第一篇细胞生物学概论
第一章绪论
自然界中分布有成千上万种生物，小至细菌，大到花草树木、鸟兽虫鱼直至人类，肉眼上很难找到它们结构上的相同之处，但在显微镜下，这些千姿百态的生物的基本结构是相同的，都是由细胞(cell)构成的。
细胞是生物体结构和功能的基本单位。
细胞的发现，至今已有300多年的历史。
细胞生物学(cell biology)以细胞为研究对象，经历了从显微水平到亚显微和分子水平的发展过程，成为今天在分子层次上研究细胞精细结构和生命活动规律的学科。
细胞生物学是当代生命科学中发展迅速和活跃的学科，其研究的新知识、新技术不断向医学领域渗透，已成为认识疾病发病机制、获取疾病防治措施的基础和支柱学科。
第一节细胞生物学概述
—、细胞生物学的概念与研究内容
细胞最早于l665年由英国科学家R.
Hooke发现，是组成入类和所有生物体的基本单位（非细胞形态的病毒除外）。
单细胞生物，如细菌，本身就是一个生命个体；多细胞生物个体由一个前体细胞（如高等动物的受精卵）通过高度有序的分裂增殖、分化、生长和发育而成。
因此可以说，细胞是生命的基本单位。
细胞生物学的研究对象是细胞。
自发现细胞以来，随着科学技术的进步特别是分子生物学技术方法的建立和渗透，对细胞的研究在不断地发生变化，从传统的细胞学逐渐发展成为现代的细胞生物学。
细胞生物学是从细胞的显微、亚显微和分子三个水平对细胞的各种生命活动开展研究的学科。
细胞的显微水平研究主要利用显微镜技术来完成；细胞的亚显微结构及其功能研究主要采用电子显微镜技术；分子生物学技术和生物物理学方法常用于细胞的分子水平研究。
细胞生物学的特点是把结构和功能结合起来，并关注细胞间的相互关系，来了解生物体的生长、发育、分化、繁殖、运动、遗传、变异、衰老和死亡等基本生命现象的机制和规律。
对细胞某些结构和功能的深入研究，逐渐衍生出一些分支学科，如细胞遗传学(cytogenet ics)、细胞生理学(cytop h ys i ol ogy)、细胞社会学(cytosociology)、膜生物学(membrane biology)、染色体生物学(chromosome biology)、干细胞生物学(s tem cell biology)等。
近些年来，随着包括入类在内的一些生物基因组序列分析的完成，以研究完整细胞中所有基因与蛋白质的表达、结构和功能差异为主要内容的基因组学(genomi cs)及蛋白质组学(proteomics)，与基因组学和蛋白质组学互为结合的细胞组学(cytom i cs)，以及基千单细胞测序技术从多细胞哺乳动物和人类组织细胞中分离单个细胞进行研究和比较等新兴研究领域的形成，使细胞生物学的研究内容愈加丰富多彩、研究进展日新月异。
二、细胞生物学在生命科学中的地位及与其他学科的关系细胞生物学是生命科学的重要分支学科。
生命科学研究的核心内容是生命的物质基础，生命的起源和进化，生物的繁殖、生长、发育、衰老、死亡、遗传与变异等生命现象的规律和机制。
生命的物质基础是核酸和蛋白质等生物大分子，这些生物大分子必须被有序地构建及装配成细胞内组分并进入细胞内一定的功能体系中才能表现出生命现象。
即使是自然界中的非细胞形态的生命体一一病毒，也只能在细胞中才表现出生命特征。
生命起源于一个原始细胞，生命的基本现象如生殖、生长、发育、衰老、死亡等过程都体现在生命的单位一细胞上。
从生命结构层次上看，细胞生物学介于分子生物学和个体生物学之间，同它们相互衔接、相互渗透。
目前，细胞生物学的两种重要研究方式是：一方面从细胞的表型特征入手，探索隐藏在其背后的分子机制；另一方面则从基因或蛋白质等生物大分子入手，了解其对细胞功能或行为的影响。
故而细胞生物学也被称为细胞分子生物学或分子细胞生物学。
细胞生物学和分子生物学同是现代生命科学的基础，它们广泛渗透到发育生物学、遗传学、神经生物学和免疫生物学等研究领域。
细胞生物学既是生命科学的基础学科，也是现代生命科学中的前沿学科之一。
许多科学家论断，21世纪是生命科学的世纪。
在分子层次上研究细胞生命活动过程中各种生命现象的规律和机制的细胞生物学，无疑将在生命科学中发挥重要的作用。
21世纪初期的细胞生物学研究成果，如干细胞与动物无性克隆研究进展、小RNA和人类基因组中非编码蛋白序列在细胞生命活动中作用的不断发现，已充分表明细胞生物学是生命科学中最为活跃的研究领域之一。
第二节细胞生物学的形成与发展趋势
细胞生物学的形成和发展经过了漫长的历程。
细胞生物学是随着研究手段的逐步改进和理论上的不断创新而逐渐形成和发展起来的。
一、细胞的发现与细胞学说的创立
细胞的发现与显微镜的发明是分不开的。
第一台显微镜是荷兰眼镜匠H.和Z.
Jan ssen兄弟于1590年试制的。
1665年英国入Hooke应用自制的放大倍数不太高的显微镜，在观察植物软木组织时，发现了许多蜂窝状排列的小室称为“细胞”(cell，小室之意）。
当时他所看到的细胞只是植物死细胞的细胞壁。
1673年和1677年荷兰科学家A.
Van Leeuwenhoek使用能放大300倍的显微镜，观察到了池塘中的原生动物纤毛虫、细菌、人和哺乳动物的精子，后来又观察到鲤鱼红细胞及其核(1695)。
1827年K.
E. V.
Bear在蛙的卵中看到了细胞核。
1831年R.
Brown在植物的叶片细胞中也看到了细胞核。
1835年，E.
Dujardin在根足虫和多孔虫细胞内观察到胶液状物质，称为肉样质(sarcode)。
1839年J.
Purkinje将动物神经细胞中的胶状液描述为原生质(protopl asm)。
至此，细胞的一些主要结构被发现了。
德国植物学家M.
J. Schleiden(1838)和动物学家T_Schwann(1839)根据自己的研究并总结前人的工作，提出了细胞学说(cell theory)，肯定”一切生物，从单细胞生物到高等动物和植物均由细胞组成，细胞是生物形态结构和功能活动的基本单位”。
后来，德国科学家R.
Virchow(1855)明确提出“一切细胞只能来自原来的细胞＂的论点。
他还指出，机体的一切病理现象都基于细胞的损伤。
他的这些观点是对细胞学说的重要补充。
细胞学说的建立，对生命科学的许多领域的研究和发展起到了积极的推动作用，恩格斯评价细胞学说为19世纪自然科学的三大发现之一（与物理学的能量转换定律和达尔文的进化论学说并列）。
二、细胞学的经典时期
从19世纪中叶到20世纪初期，细胞学得到了蓬勃发展。
细胞研究的主要内容是应用固定和染色技术，在光学显微镜下观察细胞的形态结构和细胞的分裂活动。
在细胞形态结构上，认为动物细胞内的“肉样质”和植物细胞内的原生质(1864年由H.
Von Mohl提出）具有同样意义，并提出原生质理论。
从此，细胞被看作是由细胞膜包围的一大团原生质。
原生质理论建立之后，又明确地把细胞核周围的原生质称为细胞质(cytoplasm)，把细胞核内的原生质叫做核质(karyoplasm)。
1841年R.
Remak观察到鸡胚血细胞的直接分裂。
W. Flemmi ng经过钻研，改进了细胞的固定和染色技术，于1882年首先说明细胞的间接分裂过程，并把该细胞分裂命名为有丝分裂(mitosis)，把细胞的直接分裂称之为无丝分裂(ami tosis)。
E. Straburger依据染色体在细胞分裂中的行为把有丝分裂过程分为四个期，即前期、中期、晚期和末期。
他和Flemming分别通过植物材料和动物材料研究表明，细胞核从上一代细胞到后一代细胞一直保持着其物质上的连续性。
K. Schneider(1878)发现，细胞在分裂中能把纵裂为二的染色体平均地分配到两个子细胞中，将此过程称为核分裂(karyokinesis)。
19世纪80年代末，T.
Boveri报道，动物体在形成配子过程中，染色体数目减少了一半。
之后，Straburger在植物中也观察到了同一现象。
1905年J.
B. Farmer和J.E. More把生物体有性生殖过程中，生殖细胞通过分裂使染色体数目减少一半的分裂方式称为减数分裂(meiosis)。
减数分裂为细胞分裂的主要类型之一。
染色体数目在减数分裂中减少了一半，但通过受精过程在子一代又恢复了原有的数目，使核在两代个体间保持着连续性。
1890年Van Be neden和Boveri在观察细胞分裂时发现了中心体。
随后，线粒体(R.
Altmann,1894; C.
Benda,1897)高尔基复合体(C.
Golgi,1898)也相继被发现。
三、实验细胞学时期
从20世纪初期到20世纪中叶为实验细胞学阶段。
这一阶段的主要特点是，细胞学的研究不只是借助光学显微镜着重于形态学结构的观察，而且还采用了多种实验手段对细胞的各种生化代谢和生理功能进行研究。
同时细胞学还与相邻学科相互渗透形成一些重要的分支学科。
1902年Boveri和W.
Suttan把染色体的行为与G.
Mendel的遗传因子联系起来，提出“染色体遗传理论”。
同年，W.
Cannon认为遗传因子在染色体上，并提出“遗传的染色体学说”。
1909年W.
Johannsen把遗传因子命名为gene（基因）。
1910年T.
Morgan根据他和合作者的大量实验工作，建立了“基因学说＇，证明基因是遗传性状的基本单位，且直线地排列在染色体上并成为连锁群。
由此，细胞学与遗传学结合起来形成了细胞遗传学。
1909年，R.
Harrison建立了组织培养技术，直接观察和分析细胞的形态和生理活动。
1943年，四、细胞生物学的形成和发展光学显微镜受到其分辨率和放大倍率的限制，不可能对细胞作进一步精细研究。
1933年德国E.
Ruska等人研制出第一台电子显微镜(electron microscope)。
电子显微镜的发明和20世纪中叶分子生物学的发展，标志着亚显微结构与分子水平相结合的细胞生物学的开端。
（一）电子显微镜的应用使细胞学研究深入到亚显微水平Ruska最初研制的电子显微镜的放大倍率达10000倍。
之后，由于技术上的不断革新，电子显微镜的放大倍率达到几十万倍，分辨率由最初的50nm提高到零点几个纳米。
同时用千电镜标本制作的超薄切片技术也在不断改进。
从20世纪40年代，特别是50年代中期到60年代末期，电子显微镜的应用使细胞的形态学研究深入到亚显微水平，发现了过去在光镜下看不到的细胞器，如内质网(K.
R. Porter,1945)、溶酶体(De duve,1956汃核糖体(Robe1tis,1958)；明确了过去在光镜下看到的高尔基复合体(A.
J. Dalton等，1953)和线粒体(G.
E. Palade,1953)等细胞器及其微细结构。
随着电子显微镜技术的进展，除对细胞进行超微结构观察之外，也逐步深入到结构与功能相结合的探索，即应用生物化学与生物物理学手段对分离出的细胞器进行化学组分分析。
这些工作的积累为细胞生物学的形成打下基础。
20世纪70年代，超高压电子显微镜的出现，又相继发现了细胞质中纵横交错的网状细胞骨架结构(Porter,1976)和细胞核基质内的网状核骨架结构(E.
G. Fey,1984)。
20世纪80年代初期，扫描隧道显微镜(G.
Binning和H.
Rohrer,1981)和原子力显微镜(Binning)的发明，使细胞的亚显微结构观测深入到超微（大分子）结构层次，可用于研究DNA和蛋白质等生物大分子的表面立体结构。
（二）分子生物学的研究进展促进了细胞生物学的形成与发展自20世纪50年代始，分子生物学进入一个快速的发展时期。
1953年J.
Watson和F.
Crick提出DNA双螺旋结构模型。
1958年，M.
Meselson和F.
Stahl通过DNA复制研究，证明DNA复制为半保留复制。
同年，Crick发表了“中心法则”(central dogma)，指出遗传信息的流向是DNA--+RNA--+蛋白质。
第一篇细胞生物学概论
五、细胞生物学的发展趋势
纵观细胞生物学的发展历史，可以得出理论的提出和研究技术的进步是推动细胞生物学快速发展的结论。
19世纪“细胞学说”的提出回答了生物界的统一性和生命活动的本质，奠定了包括细胞生物学在内的生命科学发展的基础；20世纪30年代电子显微镜的发明让入们看到了结构复杂和分工协作的细胞世界；20世纪50年代建立的DNA双螺旋结构模型和遗传信息传递的“中心法则”将细胞学研究带入分子水平，成为分子细胞生物学或细胞分子生物学。
我们相信，21世纪初期完成的包括人类在内的生物体基因组序列分析的完成，将引领细胞生物学的快速发展。
1990年人类基因组计划(human genome project, HGP)启动，在这一世界性范围内的科学大合作中，中国科学家千1993年加入，承担其中1％的序列分析任务。
2000年美、英、日、法、德、中6国学者共同绘制了人类基因组框架图，2003年人类基因组序列分析完成。
人们发现包括入类在内的哺乳动物基因组中近98％的序列不与蛋白质编码基因相对应。
随后发现，非编码DNA并非垃圾序列，它们均可被转录加工为非编码小RNA或长链非编码RNA。
同时不依赖于DNA序列的可遗传信息一表观遗传现象的发现，使人类基因组信息更加复杂。
可以认为，为诠释这些基因组结构及生物学意义的基因组学、转录组学、蛋白质组学、细胞组学等新兴领域生命信息和新技术体系的引入，将会像“20世纪50年代建立的DNA双螺旋结构模型和遗传信息传递的中心法则将细胞生物学研究带入分子水平“那样，细胞生物学又将进入一个新的快速发展时期。
目前，细胞生物学已经从专注“单个细胞＂的显微、亚显微和分子水平的常规研究扩展到更深的层次：一方面关注在生物个体水平研究细胞结构和功能的分子基础，研究细胞间相互作用、分工协作的社会关系，研究微环境细胞间相互联系的信息机制和功能取向；另一方面，基于多细胞生物的单个细胞测序技术精准解析不同身份细胞的功能基础。
果蝇(Drosophila melanogaster汃线虫(Caenorhabditis elegans)、爪赡(Xenop匹laevis汃斑马鱼(Danio rerio)和小鼠(M监m监CU如）等是开展这方面研究的常用模型动物。
这方面工作的有效开展，尚需要诸如活体成像技术等新的研究手段的不断进步，也包括不局限定性描述更多地开展定量测定和定量研究等技术的建立和不断革新。
人类认识世界的目的是为了更好地改造世界，更好地造福人类。
因此，细胞生物学理论及技术的转化和应用研究应该是细胞生物学发展的终极目标。
该研究领域与医学关系十分密切，其中疾病的（干）细胞治疗研究及基千基因编辑技术纠正细胞功能缺陷研究将会成为突出的亮点。
第三节细胞生物学与医学
—、细胞生物学与医学的关系
细胞生物学是现代医学的基础和支柱学科。
医学要解决的间题，是阐明人的生、老、病、死等生命现象的机制和规律，并对疾病进行诊断、治疗和预防。
人类生命是从受精卵开始的，经过了胎儿、新生儿、幼年、成年、老年直至死亡的过程，这些过程都是以细胞为单位进行的。
细胞正常结构的损伤和功能紊乱，必然导致人体组织器官的病变，并由此引起疾病。
例如，严重危害人类健康的癌症，就是正常细胞癌变的结果；心血管疾病，如动脉粥样硬化的发生与动脉壁内皮细胞的特性改变有关；老年性痴呆等神经退行性疾病是神经元选择性变性死亡的结果。
因此，细胞是体现人类生、老、病、死之单位，细胞生物学与医学的关系极为密切。
细胞生物学的理论与技术的研究成果不断向医学领域渗透，在很大程度上促进了医学的进步。
细胞生物学的研究内容在不断地加深与医学科学的结合，形成了细胞生物学的分支学科一—医学细胞生物学(me dical cell biology)。
医学细胞生物学以揭示人体各种细胞在生理和病理过程中的生命活动规律为目的，期望能对人体各种疾病的发病机制予以深入阐明，为疾病的诊断、治疗和预防提供理论依据和策略。
第—章绪论
医学细胞生物学所要探讨的主要是与医
学相关的细胞生物学问题，这些问题往往是疾病发生发展的基础。
医学细胞生物学的主要研究模式是，以疾病为导向，提出与疾病相关的细胞生物学问题，然后选择模型细胞开展细胞分子水平的基础研究，继之利用模型动物进行体内研究，力求回答临床问题。
在此基础上进一步开展的临床应用的成果转化研究，如针对医学细胞生物研究中阐明的分子靶点，寻找并研制诊断试剂、靶点药物等，是近年提出的转化医学(translational medicine)研究的主要内容。
转化医学强调将基础研究与解决患者实际问题相结合，实现从“实验图1-1转化医学研究过程：示医学细胞生物学在室到床边”的转化。
因此，可以说医学细胞转化医学研究中的地位生物学是转化医学研究的基石（图1-1)。
医学细胞生物学是医学院校学生的重要基础医学课程之一。
它既是临床医学的基础，也与基础医学的其他学科，特别是人体胚胎学、医学遗传学、生理学、病理学，以及分子生物学等的关系非常密切。
对医学生来说，学好细胞生物学，不仅能为学习其他医学课程打下扎实基础，而且有助千培养良好的科研思维习惯和科学素养，在今后的临床工作中，不断地发现问题、研究间题和解决问题。
二、细胞生物学的主要研究领域与医学意义
细胞生物学是研究细胞生命活动规律及其机制的基础性学科。
现代细胞生物学研究主要从分子水平揭示生物在生理或病理状态下细胞层面上所表现出的特征和行为。
目前细胞生物学的主要研究领域包括：细胞结构与功能的信号基础，蛋白质的分选和运输，染色质的结构和功能，细胞结构体系的组装与去组装，细胞极性与细胞迁移，细胞增殖周期调控，细胞分化与干细胞特性，受精与生殖，细胞的衰老与死亡，细胞社会学，细胞与组织工程等。
细胞生物学中许多领域的研究进展很快，这可能会成为推动医学向前发展的一个新的基础。
在此举例介绍某些研究领域及其医学意义。
（一）细胞间信息传递与细胞的信号转导
在高等动物和人类，各种生命活动，如神经系统、内分泌系统、免疫系统的运行都离不开细胞与细胞间的信息联系。
细胞间的信息联系主要是通过神经递质、激素和旁分泌因子(paracrine)等信号分子来完成的，这些信号分子与细胞表面或细胞内部的受体结合，并引起下游胞内信号分子的级联反应，实现对细胞调节的过程称为信号转导(signal transduction)，其中整个信息传递过程的路径谓之信号转导通路(signaling pathway)。
近年发现，细胞间的信息传递也可通过细胞分泌的包含复杂RNA和蛋白质的小膜泡－~外泌体(exosome)来完成。
细胞的信号转导研究是细胞生物学领域一个很活跃的研究前沿，其主要研究内容是了解信号转导通路中各信号分子之间的相互关系，包括蛋白质的互作、修饰、降解、转位的生物学效应，以及不同信号转导通路间的相互应答(cross-talk)。
细胞信号转导的生物学效应几乎涵盖了细胞所有的生命现象。
因此，通过对细胞信号转导机制的研究，可了解到细胞的运动、增殖、分化及死亡等活动的机制和规律。
细胞信号转导的研究让我们了解到某些疾病的发病机制。
例如，信号转导通路中的受体异常是高胆固醇血症和重症肌无力病入的发病原因。
在家族性高胆固醇血症病入，其肝细胞膜上的低密度脂蛋白(LDL)受体减少，致使肝细胞对血液中LDL的摄入能力降低，从而引起高胆固醇血症。
在重症肌无力患者的体内产生了抗乙酰胆碱受体的抗体，抗体与乙酰胆碱受体结合，使通过受体进行的信号转导过程受阻，出现重症肌无力症。
霍乱弧菌所致的剧烈腹泻也是细胞信号转导通路受阻的典型例子。
霍乱毒素能够糖基化肠黏膜细胞中的G蛋白的a亚基，使G蛋白持续失活，导致细胞的离子代谢紊乱和细胞内外渗透压失衡，大量水分进入肠腔。
此外，信号转导通路中的蛋白激酶功能异常与肿瘤发生发展有关。
（二）细胞分化与干细胞研究
脊椎动物和人类的机体由200多种不同类型的细胞组成。
这些细胞的结构和功能各异，是细胞分化的结果。
细胞分化(cell differentiation)是指在个体发育中，由单个受精卵产生的细胞在形态结构、生化组成和功能等方面形成明显的稳定性差异的过程。
由一个受精卵来源的细胞为什么会变得如此多样与不同？
这是细胞分化的研究内容。
细胞分化的机制，是数百年来许多生命科学家付出毕生精力而至今尚未完全解决的难题。
目前，人们认识到细胞分化的实质是基因的选择性表达，是胚胎细胞逐渐由“全能”到“多能”“单能”，最后成为“终末细胞＂的发育过程。
人类胚胎早期的弱胚内细胞团(inner cell mass, ICM)细胞是多能性干细胞，它具有分化为成熟个体中所有细胞类型的潜能，已在体外成功建系，称为胚胎干细胞(emb1-yonic stem cell, ESC)。
而来源于成体组织的单能性千细胞则称为成体干细胞(adult stem cell)或组织千细胞。
干细胞是生物个体发育和细胞分化的基础，对于细胞生物学特性的研究将有助千对生命的基本现象，即发育和细胞分化以及机体衰老机制的认识。
胚胎干细胞可以在体外培养、传代，且保持其无限增殖能力和多向分化潜能，特别是近年通过细胞重编程(cellular reprogramming)技术获得的诱导多能干细胞(induced pluripotent stem cells, iPS细胞），显示出与胚胎干细胞相同特征，这使人们看到了彻底修复和再生人体病变器官的前景。
理论上，干细胞经特定因子刺激后，可发育成特化的细胞，用于治疗由细胞功能障碍或组织受损引起的疾病，这就是所谓的细胞治疗；而利用胚胎干细胞，克隆人体组织器官，以治疗（替代病变器官）为目的的克隆技术称为治疗性克隆。
因此，目前干细胞已成为生命医学研究领域的热点。
（三）细胞增殖与细胞周期调控
细胞增殖是细胞生命活动的重要特征，是个体生长和发育的基础。
组成人体的细胞多达2x1014个，是细胞增殖的结果。
细胞增殖以周期性循环的方式进行。
一个细胞经过一系列生化事件而复制它的组分，然后一分为二，这种周期性的复制和分裂过程即为细胞（增殖）周期(cell cycle)。
在个体发育中，胚胎期细胞分裂增殖极为活跃，成体期除部分细胞不断分裂增殖之外，大多数细胞的增殖速度减慢，有的甚至停止分裂。
细胞是如何知道什么时候分裂，什么时候停止分裂的，以及细胞不对称分裂的机制等是目前细胞增殖周期调控研究的主要内容。
细胞增殖与细胞周期的调控一直是细胞生物学研究的重要领域，目前已发现了真核细胞内操纵细胞周期进程的三类细胞周期调控因子，它们是细胞周期蛋白、细胞周期蛋白依赖性激酶和细胞周期蛋白依赖性激酶抑制因子；也发现了若干个监控细胞周期进程的反馈调控机制，即细胞周期检查点(cell cycle checkpoint)。
细胞的增殖失控与人类的某些疾病，如肿瘤的发生等密切相关。
肿瘤细胞的主要特性是细胞的无休止和无序的分裂并形成肿块。
因此，研究细胞增殖与细胞周期的调控机制，也是了解肿瘤发生机制和控制肿瘤生长的重要途径。
肿瘤的发生机制与防治研究是医学领域的重要研究课题，其中基因与肿瘤发生的关系、细胞信号转导与肿瘤、肿瘤干细胞特性以及癌细胞诱导分化研究等是目前肿瘤细胞生物学的主要研究领域。
癌基因、抑癌基因的发现，以及其介导的信号转导机制的阐明，极大地丰富了人们对细胞增殖规律与细胞周期调控机制的认识。
（四）细胞衰老与细胞死亡细胞衰老与细胞死亡是生物界的普遍规律。
细胞衰老(cellular aging, cell senescence)是指细胞的形态结构和生理功能逐渐衰退的现象。
在人类和高等动物，细胞总体的衰老将导致个体的老化。
因此，细胞衰老是机体的衰老和老年病发病的基础。
迄今在细胞衰老机制研究上已取得了一些进展，如发现随着细胞分裂次数的增加，染色体端粒的末端不断缩短；在低等生物线虫中，发现了影响线虫寿命的衰老基因和抗衰老基因（也称长寿基因）；在过早老化的Werner综合征病入，由千DNA复制时解旋障碍，其体外培养的细胞与正常人的细胞相比，只分裂了较少的次数就发生了衰老和死亡。
可以想象，随着细胞衰老的规律和机制的阐明，人类延缓个体衰老的愿望将可能实现。
细胞死亡(cell death)是指细胞生命活动的结束，传统上区分为坏死和凋亡两大类，新近发现细胞焦亡是又一种形式的细胞死亡。
细胞凋亡(apoptosis)是指细胞在特定条件下遵循自身的程序而结束自己生命的过程，它是由基因控制的主动性死亡，因此也称为程序性细胞死亡。
细胞凋亡是个体发育过程中必不可少的生物学事件，细胞凋亡异常，将引起发育畸形，如并指（趾）、肛门闭锁、两性畸形和神经管发育缺陷等。
一些神经退行性疾病，如帕金森(Parkinson)病、阿尔茨海默(Alzheimer)病等与神经元凋亡密切相关。
研究细胞凋亡的机制不仅对揭示生命活动的规律，也对了解疾病的发生、发展有重要意义。
细胞凋亡研究领域非常活跃，继发现引起凋亡的基因家族（如caspase, bcl-2,p53)和诱导细胞凋亡的信号转导途径（如细胞表面死亡受体途径，线粒体途径）之后，又发现了一些新的凋亡形式，如细胞失巢凋亡(ano如s)和自噬性凋亡(autophagic apoptosis)。
细胞焦亡(pyroptosis)是一种新的程序性细胞死亡，表现为细胞不断胀大直至细胞膜破裂，导致细胞内容物的释放进而激活强烈的炎症反应。
细胞凋亡的本质是细胞的程序性坏死，广泛参与感染性疾病、神经系统相关疾病和动脉粥样硬化性疾病等的发生发展。
随着研究的深入，将会对细胞死亡的机制有更深入的了解，并有可能为细胞死亡相关性疾病的治疗提供有效手段。
（五）细胞的基因组学与蛋白质组学继入类基因组序列分析完成之后，逐渐形成的基因组学和蛋白质组学将细胞生物学研究推向一个新的领域。
基因组(genome)是指细胞或生物体的一套完整的单倍体遗传物质，是所有不同染色体上全部基因和基因间的DNA的总和。
基因组学是研究生物基因的组成，组内各基因的精确结构、相互关系及表达调控的学科。
基因的表达调控研究是近年来细胞生物学中十分活跃的领域，其中关于表观遗传调控的研究，即表观遗传学(epigenetics)是该领域新的研究热点。
表观遗传学是研究没有DNA序列变化并且可以遗传的基因功能变化的学科，如DNA甲基化，组蛋白密码(histone code，指组蛋白的乙酰化、甲基化、磷酸化、泛素化、糖基化和跋基化等影响转录因子与DNA结合的动态转录调控），基因组印记(genomi c imprinting)以及表观基因组学(e pigenomi cs)等。
此外，控制基因信息流向的小RNA和长链非编码RNA的不断发现又将为阐明细胞的生命活动规律打开新窗口。
可以相信，细胞基因组学研究的医学意义将不可估址。
蛋白质组“proteome”源于“prote in”与“genome"杂合，是指由一个细胞、一个组织或生物的基因组所表达的全部蛋白质。
细胞的蛋白质组学以细胞内全部蛋白质的存在及其活动方式为研究对象，从整体角度分析细胞内动态变化的蛋白质组成成分、表达水平与修饰状态，进而了解蛋白质之间的相互作用与联系，揭示蛋白质功能与细胞生命活动的规律。
蛋白质的亚细胞定位对蛋白质功能的发挥起关键性作用，蛋白质亚细胞定位信息暗示着其生物学功能。
目前基于亚细胞成分（如细胞膜、线粒体、溶酶体、内质网、高尔基复合体、细胞核等）分离技术的亚细胞蛋白质组学(subcellular proteomics)已成为蛋白质组学研究的重要内容。
蛋白质组学研究的另一途径是，着重于寻找和筛选引起2个样本之间的差异蛋白质谱产生的有意义的因素，揭示细胞生理和病理过程的本质、对外界环境刺激的反应途径以及细胞调控机制，同时获得对某些蛋白质的功能分析，此即比较蛋白质组学。
因此，蛋白质组学的研究不仅能为阐明细胞生命活动的规律提供物质基础，也能为探讨疾病的机制、疾病诊治和新药开发等提供重要的理论依据和实际解决途径。
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Nalure,2012,489:52-55-------------------·自然界中所有生物和人类的机体都是由细胞构成的，细胞是生物体结构和功能的基本单位。
细胞生物学的研究对象是细胞，经历了从显微水平的细胞学研究到亚显微与分子水平研究的发展，成为目前在分子层次上研究细胞的结构和生命活动规律的学科。
人类基因组计划的完成，以及随之发展起来的细胞的基因组学、转录组学、蛋白质组学乃至细胞组学研究，将成为推动细胞生物学向前发展的基础，预示着细胞生物学又将进入一个新的快速发展时期。
细胞生物学是研究细胞生命活动规律及其机制的基础性学科。
细胞生物学在包括细胞间信息传递与细胞的信号转导、细胞分化与干细胞研究、细胞增殖与细胞周期调控、细胞衰老与细胞死亡等方面的研究进展，为人类对疾病机制的认识奠定了坚实基础。
细胞生物学的研究内容在不断地加深与医学科学的结合，形成了医学细胞生物学。
医学细胞生物学所要探讨的主要是与医学相关的细胞生物学问题，它以揭示人体各种细胞在生理和病理过程中的生命活动规律为目的，期望能对人体各种疾病的发病机制予以深入阐明，为疾病的诊断、治疗和预防提供理论依据和策略。
（陈誉华）
第二章细胞的概念与分子基础
细胞是目前已知的所有生命体的基本组成单位。
单个细胞能够成为简单生命体，复杂生命体则由具有特定功能的多种细胞组装构筑而成。
现认为所有生命体的细胞均是由一个共同的祖先细胞进化而来，这种祖先细胞经过漫长的突变、选择和适应，它的后代细胞渐渐趋异进化，呈现多种多样的形态与种类，构筑成多元的生命体，呈现千姿百态的生物种群。
目前已知有结构简单的原核细胞和含有细胞核与膜包裹细胞器的真核细胞两类细胞。
细胞内的物质称为原生质，构成基础是分子，包括无机分子、有机小分子和生物大分子。
本章将介绍细胞的基本概念及分子组成，为进一步理解细胞生物学打下基础。
第一节细胞的基本概念一、细胞的种类
细胞是构成已知所有生命体的结构性、功能性、生物性的基本单元，是最小的具有独立复制能力的生命单元。
20世纪60年代，细胞生物学家H.
