLP:restriction fragment length polymorphism,限制性片段长度多态性;STR:short tandem repeat,短串联重复序列;VNTR:var1able number of tandem repeats,可变数目串联重复序列(二)基因诊断可用于多基因常见病的预测性诊断对于多基因常见病,基千DNA分析的预测性诊断可为被测者提供某些疾病发生风险的评估意见。如乳腺癌易感基因(breas t cancer suscept山山ty gene, BRCA)1号(BRCAJ)和2号(BRCA2)的基因突变可提高个体的乳腺癌发病风险,其基因诊断已成为一些发达国家人群健康监测的项目之一。随着基因变异和疾病发生相关研究的知识积累,针对肿瘤和其他一些多基因常见病的这类预警性风险预测诊断正在逐步走入临床。在一些有明显遗传倾向的肿瘤中,肿瘤抑制基因和癌基因的突变分析,是基因检测的重要靶点。预测性基因诊断结果是开展临床遗传咨询最重要的依据。相信在相关基础研究取得进展的基础上,多基因常见病的预测性诊断会越来越多地得到应用,成为未来疾病诊断的主第二十六章基因诊断和基因治疗485要内容。 (三)基因诊断可用于传染病病原体检测 针对病原体自身特异性核酸(DNA或RNA)序列,通过分子杂交和基因扩增等手段,鉴定和发现这些外源性基因组、基因或基因片段在人体组织中的存在,从而证实病原体的感染。针对病原体的基因诊断主要依赖千PCR技术。PCR技术具有高度特异、高度敏感和快速的特点,可以快速检出样品中痕量的、基因序列巳知的病原微生物。如组织和血液中SARS病毒、各型肝炎病毒等的检测包。样品中痕量病原微生物的迅速侦检、分类及分型还可以使用DNA芯片技术。 基因诊断主要适用于下列情况:O病原微生物的现场快速检测,确定感染源;@病毒或致病菌的快速分型,明确致病性或药物敏感性;@需要复杂分离培养条件,或目前尚不能体外培养的病原微生物的鉴定。分子诊断技术的特点决定了病原体的基因诊断较传统方法有更高的特异性和敏感性,有利于疾病的早期诊治、隔离和人群预防。但由千基因诊断只能判断病原体的有无和拷贝数的多少,难以检测病原体进入体内后机体的反应及其结果,因此,基因检测并不能完全取代传统的检测方法,它将与免疫学检测等传统技术互补而共存。 (四)基因诊断可用千疾病的疗效评价和用药指导遗传诊断还可应用于临床药物疗效的评价及提供指导用药的信息。例如,急性淋巴细胞性白血病经化疗等综合治疗后,大部分病人可获得缓解,但容易复发。白血病复发的主要根源在于病人体内少数残留的白血病细胞(约<0.05xl09/L)。PCR等基因诊断技术已成为临床上检测和跟踪微小残留病灶的常规方法,是预测白血病的复发、判断化疗效果和制定治疗方案的很有价值的指标。 人群中对药物的反应性存在着个体差异,致使药物的不良反应难以避免。例如,氨基糖昔类抗生素的致聋副作用的发生与线粒体DNA12S rRNA基因第1555位A-G同质性点突变有关。在人群中通过分子筛查发现这种突变的个体,对指导医生避免使用氨基糖昔类抗生素,防止儿童产生药物中毒性耳聋有很好的参考价值。药物代谢酶类(如细胞色素P450)的遗传多态性,也是个体对某些药物的反应性差异的重要因素。因此,通过测定人体的这些基因多态性或其单倍型可以预测药180190200210220230240250物代谢情况或疗效的反应性,从而制订针对1114父亲不同个体的药物治疗方案。在系统阐明入类]\____]\ 药物代谢酶类及其他相关蛋白的编码基因遗传多态性的基础上,通过对不同药物代谢基 8LI因靶点的药物遗传学检测(pharmacogenetic14八长子tes ting),将为真正实现个体化用药提供技术A队(五)DNA指纹鉴定是法医学个体识!12A母亲别的核心技术DNA指纹的遗传学基础是DNA的多态图26-2STR等位基因在家庭中遗传示意图性。世界上除了部分同卵双生子外,人与人此图以D13S317位点为例,3个子女基因型的一个等位基之间的某些DNA序列特征具有高度的个体因来自于父亲,另外一个等位基因来自千母亲特异性和终生稳定性,正如人的指纹一般,故称为DNA指纹(DNA fingerprinting)。基因诊断在法医学上的应用,主要是采用基于STR的DNA指纹技术进行个体认定(图26-2),已成为刑侦样品的鉴定、排查犯罪嫌疑人、亲子鉴定和确定个体间亲缘关系的重要技术手段岱。 当前基于PCR扩增的DNA指纹技术已取代了上述基千DNA印迹的操作程序。选择若干个基因位点(如STR、人类白细胞抗原位点等)设计相应的PCR引物对,对待测DNA样本进行PCR扩增和带型比较后即可判断结果。该方法快速、灵敏,可以对微量血痕精液、唾液和毛发进行个体鉴定。\),I{i}486第五篮医学分子生物学专题基因治疗是以改变入遗传物质为基础的生物医学治疗,即通过一定方式将人正常基因或有治疗作用的DNA片段导入人体靶细胞以矫正或置换致病基因的治疗方法。它针对的是疾病的根源,即异常的基因本身。在此过程中,目的基因被导入靶细胞内,它们或与宿主细胞染色体整合成为宿主细胞遗传物质的一部分,或不与宿主细胞的染色体整合而独立于染色体以外,但都可以在宿主细胞内表达基因产物蛋白质,而达到治疗作用。目前基因治疗的概念也有了较大扩展,凡是采用分子生物学技术和原理,在核酸水平上展开的对疾病的治疗都可纳入基因治疗范圃。基因治疗的范围也从过去的单基因遗传病扩展到恶性肿瘤、心脑血管疾病、神经系统疾病、代谢性疾病等。根据治疗的靶细胞不同,基因治疗可分为生殖细胞(germ-line)治疗和体细胞(somatic cell)治疗两大类,由于生殖细胞基因治疗涉及伦理及遗传等诸多问题,目前人类基因治疗研究与应用的重点是体细胞治疗。 —、基因治疗的基本策略主要围绕致病基因 基因治疗是指将目的基因导入靶细胞,使之成为宿主细胞遗传物质的一部分,目的基因的表达产物对疾病起到治疗的作用。绝大部分疾病的发生都受到遗传因素的影响,如果用正常的健康基因替代有缺陷的基因来治疗疾病,则为这些疾病的病人提供了一个全新的治疗模式。随着基因治疗研究的不断深入,不仅可以将外源性正常基因导入病变细胞,产生正常的基因表达产物来补充缺失或功能异常的蛋白质;还可以采用适当的技术抑制过表达基因;亦可以将特定基因导入非病变细胞,在体内表达特定产物;或者向肿瘤细胞等功能异常的细胞中导入该细胞本来不存在的基因,利用这些基因的表达产物来治疗疾病。根据不同疾病的发病机制,所采用的基因治疗方式也有所不同,基因治疗的基本策略主要有以下几种:(—)缺陷基因精确的原位修复是基因治疗的理想方法包括对致病基因的突变碱基进行纠正的基因矫正(gene con-ec tion)和用正常基因通过重组原位替换致病基因的基因置换(gene replacement)。这两种方法均属于对缺陷基因精确的原位修复,既不破坏整个基因组的结构,又可达到治疗疾病的目的,是最为理想的治疗方法,但目前尚未能从理论和技术上得到突破。 (二)基因增补是目前临床上使用的主要基因治疗策略不删除突变的致病基因,而在基因组的某一位点额外插入正常基因,在体内表达出功能正常的蛋白质,达到治疗疾病的目的。这种对基因进行异位替代的方法称为基因添加(gene augmentation)或称基因增补,是目前临床上使用的主要基因治疗策略。基因增补不仅可以用于替代突变基因,也可以在原有基因表达水平不足以满足机体需要的情况下,异位过表达来增强体内某些功能。例如在血友病病入体内导入凝血因子IX基因,恢复其疑血功能;将编码干扰素和白介素-2等分子的基因导入恶性肿瘤病人体内,可以激活体内免疫细胞的活力,作为抗肿瘤治疗中的辅助治疗,也称为基因免疫治疗。 由于目前尚无法做到基因在基因组中的准确定位插入,因此增补基因的整合位置是随机的。这种整合可能会导致基因组正常调节结构的改变,甚至可能导致新的疾病。2004年,法国一儿童医院接受基因治疗的17名严重联合免疫缺陷症病入中,有3人因逆转录病毒载体插入并激活LM0-2基因而罹患白血病。(三)基因治疗可采用基因沉默或失活有些疾病是由于某一或某些基因的过度表达引起的,向病人体内导入有抑制基因表达作用的核酸,如反义RNA、核酶、干扰小RNA等,可降解相应的mRNA或抑制其翻译,阻断致病基因的异常表达,从而达到治疗疾病的目的。这一策略称为基因失活(gene inactivation)或基因沉默(gene silencing),也称为基因干预(gene interference)。需要抑制的靶基因往往是过度表达的癌基因或者是第二十六章基因诊断和基因治疗487病毒复制周期中的关键基因。 (四)自杀基因亦可应用千基因治疗 上述三种基因治疗的策略都是以恢复细胞正常功能或干预细胞的功能为目的。在肿瘤的治疗中,通过导入基因诱发细胞“自杀“死亡也是一种重要的策略。自杀基因治疗肿瘤的原理是将编码某些特殊酶类的基因导入肿瘤细胞,其编码的酶能够使无毒或低毒的药物前体转化为细胞毒性代谢物,诱导细胞产生“自杀”效应,从而达到清除肿瘤细胞的目的。自杀基因的另一个策略是利用肿瘤细胞特异性启动子序列(如肝癌的甲胎蛋白启动子序列)以激活抑癌基因、毒蛋白基因等“细胞毒性基因“通过这些特殊的外源基因在肿瘤细胞中的特异性表达以达到对肿瘤细胞的杀伤作用。 二、基因治疗的基本程序 基因治疗的基本过程可分为5个步骤:心选择治疗基因;@选择携带治疗基因的载体;@选择基因治疗的靶细胞;@在细胞和整体水平导入治疗基因;@治疗基因表达的检测。 (—)选择治疗基因是基因治疗的关键 细胞内的基因在理论上均可作为基因治疗的选择目标。许多分泌性蛋白质如生长因子、多肤类激素、细胞因子、可溶性受体(人工构建的去除膜结合特征的受体),以及非分泌性蛋白质如受体、酶、转录因子的正常基因都可作为治疗基因。简言之,只要清楚引起某种疾病的突变基因是什么,就可用其对应的正常基因或经改造的基因作为治疗基因。 (二)治疗基因的载体可携带基因进入靶细胞 大分子DNA不能主动进入细胞,即使进入也将被细胞内的核酸酶水解。因此选定治疗基因后,需要适当的基因工程载体(见第二十三章)将治疗基因导入细胞内并表达。目前所使用的基因治疗用载体有病毒载体和非病毒载体两大类,基因治疗的临床实施一般多选用病毒载体。 野生型病毒必须经过改造,以确保其在人体内的安全后才能作为基因治疗的载体。野生型病毒基因组的编码区主要为衣壳蛋白、酶和调控蛋白编码,而非编码区中则含有病毒进行复制和包装等功能所必需的顺式作用元件。基因治疗所用病毒载体的改造是剔除其复制必需的基因和致病基因,消除其感染和致病能力。原有的病毒复制和包装等功能改由包装细胞(packaging cell)提供。包装细胞是经过特殊改造的细胞,已经转染和整合了病毒复制和包装所需要的辅助病毒基因组,可以完成病毒的复制和包装。在实际应用中,治疗用病毒载体需要先导入体外培养的包装细胞,在其中进行复制并包装成新的病毒颗粒,获得足撮的重组病毒后再用于基因治疗。 目前用作基因转移载体的病毒有逆转录病毒(retrovirus)、腺病毒(adenovirus汃腺相关病毒(a deno-associated virus, AAV)、单纯疤疹病毒(herpes simplex virus, HSV)等。不逆转录病毒逆转录酶同类型的病毒载体在应用中具有不同的逆转录病毒优势和缺点,可依据基因转移和表达的蛋白质合成出芽_尸~~融合宿主染色不同要求加以选择。以下仅以最为常用的逆转录病毒和腺病毒载体为例予以说明。 1.逆转录病毒载体逆转录病毒@ 转录逆转录 属于RNA病毒,其基因组中有编码逆转录酶和整合酶(integrase)的基因。在感染细胞内,病毒基因组RNA被逆转录成双链DNA,然后随机整合在宿主细胞的@`染色体DNA上,因此可长期存在于宿主前病毒整合细胞基因组中(图26-3)岱,这是逆转录图26-3逆转录病毒的生活周期示意医488第五篇医学分子生物学专题病毒作为载体区别于其他病毒载体的最主要优势。将逆转录病毒复制所需要的基因除去,代之以治疗基因,即可构建成重组的逆转录病毒载体。在目前的基因治疗中,70%以上应用的是逆转录病毒载体。 逆转录病毒载体有基因转移效率高、细胞宿主范围较广泛、DNA整合效率高等优点。缺点主要是在两个方面存在安全性问题,一是病入体内万一有逆转录病毒感染,又在体内注射了大剂量假病毒后,就会重组产生有感染性病毒的可能;二是增加了肿瘤发生机会。后者的原因是由于逆转录病毒在靶细胞基因组上的随机整合所致,这种整合可能激活原癌基因或者破坏抑癌基因的正常表达。 2.腺病毒载体腺病毒是一种没有包膜的大分子双链DNA病毒,可引起人上呼吸道和眼部上皮细胞的感染。人的腺病毒共包含50多个血清型,其中C亚类的2型和5型腺病毒(Ad2和Ad5)在人体内为非致病病毒,适合作为基因治疗用载体国。 腺病毒载体不会整合到染色体基因组,因此不会引起病人染色体结构的破坏,安全性高;而且对DNA包被量大、基因转染效率高,此外对静止或慢分裂细胞都具有感染作用,故可用细胞范圃广。腺病毒载体的缺点是基因组较大,载体构建过程较复杂;由于治疗基因不整合到染色体基因组,故易随着细胞分裂或死亡而丢失,不能长期表达。此外,该病毒的免疫原性较强,注射到机体后很快会被机体的免疫系统排斥。 (三)选择基因治疗的靶细胞通常是体细胞 基因治疗所采用的靶细胞通常是体细胞(somatic cell),包括病变组织细胞或正常的免疫功能细胞。由于人类生殖生物学极其复杂,主要机制尚未阐明,因此基因治疗的原则是仅限于患病的个体,而不能涉及下一代,为此国际上严格限制用人生殖细胞(germ line cell)进行基因治疗实验。适合作为靶细胞应具有如下特点:心靶细胞要易于从人体内获取,生命周期较长,以延长基因治疗的效应;@应易于在体外培养及易受外源性遗传物质转化;@离体细胞经转染和培养后回植体内易成活;@选择的靶细胞最好具有组织特异性,或治疗基因在某种组织细胞中表达后能够以分泌小泡等形式进入靶细胞。 人类的体细胞有200多种,目前还不能对大多数体细胞进行体外培养,因此能用于基因治疗的体细胞十分有限。目前能成功用千基因治疗的靶细胞主要有造血干细胞、淋巴细胞、成纤维细胞、肌细胞和肿瘤细胞等。 1.造血干细胞造血干细胞(hematopoietic stem cell, HSC)是骨髓中具有高度自我更新能力的细胞,能进一步分化为其他血细胞,并能保待基因组DNA的稳定。HSC已成为基因治疗最有前途的靶细胞之一。由于造血干细胞在骨髓中含量很低,难以获得足够的数量用于基因治疗。人跻带血细胞是造血干细胞的丰富来源,其在体外增殖能力强,移植后抗宿主反应发生率低,是替代骨髓造血干细胞的理想靶细胞。目前已有跻带血基因治疗的成功病例。 5肿瘤细胞肿瘤细胞是肿瘤基因治疗中极为重要的靶细胞。由于肿瘤细胞分裂旺盛,对大多第二十六章基因诊断和基因治疗489数的基因转移方法都比较敏感,可进行高效的外源性基因转移。因此,无论采用哪一种基因治疗方案,肿瘤细胞都是首选的靶细胞。此外,也可研究采用骨髓基质细胞、角质细胞、胶质细胞、心肌细胞及脾细胞作为靶细胞,但由千受到取材及导入外源基因困难等因素影响,还仅限于实验研究。(四)将治疗基因导入人体有生物学和非生物学法目前临床基因治疗实施方案中,体内基因递送(gene delivery)的方式有两种国。一种是间接体内疗法(ex vivo),即先将需要接受基因的靶细胞从体内取出,在体外培养,将携带有治疗基因的载体导入细胞内,筛选出接受了治疗基因的细胞,繁殖扩大后再回输体内,使治疗基因在体内表达相应产物国。其基本过程类似于自体组织细胞移植。另一种是直接体内疗法(in vivo),即将外源基因直接注入体内有关的组织器官,使其进入相应的细胞并进行表达。 基因导入细胞的方法有生物学和非生物学法两类。生物学方法指的是病毒载体所介导的基因导入,是通过病毒感染细胞实现的,其特点是基因转移效率高,但安全问题需要重视。非生物学法是用物理或化学法,将治疗基因表达载体导入细胞内或直接导入入体内,操作简单、安全,但是转移效率低。常用的基因治疗用基因导入方法见表26-2。 