Ris依据细胞的结构将细胞分为原核细胞(prokaryo tic cell)与真核细胞(eukaryotic cell)两大类。
近年的研究显示，原核生物在很早的时候就演化为两大类：古细菌(archaeobacteria)和真细菌(e ubacteria)。
古细菌可能是细胞生存的更为原始的类型。
1990年，美国C.R. Woese提出，将生物界划分为三个域：心古菌域（祖c h aea)，包括产甲烧菌、盐杆菌、热原质体等；＠细菌域(bacteria)，包括支原体、衣原体、立克次体、细菌、放线菌及蓝藻等；＠真核域(eukruya)，包括真菌、植物、动物和人类（图2-1)。
基千此分类，某些生物学家建议将生物界的细胞分为三大类型：古核细胞（古细菌）、原核细胞与真核细胞。
依据目前普遍的观点以及古细菌没有细胞核和由膜包裹的细胞器，本书仍把古细菌归属于原核细胞范畴。
细菌域古菌域真核域
绿色非硫细菌
I甲烧八迭球菌内变形虫
革兰阳性菌甲烧杆菌\＼盐杆菌纤毛虫类
紫细菌I热变形菌甲烧球菌＼速生热
蓝细菌火盘菌＼球菌黄细菌栖热抱菌微抱子虫类
滴虫类原核细胞外由细胞膜包绕，膜内的细胞质中无内质网、高尔基复合体、溶酶体和线粒体等膜性细胞器；有核糖体；含一条不与蛋白结合的DNA链，集中分布千细胞质一个区域内，该区域没有膜包裂被称为拟核(n u cleo i d)；原核细胞较小，直径约为1到数个微米。
原核细胞的另一特点是在细胞膜之外通常有一坚韧的细胞壁(cell wall)，细胞壁的主要成分是蛋臼多糖和糖脂。
常见的原核细胞有支原体、细菌、放线菌和蓝绿藻（蓝细菌）等，其中支原体是最小的原核细胞。
1支原体是最小最简单的细胞支原体(mycoplasma)是目前已知的最小的细胞，其直径约为细菌的外表面为一层坚固的细胞壁，其主要成分为肤聚糖(pept i doglycan)。
有些细菌的细胞壁外还有一层由多肤和多糖组成并具有保护功能的结构一一荚膜(capsula)，在感染真核细胞后，荚膜能够保护细菌在真核细胞内生存。
在细胞壁内面为脂质分子和蛋白质组成的细胞膜。
细菌的细胞膜常可分为细胞膜外膜、细胞膜内膜，以及内外膜中间的间隙。
有些蛋白位于外膜上，称为外膜蛋白；有些蛋白位于内膜上，称为内膜蛋白；还有些蛋白贯穿千内外膜间。
细菌的细胞膜上还含有参与代谢反应的酶类，如呼吸链酶类。
细菌胞质内的拟核区含有环状DNA分子。
细菌的DNA结构特点是重复序列少，编码蛋白的基因编码序列是无间隔排列在一起的，序列中无内含子。
在细菌的细胞质内还含有基因组DNA以外的遗传性DNA片段，常为能够自我复制的小环状DNA片段即质粒(plasmid)。
细菌胞质中含有丰富的核糖体，每个细菌约含5000-50000个核糖体，其中大部分游离于细胞质中，小部分附着在细胞膜的内表面。
细菌核糖体的沉降系数为70S，由一个50S的大亚基和一个30S的小亚基组成，它是细菌合成蛋白质的场所。
细菌蛋白质合成的特点为细胞质内基因转录形成的mRNA不需要加工，直接翻译合成蛋白。
细菌胞内蛋白合成是与基因转录偶联在一起的，即一边进行基因转录一边翻译合成蛋白。
3.古细菌多生活在极端环境中古细菌是一类单细胞微生物，没有细胞核和由膜性包裹的细胞器，属于原核生物。
古细菌最初是在极端的生态环境如热溫泉和盐湖中被发现的。
现在确定广泛分布于自然界中，包括土壤、海洋和沼泽。
古细菌也是人微生物群的组成部分，分布千人大肠、口腔和皮肤。
由于大多数的古细菌不能从实验室分离，多依赖于古细菌生活环境中的DNA序列进行分类。
古细菌具有有别于真核细胞和细菌的独特特征。
古细菌的大小与形态多与细菌相似，少部分古细菌具有奇特形态；基因结构与代谢途径，特别是基因转录和翻译的酶类，与真核细胞类似；古细菌可利用多种物质提供能品，包括有机物、氨、金属离子、氢气和阳光等，有些古细菌具有固氮能力，但与植物和藻O',类不同，古细菌不能同时固氮和进行光合作用；古细菌为无性繁殖，不形成抱子。
第二章细胞的概念与分子基础
三、真核细胞
真核细胞比原核细胞进化程度高、结构复杂。
由真核细胞构成的生物，包括单细胞生物（如酵母）、原生生物、动植物及人类等。
真核细胞区别于原核细胞的基本特征是具有由核膜包围形成的细胞核结构和由膜包裹的细胞器。
（一）真核细胞的形态与大小
高等生物由数百种真核细胞组成，其形态是多种多样的，常与细胞所处的部位及功能相关。
游离千液体的细胞多近于球形，如红细胞和淋巴细胞等；组织中的细胞一般呈椭圆形、立方形、扁平形、梭形和多角形，如上皮细胞多为扁平形或立方形，具有收缩功能的肌肉细胞多为梭形，具有接受和传导各种刺激的神经细胞常呈多角形，并出现多个树枝状突起，反映出细胞的结构形态与功能密切相关。
不同类型细胞的大小差异很大，一般用微米(µm)和纳米(nm)作为描述细胞大小的单位。
大多数细胞的直径在10~20µm之间，但有些细胞较大，如卯细胞，人卯细胞约为lOOµm，一些鸟类动物卯细胞可达几个厘米。
（二）真核细胞的基本结构
在光学显微镜下，真核细胞可区分为细胞膜(cell membrane汃细胞质(cytoplasm)和细胞核(nucleus)，在细胞核中可看到核仁结构（图2-3)。
电子显微镜下，细胞质中可以看到由单位膜组成的膜性细胞器，如内质网、高尔基复合体、线粒体、溶酶体、过氧化物酶体，以及微丝、微管、中间纤维等骨架系统。
在细胞核中也可看到一些微细结构，如染色质、核骨架。
一般将在光学显微镜下看到的结构称为显微结构，而把在电镜下看到的结构称为亚显微结构(submicroscopic structure)或超微结构(ultrastructure)。
中心线粒
细胞核
细胞
高尔基复合
真核细胞是以生物膜的进一步分化为基础，使细胞内部构建形成许多更为精细的具有专门功能的结构单位。
真核细胞虽然结构复杂，但可以从以下四个方面理解真核细胞的结构特点：1以脂质及蛋白质成分为基础的膜相结构体系一—生物膜系统生物膜系统是指以生物膜(biological membrane)为基础而形成的一系列膜性结构或细胞器，包括细胞膜、内质网、高尔基复合体、线粒体、溶酶体、过氧化物酶体及核膜等。
组成这些膜性结构或细胞器的膜具有相似的单位膜(unit m e mbra n e)结构，即电镜下的内外两层致密的深色带和中间层的浅色带，膜厚度在8~10nm之间。
这些膜性结构或细胞器均含有其特殊的酶系或蛋白质，在细胞内各自独立地执行其功能。
如细胞膜的主要功能是进行物质交换、信息传递、细胞识别及代谢调节等作用；核膜把细胞分为细胞质和细胞核两部分，不但使遗传物质得到更好的保护，而且在维持细胞核与细胞质之间的物质交换方面起重要作用；线粒体是产能细胞器，为细胞的活动提供所需的能量；内质网是细胞内蛋白质和脂类等生物大分子合成的场所；高尔基复合体是合成物质加工、包装与分选的细胞器；溶酶体则是细胞内的消化器官，能消化分解各种生物大分子。
14第—篇细胞生物学概论
2以核酸蛋白质为主要成分的遗传信息表达体系一遗传信息表达系统真核细胞的遗传物质位于细胞核中，储存遗传信息的DNA与蛋白质结合，组装成为高度有序的染色质结构。
DNA与蛋白质的结合与组装程度决定了DNA复制和遗传信息的表达状态与模式，DNA的转录产物RNA也与蛋白质结合存在于细胞内。
遗传信息的流向是由DNA一RNA(mRNA)一蛋白质。
mRNA在核糖体(ribosome)上翻译形成蛋白质。
核糖体也称核蛋白体，电镜下呈颗粒状，直径约为l5~25nm，是合成蛋白质的机器。
核糖体由RNA和蛋白质组成，RNA约占核糖体的60%，蛋白质约占40%。
从组成结构上看，核糖体中的RNA主要构成核糖体的骨架，将蛋白质串联起来形成合成蛋白的机器。
在一些细胞内核糖体位置可确定蛋白质在细胞内的位置，即可在细胞内对蛋白质进行定位。
3由特异蛋白质分子构成的细胞骨架体系——细胞骨架系统细胞骨架(cytoskeleton)是由一系列纤维状蛋白组成的网状结构系统，广义的细胞骨架包括细胞质骨架与核骨架，狭义的细胞骨架则指细胞质骨架。
细胞质骨架主要由微丝、微管和中间纤维组成，其功能是维系细胞的形态和结构，参与细胞运动、细胞内物质运输、细胞分裂及信息传递等生命活动过程。
细胞核骨架由核纤层蛋白(lamin)与核骨架组成，维持核形态、基因表达、染色体包装和分布及核内分区等核内结构。
4.细胞质溶胶在细胞质中除了细胞器和细胞骨架等有形结构外，其余的为可溶性的细胞质溶胶(cytosol)。
细胞与环境、细胞质与细胞核，以及细胞器之间的物质运输、能撞传递、信息传递都要通过细胞质溶胶来完成。
细胞质溶胶约占细胞总体积的一半，是均质而半透明的液体部分，其主要成分是蛋白质，占细胞质总址的20％左右，故细胞质呈溶胶状。
细胞质溶胶中的蛋白质很大一部分是酶，多数代谢反应都在细胞质溶胶中进行，如糖酵解、糖异生，以及核背酸、氨基酸、脂肪酸和糖生物合成反应等。
细胞质溶胶的化学组成除大分子蛋白质、多糖、脂蛋白和RNA之外，还含有小分子物质水和无机离子K+,Na+,Cl-、M矿和Ca2＋等。
以上4种基本结构体系构成了细胞内部结构紧密、分工明确、功能专一的各种细胞器，并以此为基础保证了细胞生命活动的高度程序化与自控性。
真核细胞与原核细胞比较有很大差异（表2-1)，这种差异不仅体现在形态结构上，也表现在基因组(genome)组成上。
此外，真核细胞的某些细胞器也含有DNA。
动物类细胞中线粒体中含有少址的DNA，可编码线粒体tRNA、rRNA和组成线粒体的少数蛋白。
特征原核细胞真核细胞
细胞结构核膜无有核仁无有线粒体无有内质网无有高尔基复合体无有溶酶体无有细胞骨架有细胞骨架相关蛋白有核糖体有，70S有，80S基因组结构DNA量（信息址）少大DNA分子结构环状线状染色质或染色体仅有一条DNA,DNA裸露，不与组蛋白结有2条以上DNA分子，DNA与组蛋白和部合，但可与少址类组蛋白结合分酸性蛋白结合，以核小体及各级高级结构构成染色质与染色体基因结构特点无内含子，无大队的DNA重复序列有内含子和大址的DNA重复序列第二章细胞的概念与分子基础在生物界中，病毒(virus)是迄今发现的最小、结构最简单的生物存在形式。
绝大多数病毒必须在电子显微镜下才能看到。
病毒主要是由一个核酸分子(DNA或RNA)与蛋白质组成的核酸－蛋白质复合体，含有DNA的病毒称为DNA病毒，含有RNA的病毒称为RNA病毒。
有的病毒结构更简单，仅由一个有感染性的RNA或蛋白质组成。
仅由RNA组成的病毒称为类病毒(viroid)，仅由蛋白质组成的病毒称为朊病毒(prion)。
病毒的结构简单，不能独立完成生命活动过程，依赖活细胞才能完成它们的基本生命活动，因此病毒也被视为不“完全”的生命体，是细胞的寄生体。
根据病毒寄生的宿主不同，可将病毒分为动物病毒、植物病毒和细菌病毒，其中细菌病毒又称为噬菌体。
多数动物病毒进入细胞的主要方式是靠细胞的“主动吞饮”作用来实现的。
进入细胞内的病毒核酸利用宿主细胞的全套代谢系统，以病毒核酸为模板，进行病毒核酸的复制、转录并翻译形成病毒蛋白，然后装配成新一代的病毒颗粒，最后从细胞释放出来，再感染其他细胞，进入下一轮病毒增殖周期。
病毒在细胞内的增殖过程是病毒与细胞相互作用的复杂过程，离开活细胞后，病毒无法增殖而扩增。
第二节细胞的分子基础
组成细胞的物质称为原生质(protoplasm)，不同细胞的原生质在化学成分上虽有差异，但其化学元素基本相同。
原生质的化学元素有50多种，其中主要的是C、H、0、N四种元素，约占90%，其次为S、P、Cl、K、Na、Ca、Mg、Fe等元素，这12种元素约占细胞总噩的99.9%以上。
此外，在细胞中还含有数量极少的微量元素，如Cu、Zn、Mn、Mo、Co、C1、Si、F,Br、CLi、Ba等。
这些元素并非单独存在，而是相互结合，以无机化合物和有机化合物形式存在于细胞中。
有机化合物为有机小分子和生物大分子，是组成细胞的基本成分。
—、生物小分子
细胞内有无机化合物和有机化合物两类生物小分子。
(—)水和无机盐是细胞内的无机化合物无机化合物包括水和无机盐。
水是细胞中含蜇最多的一种成分，是良好的溶剂，细胞内各种代谢反应都是在水溶液中进行的。
细胞中的水除以游离形式存在之外，还能以氢键与蛋白质分子结合，成为结合水，构成细胞结构的组成部分。
无机盐在细胞中均以离子状态存在，阳离子如Na+, K+,ca2+、Fe2+,M忙等，阴离子有Cl-、SO广、PO广、HC03等。
这些无机离子中，有的游离于水中，维持细胞内外液的渗透压和pH，保障细胞的正常生理活动；有的直接与蛋白质或脂类结合，组成具有特定功能的结合蛋白（如血红蛋白）或类脂（如磷脂）。
（二）有机小分子是组成生物大分子的亚单位
有机小分子是分子量在100~1000范围内的碳化合物，分子中的碳原子可多达30个左右。
细胞中含有4种主要的有机小分子：单糖(monosaecch釭ide)、脂肪酸(fatty acid汃氨基酸(amino acid)和核昔酸(nucleotide)。
糖主要由碳、氢、氧三种元素组成，其化学组成为(CH20)"，其中n通常等于3、4、5、6或7，故又称碳水化合物(carbohydrate)，是细胞多糖的亚基和能源的主要来源化合物；脂肪酸分子由两个不同的部分组成，一端是疏水性的长经链，另一端是亲水性的狻基(—COOH)，其衍生物如磷脂由一个以2条脂肪酸链组成的疏水的尾和一个亲水性的头组成，它们是细胞膜的组分；氨基酸是一类多样化的分子，但均有一个共同的特点，都有一个狻基和一个氨基，两者均与同一个a碳原子连接，它们是蛋白质的亚基；核昔酸分子由一个含氮环的化合物与一个五碳糖（戊糖）相连而成，该戊糖是含有多个磷酸基团的核糖或脱氧核糖，核昔酸是核酸的亚基。
二、生物大分子
生物大分子是由有机小分子构成的，细胞的大部分物质是大分子，大约有数万种生物大分子，分子量从10000到1000000不等。
细胞内大分子由小分子组装而成，分子变大，具有与小分子截然不同的生物学特性。
细胞内主要的大分子有核酸、蛋白质、多糖和脂肪，其分子结构复杂，在细胞内各自执行独特的功能。
(—)核酸携带遗传信息
核酸(nucle i c acid)是生物遗传的物质基础，目前已知的所有生物体，包括病毒、细菌、真菌、植物、动物及人体细胞中均含有核酸。
核酸是生物的生长、发育、繁殖、遗传和变异的基础。
细胞内的核酸分为核糖核酸(ribonucle i c acid, RNA)和脱氧核糖核酸(deoxyribonucleic acid, DNA)两大类。
其中DNA携带着控制细胞生命活动的全部遗传信息，RNA则参与遗传信息的表达。
1核酸的化学组成核酸分子由几十个乃至OlICl几百万个单核甘酸聚合而成，因此核昔酸是核酸的。
基本组成单位。
核背酸由戊糖、碱基（含氮有机碱）
和磷酸三部分组成。
戊糖有两种，即D－核糖和D-2脱氧核糖（图2-4)。
碱基也有两类：嗦呤和瞪唗。
嗦呤有腺嗦呤(adenine, A)和鸟嗦呤(guanine, G);核糖2'－脱氧核糖啪淀有胞啥唗(cytosine, C)、胸腺啥唗(thymine, T)和尿啥唗（u诅cil, U)（图2-5)。
除此之外，在DNA和图2-4DNA和RNA分子中戊糖的结构式RNA分子中还发现有一些修饰碱基，即在碱基的某些位置附加或取代某些基团，如6－甲基嗦呤、5－甲基胞啥唗和5－轻基胞啥唗等，因它们的含量很少，又称稀有碱基。
绝大部分稀有碱基分布在RNA分子上。
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腺嗦呤(A)
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胞瞪唗(C)胸腺啥唗(T)尿啼唗(U)图2-5常见噤呤和啼唗的结构式第二章细胞的概念与分子基础核背酸的产生过程是首先形成核昔。
核昔NHi由碱基与核糖或脱氧核糖缩合而成。
核糖的第1\位碳原子与啥唗第1位氮原子或与嗦呤第9位氮原子形成N—C键，即糖甘键。
由于核糖有两c。
种，因此核甘又分为核糖核甘（简称核昔）及脱氧核糖核甘（简称脱氧核甘）。
核甘的戊糖胫基与磷酸形成酷键，即成为核昔酸。
一般生物体内存在的大多是5'－核昔酸，即磷酸与核糖第5位上轻基形成酷键，如腺昔酸(AMP)、鸟昔酸(GMP)、胞甘酸(CMP)、尿昔酸(UMP)，以及脱氧腺背酸(dAMP汃脱氧鸟昔酸(dGMP汃脱氧胞昔酸(dCMP汃脱氧胸旮酸(dTMP)。
此外，有时磷酸可同时与核昔上2个经基形成酷键，这就形成了环化核背酸。
常见的有3',5'－环化腺昔酸(3',5'-cycl ic adenylic acid,cAMP)和3',5'－环化鸟从5'－环化鸟昔酸(cGMP)3'、5'－环化腺昔酸{cAMP)昔酸(3',5'-cycl ic guanylic acid, cGMP)（图2-6)。
图2-6单核首酸的结构式核酸由大量的单核昔酸聚合而成，单核昔酸间的连接方式为：一个核背酸中戊糖的5'碳原子上连接的磷酸基以酷键与另一个核甘酸戊糖的3'碳原子相连，而后者戊糖的5'碳原子上的磷酸基又以酷键再与另一个核昔酸戊糖的3'碳原子相连，由此通过3'、5'磷酸二酷键重复相连而形成的多聚核昔酸链即为核酸（图2-7)。
表2-2列出了DNA和。
5'磷酸二酣键[0-f=0OH
第一篇细胞生物学概论
RNA在化学组成上的异同。
从化学组成上看，DNA可视为由脱氧核甘酸线性排列组成，由于各种脱氧核昔酸中脱氧核糖和磷酸都是相同的，只有碱基是不同的，因此，可用碱基的排列顺序来代表DNA的脱氧核昔酸组成顺序。
DNA分子中的脱氧核昔酸或碱基的排列顺序也称DNA的一级结构。
RNA则由核糖核昔酸线性排列组成。
戊糖脱氧核糖核糖碱基腺嗦呤(A)鸟嗦呤(G)腺嗦呤(A)鸟嗦呤(G)胞啼唗(C)胸腺啥唗(T)胞啥唗(C)尿啥唗(U)磷酸磷酸磷酸核昔酸脱氧腺昔酸(dAMP)腺昔酸(AMP)脱氧鸟背酸(dGMP)鸟昔酸(GMP)脱氧胞昔酸(dCMP)胞昔酸(CMP)脱氧胸昔酸(dTMP)尿昔酸(UMP)3'5'2.