名称操作方法用途及优缺点 直接注射法将携带有治疗基因的非病毒真核表达载体无毒无害,操作简便,目的基因表达时间可(多为质粒)溶液直接注射入肌组织,亦称为长达至1年以上;仅限于在肌组织中表达,裸DNA注射法导入效率低,需要注射大噩DNA基因枪法采用微粒加速装置,使携带治疗基因的微米操作简便、DNA用量少、效率高、无痛苦、级金或鸽颗粒获得足够能量,直接进入靶细适宜在体操作,尤其适于将DNA疫苗导入胞或组织。又被称为生物弹道技术(biolistic表皮细胞,获得理想的免疫反应;但目前不technology)或微粒轰击技术(particle born宜用于内脏器官的在体操作bardment technology)电穿孔法在直流脉冲电场下细胞膜出现105-115nm可将外源基因选择性地导入靶组织或器的微孔,这种通道能维持儿毫秒到几秒,在官,效率较高,但外源基因表达持续时间短此期间质粒DNA通过通道进入细胞,然后胞膜结构自行恢复脂质体(lip osome)利用人工合成的兼性脂质膜包裹极性大分脂质体可被降解,对细胞无毒,可反复给子DNA或RNA,形成的微毅泡穿透细胞膜,药;DNA或RNA可得到有效保护,不易被进入细胞核酸酶降解;操作简单快速、重复性好。但体内基因转染效率低,表达时间短,易被血液中的网状内皮细胞吞噬表26-2中列举的方法均不具备细胞的靶向性。能够实现靶向性的方法是受体介导的基因转移。利用细胞表面受体能特异性识别相应配体并将其内吞的机制,将外源基因与配体结合后转移至特定类型的细胞。无论是遗传性疾病还是恶性肿瘤的基因治疗,靶向性是非常重要的,特别是应用到体内时,既要考虑对靶细胞的治疗,又要注意对正常细胞的保护。受体介导的基因转移在基因治疗中有较好的优势和发展前景。 (五)治疗基因表达的检测方法较多 无论以何种方法导入基因,都需要检测这些基因是否能被正确表达。被导入基因的表达状态可以用在第二十四章介绍过的PCR、RNA印迹、蛋白印迹及ELISA等方法去检测。对于导入基因是否整合到基因组以及整合的部位,可以用核酸杂交(见第二十四章)技术进行分析。 三、基因治疗的医学应用 基因治疗作为一门新兴学科,在很短的时间内就从实验室过渡到临床,已被批准的基因治疗方案490第五篇医学分子生物学专题有两百种以上,包括肿瘤、艾滋病、遗传病和其他疾病等。在我国,血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor, VEGF)、血友病IX因子、抑癌基因TP53等基因治疗的临床方案已进入市场或临床试验包。 遗传病的基本特征是由遗传基因改变所引起的。只受一对等位基因影响而发生的疾病属于单基因遗传病,设计基因治疗方案相对容易,例如锄状细胞贫血、a-地中海贫血、血友病等。高血压、动脉粥样硬化、糖尿病的发生是多个基因相互作用的结果,并受环境因素影响,基因治疗的效果还有待于基础研究的突破。 1.单基因遗传病的基因治疗单基因缺陷引起的遗传病,由于其致病基因比较清楚,所以基因治疗方案也相对容易确定。基本方案是通过一定的方法把正常的基因导入到病人体内,表达出正常的功能蛋白。例如将人IX因子基因与逆转录病毒载体重组后转移到血友病病人自体的皮肤成纤维细胞中,使病入血中IX因子浓度升高,出血症状及出血次数都明显减少。 2.针对多基因病的基因治疗基因治疗最早是针对一些单基因遗传病进行的,但是随着人类对其他疾病分子机制的深入了解、对许多疾病相关基因的分离和功能的研究,人们逐渐将基因治疗的策略用千如恶性肿瘤、心血管疾病、糖尿病及艾滋病等,尤其是对恶性肿瘤的基因治疗寄予极大的希望。目前已被克隆的恶性肿瘤相关基因很多,动物模型比较成熟,病人及亲属易接受,所以,恶性肿瘤的基因治疗研究日趋活跃,并取得了显著的成果。到目前为止世界各国已经批准开展进行的基因治疗方案中,70%以上是针对恶性肿瘤的包。 恶性肿瘤的基因治疗包括:针对癌基因表达的各种基因沉默、针对抑癌基因的基因增补、针对肿瘤免疫反应的细胞因子基因导入和针对肿瘤血管生成的基因失活等。其他的基因治疗方案包括:利用过表达VEGF基因促进血管生成治疗冠心病、针对病毒复制基因的基因沉默治疗艾滋病等。 四、基因治疗的前景与问题 经过20多年的努力,科学家们在基因治疗领域取得了很大的进步,获得了一些成功,但是仍然存在一些亟待解决的间题。这些问题包括:O缺乏高效、靶向性的基因转移系统;@对千多种疾病的相关基因认识有限,因而缺乏切实有效的治疗靶基因;@对真核生物基因表达调控机制理解有限,因此对治疗基因的表达还无法做到精确调控,也无法保证其安全性;@缺乏准确的疗效评价。目前的基因治疗临床试验中,限于伦理问题,多选择常规治疗失败或晚期肿瘤病入,尚难以客观地评价治疗效果。 将基因治疗方案用于人体必须经过严格的审批程序,需要专门机构的审批与监督。在我国,任何基因治疗方案都要经国家食品药品监督管理局审批。1999年6月颁布的《人基因治疗申报临床试验指导原则》详细规定了基因治疗所用生物制剂的研制、生产工艺、制剂的质量控制、临床实验和临床疗效评价的各个环节中应该遵守的原则。所有基因治疗的临床使用必须严格遵守这些法律法规。 近年来国家对基因诊断与基因治疗领域非常重视,虽然没有新出台专门的规范性文件法规,但在国家大的规划方面均有涉及。在《“十三五”卫生与健康规划》(国发(2016]77号)中提出在加强行业规范的基础上,推动基因检测、细胞治疗等新技术的发展。在《“十三五”国家战略性新兴产业发展规划》(国发(2016)67号)中提出发展专业化诊疗机构,培育符合规范的液体活检、基因诊断等新型技术诊疗服务机构。推动基因检测和诊断等新兴技术在各领域应用转化。建立具有自主知识产权的基因编辑技术体系,开发针对重大遗传性疾病、感染性疾病、恶性肿瘤等的基因治疗新技术。在《“十三五“国家科技创新规划》(国发(2016)43号)中提出开展重大疫苗、抗体研制、免疫治疗、基因治疗、细胞治疗、干细胞与再生医学、人体微生物组解析及调控等关键技术研究,研发一批创新医药生物制品,构建具有国际竞争力的医药生物技术产业体系。在《中国防治慢性病中长期规划(2017一2025年)》(国办发(2017J12号)提出支持基因检测等新技术、新产品在慢性病防治领域推广应用。 基因诊断主要是针对DNA分子的遗传分析技术,包含定性和定量两类分析方法。PCR扩增和分子杂交是现代基因诊断的基本技术。基因诊断的特异性强、敏感度高,已成为临床实验医学的一个重要组成部分。 基因诊断已成功应用于人类遗传病,尤其是单基因病的确诊及其症状前诊断。未来在多基因常见病的发病风险预测,个体化用药指导和疗效评价等方面也将显示出巨大的应用潜力。 基因治疗是以改变人的遗传物质为基础的生物医学治疗,即将人正常基因或有治疗作用的DNA片段导入人体靶细胞的治疗方法。它针对的是异常基因本身,可以进行基因矫正、基因置换、基因增补、基因沉默等。 将治疗基因导入人体的主要方式有DNA质粒直接注射、病毒栽体感染等。目前基因治疗已用于遗传病,如血友病等的治疗;在恶性肿瘤治疗方面的应用也已开始尝试。 1.人体哪些标本可用于基因诊断?试归纳出不同组织体液标本可应用的基因诊断类型。2.外周血标本可以用于诊断遗传性疾病吗?如何应用?3.基因治疗仅可以用于遗传病吗?试总结出一些可以采用基因治疗疗法的疾病,可针对的靶基因是什么?(李存保) 第二十七章组学与系统生物医学 21世纪以来,生命科学进入了空前的“大数据(big data)”时代。生命科学研究模式亦正在发生重大转变,其主要标志就是生命科学正从“微观”(实验科学)向“宏观”(整合生物科学)的方向发展。DNA基因组学生物遗传信息的传递具有方向性和整体性。组学是基于组群或转录」集合的认识论,注重事物和过程之间的相互联系,即整体性。按照遗RNA转录物组学传信息传递的方向性,可将组学按基因组学、转录物组学、蛋白质组蛋白质蛋白质组学学、代谢组学等层次加以叙述(图27-1)。生物信息学的发展为组学研功能}究提供了重要方法。系统生物医学则是在各种组学的基础上应用系代谢产物代谢组学统生物学原理与方法研究疾病发生发展规律和机制,发展现代高效的图27-1遗传信息的方预测、预防、诊断和治疗手段。系统生物医学的发展必将驱动新一轮向性与组学的关系医学科学革命。 第一节基因组学 基因组(genome)是基因(gene)和染色体(chromosome)两个名词的组合,指的是一个生命单元所拥有的全部遗传物质(包括核内和核外遗传信息),其本质就是DNA/RNA。基因组学(genomics)是阐明整个基因组结构、结构与功能关系以及基因之间相互作用的科学。根据研究目的不同而分为结构基因组学(strnctural genomics)、功能基因组学(functional genom ics)和比较基因组学(comparative genomics)。结构基因组学通过基因组作图和序列测定,揭示基因组全部DNA序列及其组成;比较基因组学通过模式生物基因组之间或模式生物与人类基因组之间的比较与鉴定,发现同源基因或差异基因,为研究生物进化提供依据;功能基因组学则利用结构基因组学所提供的信息,分析和鉴定基因组中所有基因(包括编码和非编码序列)的功能。近年来,在基因组水平上研究不改变基因组序列而通过表观遗传修饰调控基因或基因组表达的表观基因组学(epigenomics)成为研究热点。 一、结构基因组学揭示基因组序列信息 结构基因组学主要通过人类基因组计划(human genome project, HGP)的实施,解析人类自身DNA的序列和结构苍。研究内容就是通过基因组作图和大规模序列测定等方法,构建人类基因组图谱,即遗传图谱(geneti c map)、物理图谱(physical map)、序列图谱(sequence map)和转录图谱(transcription map)国。 (—)通过遗传作图和物理作图绘制人类基因组草图人染色体DNA很长,不能直接进行测序,必须先将基因组DNA进行分解、标记,使之成为可操作的较小结构区域,这一过程称为作图。HGP实施过程采用了遗传作图和物理作图的策略。 1.遗传作图就是绘制连锁图遗传图谱又称连锁图谱(linkage map)。遗传作图(geneti c mapping)就是确定连锁的遗传标志(genetic marker;或分子标志,molecul扣.marker)位点在一条染色体上的排列顺序以及它们之间的相对遗传距离,用厘摩尔根(centi-Morgan, cM)表示,当两个遗传标记之间的重组值为1%时,图距即为lcM(约为1000kb)。常用的遗传标志有限制性片段长度多态性(restriction fragment le ngth polymorphism, RFLP)、可变数目串联重复序列(variable number of tandem repeat, VNTR)和单核昔酸多态性(s ingle nucleo tidepolymorphism, SNP),其中SNP的精确度最高(05~1.0kb)。 2.物理作圈就是描绘杂交图、限制性酶切图及克隆系图物理作图(physical mapping)以物理尺度(bp或kb)标示遗传标志在染色体上的实际位置和它们间的距离,是在遗传作图基础上绘制的更为详细的基因组图谱。物理作图包括荧光原位杂交图(fluorescent in situ hybridization map, FISH map;将荧光标记探针与染色体杂交确定分子标记所在的位置)、限制性酶切图(restriction map;将限制性酶切位点标定在DNA分子的相对位置)及克隆重叠群图(clone contig map)等。在这些操作中,构建克隆重叠群图是最重要的一种物理作图,它是在采用酶切位点稀有的限制性内切酶或高频超声破碎技术将DNA分解成大片段后,再通过构建酵母人工染色体(yeast artificial chromosome, YAC)或细菌人工染色体(bacterial artificia l chromosome, BAC),获取含已知基因组序列标签位点(sequence tagged site, STS)的DNA大片段。STS是指在染色体上定位明确、并且可用PCR扩增的单拷贝序列,每隔100kb距离就有一个标志。在STS基础上构建覆盖每条染色体的大片段DNA连续克隆系就可绘制精细物理图。可以说,通过克隆重叠群作图就可以知晓特异DNA大片段在特异染色体上的定位,这就为大规模DNA测序做好了准备。 (二)通过EST文库绘制转录圈谱 人类基因组DNA中只有约2%的序列为蛋白质编码序列,对于一个特定的个体来讲,其体内所有类型的细胞均含有同样的一套基因组,但成年个体每一特定组织中,细胞内一般只有10%的基因是表达的;即使是同一种细胞,在其发育的不同阶段,基因表达谱亦是不一样的。因此,了解每一组织细胞及其在不同发育阶段、不同生理和病理情况下mRNA转录情况,可以帮助我们了解不同状态下细胞基因表达情况,推断基因的生物学功能。 转录图谱又称为cDNA图或表达图(expression map),是一种以表达序列标签(expressed sequen ce tag,EST)为位标绘制的分子遗传图谱。通过从cDNA文库中随机挑取的克隆进行测序所获得的部分cDNA的5'-或3'-端序列称为EST,一般长300-500bp左右。将mRNA逆转录合成的cDNA片段作为探针与基因组DNA进行分子杂交,标记转录基因,就可以绘制出可表达基因的转录图谱。 (三)通过BAC克隆系和鸟枪法测序等构建序列固谱在基因作图的基础上,通过BAC克隆系的构建和鸟枪法测序(shotgun sequencing),就可完成全基因组的测序工作,再通过生物信息学手段,即可构建基因组的序列图谱。 BAC载体是一种装载较大片段DNA的克隆载体系统,用于基因组文库构建。全基因组鸟枪法测序是直接将整个基因组打成不同大小的DNA片段,构建BAC文库,然后对文库进行随机测序,最后运用生物信息学方法将测序片段拼接成全基因组序列(图27-2),此称为基因组组装(genome assembly)。 二、比较基因组学鉴别基因组的相似性和差异性 比较基因组学是在基因组序列的基础上,通过与已知生物基因组的比较,鉴别基因组的相似性和差异性,一方面可为阐明物种进化关系提供依据,另一方面可根据基因的同源性预测相关基因的功能。比较基因组学可在物种间和物种内进行,前者称为种间比较基因组学,后者则称为种内比较基因组学,两者均采可用BLAST等序列比对工具。 (一)种间比较基因组学阐明物种间基因组结构的异同种间比较基因组学通过比较不同亲缘关系物种的基因组序列,可以鉴别出编码序列、非编码(调控)序列及特定物种独有的基因序列。而对基因组序列的比对,可以了解不同物种在基因构成、基因顺序和核昔酸组成等方面的异同,从而用千基因定位和基因功能的预测,并为阐明生物系统发生进化关系提供数据。 494第五篇医学分子生物学专题 基因组DNA BAC文库尸丿_ 大片段克隆 重叠物理图谱__________--________——_______Shotgun克隆~r,..J^户J--^_^---~,,一^r-,..-::,Jr~丿它一',.. Shotgun序列ACCGTAAATGGGCTGATCATGCTTAAA 拼接与组装ACCGTAAATGGGCTGATCATGCTTAAACCCTGTGCATCCTACTG (二)种内比较基因组学阐明群体内基因组结构的变异和多态性同种群体内各个个体基因组存在大量的变异和多态性,这种基因组序列的差异构成了不同个体与群体对疾病的易感性和对药物、环境因素等不同反应的分子遗传学基础。例如,SNP最大限度地代表了不同个体之间的遗传差异,鉴别个体间SNP差异可揭示不同个体的疾病易感性和对药物的反应性,有利于判定不同人群对疾病的易感程度并指导个体化用药。 三、功能基因组学系统探讨基因的活动规律 功能基因组学的主要研究内容包括基因组的表达、基因组功能注释、基因组表达调控网络及机制的研究等。它从整体水平上研究一种组织或细胞在同一时间或同一条件下所表达基因的种类、数量、功能,或同一细胞在不同状态下基因表达的差异。它可以同时对多个表达基因或蛋白质进行研究,使得生物学研究从以往的单一基因或单一蛋白质分子研究转向多个基因或蛋白质的系统研究。 (一)通过全基因组扫描鉴定DNA序列中的基因 这项工作以基因组DNA序列数据库为基础,加工和注释人类基因组的DNA序列,进行新基因预测、蛋白质功能预测及疾病基因的发现。主要采用计算机技术进行全基因组扫描,鉴定内含子与外显子之间的衔接,寻找全长可读框(open reading frame,0RF),确定多肤链编码序列。 (二)通过BLAST等程序搜索同源基因 同源基因在进化过程中来自共同的祖先,因此通过核昔酸或氨基酸序列的同源性比较,就可以推测基因组内相似基因的功能。这种同源搜索涉及序列比较分析,NCB I的BLAST程序是基因同源性搜索和比对的有效工具。每一个基因在GenBank中都有一个序列访问号(accession number),在BLAST界面上输入2条或多条访问号,就可实现一对或多对序列的比对。 (三)通过实验验证基因功能 可设计一系列的实验来验证基因的功能,包括转基因、基因过表达、基因敲除、基因敲减或基因沉默等方法,结合所观察到的表型变化即可验证基因功能。由于生命活动的重要功能基因在进化上是保守的,因此可以采用合适的模式生物进行实验。(四)通过转录物组和蛋臼质组描述基因表达模式“基因的表达包括转录和翻译过程,研究基因的表达模式及调控可借助转录物组学和蛋白质组学相关技术与方法(见本章第二、三节)进行。 四、ENCODE计划旨在识别人类基因组所有功能元件 HGP提供了人类基因组的序列信息(符号),并定位了大部分蛋白质编码基因。如何解密这些符号代表的意义,特别是还有98%左右的非蛋白质编码序列的功能,仍然是一项十分繁重的任务。 (-)ENCODE计划是HGP的延续与深入 若要全面理解生命体的复杂性,必须全面确定基因组中各个功能元件及其作用。在此背景下,美国于2003年9月启动了DNA元件百科全书(the Encycloped ia of DNA Eleme nt, ENCODE)计划。ENCODE计划的目标是识别人类基因组的所有功能元件,包括蛋白质编码基因、各类RNA编码序列、转录调控元件以及介导染色体结构和动力学的元件等,当然还包括有待明确的其他类型的功能性序列(图27-3),其目的是完成人类基因组中所有功能元件的注释,帮助我们更精确地理解人类的生命过程和疾病的发生、发展机制。 DNA复制位点 表观遗传修饰/,,, I[芦与 -----二.二之一\/--刁\y, f`'__II>基因长调控元件顺式调节元件转录本(增强子,阻遏子f(Jl默子,绝缘子)(启动子,转录因子结合位点) (二)ENCODE计划已取得重要阶段性成果 根据ENCODE计划联盟有关1640组覆盖整个人类基因组的数据分析报告认为:人类基因组的大部分序列(80.4%)具有各种类型的功能,而并非之前认为的大部分是"垃圾“DNA;人类基因组中有399124个区域具有增强子样特征,70292个区域具有启动子样特征;非编码功能元件富含与疾病相关的SNP,大部分疾病的表型与转录因子相关。这些发现有助于深入理解基因表达调控的规律,并发现和鉴定出一大批与疾病相关的遗传学风险因子。 第二节转录物组学 转录物组(transcriptome)指生命单元所能转录出来的全部转录本,包括mRNA、rRNA、tRNA和其他非编码RNA~。因此,转录物组学(transcri ptomics)是在整体水平上研究细胞编码基因(编码RNA和蛋白质)转录产生的全部转录物的种类、结构和功能及其相互作用的科学。与基因组相比,转录物组最大的特点是受到内外多种因素的调节,因而是动态可变的。这同时也决定了它最大的魅力在于\IImiii496第五篇医学分子生物学专题揭示不同物种、不同个体、不同细胞、不同发育阶段和不同生理病理状态下的基因差异表达的信息。 一、转录物组学全面分析基因表达谱 转录物组学是基因组功能研究的一个重要部分,它上承基因组,下接蛋白质组,其主要内容为大规模基因表达谱分析和功能注释。 大规模表达谱或全景式表达谱(global exp比ss i on profile)是生物体(组织、细胞)在某一状态下基因表达的整体状况。长期以来,基因功能的研究通常采用基因的差异表达方法,效率低,无法满足大规模功能基因组研究的需要。利用近年来建立起来整体性基因表达分析如微阵列(或芯片)、表达系列分析和大规模平行信号测序系统等技术,可以同时监控成于上万个基因在不同状态(如生理、病理、发育不同时期、诱导刺激等)下的表达变化,从而推断基因间的相互作用,揭示基因与疾病发生、发展的内在关系。 二、转录物组研究采用整体性分析技术 任何一种细胞在特定条件下所表达的基因种类和数量都有特定的模式,称为基因表达谱,它决定着细胞的生物学行为。而转录物组学就是要阐明生物体或细胞在特定生理或病理状态下表达的所有种类的RNA及其功能。微阵列(microarray)、基因表达系列分析(serial analysis of gene expression, SAGE)和大规模平行信号测序系统(massively parall el signatur e sequencing, MPSS)等技术可用千大规模转录物组研究。 (一)微阵列是大规模基因组表达谱研究的主要技术微阵列或DNA芯片(见第二十四章)可以同时测定成千上万个基因的转录活性,甚至可以对整个基因组的基因表达进行对比分析,因而成为基因组表达谱研究的主要技术。(二)SAGE在转录物水平研究细胞或组织基因表达模式SAGE的基本原理是用来自cDNA3'-端特定位置9~10bp长度的序列所含有的足够信息鉴定基因组中的所有基因。可利用铀定酶(anchoring enzyme, AE)和位标酶(tagging enzyme, TE)这两种限制性内切酶切割DNA分子的特定位置(靠近3'-端),分离SAGE标签,并将这些标签串联起来,然后对其进行测序。这种方法可以全面提供生物体基因表达谱信息。它还可用来定量比较不同状态下组织或细胞的所有差异表达基因。 (三)MPSS是以序列测定为基础的高通量基因表达谱分析技术MPSS的原理是采用能够特异识别每个转录子信息的序列信号(sequence signatur e,16-20hp)来定量地大规模平行测定相应转录子的表达水平。也就是将mRNA一端测出的一个包含10~20bp的特异序列信号用作检测指标,每一序列信号在样品中的频率(拷贝数)就代表了与该序列信号相应的基因表达水平。MPSS所测定的基因表达水平是以计算mRNA拷贝数为基础的,是一个数字表达系统。只要将目的样品和对照样品分别进行测定,通过严格的统计检验,就能测定表达水平较低、差异较小的基因,而且不必预先知道基因的序列。 三、转录物组测序和单细胞转录物组分析是转录物组学的核心任务目前,转录物组学的核心任务侧重千大规模转录物组测序和单细胞转录物组分析两个方面。 (—)高通量转录物组测序是获得基因表达调控信息的基础转录物组测序即RNA测序(RNA sequencin g, RNA-seq),其研究对象为特定细胞在某一功能状态下所能转录出来的所有RNA。基于高通最测序平台的RNA-seq技术能够在单核昔酸水平对任意物种的整体转录活动进行检测,在分析转录本的结构和表达水平的同时,还能发现未知转录本和低丰度转录本,发现基因融合,识别可变剪切位点和SNP,提供全面的转录物组信息。 (二)单细胞转录物组有助于解析单个细胞行为的分子基础不同类型的细胞具有不同的转录物组表型,并决定细胞的最终命运。从理论上讲,转录物组分析应该以单细胞为研究模型,这样有助于解析单个细胞的行为、机制以及与机体的关系等的分子基础。单细胞测序可解决用全组织样本测序无法解决的细胞异质性问题,尤其适用于存在高度异质性的干细胞及胚胎发育早期的细胞群体。与活细胞成像系统相结合,单细胞转录物组分析更有助千深入理解细胞分化、细胞重编程及转分化等过程以及相关的基因调节网络。单细胞转录物组分析在临床上可以连续追踪疾病基因表达的动态变化,监测病程变化、预测疾病预后。 第三节蛋白质组学 蛋白质是生物功能的主要载体。蛋白质组(proteome)是指细胞、组织或机体在特定时间和空间上表达的所有蛋白质。蛋白质组学(proteomics)以所有这些蛋白质为研究对象,分析细胞内动态变化的蛋白质组成、表达水平与修饰状态,了解蛋白质之间的相互作用与联系,并在整体水平上阐明蛋白质调控的活动规律,故又称为全景式蛋白质表达谱(global protein expression profile)分析包。 —、蛋白质组学研究细胞内所有蛋白质的组成及其活动规律蛋白质组学的研究主要涉及两个方面:一是蛋白质组表达模式的研究,即结构蛋白质组学(structural proteomics);二是蛋白质组功能模式的研究,即功能蛋白质组学(functional proteomics)。由于蛋白质的种类和数量总是处在一个新陈代谢的动态过程中,同一细胞的不同周期,其所表达的蛋白质是不同的;同一细胞在不同的生长条件(正常、疾病或外界环境刺激)下,所表达的蛋白质也是不同的。以上动态变化增加了蛋白质组研究的复杂性。 (一)蛋白质鉴定是蛋白质组学的基本任务 1.蛋白质种类和结构鉴定是蛋白质组研究的基础细胞在特定状态下表达的所有蛋白质都是蛋白质组学的研究对象。一般利用二维电泳和多维色谱并结合生物质谱、蛋白质印迹、蛋白质芯片等技术,对蛋白质进行全面的种类和结构鉴定研究。 2翻译后修饰的鉴定有助千蛋白质功能的阐明很多mRNA表达产生的蛋白质要经历翻译后修饰如磷酸化、糖基化等过程。翻译后修饰是蛋白质功能悯控的重要方式,因此,研究蛋白质翻译后修饰对阐明蛋白质的功能具有重要意义。 (二)蛋白质功能确定是蛋白质组学的根本目的 1.各种蛋白质均需要鉴定其基本功能特性蛋白质功能研究包括蛋白质定位研究,基因过表达/基因敲除(减)技术分析蛋白质活性,此外,分析酶活性和确定酶底物,细胞因子的生物学作用分析,配体-受体结合分析等也属蛋白质功能研究范畴。 2蛋白质相互作用研究是认识蛋白质功能的重要内容细胞中的各种蛋白质分子往往形成蛋白质复合物共同执行各种生命活动。蛋白质-蛋白质相互作用是维待细胞生命活动的基本方式。要深入研究所有蛋白质的功能,理解生命活动的本质,就必须对蛋白质-蛋白质相互作用有一个清晰的了解,包括受体与配体的结合、信号转导分子间的相互作用及其机制等。目前研究蛋白质相互作用常用的方法有酵母双杂交、亲和层析、免疫共沉淀、蛋白质交联、荧光共振能量转移等(见第二十四章)。 二、二维电泳、液相分离和质谱是蛋白质组研究的常用技术目前常用的蛋白质组研究主要有两条技术路线,一是基于双向凝胶电泳(two-dimensional gel electrophores i s,2-DE)分离为核心的研究路线:混合蛋白质首先通过2-DE分离,然后进行胶内酶解,再用质谱(mass spectroscopy, MS)进行鉴定3;二是基于液相色谱(liquid chromatography, LC)分离为核心的技术路线:混合蛋白质先进行酶解,经色谱或多维色谱分离后,对肤段进行串联质谱分析以实现蛋白498第五篇医学分子生物学专题质的鉴定。其中,质谱是研究路线中不可缺少的技术。(-)2-DE-MALDI-MS根据等电点和分子量分离鉴定蛋白质1.2-DE是分离蛋白质的有效方法2-DE是分离蛋白质最基本的方法,其原理是蛋白质在高压电场作用下先进行等电聚焦(isoelec tric focusing, IEF)电泳,利用蛋白质分子的等电点不同使蛋白质得以分离;随后进行SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE),使依据等电点分离的蛋白质再按分子蜇大小进行再次分离(图27-4)。目前2-DE的分辨率可达到10000个蛋白质点。 2. MALDI-MS鉴定2-DE胶内蛋白质点MS是通过测定样品离子的质荷比(mlz)来进行成分和结构分析的方法。2-DE胶内蛋白质点的鉴定常采用基质辅助激光解吸附离子化(matrix-assisted laser desorption ionization, MALDI)技术。MALDI作为一种离子源,通常用飞行时间(time of flight, TOF)作为质量分析器,所构成的仪器称为MALDI-TOF-MS。MALDI的基本原理是将样品与小分子基质混合共结晶,当用不同波长的激光照射晶体时,基质分子所吸收能量转移至样品分子,形成带电离子并进入MS进行分析,飞行时间与(mlz)1/2成正比。MALDI-TOFMS适合微量样品(fmol-amol)的分析。 利用质谱技术鉴定蛋白质主要通过两种方法:心肤质量指纹图谱(pep ti de mass fingerprinting, PMF)和数据库搜索匹配。蛋白质经过酶解成肤段后,获得所有肤段的分子质量,形成一个特异的PMF图谱,通过数据库搜索与比对,便可确定待分析蛋白质分子的性质。@肤段串联质谱(MS/MS)的信息与数据库搜索匹配。通过MS技术获得蛋白质一段或数段多肤的MS/MS信二维电泳 .-~..; . 星 §O·,... SOS-PAGE二.`-...'一 —pl渐降一 渐 降 `讥 息(氨基酸序列)并通过数据库检索来鉴定该蛋白质。混合蛋白质酶解后的多肤混合物直接通过(多维)液相色谱分离,然后进入MS进行分析。质谱仪通过选择多个肤段离子进行MS/MS分析,获得有关序列的信息,并通过数据库搜索匹配进行鉴定(图27-5)。 (二)LC-ES卜MS通过液相层析技术分离鉴定蛋白质 基于LC-ESI-MS的蛋白质组研究技术通常称之为鸟枪法(shotgun)策略(图27-6)。其特点是组合多种蛋白质或肤段分离手段,首选不同的层析技术,实现蛋白质或多肤的高效分离,并与MS/MS技术结合,实现多肤序列的准确鉴定。 1.层析分离肤混合物从组织中提取的目标蛋白质混合物首先进行选择性酶解,获得肤段混合物,然后进行二维液相分离。一维液相分离一般采用强阳离子交换层析,利用肤段所带电荷数差异进行分离;二维分离常常选择纳升反相层析,利用肤段的疏水性差异进行分离。 2.电喷雾串联质谱鉴定肤段在肤段鉴定中,纳升级液相层析(nano-LC)常与电喷雾串联质谱(electrospray ionization, ESI)相连。ESI的基本原理是利用高电场使MS进样端的毛细管柱流出的液滴带电,带电液滴在电场中飞向与其所带电荷相反的电势一侧。液滴在飞行过程中变得细小而呈喷雾状,被分析物离子化成为带单电荷或多电荷的离子,使被分析物得以鉴定。nano-LC-ES I-MS可以实现对复杂肤段混合物的在线分离、柱上富集与同步序列测定,一次分析可以鉴定的蛋白质数目超过1000个,而结合多维层析分离技术,可以利用鸟枪法一次实验鉴定吓L上万个蛋白质。 第二十七章组学与系统生物医学499 (1)样品分离2-DE挖取蛋白质点肮混合物 (2)胰酶消化 工上一匕 \`熘 ,门 / y9 图27-5基千2-DE-MALDI-MS的蛋白质组分析技术路线MS谱获得蛋白质的PMF;MS/MS可测定蛋白质的部分氨基酸序列。 500第五篇医学分子生物学专题 第四节代谢组学 细胞内的生命活动大多发生于代谢层面,因此代谢物的变化更直接地反映了细胞所处的环境,如营养状态、药物作用和环境影响等。代谢组学(metabonomics)就是测定一个生物/细胞中所有的小分子组成,描绘其动态变化规律,建立系统代谢图谱,并确定这些变化与生物过程的联系3。 —、代谢组学的任务是分析生物/细胞代谢产物的全貌代谢组学分为四个层次:心代谢物靶标分析(metabolite target analysis):对某个或某几个特定组分进行分析;@代谢谱分析(metabolic profiling an alysis):对一系列预先设定的目标代谢物进行定量分析。如某一类结构、性质相关的化合物或某一代谢途径中所有代谢物或一组由多条代谢途径共享的代谢物进行定量分析;@代谢组学:对某一生物或细胞所有代谢物进行定性和定量分析;@代谢指纹分析(m e taboli c fingerprinting analysis):不分离鉴定具体单一组分,而是对代谢物整体进行高通量的定性分析。 代谢组学主要以生物体液为研究对象,如血样、尿样等,另外还可采用完整的组织样品、组织提取液或细胞培养液等进行研究。