DNA20世纪50年代初，有关DNA样品的X－射线衍射分析结果提示，DNA分子是由两条链组成的螺旋状多聚体3对来源于不同生物细胞的DNA分子的碱基含量进行分析，证明[A]=[T],[C]=[G]([］表示摩尔浓度）。
1953年Watson和Crick提出了DNA分子的双螺旋结构模型（图2-8)，该模型认为，DNA分子由两条相互平行而方向相反的多核昔酸链组成，即一条链中磷酸二酷键连接的核昔酸方向是5'一3'，另一条是31-->5'，两条链围绕着同一个中心轴以右手方向盘绕成双螺旋结构。
螺旋的主链由位千外侧的间隔相连的脱氧核糖和磷酸组成，双螺旋的内侧由碱基构成，即一条链上的A通过两个氢键与另一条链上的T相连，一条链上的G通过三个氢键与另一条链上的C相连，或者说A总是与T配对，G总是与C配对，这种碱基间的配对方式称为碱基互补原则。
螺旋内每一对碱基均位于同一平面上，并且垂直于螺旋纵轴，相邻碱基对之5'间距离为0.34nm，双螺旋螺距为3.4nm。
构成DNA分子的两图2-8DNA双螺旋结构模式匼条链称为互补链。
由千组成DNA的两条链是互补的，即A=T、C圭G，因此，如果知道一条链中的碱基排列顺序，依据碱基互补原则，便可知道另一条链上的碱基排列顺序（图2-9)。
DNA的双螺旋结构易受环境因素特别是湿度所影响，在低湿度时呈A型，高湿度时呈B型，分别称为A-DNA和B-DNA，其中B-DNA即Waston和Crick描述的DNA双螺旋结构。
A-DNA所形成的右手螺旋与B-DNA不同，比B-DNA较大而且较平。
此外，还有入发现呈左手螺旋的DNA，称为Z-DNA。
DNA的主要功能是储存、复制和传递遗传信息。
在组成DNA分子的线性核昔酸序列中蕴藏着大量的遗传信息。
虽然DNA分子中只有四种核昔酸，但核昔酸的数量却非常巨大，并可随机排列，这就决定了DNA分子的复杂性和多样性。
如果一个DNA分子由n个核昔酸组成，则其可能的排列顺序为4n。
如此多的排列顺序展示了遗传信息的多样性，即生物种类的多样性。
细胞或生物体的一套完整的单倍体遗传物质称为基因组，它是所有染色体上全部基因和基因间的DNA的总和。
迄今包括入类在内的多个生物的DNA序列分析已经完成，入类基因组DNA含有的io~，飞，碱基数为2.9lxl06~3.2xl06kb(3xl09bp)，其中：（A+T)和(G+C)分别占54％和38%；编码蛋白质序第二章细胞的概念与分子基础列（外显子）占DNA的l.1%～1.4%，内含子序列占24%，基因间序列占75%；基因的数目约2万～3万个，每个基因的长度平均为2-30kb，其中功能未知的占60％以上；DNA中含有大量的重复序列，约占50％以上；每个入约有0.1％的核昔酸差异。
DNA分子中所携带的遗传信息传递给后代细胞靠DNA复制来实现，DNA双螺旋结构模型很好地解释了这一信息传递过程的普遍机制。
组成双螺旋DNA的两条链是互补的，每一条链都含有与其互补链精确配对的碱基序列，因此，两条链中的每一条都可以携带相同的信息。
DNA复制从两条互补的DNA链局部分离（分叉）开始，以每条链为模板，在DNA聚合酶作用下将脱氧核糖核昔酸加在DNA链的3'末端，所加上去的核昔酸是与模板链上的碱基互补的，从而产生与模板链序列互补的DNA子链。
如此，可将遗传信息全盘复制出来，最终形成完整的DNA分子。
新形成的双链DNA分子在核昔酸或碱基序列上与充当模板的亲代DNA分子完全相同，由于每条亲代DNA单链成为子代DNA双链中的一条链，故称为DNA半保留复制(semiconservative replication)。
DNA分子所携带的遗传信息的流向是先形成RNA，这种以DNA为模板合成RNA的过程称为转录(tra n scri pti on)。
DNA转录和DNA复制不同，它以一条链的特定部分为模板合成一条互补的RNA链，在RNA合成之后，DNA重新形成双螺旋结构，并释放出RNA分子，然后，形成的RNA被翻译成体现遗传信息的蛋白质，后者决定细胞的生物学行为。
近些年研究发现，不依赖千DNA序列（碱基排列顺序）的遗传信息，如DNA甲基化、组蛋白修饰等也可遗传给子代即表观遗传，这使基因组信息更加复杂，为诠释细胞的功能奠定了分子基础（详见本教材第九和第十五章）。
3. RNA DNA转录来的RNA分子也是由四种核昔酸通过3',5'磷酸二酷键连接而成的。
组成RNA的四种核甘酸为腺节酸、鸟昔酸、胞昔酸和尿昔酸，与DNA分子的区别仅在于RNA中的尿密唗替代了DNA中的胸腺啥唗。
此外，RNA分子中的戊糖是核糖，而不是脱氧核糖。
大部分RNA分子以单链形式存在，但在RNA分子内的某些区域，RNA单链仍可折叠，并按碱基互补原则形成局部双螺旋结构这种双螺旋结构呈发夹样，也称为RNA的发夹结构（图2-10)。
RNA的结构和功能的研究是近闷0i}些年来飞速发展的领域，新的RNA特别是不编码蛋白质的非编码RNA(no ncoding RNA, ncRNA)被不断地发现，表2-3总结了动物细胞内主要的RNA种类。
(l)mRNA:mRNA(messe nger RNA)约占细胞内总RNA的lo/o~5%。
含量虽少，但种类甚多而且极不均一，例如每个哺乳类动物细胞可含有数千种大小不同的mRNA。
原核细胞与真核细胞的mRNA不同，原核细胞没有真核细胞mRNA所特有的5'端7－甲基三磷酸鸟昔(m7G5ppp)帽子结构，也没有3'端的由30-300个腺昔酸组成的多聚腺甘酸尾巴(3'polyadenylate tail,糖－磷酸主链polyA)结构。
在高等真核生物，不同组织细胞中mRNA的种类相差极大。
mRNA在遗传信息流向过程中起重要作用，即携带着来源于DNA遗传信息的mRNA与核图2-10RNA发夹结构模式图糖体结合，作为合成蛋白质的模板。
mRNA分子中每三个相邻的碱基组成一个密码子(codon)，由密码子确定蛋白质中氨基酸的排列顺序。
因此，整个mRNA链即是由一个串联排列的密码子组成。
mRNA指导特定蛋白质合成的过程称为翻译(translation)。
在原核生物，mRNA在合成的同时可直接翻译为蛋白质，而真核细胞则不同，其mRNA在合成之后需经过一系列的加工，然后才能成为合成蛋白质的模板。
原核细胞的mRNA为多顺反子(polycistron)，即一分子RNA有时可携带几种蛋白质的遗传信息，能指导合成几种蛋白质，而真核细胞中的mRNA是单顺反子(monocistron)，每分子RNA只携带一种蛋白质遗传信息，只能作为一种蛋白质合成的模板。
此外，不论是原核细胞的多顺反子rnRNA，还是真核细胞的单顺反子mRNA，在其5'端和3'端都各有一段由30到数百个核甘酸组成的非翻译区(untranslated region, UTR)，中间则是具有编码蛋白质功能的编砃区(co由ng region)。
UTR是蛋白质翻译调控的重要靶点之一。
(2)rRNA:rRN A(ribosomal RNA)在细胞中的含盘较丰富，约占RNA总噩的80%~90%，其分子量在三种RNA中也最大。
rRNA的大小一般用沉降系数S表示。
rRNA通常也呈单链结构，其主要功能是参与核糖体(ribosome)的形成。
核糖体是合成蛋白质的机器，由大小两个亚基组成，在原核生物第二章细胞的概念与分子基础中核糖体为70S，其大小亚基分别为50S和30S,50S大亚基中含23S和5S rRNA,30S小亚基中含有16S rRNA。
在16S rRNA的3'端有一个与mRNA翻译起始区互补的保守序列，是mRNA的识别结合位点。
而真核生物的核糖体为80S,40S的小亚基含18S rRNA,60S大亚基则含有28S、5.8S和5S三种(3)tRNA:tRNA(transfer RNA)的含量约占细胞总RNA的5%～10%，分子较小，由70到90个核昔酸组成。
tRNA化学组成的最大特点是含有稀有碱基。
tRNA分子为单链结构，但有部分折叠成假双链结构，以至整个分子结构呈三叶草形（图2-11)：靠近柄部的一端，即游离的3'端有CCA三个碱基，它能以共价键与特定氨基酸结合；与柄部相对应的另一端呈球形，称为反密码环，反密码环上的三个碱基组成反密码子(anticodon)，反密码子能够与mRNA上密码子互补结合，因此每种tRNA只能转近些年研究发现，tRNA还可以作为反转录时的引物。
当反转录病毒在宿主细胞内复制时，需要细胞内的tRNA为引物，反转录成与其互补的DNA链(cDNA)。
可以作为引物的常见tRNA是色氨酸tRNA、脯氨酸－tRNA。
氨基酸结合臂ACC3'端3'
rRNA。
rRNA约占核糖体总量的60%，其余的40％为蛋白质。
运一种特定的氨基酸，参与蛋白质合成。
5'端:A.
tRNA三叶草形结构模式图；B.
tRNA分子空间结构模式图第—篇细胞生物学概论表达该小RNA的基因记作miR-181。
miRNA普遍存在于生物界，具有高度的保守性。
rniRNA的形成与作用机制是：在细胞核内编码rniRNA的基因转录成rniRNA初级产物(prirniRNA)，在Drosha(RNase皿家族的成员）的作用下，剪切为约70~90个核背酸长度、具有茎环结构的rniRNA前体(pre-rniRNA)。
rniRNA前体在细胞核－细胞质转运蛋白的作用下，从核内运输到胞质中。
然后，在Dicer酶（双链RNA专一性RNA内切酶）的作用下，rniRNA前体被剪切成21~25个核昔酸长度的成熟双链rniRNA。
起初，成熟rniRNA与其互补序列互相结合成所谓“双螺旋结构＂；随后，双螺旋解旋，其中一条结合到RNA诱导基因沉默复合物(RNA-induced silencing complex, RISC)中，形成非对称RISC复合物(asymmetric RISC assembly)。
非对称RISC复合物通过与靶基因mRNA3'端UTR互补结合，抑制靶基因的蛋白质合成或促使靶基因的mRNA降解，从而参与细胞分化与发育的基因表达调控（图2-12)。
miRNA初级产物miRNA前体成熟miRNA
_-~尸:u_;＿－－邓
基因组DNA.酝．瞿仁
Drosha（剪切miRNA初级产物）Dicer
非对称RISC复合物
miRNA与靶基因完全互厂~iRNA与靶基因部分互补
靶基因mRNA降解靶基因翻译抑制
需要指出的是，Dicer酶除了在rniRNA形成过程中起重要作用之外，还可将一些外源双链RNA加工成为22nt左右的小干扰RNA(small interferencing RNA, siRNA)。
同miRNA的作用机制类似，这些siRNA也能够以序列同源互补的mRNA为靶点，通过促使特定基因的mRNA降解来高效、特异地阻断体内特定基因表达，这种现象称为RNA干扰(RNA inte1ference, RN Ai)。
核酶的底物是RNA分子，它们通过与序列特异性的靶RNA分子配对而发挥作用。
目前已发现了具有催化活性的多种类型的天然核酶，其中锤头状(hammerhead)核酶和发夹状核酶已被人工合成，并显示召。
出很好的功能。
可以根据锤头结构的模式设计能破坏致病基因的转录产物，从而为基因治疗提供新途径。
第二章细胞的概念与分子基础23
（二）蛋白质是遗传信息的功能载体
蛋白质(protein)是构成细胞的主要成分，约占细胞干重的50％以上。
蛋白质是呈现DNA遗传信息的物质，决定细胞的形状和结构，担负细胞的功能。
自然界中蛋白质的种类繁多，通常由20种氨基酸组成排列组合而成。
1蛋白质的组成蛋白质是高分子化合物，分子量大多在10000以上，基本单位为氨基酸，由几十个至几百个以上氨基酸组成的多聚体。
自然界中有很多种氨基酸，组成蛋白质的有20种L-a－氨基酸；蛋白质氨基酸序列由mRNA上的遗传密码所编辑。
每一个氨基酸都含有一个碱性的氨基(-NH2)和一个酸性的狻基(—COOH)，以及一个结构不同的侧链(-R)（图2-13)。
从氨基酸的结构式可知，氨基酸为两性电解质。
按氨基酸侧链－R的带电性和极性不同，可将氨基酸分为四类：即带负电荷的酸性氨基酸，带正电荷的碱性氨基酸，不带电荷的中性极性氨基酸，以及不带电荷的中性非极性氨基酸。
酸性氨基酸有谷氨酸、天冬氨酸；碱性氨基酸有精氨酸、赖氨酸、组氨酸；其余氨基酸则为中性氨基酸。
细胞生命活动过程中氨基酸的修饰是常见现象，如蛋白质序列中的酪氨酸、丝氨酸和苏氨酸磷酸化与去磷酸化在蛋白质执行信息传递功能过程中起重要作用；组蛋白序列中赖氨酸、精氨酸的乙酰化和甲基化等行使表观遗传功能，调控基因转录等作用。
组成蛋白质的各种氨基酸按一定的排列顺序，以肤键氨基端｝狻基端}H2N—C—COOH--H3N+-C—coo-I
连接而成。
肤键是一个氨基酸分子上的狻基与另一个氨基酸分子上的氨基经脱水缩合而成的化学键（图2-14)。
CH3妯氨基酸通过肤键而连接成的化合物称为肤(peptide)，由两非离子型离子型个氨基酸连接而成的称为二肤，三个氨基酸连接而成的称图2-13氨基酸的结构式为三肤，以多个氨基酸连接而成的称为多肤。
多肤链是蛋白质分子的骨架，其中的每个氨基酸称为氨基酸残基，组成蛋白的氨基酸残基的差异体现蛋白质的特征。
因此，20种氨基酸的不同排列组合顺序反映出蛋白质的结构与功能的多样性。
肤键
2蛋臼质的结构氨基酸的排列顺序是蛋白质的结构基础，但蛋白质不只是其组成氨基酸的延伸，它是以独特的三维构象(conformation)形式存在。
通过对蛋白质晶体的X－射线衍射图谱分析，可以了解到蛋白质的三维结构。
1958年J.
Kend rew首先确定了由153个氨基酸组成的肌红蛋白的三维结构（图215)。
迄今已经有数千种蛋白质的三维结构被分析出来。
这些蛋白质结构反映出来的共同特征是其多肤链的折叠(folding)。
事实上，蛋白质的折叠与核糖体上蛋白质的合成同步进行，即边合成边折叠，新生肤链在合成过程中结构不断发生调整，合成、延伸、折叠、构象调路直至最后三维结构的形成。
除一类可溶性蛋白分子伴侣(moleculm chaperone)参与辅助或陪伴蛋白质的折叠之外，蛋白质三维构象的形成主要由其氨基酸的顺序决定，是其氨基酸组分间相互作用的结果。
图2-15肌红蛋白的三维结构根据蛋白质的折叠程度不同，通常将蛋白质的分子结构分为四级，即蛋白质的一级结构、蛋白质的二级结构、蛋白质的三级结构和蛋白质的四级结构。
蛋白质的一级结构是指蛋白质分子中氨基酸的排列顺序。
一级结构中氨基酸排列顺序的差异使蛋白质折叠成不同的高级结构。
大部分蛋白质分子结构中往往有两种主要的折叠形式，即a－螺旋(helix）和B－片层(sheel)结构，这两种结构被认为是蛋白质的二级结构。
二级结构是在蛋白质一级结构基础上形成的，是由千肤链主链内的氨基酸残基之间有规则地形成氢键相互作用的结果。
在a－螺旋中，多肤链沿着螺旋轨道盘旋，每3.6个氨基酸盘旋一周，相邻的两个螺旋之间借肤键的亚氨基(>N—H)的氢原子与碳基(>C=O)的氧原子间形成氢键，氢键与螺旋长轴平行。
细胞内的多肤在合成之后可自发地形成a－螺旋，a螺旋是多肤链最稳定的构象，主要存在于球状蛋白分子中，如肌红蛋白分子中约有75％的肤链呈氐螺旋。
在B－片层结构中，多肤链分子处于伸展状态，多肤链来回折叠，呈反向平行，相邻肤段肤键之间形成的氢键，使多肤链牢固结合在一起。
B－片层结构主要存在千纤维状蛋白如角蛋白中，但在大部分蛋白质中这两种结构同时存在。
多肤链在二级结构的基础之上进一步折叠，形成蛋白质的三级结构。
三级结构是由不同侧链间相互作用形成的，相互作用的方式有氢键、离子键和疏水键等。
具有三级结构的蛋白即表现出生物学活性，但某些蛋白质的结构较复杂，由一条以上的多肤链所组成，需要构成四级结构才能表现出生物活性。
蛋白质四级结构是在三级结构基础之上形成的，在四级结构中每个独立的三级结构的肤链成为亚单位，多肤链亚单位之间通过氢键等非共价键的相互作用，即形成了更为复杂的空间结构。
这样，只有亚单位集结在一起的四级结构才显示出蛋白质的生物学活性，机体中的大部分酶类在发挥作用时即表现为四级结构。
图2-16总结了蛋白质的高级结构特点，图2-17为血红蛋白四级结构的模式图。
．一＄夕r«二夕口P－片层二结构域、一`_,＆«`J仓蛋白质亚单位（单体）蛋白质分子（二聚体）
二级结构三级结构四级结构
蛋白质折叠成稳定的三维结构即构象的过程已在实验室中得到较深入的研究。
某些溶剂，如尿素可以破坏折叠蛋白中的非共价键，使蛋白质去折叠成失去自然构象的松散肤链，这个过程称为蛋白质的变性。
这种变性是可逆的，当去掉尿素、并加入适量的还原剂如B－琉基乙醇时，变性的蛋白质重新折叠并恢复为原来的构象，该过程谓之复性。
目前蛋白质的这种折叠与去折叠的可塑性已被广泛用于基因工程过程中表达蛋白的提取与提取后的复性，3.蛋白质的结构与功能的关系蛋白质的功能取决于其结构（或构象），可以说有什么样的结构就有什么样的功能。
一级结构是蛋白1nm血红素质功能的基础，如果氨基酸的排列顺序发生变化，将会形成异常的蛋白图2-17血红蛋白的四级结构质分子。
例如，在人体的血红蛋白中，其B链上的第六位谷氨酸如果被第二章细胞的概念与分子基础绷镁酸替代，则形成异常血红蛋白，导致入体锦刀形红细胞贫血。
一些常见蛋白如TGF书（肿瘤转化生长因子）仅在聚合成蛋白二聚体(d ime1)时，才能发挥功能。
在生活细胞内，蛋白质亚单位也只有组装成大的适当的超分子结构，如蛋白质复合物、酶复合物、核糖体、病毒颗粒等，才能更好地完成生命活动过程。
入们通常根据多肤链的独立折叠单位，即结构域(struct ural domain)去推断某些蛋白质的功能。
组成一个结构域的氨基酸残基通常在40~350之间，最小的蛋白仅含有一个结构域，较大的蛋白则含有多个结构域，此时结构域是大分子蛋白质的结构组成单元。
一个蛋白质的不同结构域常常与不同的SH3结构域激酶结构域1功能相关，例如脊椎动物中具有信号转导功能的Src蛋白激酶含有四个结构域：起调节作用的SH2和SH3结构域，以及其他两个具有酶催化活性的结构域（图2-18）。
一般情况，具有相同结构域的蛋白，往往有类似功能，例如，具有螺旋－环－螺旋(helix-loophelix,HLH)和亮氨酸拉链(leucine zipper,L-Zip)结构特点的蛋白质多为能与DNA结合的转录因子(transcri ption factor)。
活细胞内蛋白质功能的发挥与其构象的不断改变密切相关。
常见的例子是蛋白质的磷酸化与C SH2结构域激酶结构域2去磷酸化所引起蛋白质构象的改变，即将一个磷酸基团共价连接至一个氨基酸侧链上能够引起蛋白质较重要的构象改变而改变蛋白的活性，去除磷酸基团，将使蛋白质恢复原始构象并恢复原始状态。
蛋白质磷酸化包括通过酶催化把ATP末端磷酸基O=P?
—o-
团转移到蛋白质的丝氨酸、苏氨酸或酪氨酸侧链的轻基基团上，该反应由蛋白激酶催化，而其逆反应的去磷酸化
则由蛋白质磷酸酶完成（图2-19)。
细胞内包含数百种不同的蛋白激酶，每一种蛋白激酶负责不同蛋白质或不同
系列蛋白质的磷酸化；同时细胞内还有许多高度特异性的磷酸酶，它们负责从一个或几个蛋白质中去除磷酸基团。
对许多种蛋白质而言，磷酸基团总是不断重复地被加到一特定的侧链上，然后被移去，从而使蛋白质的构象不断改变，这是真核细胞完成信息传递过程的分子基础之一。
关激酶此外，磷酸基团的丢失还可驱动一类胞内重要蛋-磷酸酶-白－-GTP结合蛋白构象的巨大变化。
这类蛋白的活化—--受控于其与三磷酸鸟昔(GTP)或二磷酸鸟昔(GDP)的结激酶开：：-一－一·、关合：当蛋白质与GTP结合时呈现活性构象，而其与G DP结B磷酸酶合时则变成一种非活性构象。
如同蛋白质的磷酸化作用，—--该过程也是可逆的（图2-20)。
这些GTP结合蛋白的活化图2-19蛋白质的磷酸化与去磷酸左右其功能的发挥与去活化起分子开关的作用，在真核细胞生命活动的信息A.蛋白质磷酸化与去磷酸化反应；B蛋传递过程中起重要作用。
白激酶催化蛋白质磷酸化，可以提高也可4.酶是一类特殊类型的蛋白质酶(en zy m e)是由生以降低蛋白质活性，这取决于磷酸化的位物体细胞产生的具有催化剂作用的蛋白质。
机体内的许罚和蛋白质的结构多代谢反应乃至信息传递过程均是在酶催化下完成的。
第一篇细胞生物学概论
衬上
GTP水解
活性形式无活性形式
GTP结合蛋白形成分子开关
无活性形式
工快
活性形式
酶具有很高的催化效率，比一般催化剂高106~1010倍，和一般催化剂一样，酶只能加快反应速度，其本身在反应前后没有结构和性质上的改变。
酶具有高度的专一性，即一种酶只能催化一种或一类反应C由千大部分酶具有蛋白质四级结构特点，因此，酶具有高度不稳定性，很容易受机体内各种因素影响。
酶催化的特异性和高效性是由酶分子中某些氨基酸残基的侧链基团所决定的，这些氨基酸残基在酶蛋白的多肤链中处千不同部位，但通过多肤链折叠可使这些氨基酸残基彼此接近形成特定的区域，以识别和催化底物，这就是所谓酶的活性中心。
有些酶除了具有活性中心之外，还有一个可结合变构剂的变构位点这类酶称为变构酶。
一些物质通过与变构位点结合，调节酶蛋白构象，从而达到对酶活性的调节作用。
（三）多糖存在千细胞的膜结构表面和细胞间的间质中糖在细胞中占有很大比例，细胞中的糖除了以单糖的形式存在之外，还广泛分布着多糖和寡糖。
线形大分子和分支的大分子糖类可以由简单而重复的单元组成，短链称为寡糖，长链称为多糖。
例如，糖原是一种多糖，它完全由葡萄糖连接在一起形成。
但细胞中大部分的寡糖和多糖的序列是非重复的，由许多不同的单糖分子组成，这类复杂的寡糖或多糖通常与蛋白质或脂质连接在一起，形成细胞表面的一部分，例如，正是这些寡糖确定了一个特定的血型。
因此，细胞中寡糖或多糖存在的主要形式有糖蛋白、蛋白聚糖、糖脂和脂多糖等，这些复合产物也称为复合糖。
糖蛋白(glycoproteins)是共价结合糖的蛋白质，其中的糖链和肤链的连接是有规律的，常见的连接方式是N－糖肤键和O－糖肤键(carbohydrate-peptide linkage)。
N－糖肤键是指糖碳原子上的轻基与组成肤链的天冬酰胺残基上的酰胺基之间脱水而形成的糖昔键；O－糖肤键则是糖碳原子上的胫基与组成肤链的氨基酸残基上的轻基脱水而形成的，具有这种性质的氨基酸有丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸、经赖氨酸和胫脯氨酸等。
糖脂(glycolipids)是含有糖类的脂质。
根据组成不同，可把糖脂分为4类，即鞘糖脂、甘油糖脂、磷酸多粘醇衍生糖脂和类固醇衍生糖脂。
哺乳动物细胞中主要存在的是鞘糖脂，在鞘糖脂中含中性糖类的称为中性鞘糖脂，有些除了含有中性糖类之外，还含有唾液酸或硫酸化的单糖，其中含唾液酸的鞘糖脂又称为神经节昔脂(gangl iosides)，含磷酸化单糖的鞘糖脂则称为硫甘脂(sulfat卜d es)。
近年来在不同种类细胞的质膜上还发现了一类新的复合糖类，即糖基磷脂酰肌醇(glycosy lphos phatid ylinositol, GPI)，一些蛋白可与GPI的霖糖链结合从而铀定在质膜上。
糖蛋白、蛋白聚糖、糖脂和脂多糖等复合糖主要存在于细胞的膜结构表面和细胞间的间质中。
复合糖中糖链结构的复杂性提供了大晨的信息，糖链在构成细胞抗原、细胞识别、细胞黏附及信息传递中起重要作用。
如人类ABO血型抗原、免疫球蛋白IgG、黏附分子整联蛋白(in tegrin)等在发挥作用过程中均离不开糖链的参与。
第三节细胞的起源与进化
细胞的起源与进化是生命科学的重要研究领域，细胞起源的过程，实际上就是生命发生的过程。
目前认为，地球上所有生物的细胞都是从一个共同的祖先细胞进化而来的，最初细胞的形成经历了漫第二章细胞的概念与分子基础27长的过程，并逐渐进化为真核细胞及多细胞生物。
表2-4列出了基于目前认识而推断的细胞起源与进化的时间表。
年代（距今）发生事件
45亿年地球形成
44亿年海洋出现
38亿年生命出现（原始生命体、原始细胞形成）
35亿年蓝细菌形成（原核细胞，需氧）
15亿年真核细胞形成
12亿年多细胞生物形成（藻类）
—、原始细胞的形成
（－）地球上原始生命的诞生
一般认为，原始生命是由原始地球上的非生命物质通过化学作用，经过漫长的自然演化过程逐步形成的。
这个过程大至可以分为四个阶段：心从无机小分子形成有机小分子物质；＠从有机小分子物质形成生物大分子物质；＠从生物大分子物质组成多分子体系；＠从多分子体系演变为原始生命。
1从无机小分子形成有机小分子物质早期的地球经过若干亿年的演变，火山喷出的气体形成原始大气，主要含有二氧化碳氮气氢气及少量的甲皖氨等，但几乎没有氧气使原始地球的大气层呈还原状态。
原始大气物质在雷电、紫外线和火山爆发等因素作用下，可能聚集成简单的有机小分子，如氨基酸、核背酸、糖和脂肪酸。
在实验室模拟原始地球的条件，如水中的氢气、甲烧和氨气的混合物在真空放电、紫外线照射等条件下，可形成包括氨基酸在内的各种有机小分子。
因此人们推断原始地球大气的还原状态揭示了生命起源所需的基本物质。
水是生命之源。
在原始地球，简单的有机小分子与地壳表面的水体作用，形成含有机化合物的水溶液，在某些火山活动区域有可能形成浓的溶液。
这些稀的和浓的溶液最后汇集到大的水体中。
这就是现今大家普遍接受的观点：生命起源于早期地球“温暖小水池”的“有机汤”中。
2从有机小分子物质形成生物大分子物质一般认为，在原始地球上形成的有机小分子被雨水冲刷到原始海洋，经过长期的进化和选择，逐渐聚合成生物大分子：核昔酸与核昔酸之间能够通过磷酸二酷键相连接，并逐步形成线性多核昔酸；氨基酸和氨基酸之间能够通过肤键相连接，并逐步形成多肤。
美国科学家福克斯(F.
Fox)等人曾进行合成生命大分子的模拟实验。
将各种氨基酸混合，置于130-180屯下加热一个小时，或加入多磷酸后60气温育较长时间，能产生具有肤键结构的类蛋白物质。
同时，还证明多核昔酸也能按这种方式生成。
以上实验，说明了有机化合物和生命大分子可以在化学合成过程中实现。
3.从生物大分子物质组成多分子体系生物大分子本身并不能独立表现生命现象，只有当它们形成了多分子体系时，才有可能演化成为原始生命。
在早期地球的原始海洋中，由有机小分子聚合而来的生物大分子进一步形成由许多多肤分子及多肤－核酸组成的大分子，包含脂质分子在内于水溶液中，形成所谓的“团聚体”或“微球体”，漂浮在原始海洋中，构成独立的多分子体系。
4从多分子体系演变为原始生命多分子体系表面可能产生和存在催化功能，能够促进各类单体的聚合，并促使产生更高级的原始蛋白和核酸，经过长期的进化过程，核酸－蛋白质微滴能够从无生命的海洋中摄取化学分子和能量，体积逐渐增大到足以分裂出与“亲代“微滴相似的“子代“微滴，并利用有利的性状组合，继续增长和分裂。
当出现具有原始新陈代谢和遗传特征（自复制）时，就标志着原始的生命的产生。
第一篇细胞生物学概论
.--·-一----------------------------------------·-·-...-一一一经典实验：Miller模拟实验·------一一----------－－---．．----一一---------·-－－－－－－－－－--…,背景知识生命起原是一个极其复杂而又难以研究的问题U为了解释生命起原的原因，科学家进行了许多探索和实验，形成了各种各样的生命起庥学说。
虽然19世纪70年代恩格斯在《反杜林论》中就指出：“生命的起原必然是通过化学的途径实现的”;20世纪20年代奥巴林(A.
I. Opari n)和霍尔丹(J.
B. S.
Haldane)相继提出生命起原的化学进化观点，认为最初的生命是在地球温度下降以后，在极其漫长的时间内，在原始地球的条件下，元机物转变为有机物，有机物发展为生物大分子和多分子体系，直到演变出原始的生命体；但这些都只是理论的推剧，还缺乏令人信服的实验证据。
为了验证上述理论，1953年美国芝加哥大学研究生未勒(S.
L. Miller)在其导师尤利(H.
C. Urey)指导下，首次在实验室内模拟原始地球还原性大气中的的雷鸣闪电，结果从无机物合成出有机物（特别是多种组成蛋白质的氨基酸），这是生命起源研究的一次重大突破，称之为米勒模拟实验(M iller's simulated experim en t)。
实验内谷实验装置如图2-21所示。
将水注入左下方的500ml烧瓶内，抽出空气。
然后打开左侧的活塞，泵入CH4、NH3和凡的混
合气体（模拟还原性大气）。
再将烧瓶内的水煮沸，使水蒸气驱动混合气体在玻璃管内不断循环，进入右上方的烧瓶（带有电极）中，并在其中连续图2-21有机分子的自发形成进行火花放电（模拟雷鸣闪电）一周，再经冷凝器冷却后，产生的物质沉积在管道中（模拟原始大气中生成的有机物被币水冲淋到原始海洋），然后进行取样分析。
此实验结果得到的20种小分子有机化合物中，包含11种氨基酸，其中有4种氨基酸（甘氨酸、丙氨酸、天门冬氨酸和谷氨酸）是天然蛋白质中所含有的。
发表论文
Stan ley L.
Miller.
A production of amino acids under possible prim山ve eruth cond山ons.
Scicncc,1953,117:528-529.后续影响未勒的实验结果，引起了许多科学家的兴趣，“米勒将生命起原研究搬进实验室，开辟了生命起原研究的新途径＂。
在随后50多年中，科学家们利用类似未勒实验的条件，合成出了许多被认为与生命起原有关的有机物质。
可以说，几乎全部的生物小分子，现在都可以通过模拟原始地球的条件，在实验室内合成。
虽然科学家们证明了生命物质能从这些实验中产生出来，但这些实验室结果只解释了与生命体有联系的一些分子结构的产生，还没有彻底解释这些分子最后是怎样互相结合并进行生命活动的。
生命的起原确实是让人着迷的问题，在术勒的启发下，科学家们不断把目光投向更遥远的星球一火星、土卫六或者彗星，试图从它们的“原始汤”中寻找新的答案。
生命最本质的特征是，每一个生物体都拥有一份控制其结构和功能的“设计图”，这份“设计图”还可以一代代遗传下去。
这份“设计图”被称为“基因组＂。
基因组的起源，也即寻找最早的能维持生物个体独立生存的最小基因组是目前生命起源与进化研究的重要方向之一。
目前合成生物学领域飞速发展，美国科学家J.
C. Vente1和他的研究团队，通过化学方法人工合成第二章细胞的概念与分子基础生殖支原体(mycoplasma genitalium)DNA片段并将其“组装”成DNA链，然后将其导入受体细茵中，通过生长和分离，受体细菌产生两个细胞，一个带有人造DNA，另外一个带有天然DNA。
在后续过程中，培养皿中的抗生素将带有天然DNA的细胞杀死，只留下带有抗药标记的人造细胞不断增生。
几个小时之内，受体细菌内原有DNA的所有痕迹全部消失，人造细胞不断繁殖。
由此，世界笫一个“人造生命细胞＂诞生了。
（二）原始细胞的形成
1具有自我复制能力的多聚体的形成核昔酸与氨基酸能各自聚合形成大的多聚体。
多聚体的形成是原始细胞形成的关键步骤。
关于核昔酸与氨基酸多聚体（即核酸与蛋白质）的起源，普遍认为是首先产生了能自我复制的RNA多聚体，然后在RNA指导下合成了蛋白质。
同时，多核昔酸RNA所携带的信息也因碱基互补配对从一代传到另一代。
20世纪80年代以来具有催化能力的RNA即核酶的发现为这一观点提供了有力证据。
核酶不仅能催化核酸的剪接，而且也能催化氨基酸间肤键的形成、以及tRNA与氨基酸之间键的形成与断裂。
随着进化的演进，随机产生的某些氨基酸多聚体可能具备了某些酶的特性，它们可以作为催化剂催化RNA分子的复制，而RNA多聚体则可通过其自身核昔酸排列顺序来指导原始蛋白的合成。
因此，在生命进化过程中，原始的核酸多聚体和氨基酸多聚体是相互依存、相互作用的。
2膜的出现与原始细胞的诞生生命进化受自然界选择的影响，为了保持多核昔酸的自我复制，以及避免多核甘酸指导合成的优质蛋白质丢失，需要一个将它们包围起来的膜出现。
人们推断在生命出现前的原始液体表面，磷脂分子能自发地装配成包围RNA和蛋白质的膜结构，这种初级的形态实体经过自然选择便形成了原始细胞。
此时RNA的复制及RNA指导的蛋白质合成在一个由膜包绕的相对稳定的环境中进行。
应该指出的是，尽管上述推测的原始细胞和现存的支原体很相似，但支原体和原始细胞不同，其遗传信息储存千DNA之内，而不是在RNA内。
因此在生命进化过程中，储存遗传信息的生物大分子DNA的形成在生命体一一原始细胞形成之后，在后续的原始细胞的不断进化过程中，在蛋白质的帮助下，由RNA指导形成双螺旋DNA，以DNA方式储存的遗传信息更加稳定，而且双链形式还可提供修补的机会。
由此，一些学者认为在细胞的起源过程中，RNA起到承前启后的作用。
二、原核细胞向真核细胞的演化
原始细胞形成以后，依靠其增殖能力在进化过程中逐步获得优势，最终裂盖了地球表面。
原始细胞可能是以原始海洋表面的有机物为营养的异养型原始生物。
由于地球早期的地表大气层中没有游离氧，所以这类原始细胞只能通过厌氧呼吸获得能械。
但是，当原始海洋内的有机物随着异养消耗而减少时，只靠异养就难以生存，因而，在新的条件下，随着原始细胞形态和功能的逐渐分化，最终产生了具有质体功能的蓝藻类的原核生物，使原始生命从异养型发展为自养型。
原始细胞中出现了包圃细胞的细胞膜、储存遗传信息的DNA、指导蛋白质合成的RNA和制造蛋白质的核糖体，是原核细胞诞生的标志。
一般认为，真核细胞是由原核细胞进化而来的，原始真核细胞大约在15亿年前在地球上出现。
关千真核细胞如何从原核细胞进化而来，目前有两种假说：1分化起源说该学说认为，原核生物在长期的自然演化过程中，通过内部结构的分化和自然选择，逐步形成网膜系统、胞核系统和能量转换系统等，使其成为结构日趋精细，功能更加完善的真核细胞，最终形成真核生物。
2内共生起源说内共生学说(endosymbi ot ic hypothes is)认为，真核细胞是由原始厌氧菌的后代吞入了需氧菌逐步演化而来，进而使真核细胞能在氧气充足的地球上生存下来。
第一篇细胞生物学概沦
氧与代谢的关系在细胞进化过程中起重要作用。
原始地球的大气中不存在氧，古代原核细胞的代谢途径只能在无氧条件下进行，事实上在现存的绝大多数生物中，依然保留着进化过程中保存下来的糖的无氧分解（酵解）代谢。
当合成的原始有机物被耗尽时，那些能够利用大气中的二氧化碳和氮来合成有机物的细胞，便会在自然选择中存活下来。
这样的细胞在合成有机物如进行光合作用时，同时把氧作为代谢产物释放到大气中。
因此认为，大气中出现氧是在生物巳能进行光合作用之后的事。
随着光合作用的出现，大气中的氧含址不断增高，以致成为许多早期生物的有害物质（比如对厌氧菌）。
但通过自然选择，有些细胞可进化为能够利用氧来进行代谢反应。
随着大气中的氧不断积累，有些厌氧菌则逐渐被淘汰，而另一些厌氧菌则与需氧型细胞结合在一起营共生生活，并逐渐形成了最早的真核细胞。
人们早就推断真核细胞中线粒体的形成，是远古时期的古细菌或真核细胞吞噬真细菌的结果，但该推断无法在实验室内验证。
结合细菌和线粒体基因组的序列分析，目前认为线粒体起源千15亿年前的祖先细胞—一类似a－蛋白细菌(a-proteobacterium)的真细菌对宿主古细菌或古代真核细胞的侵袭，进入宿主内的a蛋白细菌成为内共生体(endosymbionl)，即由“入侵者“变为”被俘虏者”。
这样的真核细胞的出现，使代谢反应趋于复杂化，需要更多的膜表面来进行各种代谢反应，为此，在进化过程中为增加膜的表面积，细胞膜逐渐内陷并形成了各种各样的细胞器。
细胞核等细胞器的出现是真核细胞区别于原核细胞的主要特征。
三、单细胞生物向多细胞生物的进化
生命进化的另一个重要步骤是由单细胞进化出现了多细胞生物。
早期的真核生物均为单细胞生物，直到若干亿年后，出现了多细胞生物，然后分化成各种各样的植物和动物，最后人类从动物界分化出来。
最早的多细胞生物化石距今已有近7亿年。
多细胞生物进化的早期可能是由单细胞聚集成群体。
例如，黏细菌通常以单细胞阿米巴方式活动，以吞噬细菌为生，在遇到饥饿的情况下，单个细胞聚集起来，形成蚝瑜状的多细胞个体，并能进一步分化为基部、子包子梗、抱子痪等几个部分，以更有效地适应周围环境。
袍子毅中每个抱子在适宜条件下可发展成一个阿米巴单细胞个体。
细胞在向多细胞机体进化过程中，另一个最重要的特点是出现细胞的分化，即在多细胞的机体内，各种细胞朝不同方向发展，形成结构和功能各异的不同组织，但又互相协调成为一个有机的整体。
现存的团藻可能反映出较早出现的多细胞生物的某些特征。
团藻实际上是单个细胞经过多次分裂，后代仍聚在一团未曾分开而成的个体，但是在这团细胞中，已有一定的分工，有的细胞特化其运动功能，有的细胞特化其光合作用功能（产生能扯），有的细胞特化其有性生殖功能。
在高等脊椎动物，清楚可辨的特化细胞有200多种，这些不同特化（或分化）的细胞形成不同的组织，如上皮组织、结缔组织、肌肉组织和神经组织等，这些组织并进一步组成执行特定功能的器官和系统。
推荐读物
[I]Cooper GM, Hausman RE.
The Cell:A Molecular Approach.7th ed.
Sunderland(MA):Sinauer Associates, InC.,2013.
小结
细胞是生物体的结构和功能的基本单位。
除病毒之外，一切有机体均由细胞构成。
生物体的一第二章细胞的概念与分子基础切生理活动、生命基本特征以及生命现象都是以细胞为单位体现的。
细胞是生物进化的产物，细胞的形成经历了在原始地球条件下从无机小分子物质产生有机小分子物质；有机小分子物质自发聚合成具有自我复制能力的生物大分子；生物大分子逐渐演变为由膜包围的原始细胞；再由原始细胞演化成今天的原核细胞和真核细胞。
生物体的进化又是一个漫长而复杂的演化过程，从原核细胞到真核细胞，从单细胞生物到多细胞生物。
原核细胞与真核细胞在结构和功能上有许多相同之处，但原核细胞结构简单，主要结构特点是缺少由膜包围的核以及内膜系统和细胞骨架。
真核细胞高度进化，出现了细胞核和由膜包绕的各种细胞器。
在细胞的进化史上还有一类细胞，它们在形态结构与遗传结构装置上和原核细胞相似，但有些分子进化特征更接近真核细胞，这类细胞称之为古细菌。
细胞内的化学成分在自然界中均能找到，主要可以分为生物小分子和生物大分子两大类。
生物小分子是指无机化合物（水、无机盐等）和有机化合物（碳化合物、糖、脂肪酸、氨基酸和核芬酸）；生物大分子主要指由生物小分子组成的核酸、蛋白质和酶等。
核酸是生物的遗传物质，分为DNA和RNA。
DNA分子是由两条方向相反的多聚脱氧核菩酸链形成的双螺旋结构，携带着控制生命活动的全部遗传信息；RNA分子由一条多聚核芬酸链组成，其种类较多，可分为编码RNA(mRNA)、非编码持家RNA(rRNA、tRNA、snRNA和snoRNA)及非编码调节性RNA(miRNA、s i RNA、p iRNA和长链非编码RNA)，它们与遗传信息的表达有关；蛋白质是由氨基酸通过肤键依次缩合而成的多聚体，是遗传信息的表现形式，是细胞内重要的生物活性物质，其功能涉及细胞的一切生命活动，皮有蛋白质就没有生命；酶是具有高度催化活性的蛋白质，然而近年研究发现RNA分子也具有RNA剪切和催化功能，这样的RNA分子称为核酶。
（莫显明）
第三章细胞生物学的研究方法
细胞，特别是哺乳动物的细胞，体积微小而结构复杂，因而对细胞、细胞内部的结构、细胞组分的功能及其相互关系的了解程度主要取决千所使用的研究手段和方法。
细胞生物学的发展在很大程度上依赖于研究技术的进步与仪器设备的改进。
一种新技术或新方法的创立与应用，常常会给学科开辟一个新的领域，或带来革命性的变化。
细胞生物学研究方法很多，原理和操作步骤各不相同，但都是利用细胞及其分子的性质，以不同的方式或过程来展示细胞的生命活动。
学习研究方法的目的就是为了更好地了解和阐明细胞及其分子生命活动的特性。
本章将从细胞的形态观察、细胞的分离和培养、细胞组分的分离纯化和测定、细胞化学和细胞内分子示踪，以及功能基因组学研究技术等方面，对一些常用技术的原理、方法和应用作简要介绍，以期同学们能对细胞生物学研究方法有个概貌的了解，为今后从事生物医学研究打下基础。
第一节显微镜技术
人眼的生理结构限定了其分辨能力约为lOOµm。
典型的动物细胞直径为10~20µm，而核糖体、抗休、ATP等细胞内众多重要的复合体或分子的直径都在1~lOOnm的纳米尺度范围内。
因此，观察细胞的生命活动必须借助显微镜。
显微镜技术经历了光学显微镜技术、电子显微镜技术和纳米显微镜技术的发展阶段。
降低最小分辨间隔、呈现细胞内的精细结构，甚至实时呈现活细胞内分子间的作用过程是显微镜技术发展的直接成果。
对细胞生命活动进行探索的需求推动了显微镜技术的进步，而显微镜技术的进步也极大地推动了整个生命科学研究的发展。
—光学显微镜技术
尽管A.
Van Leeuwenhoek在17世纪70年代用他自制的显微镜看到了细菌和动物的精子细胞，但直到l9世纪初制造出具有更高分辨能力的光学显微镜时，才确认所有的动物和植物都是由细胞构成的，即细胞学说(cell doctrine)。
可以说光学显微镜与细胞生物学同步而生，不断发展，是细胞生物学必不可少的研究工具。
近年来，由千各种新型示踪分子、光学原理以及计绊机数据处理等技术的应用使得光学显微技术的作用日益重要。
(—)普通光学显微镜的分辨率
光学显微镜(l i ght mi cros(,ope)主要山聚光镜、物锐和目锐三部分组成。
衡扯显微锐成像能力的主要指标是显微镜的分辨率(reso lu tion, R)。
分辨率是指能够区分相近两点的最小距离。
能够区分的两点的距离越小，则显微镜的分辨率越高。
普通光学显微镜的横向分辨率(R,,）和纵向分辨率(R)R'-)=0.61妇．sin0,R,=2V(n·sin0)2n·sin0为镜口率，亦称数值孔径(numerical aperture, NA); n为聚光镜和物镜之间介质的折射率（空气约为1，油浸镜的镜汕为1.3-1.5);0为标本对物镜镜口张角的半角(sin0的最大值为1)；入为照明光源的波长（人眼敏感的波长为555nm，白光一般采用527nm)。
综合各种影响因素，普通光学显微镜理论上的横向分辨率为250nm，纵向分辨率为550nm。
由千第三童细胞生物学的研究方法生物样品性质和显微镜制作工艺的限制，光学显微镜实际应用中的横向分辨率约为0.
Sµm，而纵向分辨率约为lµm。
线粒体大小约为0.