血样中的内源性代谢产物比较丰富,信息量较大,有利千观测体内代谢水平的全貌和动态变化过程。尽管尿样所含的信息量相对有限,但样品采集不具损伤性。 二、核磁共振、色谱及质谱是代谢组学的主要分析工具由于代谢物的多样性,常需采用多种分离和分析手段,其中,核磁共振(nuclear生物体、器官、组织、细胞magnetic resonance, NMR)、色谱及MS等技术1离体是最主要的分析工具(图27-7)。(DNMR:是提取液当前代谢组学研究中的主要技术。代谢组学中常用的NMR谱是氢谱(I H-NMR)、碳谱GC J CE UPLC NMR、ITIR(13C-NMR)及磷谱(31P-NMR)。@MS:按质j I\I/I\/H』|LC\FT-Raman荷比(mlz)进行各种代谢物的定性或定量分LC-NMR-MS I了NMRMSUV析,可得到相应的代谢产物谱。@色谱-质谱联用技术:这种联用技术使样品的分离、定性、定量一次完成,具有较高的灵敏度和选择代谢组学数据性。目前常用的联用技术包括气相色谱-质谱(GC-MS)联用和液相色谱-质谱(LC-MS)图27-7代谢组学研究的技术系统及手段联用。 三、代谢组学技术在生物医学领域具有广阔的应用前景代谢组学所关注的是代谢循环中小分子代谢物的变化情况及其规律,反映的是内、外环境刺激下细胞、组织或机体的代谢应答变化。与基因组学和蛋白质组学相比,代谢组学与临床的联系更为紧密。疾病导致体内病理生理过程变化,可引起代谢产物发生相应的改变。因此,开展疾病代谢组研究可以提供疾病(如某些肿瘤、肝疾病、遗传性代谢病等)诊断、预后和治疗的评判标准,并有助千加深对疾病发生、发展机制了解;利用代谢组学技术可以快速检测毒物和药物在体内的代谢产物和对机体代谢的影响,有利千判定毒物、药物的代谢规律,为深入阐明毒物中毒机制和发展个体化用药提供理论依据;利用代谢组学技术对代谢网络中的酶功能进行有效的整体性分析,可以发现已知酶的新活性吓1..并发掘未知酶的功能;最后,由千代谢组学分析技术具有整体性、分辨率高等特点,可广泛应用于中药第二十七章组学与系统生物医学501作用机制、复方配伍、毒性和安全性等方面的研究,为中药现代化提供技术支撑。 第五节其他组学 一、糖组学研究生命体聚糖多样性及其生物学功能生物界丰富多样的聚糖类型狻盖了有机体所有细胞,它们不仅决定细胞的类型和状态,也参与了细胞许多生物学行为,如细胞发育、分化,肿瘤转移,微生物感染,免疫反应等。糖组学(glycomi cs)侧重于糖链组成及其功能的研究,其主要研究对象为聚糖,具体内容包括研究糖与糖之间、糖与蛋白质之间、糖与核酸之间的联系和相互作用。糖组学是基因组学和蛋白质组学等的后续和延伸。因此,要深入了解生命的复杂规律,就必须有“基因组-蛋白质组-糖组"的整体观念,这样才有可能揭示生物体全部基因功能,从而为重大疾病发生、发展机制的进一步阐明和有效控制,以及为疾病预测、新的诊断标记物的筛选及药物靶标的发现提供依据。 (一)糖组学分为结构糖组学与功能糖组学两个分支糖组(glycome)指单个个体的全部聚糖,糖组学则对糖组(主要针对糖蛋白)进行全面的分析研究,包括结构和功能两方面内容,因此可将其分为结构糖组学(s tructural glycomics)和功能糖组学(fu nctional glycomics)两个分支。糖组学的内容主要涉及单个个体的全部糖蛋白结构分析,确定编码糖蛋白的基因和蛋白质糖基化的机制。因此,糖组学主要要回答4个方面的问题:心什么基因编码糖蛋白,即基因信息;@可能糖基化位点中实际被糖基化的位点,即糖基化位点信息;@聚糖结构,即结构信息;@糖基化功能,即功能信息。 (二)色谱分离/质谱鉴定和糖微阵列技术是糖组学研究的主要技术1.色谱分离与质谱鉴定技术色谱分离与质谱鉴定技术为糖组学研究的核心技术,被广泛地应用千糖蛋白的系统分析。通过与蛋白质组数据库结合使用,这种方法能系统地鉴定可能的糖蛋白和糖基化位点。 具体策略包括如下几个步骤:心凝集素亲和层析-1(用千糖蛋白分离):依据待分离糖蛋白的聚糖类型单独或串联使用不同的凝集素;@蛋白质消化:将分离得到的糖蛋白用蛋白酶I消化以生成糖肤;@凝集素亲和层析-2(用于糖肤分离):采用与步骤CD相同的凝集素柱从消化液中捕集目的糖肤;@HPLC纯化糖肤;@序列分析、质谱和解离常数测定;@数据库搜索和聚糖结构分析以获得相关遗传和糖基化信息。然后使用不同的凝集素柱进行第二和第三次循环,捕集其他类型的糖肤,以对某个细胞进行较全面的糖组学研究。其中凝集素亲和层析亦称为糖捕获(glyco-catch)法。 2.糖微阵列技术糖微阵列技术是生物芯片中的一种,是将带有氨基的各种聚糖共价连接在包被有化学反应活性表面的玻璃芯片上,一块芯片上可排列200种以上的不同糖结构,几乎涵盖了全部末端糖的主要类型包。糖微阵列技术可广泛用于糖结合蛋白的糖组分析,以对生物个体产生的全部蛋白聚糖结构进行系统鉴定与表征。但目前可用于微阵列的糖数量还非常有限,糖微阵列技术有待进一步的发展。 3.生物信息学糖蛋白糖链研究的信息处理、归纳分析以及糖链结构检索都要借助生物信息学来进行。目前这方面的数据库和网络包括CFG、KEGG和CCSD等。 (三)糖组学与肿瘤的关系密切 目前,2-DE已经成功地用千鉴定糖蛋白差异。已报道有多种血清糖蛋白可作为肾细胞癌、乳腺癌、结直肠癌等的标记物;糖基化改变普遍存在于肿瘤的发生、发展过程中,分析糖基化修饰对于深入研究肿瘤的发生机制及诊断治疗有着重要的价值;糖基化差异也可用于构建特异的多糖类癌症疫苗,以发展新的免疫治疗策略。 与基因组学和蛋白质组学研究相比,糖组学的研究还处于起步阶段。阻碍糖组学迅速发展的原502第五篇医学分子生物学专题因主要是糖链本身结构的复杂性和研究技术的限制。但不管如何,糖组学作为基因组学和蛋白质组学的重要补充,将为人类在对生命本质深层次理解的进程中发挥越来越重要的作用。 二、脂组学揭示生命体脂质多样性及其代谢调控 生命体脂质具有化学多样性和功能多样性的特点,其代谢与多种疾病的发生、发展密切相关,很多疾病都与脂代谢紊乱有关,如糖尿病、肥胖病、癌症等。因此,脂质的分析量化对研究疾病发生机制和诊断治疗,以及医药研发有非常重要的生物学意义。脂组学(lipidomics)就是对生物样本中脂质进行全面系统的分析,从而揭示其在生命活动和疾病中发挥的作用区上(—)脂组学是代谢组学的一个分支脂组学的研究内容为生物体内的所有脂质分子,并以此为依据推测与脂质作用的生物分子的变化,揭示脂质在各种生命活动中的重要作用机制。通过研究脂质提取物,可获得脂组(lipidome)的信息,了解在特定生理和病理状态下脂质的整体变化。因此,脂组学实际上是代谢组学的重要组成部分。 脂组学的研究有以下优势:心只研究脂质物质及其代谢物。脂质物质在结构上的共同点决定了样品前处理及分析技术平台的搭建较为容易,而且可以借鉴代谢组学的研究方法。@脂组学数据库的建立和完善速度较快,并能建立与其他组学的网络联系。@脂质组分析的技术平台可用于代谢组学的研究,促进代谢组学发展。 (二)脂组学研究的三大步骤—一分离、鉴定和数据库检索1样品分离脂质主要从细胞、血浆、组织等样品中提取。由于脂质物质在结构上有共同特点,即有极性的头部和非极性的尾部。所以,脂质采用氯仿、甲醇及其他有机溶剂的混合提取液,能够较好地溶出样本中的脂质物质。 2.脂质鉴定随着分析技术的不断发展,脂质的分析方法也在不断的改进。总体而言,大部分的分析技术都能用来分析脂质,包括脂肪酸、磷脂、神经鞘磷脂、甘油三酷和类固醇等。常规的技术有菏层色谱(TLC)、气相色谱-质谱联用(GC-MS汃电喷雾质谱(ESI/MS)、液相色谱-质谱联用(LCIMS)、高效液相色谱-芯片-质谱联用(HPLC-ChiplMS汃超高效液相色谱-质谱联用(UPLCIMS)、超高效液相色谱-傅立叶变换质谱联用(UPLCIFT-MS)等。 3.数据库检索随着脂组学的迅速发展,相关数据库也逐步建立。现有数据库能够查询脂质结构、质谱信息、分类及实验设计、实验信息等,其功能也越来越完善。数据库的建立无疑成为推动脂组学自身发展的良好工具。国际上最大的数据库LIPID Maps(http:llwww. lipidmaps. org/)是由美国国立综合医学研究所(National Institute of General Medical Sciences, NIGMS)组织构建的,它包含了脂质分子的结构信息、质谱信息、分类信息、实验设计等。数据库包含了游离脂肪酸、胆固醇、甘油三酉趴磷脂等八个大类共40673种脂质的结构信息(截至2017年1月)。 (三)脂组学研究促进脂质生物标志物的发现和疾病诊断发现疾病相关的诊断标志物是进行疾病诊断的关键。脂组学所提供的方法能够监测病人与正常人之间的脂质变化,从中找到差异较大的脂质化合物,作为疾病早期诊断的指标。科学家定量研究了卵巢癌病人和良性卵巢瘤病人血清中各种胆固醇及脂蛋白的含量变化,结果表明:以载脂蛋白A I(apoA I)和游离胆固醇(free cholesterol, FC)为诊断指标排除卵巢瘤的正确率高达95.5%,综合apoA I、FC、高密度脂蛋白游离胆固醇(HDLFC)、高密度脂蛋白总胆固醇(HDLTC)、apoB及高密度脂蛋白-3(HDL3)片段诊断卵巢癌的准确率达到97.0%。另有证据报道溶血磷脂酸在卵巢癌的诊断中表现出高度的敏感性和特异性,能够作为早期诊断卵巢癌及术后随访的生物标志物。 总之,脂组学从脂代谢水平研究疾病的发生、发展过程的变化规律,寻找疾病相关的脂生物标志物,进一步提高疾病的诊断效率,并为疾病的治疗提供更为可靠的依据。脂组学能够在一定程度上促进代谢组学的发展,并通过代谢组学技术的整合运用建立与其他组学之间的关系,最终实现医学科学吓L的整体进步。 第二十七章组学与系统生物医学503 第六节系统生物医学及其应用 HGP的完成极大地促进了医学科学的发展。各种组学的不断发展以及集成已经形成了一门新的学科一系统生物医学(systems biomedicine)。在这一大背景下,现代医学正酝酿着一场颠覆性的变革,分子医学的深入、精准医学的开展以及转化医学的发展等有望从分子水平突破对疾病的传统认识,从而彻底改变和革新现有的临床诊疗模式。 一、系统生物医学是以整体性研究为特征的一种整合科学系统生物医学应用系统生物学(systems biology)原理与方法研究人体(包括动物和细胞模型)生命活动的本质、规律以及疾病发生发展机制,实际上就是系统生物学的医学应用研究。 (一)系统生物医学强调机体组成要素和表型的整体性系统生物医学从全方位、多层次(分子、细胞器、细胞、组织、器官、个体/基因型、环境因子、种群、生态系统)的角度,整体性揭示一个机体所有组成成分(基因、mRNA、蛋白质等)的构成,以及在特定条件下这些组分间的相互关系及其效应。以往的实验生物学仅关心个别或一批基因和蛋白质,系统生物医学则不同,它要研究一个细胞/机体内所有的基因、所有的蛋白质,特别是所有生物分子间的所有相互关系及其导致的生物学效应。显然,系统生物医学是以整体性研究为特征的一种整合科学(integrative science)。 (二)系统生物医学将极大地推动现代医学科学的发展系统生物医学使生命科学由描述式的科学转变为定量描述和预测的科学,改变了21世纪医学科学的研究策略与方法,并将对现代医学科学的发展起到巨大的推动作用。当前系统生物医学理论与技术已经在预测医学(predictive medicine)、预防医学(preventive medicine)和个性化医学(personalized med icine)中得到应用,如应用代谢组学的生物指纹预测冠心病病人的危险程度和肿瘤的诊断以及治疗过程的监控;应用基因多态性图谱预测病人对药物的应答,包括毒副作用和疗效。再如,表型组学的细胞芯片和代谢组学的生物指纹将广泛用于新药的发现和开发,使新药的发现过程由高通量逐步发展为高内涵(high-content)。未来的治疗不再依赖千单一药物,而是使用一组药物(系统药物)的协调作用来控制病变细胞的代谢状态,以减少药物的副作用,维待疾病治疗的最大效果。 二、分子医学是发展现代医学科学的重要基础 分子医学(molecular medicine)就是从分子水平阐述疾病状态下基因组的结构、表达产物、功能及其表达调控规律,发展现代高效预测、预防、诊断和治疗手段。因此,分子医学实际上就是医学的一个分支学科,主体内容是分子生物学在医学中的应用,涵盖了其主要的理论和技术体系。疾病基因组学、转录物组学、蛋白质组学、代谢组学等是开展分子医学的基础。 (一)疾病基因组学阐明发病的分子基础 疾病基因(或疾病相关基因)以及疾病易感性的遗传学基础是疾病基因组学研究的两大任务。定位克隆(positional cloning)技术的发展极大地推动了疾病基因或疾病相关基因的发现和鉴定,该技术将疾病相关基因位点定位于某一染色体区域后,根据该区域的基因、EST或模式生物所对应的同源区的已知基因等有关信息,直接进行基因突变筛查,从而可确定疾病相关基因(见第二十五章)。 SNP是疾病易感性的重要遗传学基础,例如,APOE基因单个碱基变异与阿尔茨海默病(Alzheimer disease,AD)的发生相关,趋化因子受体基因CCR5中一个单纯缺失突变会导致对HIV的抗性等。疾病基因组研究在全基因组SNP制图基础上,筛选和鉴定与疾病相关的SNP,从而阐明各种疾病易感人群的遗传学背景,为疾病的诊断和治疗提供新的理论基础。 504第五篇医学分子生物学专题 (二)药物基因组学揭示遗传变异对药物效能和毒性的影响药物基因组学(pharmacogenomics)是功能基因组学与分子药理学的有机结合。药物基因组学以药物效应和安全性为目标,研究各种基因突变与药效及安全性的关系。正因为药物基因组学是研究基因序列变异及其对药物不同反应的科学,所以也是研究高效/特效药物的重要途径,通过它可为病人或者特定人群寻找合适的药物包。 药物基因组学广泛应用遗传学、基因组学、蛋白质组学和代谢组学信息来预测患病人群对药物的反应,从而指导临床试验和药物开发过程。不断涌现的各种生物分析技术,如基因变异检测技术、SNP高通量扫描技术、药物作用显示技术、基因分型研究技术等,为药物基因组学的进一步发展提供了技术支撑。药物基因组学使药物治疗模式由诊断定向治疗转为基因定向治疗。 (三)疾病转录物组学阐明疾病发生机制并推动新诊治方式的进步疾病转录物组学是通过比较研究正常和疾病条件下、或疾病不同阶段基因表达的差异情况,从而为阐明复杂疾病的发生发展机制,筛选新的诊断标志物,鉴定新的药物靶点,发展新的疾病分子分型技术,以及开展个体化治疗提供理论依据。 例如,外周血转录物谱可作为冠状动脉疾病(coronai-y artery diseases, CAD)诊断与病程、预后判定的生物标志物。CardioDx发展了基于23个基因表达谱的诊断试剂盒Corns CAD,适用于早期阻塞性CAD的诊断。再如,近年研究表明多种疾病(包括肿瘤)与miRNA密切相关,检测血清中miRNA表达谱可指示某些疾病的发生。目前巳有HBV、心脏疾病(包括急性冠状动脉综合征、急性心肌梗死、高血压、心力衰竭等)、2型糖尿病和肝癌等的血清miRNA作为诊断标记物的报道。此外,miRNA还可作为某些疾病治疗的潜在靶点,例如针对miRNA-182的反义寡聚核昔酸可以用千黑色素瘤肝转移的治疗。 (四)疾病蛋白质组学发现和鉴别药物新靶点 药物作用靶点的发现与验证是新药发现阶段的重点和难点,成为制约新药开发速度的瓶颈。近年来,随着蛋白质组研究技术的不断进步,蛋白质组学在药物靶点的发现应用中亦显示出越来越重要的作用。 疾病相关蛋白质组学研究可以发现和鉴定在疾病条件下表达异常的蛋白质,这类蛋白质可作为药物候选靶点。疾病相关蛋白质组学还可对疾病发生的不同阶段进行蛋白质变化分析,发现一些疾病不同时期的蛋白质标志物,不仅对药物发现具有指导意义,还可形成未来诊断学、治疗学的理论基础。许多疾病与信号转导异常有关,因而信号分子和途径可以作为治疗药物设计的靶点。在信号传递过程中涉及数十或数百个蛋白质分子,蛋白质-蛋白质相互作用发生在细胞内信号传递的所有阶段。而且,这种复杂的蛋白质作用的串联效应可以完全不受基因调节而自发地产生。通过与正常细胞作比较,掌握与疾病细胞中某个信号途径活性增强或丧失有关的蛋白质分子的变化,将为药物设计提供更为合理的靶点。 (五)医学代谢组学提供新的疾病代谢物标志物代谢组学经过十余年的发展,方法正日趋成熟,其应用已逐步渗透到生命科学研究领域的多个方面,在医学科学中亦日益彰显出其强有力的潜能。 与基因组学和蛋白质组学相比,代谢组学研究侧重千代谢物的组成、特性与变化规律。通过对某些代谢产物进行分析,并与正常入的代谢产物比较,可发现和筛选出疾病新的生物标志物,对相关疾病作出早期预警,并发展新的有效的疾病诊断方法。例如通过代谢组学的研究,证实血清中VLDL、LDL、HDL和胆碱的含量/比值可以判断心脏病的严重程度;血清中脂蛋白颗粒的组成,如脂肪酸侧链的不饱和度、脂蛋白分子之间相互作用的强度(而不是脂质的绝对含量)是影响高血压病人收缩压的主要因素;通过比较病人与正常人尿样中嗦呤和啼唗化合物图谱,能够实现绝大多数核甘酸相关代谢遗传疾病的诊断。 第二十七章组学与系统生物医学505 三、精准医学是实现个体化医学的重要手段 精准医学(precision medicine)的目的就是全面推动个体基因组研究,依据个人基因组信息"量体裁衣”式(tailored)制定最佳的个性化治疗方案,以期达到疗效最大化和副作用最小化。 精准医学分为短期和长远两个目标。短期目标就是癌症治疗。癌症是常见的疾病,其全球发病率和死亡率逐年上升,而目前临床上尚缺乏有效的、针对性强的治疗方法。精准医学希望通过个体基因组研究,发现和鉴定与癌症发生发展相关的基因和调控因子,发掘新的肿瘤标志物,发展新的肿瘤分子分型技术,开展基于个体基因组的个体化治疗方法与技术。长期目标是健康管理。精准医学通过科技进步,将其优势拓展到健康和医疗的各个方面,从而提升对疾病风险评估,疾病发生、发展和转归机制的认识,以及疾病最佳治疗方案的制定与实施。 我国于2016年正式启动国家重点研发计划“精准医学研究”重点专项,按照全链条部署、一体化实施的原则,部署新一代临床用生命组学技术研发,大规模人群队列研究,精准医学大数据的资源整合、存储、利用与共享平台建设,疾病防诊治方案的精准化研究,精准医学集成应用示范体系建设等五大研究任务。 四、转化医学是加速基础研究实际应用的重要路径转化医学(translation al medicine)强悯以临床问题为导向,开展基础-临床联合攻关,将基因组学等各种分子生物学研究成果迅速有效地转化为可在临床实际应用的理论、方法、技术和药物。转化医学的核心是要在实验室和病床(bench to bedside,简称B2B)之间架起一条快速通道。 转化医学产生的背景主要基于以下几个方面:心基础研究与临床问题解决之间严重脱节;@疾病谱的转变使医疗成本大大增加;@基础科学研究积累大量数据的意义需要解析;@基础研究和药物开发及医学实践三者需要整合。因此,围绕以临床问题为导向,开展医学科学实践,是解决医学根本性问题的有效途径,这也是转化医学的根本目的。 转化医学的目标就是将生命科学和生物技术及相关的现代科学技术整合、转变现有的医学模式,推动医疗改革,提高入民的健康水平和生活质量,从而达到更精确的预警与诊断,更有效的干预和治疗,降低发病率推迟发病平均年龄提高治愈率、减少重症病人,以及降低医疗的综合成本。 生物遗传信息的传递具有方向性和整体性的特点。组学从组群或集合的角度梒视遗传信息传递链中各类分子(DNA、RNA、蛋白质、代谢物等)的结构与功能以及它们之间的联系。按照生物遗传信息,无方向,可将组学分为基因组学、转录物组学、蛋白质组学、代谢组学等层次。 基因组学是阐明整个基因组结构、功能以及基因之间相互作用的科学。主要研究内容包括结构基因组学、功能基因组学和比较基因组学。结构基因组学的主要任务是基因组作图和序列测定;比较基因组学通过不同生物基因组之间的比较,研究基因组的功能及其进化关系;功能基因组学利用结构基因组所提供的信息,分析基因组中所有基因(包括编码和非编码序列)的功能;ENCODE计划是HGP的延续与深入,其主要目的是识别人类基因组中所有的功能元件,特别是非编码序列的功能和转录调控元件。 转录物组学在整体水平上研究生命单元所能转录出来的全部转录本(包括mRNA和所有非编码RNA)的种类、结构和功能,以及表达水平、时空分布、相互作用及其调控规律等。转录物组受到内外多种因素的调节,因而是动态可变的。 蛋白质组学以细胞、组织或机体在特定时间和空间上表达的所有蛋白质为研究对象,分析细胞内动态变化的蛋白质组成、表达水平与修饰状态,揭示蛋白质之间的相互作用及其调控规律。二维电冰和多维色谱是分离蛋白质组的有效方法,生物质谱是蛋白质组鉴定的主要工具。\(!~~506第五篇医学分子生物学专题代谢组学的主要任务就是测定一个生物所有小分子代谢物的组成,描绘其动态变化规律,建立系统代谢图谱,并确定这些变化与基因、转录、蛋白质层面以及生物过程的联系。 糖组学主要研究对象为聚糖,重点研究糖与糖之间、糖与蛋白质之间、糖与核酸之间的联系和相互作用。脂组学是对生物样本中脂质进行全面系统的分析并从代谢水平阐明与生命过程的有机联系。 系统生物医学应用系统生物学原理与方法研究人体(包括模式动物)生命活动的本质、规律以及疾病发生发展机制,并在此基础上发展新的有效的预测、预防、诊断和治疗方法。 各种组学和系统生物医学的不断发展及其原理/技术与医学、药学等领域交又,产生了分子医学、精准医学、转化医学等现代医学概念。现代医学科学将从分子和整体水平突破对疾病的传统认识,改变和革新现有的诊断、治疗模式。 1何为组学?按生物遗传信息流方向,主要组学有哪些? 2.试述系统生物医学如何推动未来医学的发展。(焦炳华) 名词释义 5. CRISPR(clustered regularly interspaced palindromic repeats,成簇规律间隔短回文重复);细菌基因组上成簇排列的、由来自噬菌体DNA的间隔序列(spacer)和宿主菌基因组的重组序列所形成的特殊重复序列-间隔序列阵列。CRISPR存在于巳测序的40%细菌基因组和90%古细胞(archaea)基因组中。 508名词释义 泳分离的DNA片段变性为单链后转移到膜性材料,在含有探针的溶液中进行杂交反应,可对特定DNA片段进行定性和定量分析。 22. HMG-CoA还原酶(HMG-CoA reductase):在胆固醇生物合成过程中,催化HMG-CoA还原为甲轻戊酸,是细胞胆固醇合成的限速酶。23凡值(K,,, value):等于酶促反应速率为最大反应速率一半时的底物浓度。 31. RNA印迹(RNA blotting):通过检测RNA或mRNA分子,对基因表达进行分析的技术,亦称Northern blotting。利用RNA印迹技术可以对某一组织或细胞中已知的特异mRNA的表达水平进行分析,也可以比较不同组织和细胞中的同一基因的表达情况。 35癌基因(oncogene):能导致细胞发生恶性转化和诱发癌症的基因。绝大多数癌基因是细胞内正常的原癌基因突变或表达水平异常升高转变而来,某些病毒也携带癌基因。36氨基酸代谢库(ami no acid metabolic pool):体内分布于各组织及体液中参与代谢的游离氨基酸的总和,包括食物蛋白质经消化而被吸收的氨基酸、体内组织蛋白质降解产生的氨基酸及体内合成的非必需氨基酸。可作贮存或被利用。37巴斯德效应(Pasteur effect):糖的有氧氧化抑制糖的无氧氧化的现象。在有氧条件下,肌组织通过此效应实现产能的最大化。 38半保留复制(semi-conservati ve replication):DNA复制时,亲代DNA双螺旋解开成为两条单链各自作为模板,按照碱基配对规律合成一条与模板相互补的新链,形成两个子代DNA分子。每一个子代DNA分子中都保留有一条来自亲代的链e这种复制方式称为半保留复制。 39半不连续复制(semi-discon tinuo us replicat ion):前导链连续复制而后随链不连续复制的方式。40必需氨基酸(essentia l amino ac id):体内合成的最不能满足机体需要,必须从食物中摄取的氨基酸。包括:亮氨酸、异亮氨酸、甲硫氨酸、颌氨酸、苏氨酸、色氨酸、苯丙氨酸、赖氨酸和组氨酸。41必需脂肪酸(essential fatty acids):机体必需但自身又不能合成或合成量不足、必须靠食物提供的多不饱和脂肪酸。42表达载体(expression vector):用于介导特定基因在靶细胞中表达的DNA分子,也称表达构造(expression construct),含有增强子和启动子等调控序列用于引导所携带外源基因的有效转录。43别构效应(allos te ri c effect):小分子化合物或配基结合于蛋白质或酶活性部位以外的其他部位(别构部位),引起蛋白质分子的构象变化,而导致蛋白质活性改变的现象。44卧啾症(porphyria):铁卧啾合成代谢异常而导致叶啾或其中间代谢物排出增多的一类疾病,有先天性和后天性两大类。 50超螺旋结构(superhelix或supercoil):由于双螺旋DNA的弯曲、盘绕而造成的DNA分子进一步扭曲所形成的一种DNA的三级结构。DNA超螺旋有两种:当DNA分子沿轴扭转的方向与通常双螺旋的方向相反时,造成双螺旋的欠旋而形成负超螺旋;反之则为正超螺旋。在生物体内,DNA一般以负超螺旋构象存在。 51.沉默子(silencer):可抑制基因转录的特定DNA序列,当其结合一些反式作用因子时对基因的转录起阻遏作用,使基因沉默。52重组DNA技术(recombinant DNA technology):通过体外操作将不同来源的两个或两个以上DNA分子重新组合,并在适当细胞中增殖形成新的功能DNA分子的方法。53初级胆汁酸(primatJ bile acids):由肝细胞以胆固醇为原料合成的胆汁酸及其与甘氨酸或牛磺酸的结合产物,包括胆酸、鹅脱氧胆酸、甘氨胆酸、牛磺胆酸、甘氨鹅脱氧胆酸和牛磺鹅脱氧胆酸。54次级胆汁酸(seconda1J bile acids):初级胆汁酸经肠菌作用产生的胆汁酸及其结合产物,包括脱氧胆酸、石胆酸、甘氨脱氧胆酸、牛磺脱氧胆酸、熊脱氧胆酸等。55从头合成(de novo synthesis):生物体利用简单前体物质合成生物分子的途径,如利用氨基酸、5-磷酸核糖、一碳单位及CO2等代谢物前体物质为原料,经过一系列酶促反应合成噤呤核昔酸即是从头合成。56代谢(metabolism):机体活细胞内的全部化学变化,其反应几乎全部是酶促反应。 57.代谢综合征(me taboli c syndrome):一组以肥胖、高血糖(糖调节受损或糖尿病)、高血压以及血脂异常[高TC(甘油三酷)血症和(或)低HDL-C(高密度脂蛋白胆固醇)血症]集结发病的临床综合征,特点是机体代谢上相互关联的危险因素在同一个体的组合。 免受胞内核酸酶降解的一类特殊蛋白质。61单顺反子(monocistron):真核生物一个结构基因转录生成一条mRNA,编码一条多肤链的初级转录物。 62.单体酶(monomeric enzyme):由一条)汰链构成的酶称为单体酶。 63胆固醇逆向转运(reverse cholestero l transport, RCT):新生HDL从肝外组织细胞获取胆固醇并在血浆LCAT、apo A、apo D及CETP和PTP共同作用下,胆固醇被酷化、转移至内核与VLDL甘油三酣交换,新生双脂层盘状HDL逐步膨胀为单脂层球状的成熟HDL。VLDL在转变为LDL后,与成熟HDL一起经血液运输至肝,与肝细胞膜表面HDL受体、LDL受体结合,被肝细胞摄取降解,其中的胆固醇酷可被分解转化成胆汁酸排出体外,这种将肝外组织多余胆固醇运输至肝分解转化排出体外的过程就是胆固醇逆向转运途径。 64胆汁酸的肠肝循环(enterohepatic circulation of bile acid):在肝细胞合成的初级胆汁酸,随胆汁进入肠道并转变为次级胆汁酸。肠道中约95%胆汁酸可经门静脉被重吸收入肝,并与肝新合成的胆汁酸一起再次被排入肠道,构成胆汁酸的肠肝循环。 65蛋白聚糖(proleoglycan):以聚糖含扯为主,由糖胺聚糖共价连接于不同核心蛋白形成的糖复合体。 66蛋白质靶向输送(protein targeting):蛋白质合成后在细胞内被定向输送到其发挥作用部位的过程,也称蛋白质分拣(protein sorting)。67蛋白质变性(protein denaturation):在某些物理和化学因素作用下,蛋白质的特定的空间构象被破坏,从而导致其理化性质的改变和生物活性的丧失,称为蛋白质的变性。一般认为蛋白质的变性主要发生二硫键和非共价键的破坏,不涉及一级结构中氨基酸序列的改变。68蛋白质-蛋白质相互作用(protein-protein interaction, PPI):是指两个或两个以上的蛋白质分子通过非共价键相互作用并发挥功能的过程。69蛋白质的三级结构(tertia11stlucture):是指整条肤链中全部氨基酸残基的相对空间位置,也就是整条肤链所有原子在三维空间的排布位置。70蛋白质等电点(protei n isoelectr ic point, pl):在某一pH的溶液中,蛋白质解离成阳离子和阴离子的趋势或程度相等,成为兼性离子,呈电中性,此时溶液的pH值称为该蛋白质的等电点。71蛋白激酶(protein kinase):将ATP或其他核昔三磷酸的丫-磷酸基转移给靶蛋白质的Ser、Thr、Tyr、Asp或His的侧链的一类酶。可以调节被磷酸化的蛋白质分子的功能。 72.蛋白质相互作用结构域(protein interaction domain):蛋白质分子中能识别并结合其他蛋白质分子的一段特定氨基酸序列。其结合位点可通过蛋白质磷酸化而产生,也可以是具有特定氨基酸序列的肤段。73蛋白质组学(proteomics):以细胞、组织或机体在特定时间和空间上表达的所有蛋白质为研究对象,分析细胞内动态变化的蛋白质组成、表达水平与修饰状态,揭示蛋白质之间的相互作用及其调控规律的学科领域。74氮平衡(nitrogen balance):机体从食物中摄入氮与排泄氮之间的关系。正常成人食入的蛋白质等含氮物质可以补偿含氮物质代谢产生的含氮排泄物。75低密度脂蛋白受体(LDL receptor):广泛分布于体内各组织细胞表面,能特异地识别和结合LDL,主要生理功能是摄取降解LDL并参与维持细胞内胆固醇平衡。76底物水平磷酸化(substrate-level phosphorylation):ADP或其他核背二磷酸的磷酸化作用与高能化合物的高能键水解直接相偶联的反应过程,是生物体内产能的方式之一。 77第二信使(second messenger):细胞内受配体与受体结合后激活的可扩散、并调节信号转导蛋白质活性的小分子或离子,又称细胞内小分子信使。如钙离子、环腺甘酸(cAMP)、环鸟背酸(cGMP)、环腺昔二磷酸核糖、甘油二酣(diglyceride,DAG)、肌醇-1,4,5-三磷酸(inositol triphosphate, IP3汃花生四烯酸、磷脂酰神经酰胺、一氧化氮和一氧化碳等。 78电泳(electrophores is):依据分子或颗粒所带的电荷、形状和大小等不同,因而在电场介质中移动的速度不同,从而达到将蛋白质、核酸或其他带电的颗粒混合物进行分离的技术。 79电子克隆(in silico cloning):通过已获得的序列与数据库中核酸序列及蛋白质序列进行同源性比较,或对数据库中不同物种间的序列比较分析、拼接,预测新的全长基因等,进而通过实验证实,从组织细胞中克隆该基因的研究策略。 80端粒酶(telomerase):一种自身携带模板的逆转录酶,人类端粒酶由三部分组成:端粒酶RNA、端粒酶协同蛋白l和端粒酶逆转录酶。该酶兼有提供RNA模板和催化逆转录的功能。