Sµm，是普通光学显微镜通常能观察到的细胞内最小结构。
一殷将光镜下所见物体结构称为显微结构(microscopic structure)。
普通光学显微镜的放大系统一般由物镜和目镜组成。
物镜靠近被检物体，进行第一次放大，目镜靠近眼睛，将物镜放大后的图像再放大（图3-1)。
物体经过两次放大后，总放大倍数为两次放大倍数的乘积。
放大倍数越大并不意味着越能够看清楚更小的物体，光学显微镜的放大倍数有一个极限，可用下面的公式表示：最大放大倍数＝人眼分辨率(~100µm)=500光镜分辨率(-0.2µm)超过以上的放大倍数不会提高分辨率，属千无效放大。
多数细胞总重量的70％是无色透明的水，只有很少的内含物不透光。
因此，未经处理的细胞在普通光镜下几乎是看不见的。
使细胞成会为可见的常用方法就是用染料对细胞的不同组分进行染色(s taining)。
一些纺织用染料被发现可用千生物组织的着色，并对细胞的特殊部位具有选择性，如苏木精(hematoxylin)对负电荷分子有亲和性，能显示出细胞内核酸的分布；酸性染料如伊红(eos in)可使细胞质染色；苏丹染料(sudan dye)在脂肪中的溶解度比在乙醇中大，所以苏丹染料的乙醇饱和溶液能使脂肪着色。
尽管巳发现了许多特异性染料，但其大部分的作用机制尚不清楚。
生物组织在染色前必须固定(fixat i on)，固定使得大分子交联而保持在原有的位置上，不至于在以后的染色等处理过程中移位或丢失而物锐产生人工假象。
常用的固定方法是将组织放在固定液中，如甲酸或戊二酸溶液，这两种分子都能够与蛋白质的游离氨基酸形成共价键，从而将邻近的蛋白质分子牢固地交联在一起。
大部分的组织太厚而不能在显微镜下直接观察，固定后还斋制成沛切片(sect i o n)，然后将切片黏附在载玻片表面进行染色。
但由于固光源~定后组织仍很柔软，在切片前需用支持剂一蜡或树脂进行包埋(em图3-1光学显微镜bed)。
适用千光镜观察的切片厚度为l~10µm。
图中显示的是普通光学显（二）相差显微镜通常用千观察活细胞微镜的光路。
光线被聚光在观察样品的制作过程中，细胞成分的丢失或失真通常是难以避锐聚集于样品，物镜和目免的。
若想避开这个问题，只有不加固定、染色等程序，直接观察活细镜的组合能聚焦形成眼睛中的样品图像胞，这需要特殊的光学系统。
光的波长决定可见光的各种色彩，振幅决定光的亮度。
波长和振幅的改变能够被入眼所辨识。
光在通过活细胞时，波长和振幅几乎没有改变，但由于细胞各结构的密度不同，通过致密部分（如细胞核）的光线，速度变慢，与通过邻近部位（如细胞质）的光线之间产生相位偏差或光程差，这种差异人眼不能分辨。
相差显微镜(p hase contras t m icroscope)利用光的衍射和干涉效应把透过标本不同区域的光波的光程差变成振幅差，使活细胞内各种结构之间呈现清晰可见的明暗对比。
观察培养细胞的结构常用倒置相差显微镜，它的特点是光源和聚光镜装在载物台的上方，相差物镜在载物台的下方，可以清楚地观察到培养瓶内的贴壁或悬浮细胞。
相差显微镜的最大优点是能够观察活细胞的活动，但由千许多细胞运动缓慢，难以在短时间内完成观察，因此需要用显微电影摄影术(microcinematography)或电视录像(video recording)以一定时间间隔拍摄记录。
当影片或电视录像带以正常速度放映时，所拍摄的情节就被大大地加快了，用这种方法可以准确地记录细胞或细胞器的运动过程和速度。
（三）暗视野显微镜通过散射光成像暗视野显微镜(dark-fi eld microscope)是将光源以一定的角度倾斜照射到样品上，照射光无法进入物镜，只有从被照样品发出的散射光能进入物镜被放大，在黑暗的背景下呈现明亮的像。
暗视野显微镜主要是观察物体的轮廓，分辨不清内部的微细构造，适合于观察活细胞内的细胞核和线粒体、液体介质中的细菌和真菌等。
暗视野显微镜也可用千观察细胞的运动。
（四）荧光显微镜可以呈现强反差的彩色图像
荧光分子可以在吸收特定波长的光后，发射出更长波长的可见光，前者称为激发光(excitation light)，后者称为发射光(emission light)。
由于荧光分子可以使被检样品呈现不同的染色，因此也称荧光染料。
细胞内某些天然物质如叶绿素就是荧光分子；一些细胞成分虽然不是荧光分子，但可以用荧光分子对其进行染色或标记，这在实际当中有着广泛的应用。
比如，叮唗橙能对细胞DNA与RNA同时染色，显示不同颜色的荧光。
DNA呈绿色，RNA呈红色。
与抗体共价结合的荧光分子，可以用来特异性地检测细胞表面或固定后的细胞内特定的抗原。
与普通光学显微镜相比，荧光显微镜(fluorescence microscope)在结构上的突出特点是具有两组滤光片。
第一组滤光片在光源与标本之间，仅能通过荧光染料的激发光；第二组滤光片在标本与物镜之间，仅能通过激发出的荧光（图3-2)。
荧光显微镜观察到的像是以暗背景为映衬的，因此具有成像反差强，检测灵敏度高的特点。
此外，使用荧光显微镜观察细胞内标记了不同荧光染料的分子可以呈现彩色图像。
多种对细胞内特定离子有特异亲和性或依赖于细胞内酶的催化作用才能发出荧光的活体荧光染料，使入们可以对活细胞内分子的动态变化进行实时观察。
基千以上特点，荧光显微技术被广泛应用于细胞生物学研究。
3第二个滤光片：阻断不需要的荧光信号，使波长在520-560nm特异的绿色荧光通过2．分光镜：510nm以下的光反射，而510nm以上的光透过1第一个滤光片：仅让波长在450-490nm的蓝光通过＾｀＃＼—物锐I旷－~I样品图3-2荧光显微镜的光学系统荧光显微镜的滤镜组包括两个滤光镜(I和3)和一个分光镜（2)。
检测荧光分子荧光素的一套滤镜组如图所示。
由于放大，荧光图像的亮度与物镜的镜头孔径成比例，因此，对于这种显微镜来说，高锐头孔径的物镜特别重要（五）共聚焦激光扫描显微镜可以提供高清晰的彩色三维图像用普通光学显微镜观察标本的菏切片，无法得到三维结构的信息，且光学显微镜是全视野照明，来自焦平面前后的漫射光线参与最后成像，降低了图像的反差和分辨率。
共聚焦是指物镜和聚光镜第三章细胞生物学的研究方法互相共焦点，亦即两者同时聚焦到一个点，保证了只有从标本焦面发出的光线聚焦成像，焦面以外的漫射光不参加成像，因此能有效抑制背景噪声，提高信噪比，使图像更加清晰。
此外，由共聚焦产生的纵向分辨率的增强，使对细胞内部结构进行“光学切片”成为可能。
这是共聚焦显微镜与普通光学显微镜相比的突出优势。
共聚焦激光扫描显微镜(confocal laser scanning microscope, CLSM)以单色激光作为光源，对样品焦平面进行扫描，产生二维图像，改变焦平面即可得到一系列二维图像（图3-3)。
图像信息经计算机重建，就可得到完整的三维图像，并可从空间的任意角度观察标本的整体结构。
共聚焦针孔一一
激光
三维样品
焦点
由针孔来的光线聚集由聚光点发射出的荧光聚光点外发射出的成一点照射到样品上聚集在针孔到达检测器光不能聚集在针孔，检测器无法检测图3-3共聚焦激光扫描显微镜A激光经针孔聚于样品的一点上；B从样品点上发出的荧光聚焦千第二个共聚焦针孔上；C从样品的其他部位发出的光不能聚焦于第二个针孔处，故不能成像。
通过光束扫描样本，在焦平面上建立一个清晰的二维图像，而不受样品其他区域光线的影响CLSM多用于检测发射荧光或用荧光标记的物质，其横向和纵向分辨率一般为200nm和500nm,基本达到了光学显微镜分辨率的理论值。
由于其操作简便，可观察活细胞，在细胞生物学的研究中被广泛应用。
C LSM可以辨别细胞内许多复杂物质的三维结构，包括构成细胞骨架系统的纤维、染色体及基因的排列等。
（六）超分辨光学显微镜的分辨率达到纳米尺度
光的衍射效应，即穿过小孔径后的光会发生扩散，使光不能用来观察比其本身波长短得多的细节。
这是光学显微镜存在分辨率极限的主要原因。
l873年德国人Ern st Abbe首先阐明了衍射效应对光学显微镜分辨率影响，确定了物镜镜口率、照明光线波长与显微镜分辨率的关系。
因此，通常将由于光的衍射效应导致的光学显微镜分辨率极限称为Abbe限度(Abbe limit)。
近几年来，在应用新的光学原理（如非线性光学原理）、发光／示踪分子和信号分析技术的基础上，已经建立起了实用的能够突破Abbe限度的超分辨显微技术(super-resolution microsopy)，使光学显微镜的分辨率达到了30~50nm的纳米尺度。
超分辨显微技术主要是根据荧光分子的发光特性和物理机制，使距离衍射限度内的两个邻近荧光分子差异激发，以呈现分辨率超越Abbe限度的图像。
也就是说，超分辨显微技术利用荧光基团的物理或化学特性，使相邻的衍射限度内的分子处千不同的“开”或“关”的状态，以使彼此区分开来。
一般可将超分辨率显微技术可以分为两类：一类是集成成像技术，利用结构化光照明在空间上调制位于衍射限度内分子的荧光行为，使全部荧光分子不同时发射，以此来获得分辨率小千衍射限度的图像，如受激发射损耗(st imulated emission depletion,STED)技术、相关的可逆饱和线性荧光跃迁(reve氏i ble saturable optical linear fluorescence tran s山ons,RESOLIT)技术，以及饱和结构光照明显微技术(saturated structured illumination microscopy, SSIM)；另一类是单分子成像技术，利用光开关(photoswitching)或其他机制在不同的时点随机激活位于衍射限度内的单个分子，然后测届每一个单独荧光基团的位置，并进行三维重建，以此获得衍射限度内的图像，如随机光学重建显微技术(stochast i c optical reconstruction microscopy, STORM)、光激活定位显微技术(photoact i vated localization microscopy, PALM)和荧光光激活定位显微技术(fluorescence photoactivation localization microscopy, FPALM)。
超分辨显微技术利用可见光(380~740nm)，具有非接触、无损伤、可观测内部结构的特点。
这些特点使其可以观测活的组织或细胞，并可进行内部深层三维结构成像。
同本节后面介绍的能够达到纳米尺度的显微技术，即电子显微镜技术、扫描酵道电子显微镜技术和原子力显微镜技术相比，超分辨显微技术在细胞生物学研究中具有较明显的优势，随着其技术和设备的发展和完善，必将像普通光学显微镜一样，在生命科学研究中具有广泛应用。
二、电子显微技术
光学显微镜的分辨率受照明光源波长的限制，无法分辨小于0.2µm的微细结构。
电子的波长比光要短得多，电子显微镜(elec tron microscope, EM)用电子束做光源大大提高了显微镜的分辨率。
电子运动越快，波长就越短，以10万伏特电压加速的电子，其波长约为0.004nm。
理论上，用这样短波电子照明，显微镜的分辨率可达到0.002nm，但由于电磁透镜的相差比玻璃透镜的相差要大得多，电镜的实际分辨率不超过0.1nm。
这样的分辨率用于检查金属材料时，可以清晰看到相邻的金原子间的距离(0.2nm)。
生物样品由于标本的制备，反差及照射损伤等原因，电子显微镜的分辨率实际上仅约2nm，尽管如此，它仍是光学显微镜分辨率的100倍，可以观察到细胞膜、细胞核、线粒体、高尔基复合体、核糖体、中心粒等细胞器的微细结构。
这种在电子显微镜下观察到的细胞的结构称为亚显微结构（subm icroscop ic structure)或超微结构(ultrastructure)。
(—)透射电子显微镜用于观察细胞的超微结构
电子显微镜通常是指透射电子显微镜(transmission elec tron microscope, TEM)，它的总体设计与光学显微镜相似，但要大得多，且上下颠倒。
照明光源是释放电子的鸽丝，作为阴极位于约2m高的镜筒顶端。
电子能与空气中的分子碰撞而发生散射，故需将镜筒中的空气抽出保持高度真空状态。
由灯丝发射的电子受到其下方阳极吸引而加速，通过一个中央小孔而形成电子束，沿镜筒向下运动。
沿镜筒设置的精密线圈产生轴对称磁场从而作为电磁透镜使电子聚焦，就如同光学显微镜中光线被玻璃透镜聚焦那样（图3-4)。
标本通过一个气闸送入镜筒，置于电子束的通道上。
电子束通过标本时，根据标本各部位密度的不同，部分电子发生散射，只有剩余的电子成像，经物镜和投影镜等放大后投射到照相底片上或荧光屏上。
散射的电子不参加成像，故标本中密度大的部分成像后形成电子流蜇减少的暗区，相反，标本密度小的部位散射电子少而形成明区。
用于电镜观察的生物标本需特殊制备。
电镜标本必须置于高真空中进行观察，所以含水的活组织细胞是无法观察的。
为防止生物样品在死亡后和在脱水过程中产生结构改变，离体的生物标本要迅速加以固定。
常用戊二醋和四氧化俄双重固定，戊二醒在蛋白质分子之间形成共价键将它们交联固定，四氧化俄除了与蛋白质共价结合之外，还对多种成分特别是对脂类有良好的固定效果。
电子的穿透力很弱，镜检前必须将固定后的组织制成50~100nm，即约细胞的1/200厚度的超簿切片。
为此，要将固定和脱水的标本放入液态的单体树脂中浸透，加温使之聚合成为固体的包埋块。
在特定的超薄切片机上，用玻璃刀、钻石刀将包埋块切成超蒲切片，最后将切片置于直径3mm的金属载网上进行观察。
电镜下所见到的标本的反差，取决于组成元素的原子序数，原子序数越高，散射的电子越多，反差越大。
生物分子主要是由一些低原子序数的轻元索（氢、氧、碳、氮等）组成的，它们散射电子的能力笋三章2日胞生吻学的研穷方，去电子枪------l匕\/非常弱，在电镜下难以见到明暗反差。
为此，常常在切片前后用一些俄、铀、铅等狱金屈的盐类浸染标本进行电子染色，以增大反差。
细胞的不同成分对这些盐类有不同的亲和力，造成染色程度的不同，显示不同的反差。
例如，俄对脂质容易着色，用来观察细胞的各种膜性构造效果非常好。
高压透射电镜(h igh-voltage electron microscope, HVEM)的光源的加速电压一般在20万伏特以上。
加速屯压在so万伏特以上则称为超高压电子显微镜。
目前世界上已有加速电压在300万伏特的超高压电镜。
超高压电镜由千增加了加速电压，增强了电子的穿透能力，可以观察更厚的电镜切片。
在10万伏特下，可见到3~7µm厚切片中的细胞超微结构，加速电压为300万伏特时，可以观察到10µ,m厚切片内的超微结构。
而且加速电压越高，电子波长越短，电镜的分辨率也越高。
透射电子显微镜借助金属投影、冰冻断裂及冰冻蚀刻技术可获取三维图像。
金屈投影法(metal shadowing)把带有干燥样品的载网放在真空罩中，高温蒸发铅或跁等重金属，使金屈颗粒以一定的倾斜角度喷向样品。
这样，随着样品表面的高低起伏，重金屈形成不同厚度的薄膜，显示了投影(shadowin g)效果，给出了一个样品表面结构的三维图像。
如果喷锁的样品很小或喷锁后的金属膜淜得足以使电子束透过，则可以直接用透射电镜进行观察，比如一些蛋白、核酸类大分子，病毒颗粒及细胞壁这样的样品。
对厚样品则需在喷锁后将样品部分溶去，仅剩砌沛的样品的金屈复型(replica)，再用碳元素垂直喷锁形成一碳膜，加固复型，然后在透射电镜下观察复型。
下述冰冻断裂与冰冻蚀刻两种技术是金属复型法的最好应用事例，为细胞生物学的研究作出了重大贡献。
冰冻断裂(freeze-fracture)多用于观察细胞膜性结构的内部构造。
将样品用液态氮(-196"C）快速冷冻后，用刀切割冻结的样品组织块。
切面常常从膜脂质双层的中央疏水部通过，暴露出膜的内部构造。
将暴露出的切面用铅进行喷锁，制成复型后观察。
用此技术对蛋白质在膜内的分布悄况进行观察，方便、直观，具有划时代意义。
冰冻蚀刻(freeze-etching)与冰冻割断法一样，低温（液态氨，－269"C）下切割后，徐徐升溫，真空下使水分升华（冷冻干燥），在细胞周围的冰迅速减少下陷的同时，细胞内的游离水也减少下陷，膜和其他一些结构暴露出来，制作复型后有显著的断面浮雕效果，用于观察细胞的内部构造。
（二）扫描电子显微镜用于观察生物样品表面的立体结构用透射电镜观察超薄切片仅能反映细胞的二维结构，虽然可以通过观察大队的连续切片重建立体图像，但费时费力，步骤繁琐。
用扫描电子显微镜(scanning electron microscope, SEM)可以直接观察标本表面的三维形态。
扫描电镜比透射电镜小，结构简单。
透射电镜是电子透过标本后成像，扫描电镜是电子束照射在标本后产生二次电子成像。
样品衙经固定、干燥并用重金屈膜拟盖。
由光源发出的非常细的电子束（一次电子）在样品表面逐点逐线地扫描，产生的散射，即二次电子信号被收集、转换放大，在电视荧光屏上同步扫描成像（图3-5)。
样品产生二次电子多的部位在荧光屏上相应的点就亮，反之则暗。
由千二次电子产生的多少与电子束在标本表面的投射角有关，亦即与样品的表面起伏有关，在荧光屏上就会得到样品表面形貌的立体图像。
扫描电镜分辨率较低(3~10nm)，不及透射电镜，多用于细胞整体或组织的观察。
三］电子枪
样品
图3-5扫描电镜的工作原理在扫描电镜中，电磁线圈聚焦电子束扫描样品，产生二次电子，经检测器收集后在荧光屏成像（三）冷冻电镜用于解析生物大分子的结构在低温下使用透射电子显微镜观察样品的显微技术，被称为冷冻电子显微镜技术，简称冷冻电镜(c1Jo-electron microscopy, c1Jo-EM)。
冷冻电镜是重要的结构生物学研究方法，它与另外两种技术：X射线晶体学(X-ray crystallography)和核磁共振(nuclear magnetic resonance, NMR)一起构成了高分辨率结构生物学研究的基础，在获得生物大分子的结构并揭示其功能方面极为重要。
经过三十多年的发展，冷冻电镜技术已经产生了多种解析生物分子或细胞结构的方法。
2017年诺贝尔化学奖授予三位冷冻电镜领域的学者，表彰他们“在开发用于溶液中生物分子高分辨率结构测定的冷冻电子显微镜技术方面的贡献”。
目前备受瞩目的冷冻电镜结构解析则主要是指单颗粒三维重构技术。
该方法通过对大蜇离散分布的单个分子的电子显微像进行统计分析来解析生物大分子的三维结构。
第三章细胞生物学的研究方法
快速冷冻可以使蛋白质和所在的水溶液环境迅速从溶液态转变为玻璃态，玻璃态能使蛋白质结构保持其天然结构状态，如果以缓慢温和的方式冷冻，这个过程会形成晶体冰，生物分子的结构将被晶格力彻底损坏。
低剂量冷冻成像能够保存样品的高分辨率结构信息，确保了从电镜图形中解析蛋白质结构的可能性。
与此同时，在电镜图像处理算法方面奠定和发展了这项技术的理论基础。
冷冻电镜技术大致可以分为三个主要步骤：心样品冷冻（保持蛋白溶液态结构）；＠冷冻成像（获取二维投影图像）；＠三维重构（从二维图像通过计算得到三维密度图）。
冷冻电镜技术的特点是：不需要大量样品，不需要结晶，即可迅速解析大型蛋白复合体原子分辨率三维结构。
三、其他显微技术
从1665年R.
Hooke第一次使用显微镜观察细胞以来，显微镜的发展经历了光学显微镜时代和电子显微镜时代，目前扫描探针显微镜(scanning probe microscope, SPM)也得到了很好的开发和应用。
扫描探针显微镜实现了人们直接观察单个原子的梦想，而且还能对原子进行操控、组合，形成具有新的物理、化学、生物学特性的颗粒。
扫描隧道显微镜和原子力显微镜是扫描探针显微镜体系的主体，由于它们的分辨率和可操控的颗粒在纳米水平，因此也称作纳米显微技术。
（一）扫描隧道显微镜可直接观察到大分子的三维结构扫描隧道显微镜(scann i ng tunneling microscope, STM)是利用量子力学的隧道贯穿理论设计制造的，它使用一个直径为原子尺度的精密的探针在观察标本的表面进行扫描，探针尖不接触所研究样品的表面，与样品之间保持大约1nm的微小的间隙，在针尖和样品间施加一定电压，就会产生所谓的隧道效应，即在两者之间出现以一个根据观测表面形貌变化的隧道电流。
当探针在平行千样品表面的恒定高度移动并扫描时（恒高方式），同步记录隧道电流的变化，就可以获得所观察物体表面的原子水平的微观信息。
也可以通过反馈系统的调节，使探针尖随样品表面的变化上下移动扫描并保持恒定的隧道电流，此时记录针尖和样品表面的距离变化就可以得到表面的形貌特征（恒流方式）。
扫描隧道电镜的主要优点是有非常高的分辨率（侧分辨率为0l~02nm，纵分辨率0.001nm),而且可以在大气和液体等非真空状态下工作，避免了其他电镜采用的高能电子束对样品的辐射和热损伤作用，因此在细胞生物学、分子生物学和日益发展的纳米生物学的研究中得到非常广泛地应用。
迄今已经直接用扫描隧道显微镜观察到自然状态下DNA分子双螺旋结构中的大沟和小沟以及大肠杆菌的环状DNA的结构。
（二）原子力显微镜可对单个分子进行操控
原子力显微镜(atomic force microscope, AFM)是在扫描隧道显微镜基础之上发展起来的新型扫描探针显微镜，与扫描隧道显微镜相比，原子力显微镜的一个突出的优点是不需要所检测的样品具有导电性，它通过分析探针尖与样品之间的原子间作用力来获取所观察表面的微观信息，这对研究通常不导电的生物材料是一项非常有意义的革新。
原子力显微镜的探针被置于一个弹性系数很小的微悬臂的一端，微悬臂的另一端固定。
探针尖和被检测的样品表面轻轻的接触，针尖的原子和样品表面的原子之间的微弱的排斥力使对力的变化非常敏感的微悬臂的游离端发生弯曲，经过光学透镜准直和聚焦后投射在微悬臂背面的一束激光及其监测器能将这种微弱的曲度的变化转换为电流的变化。
通过移动样品平台使探针在被检测材料的表面逐点作快速扫描时，样品表面的微细结构特征的三维坐标数据就被转换为图像信息并准确地呈现在屏幕上。
原子力显微镜的工作范围与扫描隧道显微镜相似，可以在三态（固态、气态和液态）状况下工作，但其分辨率不及后者，目前主要用于活细胞表面及生物大分子空间伸展及其结晶体表面的观测，例如肌动蛋白聚合动力学中自组织纤维的多态性分析。
原子力显微镜可以对单个分子进行操作，通过检测操作后引发的生物化学反应来研究生物大分子和大分子复合物的功能，即进行所谓的分子手术(mo lecular surgery)。
以扫描隧道显微镜和原子力显微镜为代表的纳米显微技术实现了人们直接观察和操控原子的梦想，也使纳米技术进入到生命科学的研究中。
纳米技术与生命科学相结合，产生了21世纪最典型的交叉学科—纳米生物学。
纳米生物学的发展使人们对生物大分子复合物和细胞生理活动的认识进入到前所未有的领域。
第二节细胞的分离和培养
几乎所有高等生物（包括动物和人）的组织都是由许多种不同类型细胞组成的。
了解某一种细胞的生命活动过程，常需要大量的同一种细胞。
这就要求从组织中分离和纯化目的细胞，并能够在体外进行培养。
细胞的分离和培养是细胞生物学的基本研究技术，也是细胞生物学前沿领域（如干细胞、细胞工程等）研究和应用的实验基础。
—、不同类型细胞的分离
利用细胞的物理学和生物学特性以及实验目的的不同，可将目的细胞从实体或悬液组织中分离出来。
从实体组织中分离活细胞的第一步是将组织制备成游离的细胞悬液。
通常将组织剪成小块，然后联合或独立应用机械方法（如细切、通过筛网、用力吹打等）和酶解方法，即可得到游离细胞悬液。
酶解方法主要是用胰蛋白酶、胶原酶消除细胞间的连接和细胞外基质，用金属离子鳌合剂（如EDTA和EGTA)除去细胞黏着所依赖的钙离子。
酶解方法在操作过程中必须遴守以下基本原则：心分离体系所用的溶液必须是等渗的，要具有缓冲性的离子强度；＠分离体系应保持低温，以降低细胞的代谢活动；＠无菌操作，以备进一步用于细胞培养和分离纯化某些成分；＠所用的试剂、器皿需要高压灭菌或过滤除菌。
（一）利用细胞的物理和生物学特性可简单有效地分离和筛选细胞有些类型的细胞只有黏着在培养皿表面才能进行良好的生长和增殖；有些细胞不需黏附在培养皿表面，而只是悬浮在培养基中就可以进行良好地生长增殖，即细胞具有贴壁或悬浮生长的特性。
利用贴壁生长的特性，可以有效地将上皮、内皮、成纤维、骨骼肌等类型的细胞与血液细胞和操作过程中形成的死细胞分离；利用细胞悬浮生长的特性可以有效地分离出生长于血液、腹水或胸水等悬液组织中的细胞。
利用细胞的密度特性也可有效分离不同的细胞。
血浆白蛋白使血浆具有一定的黏稠度和密度，是一种天然的密度介质。
外周血中的白细胞密度介千血浆和红细胞之间。
2500g离心10分钟即可将外周血分成三层，白细胞层位于血浆层（上层）和红细胞层（下层）之间，从而将白细胞分离。
在离心力的作用下，细胞可沉降于与自身密度相同的密度平衡点。
因此，使用能够形成精细密度梯度的介质，如Percoll（胶体硅）等，可对密度差异较小的细胞进行精细分离。
分离细胞不一定需要复杂的设备，综合利用细胞本身的物理和生物学特性能够对某些特定类型的细胞进行有效分离。
一般来说分离细胞采用的步骤越少，越能提高细胞的存活率和分离产量，并保护细胞原本的生活状态。
此外，选择性培养和克隆化培养也是精细分离不同类型细胞的有效手段（详见第十八章细胞工程）。
（二）流式细胞术精确分选荧光标记的细胞
流式细胞仪(flow cytometer)，也称荧光激活细胞分选仪（伽orescence activated cell sorter, FACS)是从多细胞悬液中分离目的细胞的精密仪器。
流式细胞仪一般由液流系统、激光发器件、信号检测和控制系统四部分组成。
通常用氢离子激光发出的激光束为激发光，通过调节液压，迫使悬浮细胞排成单第三章细胞生物学的研究方法列，按重力方向流动，当细胞通过激光束检一喷嘴振荡器测区时，细胞被激光束照射而向各个方向发出散射光，若经荧光染色的细胞，就会发.．｀—一细胞悬液出一定强度的荧光。
仪器的检测系统可逐个对细胞的散射光和荧光强度进行测定，并将测得的光信号转变成电信号，由电子控制台放大和显示。
因此，流式细胞仪具有更广泛的用途。
在用千细胞分离上，其特点是用带有荧光的特异抗体标记待分离的细胞，然后在流式细胞仪中从未标记的细胞中分选出标记细胞。
当一个有荧光抗体标记的细胞液滴通过激光检测器时，将被带上负电，不含荧光标记的细胞被带上正电，这些带电细胞液滴通过电场时将偏习－—没有荧光的离原来流动的方向，分别收集带正、负电荷液滴带正电的细胞即可得到想要分离的细胞（图3-6)。
粒，外包一层聚苯乙烯或聚氯乙烯等高分
子材料。
在外部磁场作用下，磁性微球可
迅速从介质中分离出来，当外部磁场撤离收集不带电的液滴的烧瓶后，微球又可重悬千介质中。
由于微球的图3-6流式细胞仪原理图解外表面为聚乙烯性质的高分子材料，很容监测通过激光束的细胞的荧光。
根据细胞是否带有荧光，易包被不同类型的单克隆抗体。
因此利用含有单个细胞的液滴被带上负电或正电。
在电场的作用下将带有不同电荷的液滴分别收集于各自的细胞收集器。
注带有特定单抗的免疫磁珠与靶细胞特异结意要将细胞浓度调整到大多数液滴不含细胞并且能够流合的特点，能快速地从多细胞悬液中将目入废液缸的细胞分离出来。
在操作过程中，首先将待分离细胞与包被有特定单抗的免疫磁珠混合孵育，并将分离柱安装于磁场中，然后将磁珠－细胞混合液缓慢过柱，此时在柱外磁场的作用下，与磁珠结合的细胞被磁场吸附，未结合的细胞从柱中流出，进一步洗去未结合的细胞后，去除磁场，回收目的细胞。
免疫磁珠法操作简便，特异性强，具有很好的细胞回收率，同时磁珠颗粒对细胞无影响。
连续两次过柱分选可进一步提高分选细胞纯度，通常可达95%-99%。
（四）激光捕获显微切割技术能从组织切片中精确分离单一细胞激光捕获显微切割技术(Laser capt ure microdissection, LCM)虽然不能用千分离活细胞，但其突出优点是能够从组织切片中精确地分离单一的细胞。
其一般过程是：制备组织切片（通常是冰冻切片），在显微镜下将组织切片稷以特制的透明薄膜，用激光束切割所需的细胞区域，覆膜在激光束经过的地方被溶化，并与下面的细胞紧密连在一起，然后再用另一激光束将其弹出到细胞收集管（图37)。
分离的细胞可用于生化与基因组分析等研究。
激光捕获显微切割技术将形态学观察与分子水平研究有机结合起来，特别适用于待分离细胞在组织（切片）中的数蜇较少或呈散在分布的情况。
目前第一篇细胞生物学概论迅速发展的激光捕获显微切割技术正在与高通量的基因芯片技术结合，将在生物医学领域中得到广泛应用。
激光束切割所需部位
肿瘤组织切片
第二束激光使被切割的组织弹出到容器中
玻璃显微锐玻片
图3-7激光显微切割技术激光显微切割允许从组织切片中选择分离细胞。
这种方法使用激光束切割所需部位并将其弹出到容器中，因此即使单个细胞也可以从组织样品中分离细胞培养(cell culture)是指细胞在体外的培养技术，即无菌条件下，从机体中取出组织或细胞，模拟机体内正常生理状态下生存的基本条件，让它在培养器皿中继续生存、生长和繁殖的方法。
通过细胞培养可以获得大谥的、性状相同的细胞，以便千研究细胞的形态结构、化学组成及功能和机制。
(—)细胞培养的全过程必须在无菌的环境下进行细胞培养的全过程必须在无菌的环境下进行。
为避免环境中的微生物及其他有害物质的影响，需要特殊的无菌室。
无菌室应包括操作间和缓冲间两部分。
操作间要求有供无菌操作的超净工作台、观察培养细胞的倒置显微镜、离心细胞的小型离心机、及复苏细胞和预热培养基的水浴锅等。
培养细胞所需要的氧和二氧化碳由接有二氧化碳钢瓶的培养箱提供。
培养箱中充填二氧化碳的目的是用来缓冲和维持细胞培养基的pH，提供适宜细胞生长的酸碱度。
细胞生长的营养物质由培养基供给。
目前常用基础培养基有Eagle氏培养基、RPMl-1640、DMEM及F l2培养基等。
这些基础培养基虽然组成不尽一致，但都含有细胞所需要的氨基酸、维生素和微温元素等成分。
基础培养基只能提供细胞生长的简单营养物质，细胞实际培养时，还需要添加一些天然的生物成分，其中主要是血清。
血清含有许多生长因子，促进细胞贴壁和增殖。
不同的细胞培养需要选择不同的培养基。
（二）细胞培养的主要方式是原代与传代培养
体外培养的细胞可分为原代细胞和传代细胞。
直接从体内获取的组织或细胞进行首次培养为原代培养(primary cul ture)；当原代细胞经增殖达到一定密度后，将细胞分散，从一个培养器以一定比例移到另一个或几个容器中的扩大培养，为传代培养(secondar-y culture)。
传一次习惯上就称为一代。
用这种方法可以重复传代数周、数月以至数年。
但若反复传代，不仅会消耗大址的培养皿和培养基，而且传代次数的增加、在体外环境中的生长时间过长也会引起细胞特性的逐渐变化，特别是大部分组织来源的细胞不能在体外“永生”，因此，需要将培养的细胞及时冷冻在－196气的液氮中长期保存，待需要时将细胞复苏后再培养。
（三）来源于体内的细胞可以在体外建系多数原代培养的脊椎动物细胞，在体外经过有限次数的传代培养之后就会死亡。
来源千人和动物正常组织的细胞，在体外传代次数一般不超过50代。
例如，从胎儿中分离到的成纤维细胞可传50贫o··,，代，来源千成人肺组织的成纤维细胞只能传20余代。
通常来源千恶性肿瘤组织的细胞能够在体外无第三章细胞生物学的研究方法限繁殖、传代，称为细胞系(cell line)。
例如来源于宫颈癌组织的HeLa细胞系，于1951年建立，至今仍在世界各地的实验室应用，成为“永生“细胞。
正常组织培养的细胞在某些特殊条件下，如放射线照射、化学致癌物处理或癌基因转染等，也能形成“不死”的变异细胞，成为具有肿瘤细胞系性质的细胞。
在细胞建系过程中，无论是自肿瘤组织中分离的细胞，还是正常组织细胞经特殊诱导后产生的“不死“细胞，均需对其生物学特性加以鉴定。
还可以用细胞克隆化(cloning)的方法进一步改善细胞系的均一性，即分离出单个细胞使之增殖形成细胞群(colony)。
由此产生的细胞群称为细胞株(cell strain)，它来源于一个克隆(clone)，是一个具有相同性质或特征的培养细胞群体。
迄今世界上所建立的各种能连续传代的细胞系和细胞株达5000余种。
许多国家的研究机构均设有细胞库，随时可以供研究者使用。
产……
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…·经典实验：Hela细胞的建系－......
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[背景知识
:20世纪50年代，组织培养技术已经有近五十年的历史，嗤齿动物肿瘤细胞已在多年前由W.
Lew i s培养成功并保持着稳定的生长状态。
当时的肿瘤学家非常渴望得到能够在体外无限生长的人类肿瘤细胞。
有了这样的细胞就可以对肿瘤进行细致的可重复的观察，并可以用它为材料进行在人体无法进行的实验研究。
当时肿瘤学家相信，荻得人类的肿瘤细胞就可以找到治愈肿瘤的方法。
尽管人们为此进行了大量的尝试，人类肿瘤细胞的培养在当时还没有荻得成功。
这种状况在G.
Gey得到Henrietta Lacks的宫颈癌组织之后发生了根本转变。
实验内容1951年2月1日，已有5个幼子的黑人妇女Lacks由于绝经并有出血来到马里兰州巴尔的摩的霍普全斯医院，为其进行桧查的H.
Jones医生发现Lac ks的宫颈有一个柔软的、微紫色的肿瘤，取活组织进行病理诊断后确定为恶性。
8天后Lacks来到霍普全斯医院进行放射治疗，在治疗前她的肿瘤组织再次被取下了一些，这些组织被送到了霍普全斯医院组织培养研究负责人G.
Gey的实验室。
当时的组织培养实验室与现在迥然不同，没有超净工作台，Gey和他的合作者，他的妻子M.
Gey，只能在本生灯（类似煤气灯）火焰下的无菌区工作。
没有商品化的合成培养基和已过滤除菌的不同类型的动物血清，Gey进行组织培养前要去屠宰场从鸡心脏抽血以制备血浆，然后再去屠宰场取牛胚胎用来制备组织匀浆孜，还要去产房吸取人肵带血，用这些混合物制备成培养基来支持组织细胞的体外生长。
在Gey的妻子M.
Gey极其小心谨慎地日复一日地养护下，Lack s的肿瘤细胞开始在试管中生长，并表现出了旺盛的生命力。
这些肿瘤细胞吸附在试管壁上，消耗看浸润着它们的培养液，由它们形成的细胞层越来越厚。
肿瘤细胞的这些特性是已经进行了近20年人类细胞培养研究的Gey前所未见的。
在使用胰蛋白酶消化，进行扩大培养后，Lacks的肿瘤细胞持续性生长。
1951年10月4日Lacks辞世的那一天，Gey在电视中宣布他荻得了笫一株可在体外培养条件下持续生长的人类的肿瘤细胞细胞系，这株细胞系的名称就是Henrietta Lacks的头两个字母的组合—HeLa。
后续影响
以HeLa细胞为材料进行的实验研究为我们提供了大量的有关肿瘤细胞的基本知识，极大地提高了肿瘤生物学的研究水平。
随着组织培养技术的发展，到20世纪70和80年代，数以千计的几乎囊括人体各种组织的细胞系被相继建立起来，并得到广泛应用。
尽管如此，HeLa细胞在肿瘤和细胞生物学研究中的地位仍然无法取代，至今它仍然是世界范围内应用最广的肿瘤细胞之一。
蚧、－--------－-···-····--··--··--··---··-·一·--·------------·----.--------·---------------------------------------------（四）培养中的细胞是细胞行为研究的主要模型培养的细胞能够比较完整地保留和展示细胞生长、增殖、运动、黏着、通讯、分化、死亡等生理活动，是在体外研究细胞行为的主要模型。
例如，细胞癌变后通常伴有增殖能力、转移能力的提高，这些能力在体外培养的条件下同样可以保持下来。
将适当数目的细胞在含有软琼脂的培养基中培养，计数形成集落的个数，可以考察细胞增殖能力的变化；测定体外培养细胞线粒体唬珀酸脱氢酶活性，同样也可考察细胞增殖能力的变化；利用底层膜由细胞外基质成分构成的嵌套小室(transwell)，可以考察细胞侵袭和转移能力的变化，tran swell同样可以考察细胞彼此之间的相互作用。
第三节细胞组分的分离和纯化技术
细胞生物学研究经常涉及对细胞器或分子进行功能分析，但细胞器或功能分子总是存在千细胞内部的多种结构或混合成分之中，因此需要对细胞器和功能分子进行分级分离。
—、细胞裂解
由于细胞外膜和内膜的分隔作用，使人们不能直接获得亚细胞结构和功能分子，需要进行细胞裂解。
细胞裂解导致的渗透压变化及多种水解酶的释放，能够破坏细胞器，失活甚至降解细胞的功能分子，因此需在裂解液中加入渗透压维持剂和蛋白酶抑制剂等成分。
尽可能保护各种亚细胞结构固有的功能和细胞功能分子的活性，是细胞裂解的基本原则。
使用物理的方法裂解细胞可以避免损伤亚细胞结构，如低渗透压、超声振荡、强制通过微孔、机械破碎或研磨等。
这些方法使细胞膜及内质网膜等破裂成为断片，断片立即自我封闭形成小泡，而细胞内的各种亚细胞结构如细胞核、高尔基复合体、线粒体、溶酶体、过氧化物酶体等基本不受损伤。
常常把由内质网形成的小泡称做微粒体(microsome)。
这些膜性成分与细胞的蛋白、核酸、多糖、离子等功能性分子悬浮在细胞裂解液中，形成浓稠的匀浆(homogenate)。
去垢剂能够溶解细胞的膜性结构，并且破坏蛋白分子之间的疏水相互作用，提高蛋白的溶解性，常用于细胞裂解。
去垢剂包括离子型（如阴离子去垢剂十二烧基磺酸钠，SDS)、非离子型（如TritonX100和NP-40)和兼性离子型（如CHAPS)等几类。
离子型去垢剂对膜的溶解作用强，细胞裂解充分，但易引起蛋白质变性；非离子型去垢剂作用温和，对细胞裂解不彻底，但在适当浓度下可以选择性地抽提细胞质蛋白；非离子型和兼性离子型去垢剂不影响蛋白的等电点，常用于双向电泳样品制备中。
一般根据样品来源和实验目的的不同，单独或联合使用多种类型的去垢剂。
尿素、盐酸肌、异硫饥酸｝狐等离液剂(c haotropi c age nt)也广泛应用于细胞裂解。
但它们对蛋白和膜脂具有较强的变性作用，常用丁无需保持蛋白活性的样品制备和细胞DNA和RNA的抽提中。
二、细胞器及细胞组分的分级分离
离心方法是分离提取亚细胞结构和功能分子的重要手段。
利用细胞内各种颗粒成分的大小、形状和密度不同，采用差速离心或密度梯度离心的方法将其分离。
蛋白、核酸等细胞的功能分子存在于亚细胞结构的基质或细胞匀浆离心后形成的上清中，可利用层析技术或离心技术进一步分离纯化。
电泳技术可对分离纯化得到的终产物进行初步的鉴定。
（一）差速离心分离体积、质量差别较大的颗粒
差速离心法(differen tial centrifugation)是分离细胞核、线粒体等亚细胞结构常用的方法。
在密度均一的介压中，颗粒沉降速度与其直径成正比，颗粒越大沉降越快。
低速离心时，大的组分如细胞核和没破坏的细胞很快沉降，在离心管底部形成小的沉降团块；在较高速度时，线粒体沉降成块；在更高彸";1速度加长时间离心，可以先收集封闭小泡，然后收集核糖体（图3-8)。
低速离心
第三童细胞生物学的研究方法
由于离心沉降前，各种颗粒在介质中是均匀分布的，因而某些慢沉降颗粒被裹到快沉降颗粒的沉降块中，如此分级分离所得到的分离组分纯度不高，再次悬浮小沉降块中的组分，反复离心可去掉杂质而纯化。
应用物理的方法，在等渗缓冲液中裂解细胞，离心后获得的细胞匀浆中含有膜性结构完整的细胞器。
这些细胞器的表面分布有特异性的蛋白，如位千线粒体外...
膜参与蛋白转运的TOMM22，过氧化物酶体表面参与蛋
白转运的PM70。
利用能够识别这些标志的磁珠(mag
netic beads)，无需高速离心，即可将膜性细胞器从细胞
匀浆中方便地分离出来。
含有整个细胞、
细胞核和细胞骨架用100OOOg将细胞匀浆超速离心，可以将各种细......
上清进行中速离心胞器及微粒体沉降下来，上清部分即包含分布于细胞内..t.细胞器之间的液相成分，即细胞质溶胶(cytosol)。
细胞•..
质溶胶是细胞内蛋白质合成及其他主要生化反应的场.
所，含有RNA及大量的蛋白。
（二）速度沉降分离沉降系数不同的颗粒
..上述差速离心只能将那些大小显著不同的成分分含有线粒体、溶酶体和过氧化物酶体的沉淀开。
速度沉降(velocity sedimentation)则可进行更精细..
上清进行高速离心
含有微粒体和上清进行超速离心小泡的沉淀
含有核糖体、病毒大分子的沉淀
图3-8用离心法进行细胞成分的分级分离逐渐提高离心速度可以使细胞匀浆按成分分离。
一般来说，亚细胞成分越小，所需离心力越大。
图中所示各步离心的数值如下：低速1000g, JO分钟；中速20OOOg,20分钟；高速80OOOg,1小时；超速150OOOg,3小时的分离。
分离方法是在离心管中加入稀盐溶液，将细胞的抽提液在盐溶液上覆一薄层。
为防止对流混合，在离心管中制备由顶部到底部逐渐增加的庶糖溶液的密度梯度（通常5%～20%）。
离心后混合物中的各成分以不同的速度沉降，形成不同的沉降带，各沉降带可分别收集（图3-9A)。
不同组分的沉降速率取决于它们的大小与形状，通常用沉降系数(S)值表示。
许多细胞组分，如蛋白质和核酸的沉降系数在1-200S之间。
目前超速离心机的转速可以达到85000转／分，产生的离心力为重力的600000倍。
在这样巨大的离心力下，即使较小的生物分子，如tRNA分子和简单的酶分子都可根据它们的大小将其分开。
超速离心法可以根据生物大分子的沉降系数较精确的测定其分子量。
（三）平衡沉降分离密度不同的颗粒
另一种精密的超速离心分离方法是平衡沉降(equ ilib rium sedimentati on)法，它取决千细胞成分的浮力密度，与大小形状无关。
平衡沉降方法是在离心管中制备由顶部到底部高浓度差的庶糖或氯化绝(ces ium chl oride)溶液密度梯度，可把细胞匀浆均匀分布在庶糖或氯化艳介质中后超速离心。
匀浆中的不同组分沉降至与自身等密度处时不再移动，形成沉降带，各沉降带再分别收集（图3-9B)。
用这种方法可以将摄入与未摄入同位素13C或15N的同一种生物分子离心分开。
用氯化绝制备密度梯度，进行平衡沉降方法1957年被开发，因分离细菌中15N标记DNAA B与非标记DNA而直接证明了DNA是半保留复制，使这一实验成为历史性的实验。
稳定的（四）非细胞体系有助于确定各种细胞庶糖梯度器及其他细胞成分的功能的荒糖梯度通过对经超速离心分离得到的细胞器及其I他亚细胞成分的研究，可以确定各种细胞器及离心v细胞成分的功能。
例如，用离心纯化的线粒体和叶绿体进行实验，得知这些细胞器在能量转换中的重要作用。
同样，分离由糙面内质网或光面内质网的断片形成的封闭颗粒，将其作为快沉降成分研究糙、光面内质网功能的模型也取得了很好I的效果。
从分级分离得到的具有生物功能的细分级分离i胞抽提物称为非细胞体系(cell free system)，广泛应用于细胞生物学研究。
因为只有用这种方法，才能将某个生物过程与细胞中发生的其他高密度成分复杂的反应分割开来，从而确定其详细的分子机制。
应用这种方法所取得的早期成果是阐明了蛋白质合成机制。
首先发现，细胞粗提物可以从RNA翻译出蛋白质。
把粗提物进行分级分离，即可得到与蛋白质合成有关的核糖体、tRNA及各种酶的成分。
各种纯化的组分一旦得到后，就可以分别地采取加入或不加入进行对照，弄清楚每个组分在蛋白质合成过程中的图3-9速度沉降和平衡沉降离心的比较确切作用。
在确定了蛋白质合成过程中的各在速度沉降(A)中，亚细胞成分样品置于含有庶糖的成分的作用之后，体外非细胞体系蛋白翻译系稀溶液上层，根据其大小与形状以不同速度沉降。
为统被成功地用于破译遗传密码，即用已知序列稳定沉降带，离心管内由上至下需制作成5%~20%的合成多核昔酸仵为mRNA，在体外翻译成的连续庶糖梯度；在平衡沉降(B)中，离心形成庶糖密度梯度（用更高浓度的氯化绝分离蛋白与核酸分子效多肤。
果更好），亚细胞成分根据自身的密度或升或降，以达到与庶糖同样密度的位置三、蛋白质的分离与鉴定蛋白质是细胞内的最主要成分，它们不仅参与形成细胞的各种结构，还几乎是细胞所用功能的执行者。
因此，分离和鉴定各种目的蛋白，也是当今细胞生物学不可缺少的技术。
将蛋白质进行分级分离并最终进行纯化，常常需要综合运用多种分离手段才能够完成，包括盐析、有机溶剂沉淀、各种常规层析、高压液相层析(high performanc e liquid chr omatography, HPLC)等。
要根据目的蛋白质在组织或细胞中的含量，蛋白质分子量的大小，蛋白质的理化性质及检测方法来摸索、选择合适的途径。
(—)用层析的方法纯化蛋白质分离纯化细胞中某种特定的蛋白质最常用的方法是柱层析(column c h romatography)。
可以将细胞匀浆或经过盐析、有机溶剂沉淀等处理的样品在常压或高压下，通过用固体性颗粒充填形成的柱，不同的蛋白质因与颗粒相互作用的不同而被不同程度地滞留。
当它们从柱的底部流出时，可被分别收集（图3-10)。
彸妇，根据所选择的充填颗粒的不同，常用的柱层析可以分为：心离子交换层析，充填颗粒带有正电或第三章细胞生物学的研究方法时间分别收集流出的已被分开分子图3-10柱层析法分离蛋白质将含有多种成分的样品添加到充满浸没于溶剂的固体基质的圆形玻璃株或塑料株的顶部，随后，大址溶剂缓慢流过柱子，将底部流出的液体分别收集于不同试管。
由于不同样品成分在柱中的移动速率不同，因此可以分离后收集千不同的试管负电，蛋白质按其表面电荷的分布而被分离（图3-llA)；＠凝胶过滤层析，充填颗粒为多孔性的凝胶颗粒，根据蛋白质的大小将其分离（图3-1lB)；＠疏水性层析，将疏水性基团共价结合在充填颗粒上，不同蛋白质表面疏水区域会有强弱的差异，流出柱的速度也不同；＠亲和层析，把能够与蛋白质表面的特定部位进行特异性结合的分子共价连接于惰性多糖类颗粒上，如酶的底物、特异性抗体或抗原（图3-ll C)，根据蛋白质亲和性的不同将其分离。
亲和层析分离纯化重组蛋白为最常用的方法。
值得强调的是，由于蛋白质的结构、理化性质的复杂多样性，除了带有特殊标签的人工表达蛋白质以外，很难找到针对某种特定蛋白质的特异性亲和层析法。
因此，大部分蛋白质的分离纯化需要多种方法，包括多种柱层析法的组合，才能够达到目的。
普通柱层析法由于充填颗粒的不均匀等因素，使通过柱的液相流量不均，导致分离能力下降。
高压液相层析是将直径在3~l0µm之间的微小球型树脂（通常为硅胶树脂）用特殊的装置均匀充填在层析柱中。
由于颗粒小充填紧密，必须加高压才能使液相流过。
高压液相层析所用层析柱多为不锈钢柱，分离时间短、效率高，可用来分析各种大小分子，但所需仪器精密，造价高。
各种层析方法包括高压液相层析，多可以维持蛋白质不发生变性，保待蛋白原有的功能。
但高压液相层析的反向层析柱常常被用来分离小分子蛋白、用酶或化学试剂切断的蛋白质的多肤混合物，根据多肤亲疏水性特点，流动相采用梯度有机溶剂。
（二）用电泳的方法分析、鉴定蛋白质
由于氨基酸带有正电荷或负电荷，蛋白质往往带有净正电荷或净负电荷。
将含有蛋白质的溶液加上电场，蛋白质分子就会按照它们的净电荷多少、大小及形状的不同在电场中移动，这一技术称为电泳(elecu·op h oresis)。
最初，用淀粉等多孔性基质为支持体，分离水溶液中的蛋白质混合液。
但后来，丙烯酰胺逐渐成为最常用的支待体。
1. SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳依据分子量的不同分离蛋白质20世纪60年代中期，利用阴离子表面活性剂十二烧基硫酸钠(sodium dodecyl sulfate, SDS)进行改良的聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS polyo-.