RNA组分中含有一段短的模板序列与端粒DNA的重复序列互补,而其蛋白质组分具有逆转录酶活性,以RNA为模板催化端粒DNA的合成,将其加到端粒的3'-端,以维持端粒长度及功能,81短散在核元件(short interspersed nuclear elements, SINEs):以散在方式分布于基因组中的较短的重复序列,重复序列平均长度约为300-500bp,与平均长度约为lOOObp的单拷贝序列间隔排列。又称为短散在重复序列(short interspersed repeat sequence)。 彼此聚合形成一个结构和功能上的整体,此即为多酶复合物,亦称为多酶体系(multienzyme system)。90多顺反子(polycistron):携带了几条多肤链的编码信息,受同一个控制区调控的mRNA分子,多见于原核生物。一个多顺反子通常包括数个功能上有关联的基因,它们串联排列,共同构成编码区,共用一个启动子和一个转录终止信号序列,几个编码基因在转录合成时仅产生一条mRNA长链,为几种不同的蛋白质编码。 91翻译(lrnnslation):在多种因子辅助下,核糖体与mRNA模板结合,tRNA识别模板mRNA序列中的密码子及转运相应氨基酸,进而按照模板mRNA信息合成蛋白质肤链的过程。 92.翻译后加工(post-translational processing):新生肤链转变成为有特定空间构象和生物学功能的蛋白质的过程,包括肤链的折叠和二硫键的形成、肤链的剪切、肤链中某些氨基酸残基侧链的修饰、肤链聚合及连接辅基等。 93反式作用因子(trans-acting factor):起反式作用的调控元件。有些调节序列远离被调控的编码序列,通过其产物(mRNA或蛋白质)间接调节基因的表达。这种调节基因产物又称为调节因子,它们不仅能对处于同一条DNA链上的结构基因的表达进行调控,而且还能对不在一条DNA链上的结构基因的表达起到同样的作用。因此,这些分子被称为反式作用因子。反式作用因子以特定的方式识别和结合在顺式作用元件上,实施精确的基因表达调控。 酸、肌酸酐、尿酸、胆红素和氨等。 98分子伴侣(molec ular chaperone):与部分折叠或错误折叠的肤链以非共价形式特异结合,促使其正确折叠或提供折叠微环境的一类辅助性蛋白质,在生物界广泛存在。目前研究得较为清楚的是热激蛋白70(heat shoc k protein70, Hsp70)家族和伴侣蛋白(chaperonin)。 99.分子病(molecular dis ease):由于基因上DNA分子的缺陷,致使细胞内RNA及蛋白质合成出现异常、人体结构与功能随之发生变异的疾病。DNA分子的此种异常,有些可随个体繁殖而传给后代。例如锁状细胞贫血。100分子医学(molecular medicine):从分子水平阐述疾病状态下基因组的结构、功能及其表达调控规律,发展现代高效预测、预防、诊断和治疗手段的学科领域。 101.复合糖类(complex carbohydrate):糖基分子与蛋白质或脂以共价键连接而形成的化合物,即糖蛋白、蛋白聚糖、肤聚糖、糖脂及脂多糖等含有糖类的复合生物大分子的统称。 104.复制基因(replicator):含有一个复制起点并能促进DNA复制起始所必需的全部DNA序列。E.coli的复制因子是oriC。在原核细胞中,复制因子的识别与DNA解旋、募集DNA聚合酶偶联进行。而在真核细胞中,这两个阶段相分离可以确保每个染色体在每个细胞周期中仅复制一次。 105复制子(replicon):从一个DNA复制起点起始的完整DNA分子或DNA分子上的某段复制区域称为复制子。复制子是含有一个复制起点的独立完成复制的功能单位。高等生物有数以万计的复制子,复制子间长度差别很大,约在13-900kb之间。 106.干扰小RNA(siRNA):受内源或外源双链RNA诱导后,细胞内产生的一类双链RNA。在特定情况下通过一定酶切机制,这些RNA可转变为具有特定长度(21-23个碱基)和特定序列的小片段RNA。siRNA参与RISC组成,与特异的靶mRNA完全互补结合,导致靶mRNA降解,阻断翻译过程。 107感染(infect ion):致病微生物(如病毒、细菌、真菌)入侵机体组织或细胞的过程。在分子生物学中,一般是指以病毒作为外源DNA运载体导入哺乳细胞的过程。108冈崎片段(O kazaki fragment):沿着后随链的模板链合成的新DNA片段被命名为冈崎片段。复制完成后,这些不连续片段经过去除引物,埴补引物留下的空隙,连接成完整的DNA长链。109高度重复序列(highly repetitive seque n ce):真核基因组中存在的有数千到几百万个拷贝的DNA重复序列。这些重复序列的长度为6-200bp,不编码蛋白质或RNA。 110功能克隆(functional clon in g):从异常表型入手,找出造成这种表型的代谢缺陷或蛋白质结构异常,如酶的失活或缺失,结构蛋白质分子的异常等,最后确定编码这种蛋白质的基因并将其定位、克隆的技术。换句话说,这是从表型异常出发,找出导致出现异常表型的异常功能蛋白质,根据蛋白质的氨基酸序列推导出编码的核昔酸序列,以此作为探针,在基因组文库或cDNA文库中去筛选目的基因或目的cDNA,最后克隆和定位这种异常蛋白质的编码基因。 111霖聚酶(o ligomeric enzyme):由多个相同或不同的肤链(即亚基)以非共价键连接组成的酶称为驿聚酶。 512名词释义 ll4核昔酸切除修复(nucleotide excision repair, NER):在一系列酶的作用下,将DNA分子中受损伤部分切除,并以完好的DNA链为模板,合成和连接得到正常序列,使DNA恢复原来的正常结构的DNA损失修复方式。与碱基切除修复不同,核昔酸切除修复系统并不识别具体的损伤,而是识别损伤对DNA双螺旋结构所造成的扭曲,但修复过程与碱基切除修复相似。首先,由一个酶系统识别DNA损伤部位;其次,在损伤部位两侧切开DNA链,去除两个切口之间的一段受损的寡核昔酸;再次,在DNA聚合酶作用下,以另一条链为模板,合成一段新的DNA,填补缺损区;最后由连接酶连接,完成损伤修复。 115.核酶(ribozyme):具有催化功能的RNA分子。它的发现打破了酶都是蛋白质的传统观念。 118.核酸(nucle ic acid):由核昔酸或脱氧核昔酸通过3',5'-磷酸二酷键连接而成的一类生物大分子,有核糖核酸(RNA)和脱氧核糖核酸(DNA)两种。分别具有携带和传递遗传信息的功能。 123核糖体(ribosome):由大亚基和小亚基组成的生物体细胞器,是蛋白质合成的场所。通过mRNA与携带氨基酸的tRNA的相互作用合成蛋白质。核糖体的大亚基和小亚基分别由rRNA和核糖体蛋白质组成。 124.核糖体RNA(ribosomal RNA, rR NA):核糖体中的RNA。真核生物核糖体通常有28S、18S、5.8S和5S四种;原核生物核糖体则有23S、16S和5S三种。 125核糖体结合位点(ribosome-binding site, RBS):原核生物mRNA起始密码子AUG及其上游的一段序列。该序列距AUG上游约10个核节酸处通常为-AGGAGG-(也称Shine-Dalgarno序列),可被16S rRNA通过碱基互补而精确识别,从而将核糖体小亚基准确定位于mRNA。 126核小RNA(s mall nuclear RNA, snRNA);细胞核内的短片段RNA,长度100-215个核甘酸,研究较多的为7类,由于含U丰富,故编号为U l~U7。其中U3存在于核仁中,其他6种存在于非核仁区的核液里。U3snRNA与核仁内28S rRNA的成熟有关。U7与组蛋白前体mRNA的茎环结构的加工有关。其他5种小核RNA是真核生物转录后加工过程中RNA剪接体(spliceosome)的主要成分,参与前体mRNA的加工过程。 127.核小核糖核蛋白(small nuclear ribonucleoprotein, snRNP):由核小RNA与一些蛋白质构成的复合体,参与RNA剪接等重要生物学过程。比如5种核小核糖核蛋白是剪接体的主要组成部分,U7snRNP则参与组蛋白前体mRNA的茎环结构的加工。 128.核小体(n ucleosome):由约200bp的DNA区段和多个组蛋白组成的复合体,是染色质基本组成单位。其中146bp的DNA区段与八聚体(H2A、印B、H3和H4各两分子)的组蛋白组成核小体核心颗粒,核心颗粒之间通过一个组蛋白HI分子以及0~50bp的DNA连接区彼此相连,构成真核染色质的一种重复的串珠状结构。 129.核心酶(core enzyme):不含sigma位)因子的原核RNA聚合酶,由凸邸'o五个亚基组成。核心酶能够催化NTP按模板的指引合成RN A。130后随链(lag驴ng strand):在DNA复制过程中,因为复制方向与解链方向相反,不能连续延长,只能随着模板链的解开逐段地从5'---+3'生成引物并复制子链。这一不连续复制的链称为后随链。 131呼吸链(respiratory chain):又称电子传递链(electron transfer chain),指线粒体内膜中按一定顺序排列的一系列具有电子传递功能的酶复合体,形成一个传递电子/氢的体系,可通过连续的氧化还原反应将电子最终传递给氧生成水,并释放能掀。 132化学降解法测序(chemical degradat ion sequenci n g):通过标记DNA片段末端,并利用专一性化学试剂对DNA进行特异性降解,使之从糖环上脱落导致磷酸二酷键断裂,产生4套含有长短不-DNA分子的混合物,从而确定DNA分子中4种碱基序列的技术。 133.化学渗透假说(chemiosmotic hypothesis):线粒体呼吸链进行电子传递时,通过呼吸链复合体I、III、W将基质侧的质子泵至线粒体内膜的膜间隙侧,形成跨内膜的质子电化学梯度(质子浓度和跨膜电位差)而储存能量,当质子顺浓度梯度回流至基质时促进ATP合酶利用ADP合成ATP。 134环形RNA(circularRNA,circRNA):一类具有封闭环状结构的单链RNA分子。 135黄疽(jaundice):血浆胆红素高于正常水平时扩散进入组织造成黄染的体征。 136回文序列(palindrome):双链DNA中的互补链核昔酸序列以相同方向配对,因此,从5'一3'方向的序列完全一致,这两条链的核甘酸序列称作回文序列。137活化能(activation energy):是指在一定溫度下,lmol反应物从基态转变成过渡态所需要的自由能。138活性染色质(active chromatin):相对松弛、具有转录活性的染色质。当基因被激活时,可观察到染色质相应区域发生某些结构和性质变化,使其易于被转录因子等识别结合,起始转录。139基因(gene):一段含有特定遗传信息的核昔酸序列(大多数生物中是DNA序列,少数是RNA序列),能够编码功能产物多肤或RNA。 140基因表达(gene expression):基因转录及翻译的过程,也是基因所携带的遗传信息表现为表型的过程。在一定调节机制控制下,大多数基因经历转录和翻译过程,产生具有特异生物学功能的蛋白质分子,赋予细胞或个体一定的功能或形态表型。但并非所有基因表达过程都产生蛋白质,rRNA、tRNA编码基因转录产生RNA的过程也属于基因表达。 141基因表达调控(regulation of gene expression):细胞或生物体在接受内、外环境信号刺激时或适应环境变化的过程中,在基因表达水平上作出应答的分子机制。 142.基因捕获(gene trapping):将一个含报告基因的DNA载体随机插入基因组,产生内源基因失活突变,通过报告基因的表达,提示插入突变的存在以及内源基因的表达特点的技术。 143基因超家族(gene superfamily):一些DNA序列相似,但功能不一定相关的若干个单拷贝基因或若干组基因家族总称。 147基因家族(gene fami ly):基因组中存在的许多来源千同一个祖先,结构和功能相似的一组基因。同一家族的这些基因的外显子具有相关性。 150基因敲入(gene knock-in):通过同源重组的方法,用某一基因替换另一基因,或将一个设计好的基因片段插入到基因组的特定位点,使之表达并发挥作用的技术。151基因添加(gene augmentation):不删除突变的致病基因,而在基因组的某一位点额外插入正常基因,在体内表达出功能正常的蛋白质的方法。 152基因芯片(gene chip):在单位面积有规律地紧密排列特定的霖核背酸、DNA片段等的固体支待物,亦被称作DNA微阵列(DN A mi croarray)。利用这类芯片与标记的生物样品进行杂交,可对样品的基因表达谱信息进行快速定性和定量分析。 153基因亚家族(gene subfamily):一个多基因家族中可有多个基因,根据结构与功能的不同又可以分为亚家族。如G蛋白中属ras超家族约有50多个成员,根据其序列同源性程度又可进一步分为Ras、Rho和Rab三个主要的亚家族。 154.基因诊断(gene d iagnosis):以DNA和RNA为诊断材料,通过检查基因结构、功能以及表达是否正常,是否存在外源基因及表达产物等,对人体状态和疾病作出诊断的方法。 155.基因治疗(gene therapy):在基因水平上治疗疾病的方法。包括基因置换、基因修正、基因修饰、基因失活、引入新基因等。156基因置换(gene replacement):通过基因操作,用正常基因替换体内有缺陷的基因,使基因的功能得以恢复的方法。 157.基因组(genome):是指一个生物体内具有的遗传信息的总和。 158基因组编辑(genome ed山ng):对基因组进行定点修饰的一项新技术。利用该技术,可以精确地定位到基因组的某一位点上,在这位点上剪断靶标DNA片段并插入新的基因片段。此过程即模拟了基因的自然突变,又修改并编辑了原有的基因组,真正达成了“编辑基因“。 159.基因组构(gene organization):单个基因的组成结构及一个完整的生物体内基因的组织排列方式统称为基因组构。160基因组学(genomics):阐明整个基因组结构、结构与功能的关系以及基因之间相互作用的学科领域。161激素敏感性脂肪酶(h ormon e sensitive lipase, HSL):即脂肪细胞中的激素敏感性甘油三醋脂肪酶,在脂肪动员过程中催化甘油二酷水解生成甘油一酷及脂肪酸,它对多种激素敏感,其活性受多种激素调节,是脂肪动员的限速酶。 162.极低密度脂蛋白(very low density lipopr otein, VLDL):肝细胞合成的甘油三酷在肝细胞内质网与载脂蛋白BlOO、C等载脂蛋白及磷脂、胆固醇组装成的一种脂蛋白,由肝细胞分泌入血,功能是运输内源性甘油三醋和胆固醇。 A)。前体mRNA的剪接在剪接体完成。 166碱基(base):一类带碱性的有机化合物,是嗦呤和啼唗的衍生物。DNA中的碱基主要有腺嗦呤、鸟嗦呤、胞啥唗和胸腺瞪唗;RNA中的碱基主要有腺膘呤、鸟嗔呤、胞啥唗和尿啥唗。 167.碱基错配修复(mismatc h base repa ir):DNA损伤修复的一种特殊形式,是维持细胞中DNA结构完整稳定的重要方式,主要负责纠正下列错误:O复制与重组中出现的碱基配对错误;@因碱基损伤所致的碱基配对错误;@碱基插入;@碱基缺失。从低等生物到高等生物,均拥有保守的碱基错配修复系统或途径。 168碱基堆积力(ba se stacking force):核酸分子双螺旋结构中的相邻两个碱基对在旋进过程中,由于彼此重叠而产生的疏水性相互作用。 169.碱基对(base pa江):核酸中两条单链的碱基通过氢键形成的一种特定的化学结构。主要的碱基对有腺嗦呤-胸腺啥唗(A-T)碱基对、腺噤呤-尿瞪唗(A-U)碱基对、鸟膘呤-胞啥唗(G-C)碱基对和鸟嗦呤-尿啥唗(G-U)碱基对。 170碱基切除修复(base excision repair, BER):受损DNA通过生物体内存在的一类特异的DNA糖昔酶的作用切除错误碱基,再由一系列的酶加工进行正确填补而恢复功能的DNA损伤修复方式,普遍存在于各种类型的生物中。