多孔粒子
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佥I.干－.．
A．离子交换层析
B．凝胶过滤层析
溶剂流动
吆士上勺口
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物的粒子
c．亲和性层析
图3-11三种常用的层析法工作原理在离子交换层析(A)中，不可溶的基质上的荷电离子阻滞带有相反电荷分子的移动。
可溶性分子与基质结合的强度取决于各自的离子强度与溶液的pH；在凝胶过滤层析(B)中，基质是惰性的多孔粒子，能够进入基质的小分子因旅程长而溶出延迟。
根据多孔粒子孔径的大小可以分离分子噩500-5xl06的分子；亲和性层析(C)中特异配体，如抗体、酶底物等，被共价连接在基质上以结合特定蛋白。
当被固定的底物与酶分子特异结合后，酶分子可以被高浓度的游离底物重新溶出。
而与固定抗体结合的蛋白，可以用高盐溶液或高、低pH溶液使抗原－抗体复合物分离而使抗原蛋白溶出。
仅通过一个亲和层析柱，常可以得到高纯化蛋白ac1-ylamid gel electrophoresis, SDS-PAGE)，成为常规的蛋白质分析方法。
使单体丙烯酰胺交联聚合成聚丙烯酰胺凝胶作为蛋白质在其中移动的支持体，根据需要控制凝胶孔的大小。
先将待分离的蛋白质样品置于SDS溶液中，SDS的疏水端与蛋白质的疏水区结合，其带负电荷的亲水端互相排斥，使折叠的蛋白质分子展开成为伸展的多肤链（图3-12)。
此外，常常加入2－琉基乙醇(2-mercaptoethanol,2ME)或二硫苏糖醇(dithiothreitol,DIT)类的还原剂，使蛋白质中所有的S-S结合键断裂。
SDS加还原剂的处理使蛋白质分子失去与其他蛋白质或脂质成分的联系而游离地溶解于溶液当中，也使蛋白质自身的亚单位之间的连接分开。
由于所有蛋白质都带有大量的负电荷，蛋白质自身原有的电荷可以忽视，电场中所有蛋白质都向正极迁移，其中小分子比大分子通过凝胶网孔要容易得多，因而迁移快。
结果复杂的蛋白质混合物完全按分子量大小依次被分离，经蛋白质染色后，可以观察到整齐排列的条带（图3-12)。
2.等电聚焦电泳依据等电点不同分离蛋白质蛋白质是否带电荷，是带正电荷还是带负电荷，是由溶液的pH决定的。
当溶液在某一pH条件下使某一蛋白质不带电荷时，这个pH就是这种蛋白质的等电点(i soelectric point)。
所有的蛋白质都有自己特定的等电点，由于不带电荷，在电场中就不会移动。
等电聚焦电泳(isoelectric focusing)是在丙烯酰胺凝胶两端形成电场，使含有不同等电点的两性电解质(ampholyte)在电场当中形成pH梯度，样品中所有的蛋白质在电泳时都向自己的等电点处第＝章细胞生物学的研究方法A B平板丙烯酰胺凝胶。
图3-12sos－聚丙烯酰胺凝胶电泳(SOS-PAGE)A电泳装置；B单个多肤链与荷负电的SDS分子形成复合物，因此，荷负电的SDS－蛋白复合物在多孔聚丙烯酰胺凝胶中向阳极移动。
在这种条件下，多肤的分子量越小，移动速度越大，因此这种技术可被用于确定多肤链和蛋白亚基的分子楹。
但是，如果蛋白质含有大批碳水化合物，那么该蛋白在凝胶中的移动速度不规范，用SOS-PAGE测得的表观分子量不准确移动，最后聚集、静止于各自的等电点。
等电聚焦电泳分离效果很好（图3-13)。
3双向电泳有更好的分离效果单一方向的蛋白质电泳，不管是SDS-PAGE还是等电聚焦，都难免有许多蛋白质由于分子量或等电点的相近或相同而导致相互重叠。
把等电聚焦与SDS-PAGE结。
稳定的梯度
低pH时，++等电点(pH6.5)时，十：．＋＋二．蛋白净电荷为零蛋尸尸气产壹i fl.,.++1在电场中不再移动
+1
I.
高pH时，
蛋白带负电荷
e)图3-13等电点电泳分离蛋白质
低pH（高H＋浓度）时，蛋白质的狻基倾向千不带电荷(—COOH)，含氮碱性基团带正电荷（如：－NH3+），使大部分蛋白质净电荷为正。
高pH时，蛋白质的狻基带负电荷(—COO-），碱性基团倾向于不带电荷（如：—NH2)，使大部分蛋白质净电荷为负。
在一个蛋白质的等电点时，正负电荷平衡，所带净电荷为零。
因此，电场中管状凝胶形成一个固定pH梯度时，每种蛋白质都移动至它的等电pH，聚集成一条带第一篮细胞生物学概论合进行双向电泳能够产生十分好的分离效果。
方法是先在长条状凝胶介质中进行等电聚焦电泳，然后将凝胶条横放千聚合好的平板SDS－丙烯酰胺凝胶上再进行垂直电泳。
普通的实验室自制的凝胶进行双向电泳可以辨认千种以上不同的蛋白质，使用商业化的条状等电点疑胶及平板SDS丙烯酰胺凝胶加上相应的仪器设备，可以使分辨数量及效果大大增加。
双向电泳法在蛋白质分析技术不断进步的今天，仍然被广泛应用，特别是在初步筛选、分析正常与异常组织、细胞中蛋白质表达情况方面仍有不可替代的作用。
双向电泳显现的差异蛋白质条带或点(spot)，常常用质谱技术进行进一步鉴定。
单向或双向后的SDS-PAGE也可以进一步通过蛋白质印迹(Western blotting)技术检测特定目的蛋白质分子（见本章第五节）。
四、核酸的分离纯化与鉴定
(—)差速离心沉淀是核酸分离纯化的常用方法
DNA和RNA是细胞重要的功能分子。
无论DNA还是RNA，它们在细胞中总是与蛋白质结合，以复合物的形式存在千细胞中。
进行核酸分离纯化的过程就是使核酸与细胞内的其他组分分离，去除纯化试剂的污染，并保持核酸一级结构的完整性。
细胞中的DNA分子主要存在千细胞核和线粒体中，RNA分子在细胞核和细胞质中广泛存在。
细胞核中的染色体DNA是长的线性分子，相对稳定，纯化过程中产生的机械剪切力即可使其断裂。
线粒体DNA是环形分子，一般需以线粒体为起始材料，才能获得高纯度的线粒体DNA。
RNA分子较不稳定，且RNA酶广泛存在，防止降解是RNA分子纯化过程中的主要注意事项。
核酸的高负电荷磷酸骨架使其比蛋白、脂类、多糖等细胞内其他组分具有更高的亲水性，可通过选择性沉淀和差速离心使核酸与它们分离。
在纯化过程中一般加入对应的核酸酶，而选择性地保留DNA或RNA分子。
异硫氝酸胀等离液剂可使膜脂、蛋白变性，释放出细胞内的核酸分子，是核酸抽提液的主要成分。
纯化过程中加入氯仿，可去除细胞内的脂类，并使更多的蛋白变性，易于核酸分离纯化。
同RNA相比，DNA分子量高，易千集聚。
在细胞裂解后进行高速离心，RNA分子能够保留在上层水相中，使RNA与DNA分离。
蛋白酶K能够水解细胞内的蛋白和膜蛋白，能使DNA酶和RNA酶失活，也具有裂解细胞的作用，并且蛋白酶k不易失活，在65°C仍能保持活性，常添加在DNA的抽提液中。
通过离心沉淀的方式可获得保留在水相中的核酸分子。
钠离子可中和磷酸骨架的负电荷，在酸性条件下可促进DNA的疏水复性，加入乙醇后，低温孵育，可有效沉淀DNA分子。
异丙醇可降低水溶液的极性，一般用来沉淀RNA分子。
另外，硅胶膜可有效地吸附溶液中的核酸分子，巳广泛地应用到了全自动核酸纯化技术中，适应了后基因组时代大样本核酸分析的需求。
（二）凝胶电泳是核酸分离鉴定的主要方法
经离心沉淀分离纯化的核酸(DNA和RNA)分子，通过凝胶电泳可直接判定核酸的纯度、完整性及片段大小。
核酸电泳常用的支持体为琼脂糖(agai·ose)与丙烯酰胺(ac1-ylamide)。
与蛋白质电泳相比，核酸电泳更简单。
因为核酸分子中的每个单核昔酸都带有一个负电荷，在碱性条件下向阳极移动，故可以按照其构成碱基数的多少被有效地分离。
琼脂糖凝胶电泳操作简单，电泳速度快，样品不需事先处理就可直接进行电泳，结果观察方便。
但琼脂糖凝胶电泳分辨率相对较低，不适合分离100碱基以下的核酸分子。
可根据待测核酸分子的大小调节琼脂糖浓度。
丙烯酰胺凝胶电泳分辨率高，一般多用于500碱基以下的DNA分子片段的分离与测序，可以将两条仅相差一个碱基的DNA片段分开。
建立在琼脂糖凝胶电泳基础之上的印记杂交技术，如Southern印迹杂交(Southern blot)和;1Northern印迹杂交(Northern blot)技术，是分子细胞生物学研究的常用方法（见本章第五节）。
第三章细胞生物学的研究方法
第四节细胞化学和细胞内分子示踪技术
形态与功能相结合是细胞生物学研究的突出特点，显示细胞内大分子、小分子甚至是无机离子在细胞内分布的分子示踪技术对细胞生物学的研究尤为重要。
目前实验室普遍应用的细胞内分子示踪技术是基千光镜和电镜的细胞化学技术。
细胞化学技术(cytochemistry techniq u e)是一类将细胞形态观察和组分分析相结合的分析方法，是在保持组织原有结构的情况下利用生物大分子、小分子、无机离子的物理、化学特性来研究它们在细胞内的分布、数量及动态变化，包括酶细胞化学技术、免疫细胞化学技术、原位杂交技术、放射自显影技术等。
随着检测分析仪器的进步和以荧光染料为代表的活体染料的广泛使用，细胞内的分子示踪技术已经能够对活细胞内的分子进行实时的动态观察。
一、酶细胞化学技术
酶是细胞绝大多数生命活动过程的最终执行分子，细胞内各种酶的分布和活性变化，如蛋白激酶、蛋白酶、过氧化物酶等，反映了细胞的生理状态和病理状态的变化。
酶细胞化学技术(Enzyme cytoc h e mis t1y)就是通过酶对特异底物的反应并显色来检测酶在器官、组织和细胞内的分布及酶活性强弱的一种技术。
酶细胞化学反应的基本原理是将酶与其底物共同孵育，然后使产物与显色剂反应生成荧光分子、有色可溶性化合物、有色沉淀或高电子密度沉淀，最后通过光度计、光镜、电镜等进行检测和观察。
二、免疫细胞化学技术
抗体对抗原的严格特异性使之成为细胞生物学的一种有力工具。
免疫细胞化学技术(immunocytochem istry, ICC)是利用免疫学中抗原抗体特异性结合的原理来定性和定位研究器官、组织和细胞中的生物活性大分子的技术。
用荧光染料标记的抗体，在荧光显微镜下，可以对细胞中的特殊分子进行定位。
将电子密度高的胶体金标记抗体，则可在电镜下高分辨观察特定分子的分布情况。
为了提高检测其灵敏度，可以将荧光物质或酶类标记与一级抗体结合的抗体（二级抗体），而不是标记与抗原直接反应的抗体（一级抗体）。
每个一级抗体上可以结合多个二级抗体，因此进行荧光检测或酶与底物的显色反应，可大大增加信号的强度。
三、放射自显影技术
天然存在的元素，大多是同位素的混合物。
同位素间尽管核重品不同，但核外电子数相同，化学性质也相同。
放射性同位素(radioi sotope)的核不稳定，随机衰变成为另一种原子的同时，释放出B或丫射线。
放射性同位素很少天然存在，需在原子炉中用高能粒子轰击原子产生。
生物学研究中常用的放射性同位素有32p、Ill I、35S、'4c、“Ca、3H等。
放射线可以用几种不同方法检测。
如果是B粒子可以用盖革计数器或液体闪烁计数器定量计数。
常常用这种方法对生物样品中放射性同位素标记的某种分子进行定性或定量检测。
放射性自显影技术(autoradi ography)是用放射性同位素标记生物样品中的大分子或其前体物质，然后通过乳胶感光（卤化银还原成为银原子），显示出被标记物在组织和细胞内的位置、数址及其变化。
在放射性同位素实验中常用的“S、'4c、3H是弱放射性同位素，32p是强放射性同位素。
实验中常切H亮氨酸和35S蛋氨酸标记蛋白质，用3且岩藻糖和3H－甘露醇标记糖类，3H－胸腺瞪唗脱氧核昔、3H－胸昔或3且尿甘标记核酸。
放射性自显影技术的具体操作步骤是：首先，用注射、掺入、脉冲标记等方法将放射性化合物渗入活细胞，培养不同时间后取样固定，制备光、电镜切片；在暗盒中把感光乳胶裂盖在切片上存放数日。
由千放射性同位素衰变使乳胶感光（自显影过程），经过显影和定影，根据银盐颗粒所在位置即可知道细胞中放射性物质的分布情况。
例如，用放射性前体3H－胸昔，3H－尿昔分嘘{t:i别脉冲渗入培养细胞，显示DNA是在细胞核中合成并保留在核内，而RNA最初在细胞核内合成，然后很快积累于细胞质中。
放射自显影是一种很灵敏的技术，在适宜的条件下几乎能检测出放射性原子的每次衰变，在细胞生物学研究领域中曾经发挥并且还在发挥着重要的作用。
四、活细胞内分子示踪
普通的细胞化学技术虽然能反映出细胞内生物分子的存在位置及其与细胞功能的关系，但这种技术在应用过程中通常是观察固定后的细胞内的分子分布情况，与活细胞中分子的分布存在一定距离。
活细胞内的分子示踪则克服了这一缺点，近些年来被广泛应用于细胞的生理功能研究。
(—)离子探针进行细胞内离子的实时检测
细胞内离子有着重要的生理功能，它们有的是信号转导的信使（如钙离子），有的是酶催化所必需的（如钠、钾、钙、镁、铜、铁、锌、猛等离子），有的通过离子通道跨膜转运影响膜电位（如钠、钾等离子），有的则促进膜的融合（如钙离子）。
细胞内离子的实时检测将揭示一些生理过程的机制。
一些染料专一地与某种离子结合后会产生荧光或改变本身荧光的发射波长与强度，从而通过荧光检测可以显示该离子的量。
通常称这些染料为离子探针。
如果将它们导入细胞内，就能在时间与空间上显示活细胞内某种离子的动态变化。
（二）绿色荧光蛋白常被用千显示特定蛋白质在细胞内的定位绿色荧光蛋白（驴·een fluor esce nt protein, GFP)是应用最广泛的研究蛋白质亚细胞内定位的报告分子。
GFP最初从水母中分离，含有238个氨基酸残基，是一种构象很稳定的蛋白质。
它不含辅基，也不需要辅助因子，在蓝色光源(450~490nm)的激发下，发射出绿色荧光(520nm)。
GFP基因可以很容易地导入到其他种类的细胞当中去表达。
构建绿色荧光蛋白基因与目的蛋白基因的融合基因表达载体，转染特定的细胞，可以在荧光显微镜或者是共聚焦显微镜下观察目的蛋白质在细胞内的位置及随时间变化情况。
在大部分情况下，所表达的融合蛋白的状态是由目的蛋白决定的，也就是说融合蛋白中的GFP仅仅是一个标记物，不影响另一部分目的蛋白在细胞内的真实定位（图3-14)。
通过点突变的方法研究GFP的结构与功能，发现一些突变蛋白的光吸收与荧光行为发生改变，由此开发出多种不同颜色“GFP”。
目前常用的有不同激发光与发射光谱的“GFP“包括GFP、黄色荧光蛋白(YFP)、青色荧光蛋白(CFP汃蓝色荧光蛋白(BFP)等。
此外还有相应的荧光强度较大的增强绿色荧光蛋白(EGFP)、增强黄色荧光蛋白(EYFP)、增强青色荧光蛋白(ECFP)等，其中EGFP与GFP的不同在于有F64L和S65T两个点突变。
细胞的信号传递过程、酶的失活或激活过程、受体和配体的结合等重要的分子事件都依赖于蛋白与蛋白的相互作用。
虽然GFP的融合蛋白能够提供许多信息，也可以研究几种蛋白质的细胞内共图3-14辅酶II依赖性视黄醇脱氢－还原酶选择定位，但不能给出蛋白与蛋白有直接相互作用的证性剪接体亚型(NRDRB1)在Hela细胞中的据。
此时，荧光共振能量转移就有了广泛应用。
定位（三）荧光共振能量转移可实时观察细胞内蛋图中绿色荧光显示了N－末端与GFP融合的NRDRBl在HeLa细胞内的分布，红色荧光是特异白质与蛋白质相互作用性标记的过氧化物酶体，两种颜色的荧光重叠处细胞内蛋白质发挥功能的主要方式之一是不发出黄色荧光。
该图说明NRDRBl仅有部分与过同蛋白质之间的相互作用并形成复合物，荧光共振伈3氧化物酶体重叠，从而定位到过氧化物酶体能量转移是检测蛋白质之间相互作用的新方法。
第三章细胞生物学的研究方法
荧光共振能量转移(fluorescence resonance energy transfer, FRET)是一种量子力学现象，当一个荧光供体与一个荧光受体分子彼此接近而供体的发射光谱与受体的激发光谱重叠时就会发生FRET现象，此时能量以非辐射的方式由供体转移到受体。
其直观表现是：供体荧光和受体荧光之间靠近达到合适的距离时，如果以供体的激发光激发，供体的荧光强度则比它单独存在时要低得多。
目前常用的FRET荧光染料对主要有Cy3-Cy5、Alexa546-Alexa647和Texas Red-Tetramethylrhodamine等；而供体和受体均为荧光蛋白的包括CFP-YFP、BFP-EGFP等。
细胞生物学中早期FRET的研究多以生物分子的荧光类似物或在生物大分子上以共价或非共价方式偶联上一个荧光基团作为荧光供体或受体。
在把GFP引入到基于FRET的显微映象研究后，可以实时观察细胞内蛋白与蛋白相互作用、生物大分子构象变化，极大地促进了细胞内实时反映动态分子过程的研究。
（四）单分子示踪是研究活细胞内大分子行为及功能的重要方法单分子荧光成像(single molecul釭fluorescence imaging)和原子力显微镜是活细胞体系中单分子研究的两种核心技术。
单分子荧光成像具有较高的时间分辨率，对细胞在生理活性条件下的检测比其他技术更为成熟，是目前用于活细胞中单分子研究的最重要的一种方法。
与普通荧光技术相比，单分子荧光成像技术具有样品激发范围小、光子收集效率高、采用高量子产量高信噪比荧光基团及低本底荧光的特点。
目前单分子荧光成像技术可以采用全内反式荧光显微镜(total internal reflection fluorescence microscope, TIRFM)和共焦激光扫描显微镜进行成像。
目前巳报道的活细胞单分子荧光成像在细胞生物学研究中的应用包括研究配体与受体的结合、蛋白质的聚合和解聚、蛋白、mRNA等生物大分子的动力学行为及蛋白、病毒的示踪等。
原子力显微镜能够在溶液和室温下进行操作，分辨率高，非常适合千在生理条件下显示生物分子的特异性相互作用。
实现活细胞中分子（如受体－配体）的相互作用的单分子力测量一直是原子力显微镜的应用目标，但目前存在的困难有：细胞固有弹性的影响，目标分子易于从细胞膜上拉下来，受体－配体密度过低而难形成有效的相互作用，影响测力因素过多导致结果难以解释，以及针尖易被污染等。
因此，尽管在单分子水平上的研究很多，但是真正在活细胞上实现的很少。
近几年来，在活细胞原子力测堂方面不断出现新的成果，主要集中在血液凝集、白细胞黏附等细胞黏附性质的研究上。
尽管活细胞单分子行为的研究目前仍处千起步和探索性阶段，其应用还主要限于简单的分子以及已经研究的比较成熟的简单生物学问题，但是不难看出活细胞单分子行为及实时检测研究是生命科学向微观世界深入探索的一个重要标志。
第五节细胞功能基因组学研究技术
现代细胞生物学强调在基因与蛋白质等分子水平上理解细胞的功能。
基因表达水平的变化与细胞行为的变化密切相关。
提高或降低某一基因在细胞内的表达，观察与之相应的细胞行为的变化，是确定基因功能的主要方法。
在入类基因组计划获得的理论和技术突破的推动下，细胞生物学研究已经能够在全基因组的水平考察细胞功能和特性的变化，进入了功能基因组学时代。
—、基因表达的定量分析
基因功能性产物（包括蛋白、RNA分子）含量的变化是真核细胞尤其是哺乳动物细胞基因表达调控的主要方面。
定最地确定基因表达水平的变化，是现代细胞分子生物学研究的基本要求。
(—)印迹杂交技术是定量检测基因表达变化的基本方法20世纪80年代后相继建立了能够定量检测RNA和蛋白质分子的Northern、Western印迹分析技术(Blotting）。
其基本过程都包括：电泳分离待检测分子，将待检测分子转移到可方便操作的硝酸纤维素膜或PVDF膜上，然后将带有报告基团的探针（或抗体）与膜杂交（或孵育），最后通过同位素或化学发光试剂显示目的分子的条带，通过条带的深浅可判断目的分子的含噩和分子蜇大小。
North ern印迹分析是检测组织或细胞中特异性mRNA的方法。
它以带有放射性或非放射性物质标记的单链cDNA、RNA片段或寡核昔酸为探针，检测RNA分子，不仅能够定橄检测基因表达水平(mRNA)的变化，而且能够提供基因不同转录本的转录长度信息。
对小的RNA分子，如长度约20nt的miRNA分子，Northern印迹分析也能有效地检测。
在进行检测时，首先从组织或细胞中提取总RNA或mRNA，在琼脂糖凝胶电泳之前需要对RNA样品进行变性处理，以破坏RNA分子中的局部双螺旋结构，使整个RNA分子呈单链（便千分子杂交）。
常用变性剂为甲醒或戊二酪。
Western印迹分析检测的是蛋白质分子，它是在蛋白质水平定量检测基因表达改变的主要方法，首先将经细胞裂解而获得的蛋白质样品进行SDS-PAGE分离，然后依次经过印记、抗体孵育和显示蛋白质条带等步骤。
Wes tern印迹分析以抗体分子作为检测分子，不仅能够识别细胞中不同种类的蛋白分子，而且能够识别同一种蛋白分子的不同修饰方式，如磷酸化、甲基化、泛素化等，是考察蛋白质含盎、大小和活性状态的重要方法。
印迹分析是低通量的检测技术，步骤较繁琐，花费时间长。
但印迹分析检测不需昂贵设备，结果准确，少有假象，也常被用于验证生物芯片等高通罹研究方法获得的结果。
（二）原位杂交可提供基因表达的时空信息
组织细胞中基因的表达不仅存在量的差异，而且还存在表达时间和空间的变化。
核酸原位杂交技术(in situ hybridization, ISH)是在RNA水平检测这些变化的基本方法。
原位杂交以短的单链cDNA、RNA片段或寡核背酸为探针，将探针与经过固定并提高了通透性的细胞、组织切片或胚胎进行杂交，以荧光分子或显色酶为报告基团，显示特定RNA(mRNA)分子在组织或细胞内分布，通过荧光信号或显色的强弱可以判断含量的变化。
原位杂交没有组织和细胞的裂解步骤，并通过固定的方法将RNA分子保持在组织和细胞内的原位，因此展示细胞和组织内特定基因表达的时间和空间变化。
（三）荧光实时定量PCR技术是检测基因表达变化的常规方法聚合酶链式反应(polymerase chajn reaction, PCR)能够在体外对特定DNA序列进行重复性复制（扩增）。
其反应体系包括：模板DNA、耐热的DNA聚合酶、引物、4种脱氧核昔酸(dNTP)及适当的反应缓冲液。
PCR反应一般分为变性、退火、延伸三步骤进行：首先在95"C进行DNA双链解离；然后在50~65"C之间进行引物与DNA链的互不结合，即退火；最后在72"C由耐热DNA聚合酶合成与模板互补的新的DNA链。
此三步骤重复20~30个循环即可完成扩增反应。
普通PCR反应可以对目的DNA片段进行高效地克隆，能够非常灵敏地检测目的DNA片段。
但由千PCR高效的指数扩增过程，在扩增结束后不同含量的初始模板都具有几乎相同量的终产物，因此不能对初始模板进行定盘。