整个修复过程包括:G)DNA糖昔酶特异性识别DNA链中已受损的碱基并将其水解去除,产生一个无碱基位点;@在此位点的5'-端,无碱基位点核酸内切酶将DNA链的磷酸二酷键切开,同时去除剩余的磷酸核糖部分;@DNA聚合酶在缺口处以另一条链为模板修补合成互补序列;@由DNA连接酶将切口重新连接,使DNA恢复正常结构。 171校对(proofreading):具有3'一5'外切酶活性的DNA聚合酶可将错配的碱基水解下来,同时利用5'->3'聚合酶活性补回正确配对的碱基,复制可以继续下去,这种功能称为校对。172接合作用(conjugation):细菌的遗传物质在细菌细胞间通过细胞-细胞直接接触或细胞间桥样连接的转移过程。173结构域(domain):是蛋白质分子结构中紧密球状的折叠区,可被特定分子识别和具有特定功能的三级结构元件。174结合胆红素(conjugated b如ub in):胆红素在肝细胞内与葡糖酪酸结合生成的胆红素,为水溶性,可从尿中排出。175解链(melting):核酸溶液在温度升高时,由于其碱基对的氢键以及碱基堆积力受到破坏,核酸的双链分子或单链分子的双链区域解离成为单链的过程。 176.解链曲线(melting cU1-ve):亦称熔解曲线。以核酸溶液的吸光度(一般在260nm处)作为溫度的函数的曲线。此曲线描述,由于温度的增高,双链DNA或RNA分子解离成为单链的曲线。177解链温度(melting temperature):双链DNA分子或双链RNA分子丧失半数双螺旋结构时的温度,用符号T,',表示。一般由解链曲线所确定。每种DNA或RNA都有其特征性的T,',值。 178解旋酶(he licase):复制起始利用ATP供能来解开DNA双链的酶,DnaB在原核生物中起解旋酶的作用,真核生物也具有和原核生物同源的解旋酶。 名词释义515 酶促反应的表观凡值增大,最大反应速率(vm.,)不变。可以通过增加底物浓度解除这种抑制。 181.聚合酶链反应(polymerase chain reaction, PCR):在体外扩增特定DNA片段的技术方法。以DNA为模板,以1对与模板互补的寡核甘酸片段为引物,反复进行变性、退火和延伸,在DNA聚合酶作用下,使目的DNA片段得到扩增。 182聚合酶转换(polymerase swi tching):真核生物DNA复制过程中,DNA polo.合成引物,然后迅速被具有连续合成能力的DNA pol8和DNA pole所替换,这一过程称为聚合酶转换。DNA pol8负责合成后随链,DNA pole负责合成前导链。 183聚糖(glycan):由单糖通过糖背键聚合而成的寡糖或多糖。184绝缘子(ins ulator):是基因组上对转录调控起重要作用的一种元件,可以阻碍增强子对启动子的作用,或者保护基因不受附近染色质环境(如异染色质)的影响。 185可变剪接(alternative splicing):有些前体mRNA被剪切或(和)剪接加工成结构有所不同的成熟mRNA,最终产生不同的蛋白质分子的RNA剪切方式的现象,又称选择性剪接。即,这些真核生物前体mRNA分子的加工可能具有2个以上的加多聚腺昔酸的断裂和多聚腺昔酸化的位点,因而一个前体mRNA分子可经剪切或(和)可变剪接形成不同的mRNA。 186可读框(open reading frame, ORF):从mRNA的5'-端起始密码子AUG开始,至3'-端终止密码子的一段能编码并翻译出氨基酸序列的核昔酸序列。可读框通常代表某个基因的编码序列。 190磷酸戊糖途径(pentose phosphate pathway):从糖酵解的中间产物葡糖-6-磷酸开始形成旁路,通过氧化、基团转移两个阶段生成果糖-6-磷酸和3-磷酸甘油酸,从而返回糖酵解的代谢途径。此途径不产能,但可提供NADPH和磷酸核糖。 191磷脂酶A2(p hospholipase A2, PLA2):参与磷脂降解的一种磷脂酶,能水解甘油磷脂2位酷键,生成1分子游离脂肪酸和1分子溶血磷脂。 196酶(enzyme):催化特定反应的蛋白质,是一种生物催化剂。酶能通过降低反应的活化能加快反应速率,但不改变反应的平衡点。酶具有催化效率高、专一性强、作用条件温和等特点。 199.酶的共价修饰(cova lent mod山cation of enzymes):酶蛋白肤链上的一些基团可在其他酶的催化下,与某些化学基团共价结合,同时又可在另一种酶的催化下,去掉已结合的化学基团,从而影响酶的活性,酶的这种调节方式称为酶的共价修饰。 200酶的活性中心(active ce nter of enzymes):酶分子中能与底物特异地结合并催化底物转变为产物的具有特定三维结构的区域称为酶的活性中心。 201.酶的特异性(enzyme specific ity):一种酶仅作用于一种或一类化合物,或一定的化学键,催化一定的化学反应并产生一定的产物,酶的这种特性称为酶的特异性,亦称为酶的专一性。根据酶对底物选择的严格程度,酶的特异性可分为绝对特异性和相对特异性。 202.酶原(zymogen或proenzyme):无活性的酶的前体称作酶原。在一定条件下,酶原向有催化活性的酶的转变过程称为酶原的激活。酶原的激活大多是经过蛋白酶的水解作用,去除一个或几个肤段后,导致分子构象改变,从而表现出催化活性。酶原激活的实质是酶的活性中心形成或暴露。 203密码子(codon):由3个相邻的核昔酸组成的mRNA基本编码单位,又称编码三联体(coding triplet),或三联体密码(tripl et code)。密码子共有64种,包括61种氨基酸密码子(包括起始密码子)及3个终止密码子,由它们决定多肤链的氨基酸种类、排列顺序以及翻译的起始和终止。在mRNA的可读框区域,每3个相邻的核昔酸为一组,编码一种氨基酸或肤链合成的起始/终止信息,称为密码子或三联体密码(tripl et code)。 204免疫印迹法(immunoblotting):利用抗体对电泳之后转移和固定到膜型材料上的蛋白质分子进行检测的技术,亦称蛋白质印迹、Western blotting。可用于检测样品中特异性蛋白质的存在、进行半定掘分析。205免疫组织化学和免疫细胞化学技术(immunohistochemistry and immunocytochemistJ·y techniques):用标记的抗体在组织/细胞原位对目标抗原(目标蛋白质/多肤)进行定性、定址、定位检测的实验技术。206模体(motif):蛋白质二级结构和三级结构之间的一个过渡性结构层次,在肤链折叠过程中,一些二级结构的构象单位彼此相互作用组合而成。207内含子(intron):位于外显子之间、可以被转录在前体RNA中,但经过剪接被去除,最终不存在于成熟RNA分子中的核背酸序列,又被称为间插序列。208逆转录(reverse transcription):以RNA为模板,以四种脱氧核旮三磷酸(dNTP)为底物,由逆转录酶催化合成DNA链过程。因其信息流动方向(RNA--->DNA)与转录过程(DNA--->RNA)相反而得名,是一种特殊的复制方式。 209逆转录PCR(reverse tra nscr iption PCR, RT-PC R):是将RNA的逆转录反应和PCR反应联合应用的一种技术。以RNA为模板,在逆转录酶的作用下合成cDNA,再以cDNA为模板通过PCR反应来扩增目的基因。可对已知序列的RNA进行定性定盘分析。 210.拧檬酸循环(c itric acid cycle):线粒体内使l分子乙酰CoA彻底氧化的由八步酶促反应所构成的循环反应系统。包括4次脱氢反应、2次脱狻反应,生成4分子还原当址和2分子CO2,循环的各中间产物没有乱的变化。它是糖、脂肪、氨基酸的共同供能途径和物质转变枢纽。 211葡萄糖耐扯(glucose tolerance):人体对摄入的葡萄糖具有很大耐受能力的现象,表现为一次性食入大批葡萄糖后,血糖水平不会持续升高,也不会出现大的波动。 212启动子(promoter):启动子是依赖DNA的RNA聚合酶(简称RNA pol)识别、结合和启动转录的一段DNA序列。启动子一般位于转录起始位点的上游。原核细胞的启动子含有RNA pol特异性结合和转录起始所需的保守序列。在真核细胞,RNA pol一般不直接结合启动子,而是通过通用转录因子结合到启动子的DNA双链上。 213启动子解脱(promoter escape):真核生物基因转录起始后,合成的RNA片段超过l0个核昔酸时,形成一个稳定的包含有DNA模板、RNA聚合酶和RNA片段的转录起始复合体,此时复合体中RNA聚合酶从启动子上脱离的现象称为启动子解脱。 214前导链(leading strand):在DNA复制过程中,复制方向与解链方向相同,沿着解链方向生成的子链DNA的合成是连续进行的,这股链称为前导链。215全基因组关联分析(genome-w ide association study, GWAS):在人类全基因组范围内找出存在的序列变异,即单核昔酸多态性((single nucleotide polymorphism, SNP),从中筛选出与疾病相关的SNP。216全酶(holoenzyme):由核心酶加上G亚基的原核RNA聚合酶。6亚基的功能是辨认转录起始点,RNA聚合酶全酶能在特定的起始点上开始转录。细胞的转录起始是需要全酶的,转录延长阶段则仅需核心酶。217全外显子测序(whol e exon sequencin g):对全基因组外显子区域DNA富集从而进行高通证测序的技术,它选择性地检测蛋白质编码序列,有助于实现定位克隆,对常见和罕见的基因变异都具有较高灵敏度。218染色体(chromosome):在细胞发生有丝分裂时期,细胞核中携带遗传信息的物质深度压缩形成的聚合体,易于被碱性染料染成深色。主要由DNA和蛋白质组成。219染色体原位杂交(in situ h ybridization)是核酸分子杂交技术在基因定位中的应用,也是一种直接进行基因定位的方法。 220.染色质(chromatin):细胞内具有遗传性质的物质在细胞分裂间期的存在形式,结构较松散,形态步规则,弥散在细胞核内。221乳糜微粒(chylomicron, CM):由小肠黏膜细胞利用从消化道摄取的食物脂肪酸再合成甘油三酷后组装形成的一种脂蛋白,经淋巴系统吸收入血,功能是运输外源性甘油三酷和胆固醇。 222乳酸循环(Cori cycle):肌收缩通过糖的无氧氧化生成乳酸,乳酸经血液运入肝,在肝内异生为葡萄糖。葡萄糖释入血液后又可被肌摄取,由此构成循环。此过程既能回收乳酸中的能址,又可避免乳酸堆积而引起酸中毒。 名词释义517 223生物氧化(biological oxidation):各种代谢物在生物体内的氧化分解过程。其中糖、脂肪、蛋白质等营养物质产生的NADH、FADH2在线粒体内经氧化分解产生CO2和H20,释放能量驱动ADP磷酸化生成ATP,是细胞产生ATP的主要方式。另外,微粒体等氧化酶也可对底物进行氧化修饰等,但不产生能量。 224.生物转化(biotransformation):机体对异源物及某些内源性的代谢产物或生物活性物质进行的氧化、还原、水解及各种结合反应,增加其水溶性和极性,易于从尿或胆汁排出体外。 定最PCR。实时PCR消除了产物堆积对定量分析的干扰,可以准确地确定起始DNA拷贝数,实现精确定最。227噬菌体展示(phage display):将外源性DNA插入到噬菌体衣壳蛋白编码基因中的一种表达克隆技术。 228.受体(receptor):细胞膜上或细胞内能特异识别生物活性分子并与之结合,进而引起生物学效应的特殊蛋白质(少数为糖脂分子)。 229受体酪氨酸激酶(receptor tyrosine kinase, RTK):具有细胞外受体结构域的酪氨酸激酶,当膜外信号物质结合受体后,激活其细胞内的激酶活性域,从而对底物的酪氨酸残基进行磷酸化。 230.双核中心(binuclear center):呼吸链中复合体IV用于传递电子的功能单元。主要由Cu离子和血红素中的Fe离子组成,其功能是将电子传递给氧生成水。 233双向复制(b吐rectional replication):复制从起点开始,向两个方向进行解链,复制中的模板DNA形成2个延伸方向相反的开链区。原核生物基因组是环状DNA,只有一个复制起点(or igin),进行的是单点起始双向复制。真核生物基因组由多个染色体组成,全部染色体均需复制,每个染色体又有多个起点,呈多起点双向复制特征。 234双向启动子(b吐rectional promoter):位于两个相邻且转录方向相反的基因之间的一段DNA序列。近年来在人类等动植物基因组中存在大量的相邻且转录方向相反的基因,被称之为"头对头“基因对(h ead-to-head gene pairs)。当这两个相邻的"头对头“基因转录起始位点之间的距离小于1kb'左右时,这段基因间的DNA序列称为双向启动子。 235水溶性维生素(water-soluble vi tam in):是一类溶于水而不溶于脂肪和有机溶剂的有机分子,在体内主要构成酶的辅因子,包括B族维生素(维生素B!、维生素B2、维生素B6、维生素Bl2、维生素PP、泛酸、生物素与叶酸)和维生素C。 236顺式作用元件(cis-acting element):DNA分子中与被调控基因临近的一些调控序列,包括启动子、上游调控元件、增强子和一些细胞信号反应元件等,这些调控序列与被调控的编码序列位于同一条DNA链上,故被称为顺式作用元件,又被称为顺式调节元件(cis-regula tor element, CRE)。 237狻基末端结构域(carboxyl-terminal domain, CTD):真核RNA聚合酶II的最大亚基的狻基末端有一段共有序列(consens us sequen ce),为Tyr-Ser-Pro-Thr-Ser-Pro-Ser样的七肤重复序列片段,称为狻基末端结构域。狻基末端结构域被磷酸化后,转录开始。 238肤键(peptide bond):一个氨基酸的a-氨基与另一个氨基酸的a-狻基脱水而形成的酰胺键连接。肤键具有部分双键的性质而有一定的刚性。 239.探针(probe):是带有放射性核素或其他标记(荧光、生物素等)的核酸片段,它具有特定的序列,能够与待测的核酸片段互补结合,因此可用于检测核酸样品中存在的特定基因。240糖胺聚糖(glycosaminoglycan):由二糖单位重复连接而成的杂多糖,不分支。二糖单位中一个是糖胺(N-乙酰葡糖胺或N-乙酰半乳糖胺),另一个是糖酪酸(葡糖醋酸或艾杜糖醋酸)。 241糖蛋白(glycoprotein):糖类分子与蛋白质分子共价结合形成的蛋白质,即含糖基的蛋白质。 242糖的无氧氧化(anaerobic oxidation of gl ucose):不利用氧时,1分子葡萄糖先经糖酵解生成2分子丙酮酸,然后在细胞质中还原成2分子乳酸,这一过程净生成2分子ATP,可为机体快速供能。 243糖的有氧氧化(aerobic oxidation of glucose):有氧时1分子葡萄糖先经糖酵解生成2分子丙酮酸,接着进入线粒体氧化脱狻生成2分子乙酰CoA,再进入拧檬酸循环并偶联发生氧化磷酸化,彻底生成CO2和H20。此过程净生成30或32分子ATP,是人体利用葡萄糖产能的主要途径。 518名词释义 244糖基化(gl ycosylation):非糖生物分子与糖形成共价结合的反应过程。245糖基化位点(glycosylation site):糖蛋白分子中与糖形成共价结合的特定氨基酸序列,即Asn-X-Ser/Thr(X为脯氨酸以外的任何氨基酸)3个氨基酸残基组成的序列。246糖基转移酶(glycosyltransferase):催化糖基从糖基供体(如尿昔二磷酸葡萄糖)转移到受体化合物(蛋白质、脂或另一糖分子)的酶。 247.糖酵解(glycolysis):I分子葡萄糖在细胞质中生成2分子丙酮酸的过程,净生成2分子ATP和2分子NADH,是糖有氧氧化和无氧氧化的共同起始阶段。248糖密码(sugar code):每一聚糖都有一个独特的能被单一蛋白质阅读,并与其相结合的特定空间构象(语言),即糖密码。249糖生物学(glycobiology):研究糖类及其衍生物的结构、代谢以及生物学功能,探索糖链的生物信息机制与生命现象关系的学科领域。250糖形(glycoform):不同种属、组织的同一种糖蛋白的N-连接型聚糖的结合位置、糖基数目、糖基序列不同,可以产生不同的糖蛋白分子形式,这种糖蛋白聚糖结构的不均一性称为糖形。 251糖异生(gluconeogenesis):非糖化合物(乳酸、甘油、生糖氨基酸等)在肝和肾转变为葡萄糖或糖原的过程,对于饥饿引起肝糖原耗尽后的血糖补给具有重要意义。 包括糖与糖之间、糖与蛋白质之间、糖与核酸之间的联系和相互作用,旨在阐明聚糖的生物学功能以及与细胞、生物个体表型的联系。256.铁蛋白(ferritin):由24个亚基组成的中空蛋白质分子,可结合450个铁离子,是体内铁的储存形式。 257.通用转录因子(general transcription factor):一类直接或间接结合RNA聚合酶的转录因子,又称基本转录因子(basal transcript ion fact01)。通用转录因子、中介子(mediator)和RNA聚合酶是真核生物启动转录的蛋白质复合体的基本和主要组分。 258同工酶(isoenzyme或isozyme):是指催化相同的化学反应,但酶蛋白的分子结构、理化性质乃至免疫学性质不同的一组酶。 259同切点酶(isoschizome1):识别DNA链上相同序列但切割位点不同的限制性内切核酸酶,也称异源同工酶。 260同尾酶(i socaudarner):识别DNA链上不同序列但切割后产生相同黏端的限制性内切核酸酶,所产生的相同黏端称为配伍末端(compatible end)。 261同源重组(homologous recombination):在两个相似或相同DNA分子之间核昔酸序列互换的一种遗传重组,又称基本重组(general recombination)。在哺乳动物的配子发生的减数分裂过程中,同源重组可产生DNA序列的新重组,标示着后代的遗传变异;不同种屈的细菌和病毒也在水平基因转移中用同源重组互换遗传物质。 262酮体(ketone bodies):脂肪酸在肝经B-氧化分解后转化形成的中间产物,包括乙酰乙酸、B-胫基丁酸和丙酮。酮体经血液运输至肝外组织氧化利用,是肝向肝外输出能撮的一种方式。263退火(annealing):变性的双链DNA经缓慢冷却后,两条互补链可以重新恢复天然的双螺旋构象的过程。 264.脱氧核糖核酸(deoxyribonucleic acid, DNA):一类带有遗传信息的生物大分子。由4种主要的脱氧核昔酸(dAMP、dGMP、dCMP和dTMP)通过3',5'-磷酸二酷键连接聚合而成的生物大分子。DNA携带遗传信息,并通过复制的方式将遗传信息进行传代。组成DNA的脱氧核甘酸的比例和排列不同,显示不同的生物功能,如编码功能、复制和转录的调控功能等。排列的变异可能产生一系列疾病。 265瓦伯格效应(Warburg effec t):有氧时,葡萄糖不彻底氧化而是分解生成乳酸的现象,有利于增殖活跃的组织细胞进行生物合成。 266.外显子(exon):基因组DNA中出现在成熟RNA分子上的核甘酸序列。外显子被内含子隔开,转录后经加工被连接在一起,生成成熟的RNA分子。信使核糖核酸(mRNA)所携带的信息指导多肤链的生物合成。267微RNA(m icroRNA, miRNA):真核生物中广泛存在的一类长度为22个核昔酸的非编码RNA分子。通过特异性结合靶信使核糖核酸(mRNA)抑制转录后的基因表达。在调控基因表达和调控细胞性状等方面发挥主要作用。268微粒体乙醇氧化系统(mi crosomal ethanol ox心zing system, MEOS):是乙醇-P450单加氧酶,仅在血中乙醇浓度很高时被诱导,其催化的产物是乙醒。 269微量元素(trace element或m icroelement):维持机体正常生理功能、在人体中存在的量低于人体体重0.01%,每日需要量在100mg以下的化学元素,包括铁、碳、铜、锌、镁、硒、氯、钥上古、铭、年凡、锡、银、硅,主要功能是作为酶的辅因子等。 270.维生素(v itami n):生物体内不能合成,或合成量甚少、不能满足机体的需要,必须由食物供给,以维持正常生命活动的一类低分子量有机化合物,是生物体内的重要营养素之一,按其溶解特性的不同,分为脂溶性维生素和水溶性维,生素两大类。 271卫星DNA(satellite DNA):真核细胞染色体具有的高度重复核背酸序列,主要存在于染色体的着丝粒区,通常不被转录,在人基因组中可占10%以上。由于其碱基组成中GC含量少,具有不同的浮力密度,在氯化绝密度梯度离心后呈现出与大多数DNA有差别的"卫星”条带而得名。 274无噤呤/无1密唗位点(apurinic/apyrimidini c site):DNA分子上受损伤的碱基被一种特异的DNA-糖旮酶除去,形成的无嗦呤或无瞪唗的位点(AP位点),这些位点在内切酶的作用下可形成DNA链的断裂。275无义介导的mRNA降解(nonsense-mediated mRNA decay, NMD):细胞在对前体mRNA进行剪接加工时,异常的剪接反应会在可读框内产生无义的终止密码子。无义介导的mRNA降解是一种广泛存在于真核生物细胞中的mRNA质量监控机制。该机制通过识别和降解含无义的终止密码子的转录产物来防止有潜在毒性的截短蛋白质的产生。 276.戊糖(pentose):由5个碳原子组成的单糖,其中最主要的一种形式是以D形式存在的核糖和脱氧核糖,是核糖核酸(RNA)和脱氧核糖核酸(DNA)的主要成分。 277系统生物学(systems biolo扮'):以系统论理论、结合实验科学、数学和计算机建模等方法,对一个生物系统中所有组成成分(基因、mRNA、蛋白质等)的构成,在特定条件下这些组分间的相互关系及其导致的生物学效应进行整合研究为特征的生物学。 278系统生物医学(systems biomedic ine):应用系统生物学原理与方法研究人体(包括动物和细胞模型)生命活动的本质、规律以及疾病发生发展机制的学科领域,实际上就是系统生物学的医学应用研究。 287锌指(zinc finger):一些蛋白质中存在的一类具有指状结构的模体。主要存在于作为转录因子的DNA结合结构域模体中,锌指结构由一个a-螺旋和两个反平行的B-折叠三个肤段组成。其中2个半胱氨酸残基和2个组氨酸(或4个半胱氨酸)残基鳌合锌离子。 288.新一代测序(next generation sequencing, N GS):满足DNA测序微趾、快速和低成本化需求而产生的一些新的高通拭DNA测序技术。这些技术在原理上不同于经典的测序技术,其共同特点在一次反应中同时分析多个DNA小片段,因而可快速获得所有序列,再经生物信息学整合分析,得出个体的基因组序列。这些技术是实现个体全基因组测序的核心。289信号序列(signal sequence):决定蛋白质靶向输送的特征性序列,存在于新生肤链的N-端或其他部位,可被细胞转运系统识别并引导蛋白质转移到细胞内或细胞外的特定部位。 290.信号转导(signal u·ansduction):细胞对来自外界的刺激或信号发生反应,通过细胞内多种分子相互作用引发一系列有序反应,将细胞外信息传递到细胞内,并据以调节细胞代谢、增殖、分化、功能活动和凋亡的过程。 291信号转导复合物(signaling complex):衔接蛋白和支架蛋白通过蛋白质相互作用结构域将一些信号转导分子结合在一起形成的复合物,既可使信号转导分子有序相互作用,又可使相关的信号转导分子容纳于一个隔离而稳定的信号转导通路内,避免信号途径之间的交叉反应,维持信号转导通路的高效和专一性。 292信号转导途径(signal transdu ction pathway):信号分子与其在细胞的受体结合以后所引起的一系列有序的酶促级联反应过程。 293信使RNA(messenger RNA, mRNA):携带从DNA编码链得到的遗传信息,并以三联体读码方式指导蛋白质生物合成的RNA,由编码区、上游的5'-非编码区和下游的3'-非编码区组成。约占细胞RNA总蜇的3%~5%。真核生物mRNA的5'-端有帽子结构和3'-端含多腺背酸的尾巴结构。 294血脂(plasma lipid):血浆中脂质的总称,包括甘油三酉趴胆固醇、胆固醇酷、磷脂和游离脂肪酸等。临床上常用的血脂指标是甘油三醋和胆固醇,正常成人12~14小时空腹血浆甘油三醋为10~150mg/d i(平均l OOmg/dl),总胆固醇为150~250m g/di(平均200mg/dl)。 pol催化下逐一加入dNTP而形成DNA子链。亦可是体外人工合成DNA时,可与模板结合的单链DNA片段。 302应激(stress):机体或细胞为应对内、外环境刺激所作出一系列非特异性反应。 303运铁蛋白(transferrin, TRF):能与金属结合的一类分子质量约76~81kD的糖蛋白,又称转铁蛋白,是血浆中主要的含铁蛋白质,负责运载由消化道吸收的铁和由红细胞降解释放的铁。304载脂蛋白(apolipoprotein):脂蛋白中的蛋白质部分,分为A、B、C、D、E等几大类,在血浆中起运载脂质的作用,还能识别脂蛋白受体、调节血浆脂蛋白代谢酶的活性。305增强子(enhancer):增强启动子工作效率的顺式作用元件,能够在相对于启动子的任何方向和任何位置(上游或下游)都发挥作用。306增色效应(hyperchromic e[fect):双链DNA分子或双链RNA分子解链变性后,其核酸溶液的紫外吸收(一般在260nm处)增强的现象。307支架蛋白(scaffold protein):带有多个蛋白质结合域可将同一信号转导途径中相关蛋白质组织成群的蛋白质,一般是分子盘较大的蛋白质。 308脂蛋白(lipoprotein):血浆脂蛋白是脂质与载脂蛋白结合形成的复合体,一般呈球形,表面为载脂蛋白、磷脂、胆固醇的亲水基团,这些化合物的疏水基团朝向球内,内核为甘油三酷、胆固醇酷等疏水脂质。血浆脂蛋白是血浆脂质的运输和代谢形式。 309.脂蛋白脂肪酶(lipoprot.e in lipase, LPL):分布于骨骼肌、心肌及脂肪等组织毛细血管内皮细胞表面的一种脂肪酶,能水解CM和VLDL中的甘油三酷,释放出甘油和游离脂肪酸供组织细胞摄取利用。310脂肪动员(fat mobilization):储存在脂肪细胞中的脂肪在脂肪酶的作用下,逐步水解,释放出游离脂肪酸和甘油供其他组织细胞氧化利用的过程。 311.脂溶性维生素(lipid-soluble vitamin):是疏水性化合物,易溶于脂质和有机溶剂,常随脂质被吸收,包括维生素A、维生素D、维生素E和维生素K。 312.脂酰-CoA胆固醇脂酰转移酶(acyl-CoA:cholesterol acyltransferase, ACAT):分布于细胞内质网,能将脂酰辅酶A上的脂酰基转移至游离胆固醇的3位轻基上,使胆固醇酷化储存在胞质中。 313脂组学(lipidomics):研究生物体内所有脂质分子的组成与结构,并以此为依据推测与脂质作用的生物分子的变化,揭示脂质在各种生命活动中的重要作用的学科领域。 名词释义521 316转氨基作用(transa minati on):氨基转移酶所催化的将a-氨基酸的氨基转移给a-酮酸、从而产生相应的a-酮酸与仅氨基酸的可逆的氨基转移过程。 317转导作用(transduction):病毒或病毒载体介导外源DNA进入靶细胞的过程。 318转化(transformati on)通过直接从周闱环境中摄取并掺入外源遗传物质引起细胞遗传改变的现象。 319转化医学(translational medicine):以临床、实验室和社会三大支柱为核心的生物医学分支学科。旨在强调以临床问题为导向,开展基础-临床联合攻关,将基因组学等各种基础研究成果迅速有效地转化为可在临床实际应用的理论、方法技术和药物。320转化作用(transformation):受体菌通过细胞膜直接从周围环境中摄取并掺入外源遗传物质引起自身遗传改变的过程,受体菌必须处于敏化状态,这种敏化状态可以通过自然饥饿、生长密度或实验室诱导而达到。321转基因动物(tran sge ni c a nimal):应用转基因技术培育出的携带外源基因,并能稳定遗传的动物,其制备步骤主要包括转基因表达载体的构建、外源基因的导入和鉴定、转基因动物的获得和鉴定、转基因动物品系的繁育等。 322转基因技术(transgenic technology):将外源基因导入受精卵或胚胎干细胞(embryon ic stem cell),即ES细胞,通过随机重组使外源基因插入细胞染色体DNA,随后将受精卵或ES细胞植入假孕受体动物的子宫,使得外源基因能够随细胞分裂遗传给后代的技术。 323.转录(transcription):生物体以DNA为模板合成RNA的过程,意指将DNA的碱基序列转抄为RNA序列。 324.转录偶联修复(transcrip tion coupled repa订,TC-NER):核昔酸切除修复的一种方式,即对那些正在转录的基因模板链上的损伤进行修复。另一种修复方式是全基因组损伤修复(global genomic repair, GG-NER)。在转录偶联修复中,RNA聚合酶识别损伤部位,起始损伤修复。 325.转录衰减(tJ·a nscription attenuation):新生成的mRNA链与RNA聚合酶相互作用使转录水平降低并提前终止的转录调节方式,为原核生物操纵子调节机制之一。326转录物组学(transcrip tomics):以细胞、组织或机体基因组在特定时间和空间转录产生的全部转录物的种类、结构和功能进行研究的学科领域,包括对其表达水平、时空分布、相互作用及其调控规律等方面的分析。 327转录因子(transcription factor, TF):直接结合或间接作用于基因启动子、增强子等特定顺式作用元件,形成具有RNA聚合酶活性的动态转录复合体的蛋白质因子。绝大多数转录因子由其编码基因表达后进入细胞核,通过识别、结合特异的顺式作用元件而增强或降低相应基因的表达。转录因子也被称为反式作用蛋白或反式作用因子。 328转染(transfection):植物、动物细胞通过细胞膜摄取外源遗传物质引起自身遗传改变的现象,通常可引起癌变。 329转移RNA(tra nsfer RNA, tRNA):由75~90个核昔酸组成的小分子RNA。每种tRNA可在氨酰tRNA合成酶催化下与特定的氨基酸共价连接生成氨酰tRNA。在核糖体中通过tRNA的反密码子和mRNA的密码子相互作用,参与蛋白质生物合成。 330转座重组(tran sposi tion al recombinat ion)或转座(transpos山on):由插入序列(IS)和转座子(Tn)介导的基因移位或重排。331转座子(transposon, Tn):能将自身或其拷贝插入基因组新位置的DNA序列,一般属于复合型转座子(composite Tn),有一个中心区域,两边是插入序列(IS),除有与转座有关的编码基因外,还携带其他基因如抗生素抗性基因等。 332.缀合酶(conjugated enzyme):由蛋白质部分和非蛋白质部分共同组成的酶称为缀合酶。其中的蛋白质部分称为酶蛋白,非蛋白质部分称为辅因子。酶蛋白主要决定酶促反应的特异性及其催化机制;辅因子主要决定酶促反应的类型。 333着色性干皮病(xeroderma pigmentosum, XP):一种由千DNA损伤切除修复系统缺陷所导致的遗传病。着色性干皮病病人的皮肤对阳光极度敏感,易受照射损伤,可在幼年时罹患皮肤癌,同时伴有智力发育迟缓,神经系统功能紊乱等症状。 推荐阅读 参考书 [1]Agutter PS, Wheatley DN. About Life-Concepts in Modern Biology. Amsterdam:Springer Netherlands,2007