荧光实时定量PCR(fluorescence real-time quantitative PCR, qPCR)技术在PCR反应体系中加入与DNA双链结合后能够发出荧光的荧光染料，或能够与靶序列结合并带有荧光报告基团的探针。
在PCR反应过程中，每次反应循环后，都会检测反应管中的荧光强度。
以反应管中荧光强度达到阔值时所需的PCR反应循环个数(Cp值），表示模板中目的片段的初始含量。
由于是在PCR反应进行过程中的检测，而不是在PCR反应结束时的终点检测，因此荧光实时定量PCR技术能够进行目的DNA片段的定量分析。
在检测组织细胞中基因表达时，首先需要将分离提取的RNA(mRNA)反转录(reverse transcription)为cDNA，然后再行荧光实时定量PCI从因之，qPCR也常称为荧光实时定量RT-PCR，是检测基因表达改变的简便方法。
二、基因表达的上调和下调技术
为确定基因的功能，常需要在细胞和个体中对基因进行方向相反的两个操作，即提高基因表达水第三章细胞生物学的研究方法平（上调）和降低基因表达水平（下调）。
与个体水平的基因操作技术相比，在细胞水平很容易对目的基因的表达水平进行控制。
熟练掌握基因的克隆技术是进行基因表达上调和下调研究的前提。
基因克隆，通常指cDNA克隆(cDNA cloning)，即将mRNA逆转录形成的cDNA或通过体外聚合酶链式反应得到的基因片段，插入到能进行自我复制的载体（通常是质粒，plasmid)，实现在受体细菌内大量扩增的过程。
克隆过程中用到的载体被称为克隆载体(clon in g vector)。
为开展基因表达的上调和下调研究，需要借助适当的限制性核酸内切酶(restriction nuclease)，从含有目的基因片段的克隆载体中酶解出目的基因DNA，转移到能够启动目的基因表达的表达载体(expression vector，通常是质粒或病毒载体）中。
（一）外源性基因在细胞中的过表达是上调基因表达的主要方式通过脂质体包裹的基因转染(transfection)或病毒介导的感染等技术（详见本书第十八章），就可以将带有外源性基因的表达载体导入动物和人类细胞。
在表达载体启动子的驱动下，外源基因将获得过表达(over-expression)，从而实现上调细胞中的目的基因表达。
（二）RNA干扰技术是下调基因表达的常用方法近年建立的RNA干扰(RNA interference, RNAi)技术可比较简便地在低等生物（如线虫）或哺乳动物细胞水平对特定基因进行降低或功能丧失的操作。
RN儿的基本原理：一定数址的外源性双链RNA(dsRNA)进入细胞后，被类似千核糖核酸酶皿的Dicer酶切割成短的21-23bp的双链小干扰RNA(small interferencing RNA, siRNA), siRNA与解旋酶和其他因子结合，形成RNA诱导沉默复合物(RNA-induced silencing complex, RISC)。
激活RISC需要一个依赖ATP的将小分子RNA解双链的过程。
激活的RISC通过碱基配对定位到同源mRNA转录本上，并在距离siRNA3'端12个碱基的位置切割mRNA。
尽管切割的确切机制尚不明了，但每个RISC都包含一个siRNA和一个不同千Dicer的RNA酶。
因此，siRNA能够以序列同源互补的mRNA为靶点，通过促使特定基因的mRNA降解来高效、特异地阻断体内特定基因表达，诱发细胞呈现出特定基因表达降低(knock down)表型。
RN儿技术操作简便，主要步骤是：首先人工化学合成或酶促合成RNA双链，然后直接通过脂质体包裹、或克隆到特殊的表达载体等技术将其转染到体外培养的哺乳动物细胞，主要用于基因功能研究。
也可以根据靶基因设计短发卡RNA(short hairpin RNA, shRNA)，克隆到表达载体。
转染后的表达载体可以表达由环拌连接的正反义互补的短干扰RNA序列，行使RN儿的作用。
另外，利用慢病毒构建的shRNA载体，与化学合成的siRNA和基于瞬时表达载体构建的shRNA相比，一方面可以扩增替代瞬时表达载体使用，另一方面，可用于感染依靠传统转染试剂难以转染的细胞系如原代细胞、悬浮细胞和处于非分裂状态的细胞，并且在感染后可以整合到受感染细胞的基因组，进行长时间的稳定表达。
（三）CRISPR/Cas9基因编辑技术
CRISPR的全称为：成簇的规律间隔的短回文重复序列(clustered regulru-ly interspaced short palindromic repeats); Cas是CRISPR连接蛋白(CRISPR associated prote in)。
CRISPR序列构成了决定切割位点特异性的非编码RNA,Cas基因编码的Cas蛋白具有核酸酶活性。
CRISPR序列转录产生两个非编码RNA分子，依靠重复序列互补形成异二聚体，再与Cas蛋白结合。
Cas蛋白能够将异二聚体RNA剪切加工成为一端为有20个碱基向导序列的成熟RNA分子(gRNA)。
这段向导序列能够特异识别基因组DNA分子的互补序列，而Cas蛋白再次利用核酸酶活性将DNA分子切断。
在向导序列的3'端，Cas识别的DNA位点还必须有一个PAM(protospacer adjacent motif)区域。
在酿脓链球菌的CRISPR系统里，紧跟于靶序列后的PAM序列是5'-NGG。
而Cas识别位点的特异性就由20个碱基的向导序列和3个碱基的PAM序列共同决定。
现在商家已经直接将异二聚体RNA构建成一个有向导序列和与Cas蛋白结合序列的融合RNA(s ingle-guide RNA, sgRNA)，从而将CRISPR/Cas系统简化成Cas蛋白和sgRNA两个组分（图3-15)。
切割后对DNA断点附近的序列进行编辑，同样是非同源末端连接修复机制和同源重组的方式进行。
目前，巳发现了三种类型的CRISPR/Cas系统，II型CRISPR/Cas系统在发挥功能时仅需要一种蛋白，即Cas9核酸酶参与。
因此，CRISPR/Cas9系统得到了广泛应用。
CRISPR/Cas9技术是近年来出现的一种革命性技术，被广泛用于基因的敲除、点突变和外源性基因的插入等。
基因组DNA
:l酶切断
lI IIlll I||l||||l|ll Il lllIlIlIlIlIll ll llI IlIlIllll IlIlIllIl IIll Il|||ll Il|IIl ll l|IIIIIIIIIIIIlIl ll lI'IIl Ill'II1TIIIIIIIIII l l l II l l I l II l l II l11|III l l l l l Il l I Il IIl l I IIIIIIIIIIIIIIIIIIIIII l l ll l l l,Il IIIIIIIII错配修复，导致基因功能消失插入的目的片段可以是基因，也可以是导致原基因功能丧失的突变序列图3-15CRISPR/Cas9技术sgRNA是由与D NA互补的向导序列和与Cas9蛋白结合的重复互补序列组成。
Cas9蛋白具有核酸酶活性。
在向导序列的3'端，Cas9识别并切割的DNA位点还必须有一个PAM区域。
特异切割后对DNA断点附近的序列进行修复，可以是非同源末端连接修复和同源重组的方式进行此外，在动物和人类细胞中过表达特定基因编码蛋白的部分功能域缺失或基因突变体，也是研究基因功能的常用方法。
三、蛋白质相互作用的研究技术
蛋白质是细胞功能的主要执行者。
在许多情况下，一个细胞功能的实现是多个蛋白质分子相互作用的结果。
细胞的生命活动，如细胞的信号转导、基因转录、蛋白转运、蛋白质修饰和降解等，都依赖于蛋白质之间的相互作用。
研究蛋白质相互作用是理解细胞生命过程的关键。
实验室中常用的蛋«?
Q1白质相互作用研究技术包括免疫沉淀、酵母双杂交等方法。
第三章细胞生物学的研究方法
（一）免疫沉淀可验证蛋白质－蛋白质相互作用
免疫沉淀(immuno-prec ipitation, IP)的主要过程是：首先用耦联在凝胶颗粒或磁珠上的目的蛋白的抗体将细胞匀浆或裂解液中的目的蛋白沉淀出来，在此过程中能够与目的蛋白发生相互作用的蛋白会被同时沉淀下来，然后用SDS-PAGE、免疫印迹或生物质谱对沉淀出来的蛋白进行鉴定。
免疫沉淀方法简便易行，是实验室最常用的方法，但是它属千体外(in vitro)实验方法，不能给出细胞内蛋白相互作用的动态结果，同时细胞内本来没有相互作用的蛋白质在破碎细胞时可能发生凝聚，因此免疫共沉淀还存在假阳性的问题。
（二）酵母双杂交用千筛选存在相互作用的蛋白质酵母双杂交(yeast two-hybridization)的基本原理是：将目的蛋白与报告基因的DNA结合结构域构建成融合蛋白［目的蛋白通常称作诱饵(bai t)］，将被筛选的蛋白与报告基因的转录激活结构域构建成融合蛋白［被筛选的蛋白通常称作俘获物(prey)］，如果目的蛋白和筛选的蛋白在酵母细胞中存在相互作用，则报告基因就会在酵母中进行表达，然后从阳性酵母菌落中分离出阳性蛋白的质粒就可以确定阳性蛋白的编码序列。
酵母双杂交能快速检测蛋白相互作用，包括相应的结构域，并找到相应的编码基因，是一种被广泛采用的，在体内(in vivo)条件下研究蛋白质相互作用的方法。
但是酵母双杂交只能说明两个蛋白质之间有相互作用的结构基础，并不表示这两个蛋白质在细胞内一定会相遇或这种相互作用在活细胞确实存在，因此酵母双杂交确定的实验结果通常需要用免疫共沉淀进行验证。
另外，酵母双杂交只是个筛选系统，并不能直接将蛋白质相互作用与特定的细胞功能联系起来。
（三）噬菌体展示可筛选存在相互作用的蛋白质
噬菌体展示(phage di splay)是一种体外筛选蛋白质与蛋白质相互作用的技术，其基本原理是：将被筛选蛋白与噬菌体的衣壳蛋白构建成融合蛋白，使被筛选蛋白在噬菌体的表面进行表达；然后将目的蛋白固定在平板或小珠上，与展示不同筛选蛋白的噬菌体文库进行孵育；孵育后洗去未结合噬菌体，然后分离特异性结合的噬菌体；分离出的噬菌体经体内扩增，再重复上述结合分离过程，使那些能展示与目的蛋白发生最特异结合的筛选蛋白的噬菌体得到逐步的富集，一般需经过三轮筛选／扩增循环，最后经过DNA测序鉴定所得噬菌体中筛选蛋白的编码基因。
与其他技术相比，噬菌体展示技术的主要优点是容易对库容最较大的文库（多样性大千109)进行筛选。
四、蛋白质与核酸相互作用的研究技术
蛋白质与核酸(DNA和RNA)的相互作用是基因表达调控的基础。
基因表达调控是细胞对外部或内部刺激发生应答的方式，可以发生在转录水平、转录后水平、翻译水平和翻译后水平。
转录水平的调控涉及基因组DNA与一系列结合蛋白的相互作用，也就是多种转录因子与多个基因转录调控区域的特异性结合；而转录后水平和翻译水平的调控涉及多种RNA结合蛋白(RNA binding protein, RBP)参与，也即多种RNA分子与多种RBP之间的特异结合，以完成RNA加工、修饰、转运、定位和降解等过程。
掌握DNA与蛋白质、RNA与蛋白质相互作用的研究方法，对深入研究基因表达调控的分子机制有重要帮助。
随着基因组学、生物信息学和测序技术的进步，我们已经可以在全基因组水平对细胞的基因表达调控进行分析。
（一）染色质免疫沉淀技术研究DNA与蛋白质相互作用染色质免疫沉淀技术(chromatin immunoprecipitation, C hIP)是一种在体内研究DNA与蛋白质相互作用的方法。
其基本过程是：在生理状态用甲醒将细胞内的DNA与蛋白质交联在一起，用适度的超声波处理将交联复合体打断成含500-IOOObp DNA的片段，然后用所要研究的目的蛋白的特异抗体沉淀交联复合体片段，只有与目的蛋白结合的DNA片段才能够被沉淀下来，最后经过去交联和DNA纯化步骤，即可以对与目的蛋白结合的DNA片段进行分析（图3-16)。
第一篇细胞生物学概论
用甲醋交联染色质中的DNA与蛋白质
收集并裂解细胞
释放出的染色质
超声振荡或酶解使染色质片段化
窃幸
44心片段化的染色质500-lOOObp
......
寄生
i用针对特定蛋白（如TFIIB)或氨基酸4妇残基修饰方式（如H3K4me3)的抗体与片段化的染色质结合{t~Ll与特定蛋白交联的DNA片段被结合在磁珠上，并被沉淀下来图3-16染色质免疫沉淀如图所示，分离得到DNA以后，通过PCR扩增并结合DNA测序即可判定与特定蛋白结合的基因序列；通过qPCR可以获得特异蛋白与DNA的结合是否有转录促进作用；通过基因芯片分析，既可获得与特定蛋白结合的基因序列，也能了解到特异蛋白与基因序列的结合是否有转录促进作用，该方法被称为染色质免疫沉淀芯片(ChIP-chip)；分离得到的DNA也可直接通过高通噩测序获得基因序列信息，该方法被称为ChIP-seq第三章细胞生物学的研究方法同研究DNA与蛋白质相互作用的其他方法相比，如电泳迁移率变动分析(electrophoretic mob山ty shift assay, EMSA)、酵母单杂交系统(yeast one-hybrid system)等，C hIP是一种体内(in vivo)研究方法，能够捕捉到发生在染色质上的基因表达调控的瞬时事件，反映细胞内基因表达调控的真实情况。
染色质免疫沉淀技术可以用千低通猛的研究，如验证某个特定的转录因子能否与某个或多个基因的启动子区域结合，或者验证某个蛋白结合的DNA区域是否是启动子区域等。
染色质免疫沉淀也可用于高通量的基因组水平的研究，如以Oct4和Nanog为目的蛋白分别对胚胎干细胞和已分化细胞进行免疫沉淀，然后应用表达谱芯片或高通量测序技术分析获得的DNA片段，可以在全基因组水平发现胚胎干细胞和已分化细胞的基因表达调控的差异和特性。
由于抗体可以区分同一蛋白的甲基化、乙酰化、磷酸化等不同的修饰状态，染色质免疫沉淀在以组蛋白修饰为主要内容的表观遗传学研究中有广泛的应用。
（二）紫外交联免疫沉淀研究RNA与RNA结合蛋白相互作用在染色质免疫沉淀的最后步骤中，如果不纯化DNA而是纯化RNA，逆转录后分析沉淀下来的RNA片段，则可以考察与特定转录因子或组蛋白结合的RNA分子，这种方法适于研究染色质中存在的功能性RNA分子。
如果考察整个细胞内与特定RNA结合蛋白(RBP)结合的RNA分子，一般用紫外交联免疫沉淀技术(ultraviolet crosslinking and immunoprecipitation, CLIP)。
CLIP的基本原理是：用254nm紫外线照射使细胞中RNA分子与RNA结合蛋白发生共价结合，以RNA结合蛋白的特异性抗体将RNA－蛋白质复合体沉淀之后，回收其中的RNA片段，经过逆转录后对RNA分子进行测序，进而发现RNA分子与RBP分子之间的相互作用关系。
应用带有限制性酶切位点和识别序列(barcode)的引物进行逆转录，可以识别出在交联碱基处被截断的cDNA的单核甘酸序列，从而使CLIP的分辨率达到单个碱基水平，即）CLIP(ind ividual nucleotide resolution CLIP)。
CLIP能够在全基因组水平揭示RNA与RNA结合蛋白相互作用，是研究RNA与蛋白相互作用的有力工具。
但在实际应用中存在一些不足，如交联效率低、难以区分结合与非结合RNA序列、254nm紫外线照射可诱发细胞DNA损伤并合成新的RBP等。
CLIP重要的改良技术之一，光活化核糖核背增强的交联免疫沉淀技术(photoactivatable ribonucleoside enhanced crosslinking and immunoprecipitation, PAR-CLIP)可克服以上不足，并能够比较准确地确定RNA分子中与RBP结合的序列（详见本章后面的推荐读物）。
CLIP通常与高通证测序技术联合应用，称为HITS-CLIP(high-throughput sequencing CLIP)或CLIP-seq。
其测序结果经过生物信息学分析，可深入揭示全基因组水平RNA结合蛋白与RNA分子的调控作用及其生物学意义，极大地促进了细胞基因表达凋控的研究。
五、生物芯片技术
生物芯片(biochip)是20世纪90年代初期发展起来的一门由生物学、微电子学、物理学、化学和计算机科学等多学科交叉融合而成的高新技术。
主要包括基因芯片和蛋白质芯片。
基因芯片(gene chip)技术是一种特殊类型的核酸杂交技术，其特点是，用于杂交的探针被固定在固相支持物（如玻璃片、硅片、硝酸纤维素膜）上，在每个支持物表面固定有大量（通常每平方厘米高于400)的特定基因片段或霖核节酸探针，这些探针有规律地排列成二维DNA阵列，故又称为DNA微阵列芯片(DNA microarray)。
基因芯片与带有荧光标记样品DNA分子按碱基配对原理进行杂交，通过检测杂交的荧光强度就可获取样品分子的数量和序列信息。
基因芯片主要技术流程是：芯片的设计与制备，靶基因的标记，芯片杂交，杂交信号检测。
芯片的制备主要是应用DNA点样仪将化学合成的寡核昔酸探针或PCR扩增的特异性基因片断点在经特殊处理的固相支持物表面。
靶基因的标记通常采用荧光标记法，即在由mRNA反转录成cDNA时，应用荧光素标记其中一种核昔酸，这样便能合成带有荧光素标记的cDNA。
例如要检测实验组和对照组中的基因表达变化，如果实验组以红色荧光素标记，则对照组要以绿色荧光素标记。
基因芯片与靶基因的杂交和一般的分子杂交过程基本相同，通常是将自等量总RNA或mRNA反转录成的经荧光素标记的实验组和对照组cDNA与一个芯片同时杂交。
荧光观察结合计算机进行，如果芯片上的荧光点为黄色，则说明该基因在实验组和对照组中均有表达，并且表达扯相同；若荧光点为红色则表明实验组中该基因高表达，荧光点为绿色表明对照组中该基因高表达。
基因芯片技术同时将大量探针固定于支持物上，可对样品中数以千计的核酸序列进行一次性的快速检测和分析，常用于组织细胞的基因表达谱测定、基因多态性与基因突变分析等方面。
在基因功能研究中，基因芯片技术常用于筛选候选基因。
蛋白质芯片(protein chip)技术是指将大量蛋白质或多肤固化于固相支持物表面，通过蛋白质—蛋白质间的相互作用（如抗原抗体反应、受体配体识别等），对样品中靶蛋白分子进行高通扯检测的一种技术。
蛋白质芯片的工作原理与基因芯片类似，也多是把荧光标记的待检样品与芯片上的蛋白质探针反应，洗脱未反应成分后检测特异的反应信号。
六、蛋白质组学技术
蛋白质组(proteome)是指在特定时空条件下某种细胞、组织或器官所含有的全部蛋白质。
与此相对应，蛋白质组学(proteomics)是以特定时空条件下某种细胞、组织或器官所含有的全部蛋白质的存在及其活动方式为研究对象的学科。
目前蛋白质组学研究技术已成为确定基因功能的有效手段，是基因组学研究进入功能基因组时代的主要标志，是功能基因组时代生命科学研究的核心内容。
其中，亚细胞器蛋白质组和器官蛋白质组研究日益成为蛋白质组学研究领域的热点。
蛋白质组学最初应用蛋白质双向电泳和质谱技术研究不同组织细胞中蛋白表达谱，是蛋白质组学研究的基本技术，在此简要介绍。
来源于细胞或亚细胞结构的蛋白质样品在双向电泳中，先在第一向的高压电场下进行等电聚焦(IEF)，然后再进行第二向的SDS－聚丙烯酰胺凝胶电泳分离。
目前等电聚焦电泳采用固相pH梯度(IPG)胶条，避免了因载体两性电解质引起的聚焦时间延长、pH梯度不稳定、阴极漂移等现象，其分辨率达已到1万多个蛋白质点，但对过千偏酸或偏碱、高分子量、微猷蛋白质、及难溶性蛋白质的分辨仍感困难。
由千双向疑胶电泳对批僵蛋白质可实现一次性分离，具有高灵敏度和高分辨率、便于计算机进行图像分析处理、可以很好地与质谱分析等鉴定方法匹配的优点，因而成为目前分离蛋白质组分的核心技术。
基于双向凝胶电泳的蛋白质组研究会产生大量数据，传统的微扯蛋白质测序、氨基酸组成分析等蛋白质鉴定方法费时、费力、不易实现高通量分析。
因此一种新的蛋白质鉴定技术——质谱法(mass spectrometry)受到了人们的重视和应用，其基本原理是样品分子离子化后，根据离子间质荷比(m/z)的差异来分离并确定样品的分子质量。
目前用千蛋白质鉴定的质谱主要有两种：电喷雾电离质谱(electrospray ionization mass spectrometry, ESI-MS)和基质辅助激光解吸／电离飞行时间质谱(matrix-assisted laser desorption ionization/time-of-flight,MALDI-TOF-MS)。
蛋白质的质谱测序通常借助串联质谱(tandem mass spectrometry, MS/MS)，即质谱联用技术，测定肤片段的序列结构。
串联质谱将每个酶解短肤经第一级质谱或色谱分离进入碰撞室，与氮气或氨气碰撞，沿着碳骨架断成不同长度的霖肤；第二级质谱测定由第一级质谱产生的寡肤的分子质量，一系列寡肤的分子质量差异对照各种氨基酸残基的分子质量，如此对号入座即可解读出肤段的氨基酸序列（图3-17)。
串联质谱在测定氨基酸序列方面具有灵敏度高、耗时短、样品不需纯化的特点。
第三章细胞生物学的研究方法
电喷雾离子化源第一质揽分析器撞击室第二质矗分析器检测器第一质盘分析器第二质盘分析器I II I II I II…—N-C-C—N-C-C-N-C-C图3-17串联质谱测定多肤氨基酸序列A串联质谱仪结构；B肤段在串联质谱中的运动过程；C.肤段断裂位点高通量测序技术堪称DNA序列分析技术发展历程的一个里程碑。
该技术可以对数百万个DNA分子进行同时测序，这使得对一个物种或个体的转录组和基因组进行细致全貌的分析成为可能，因此也将其称为深度测序(deep sequencing)或下一代测序技术(next generation sequencing, NGS)。
为便千理解和应用，在此首先介绍常规的DNA测序方法。
DNA常规测序的原理，是基于F.
Sanger建立的双脱氧链末端合成终止法。
即在以单链DNA为模板的DNA合成反应体系中，利用一定比例的4种3'－双脱氧核昔三磷酸(ddNTP)代替部分脱氧核昔三磷酸(dNTP)作为底物，一旦双脱氧核背三磷酸掺入到合成的DNA链时，由于核糖的3'位碳原子上不含轻基，无法与下一个核背酸反应形成磷酸二酷键，导致正在延伸的DNA终止。
目前最常应用的是四色荧光自动化测序技术。
用4种发出不同颜色荧光的荧光素分别标记4种ddNTP，以一定的比例与4种无标记dNTP混合，在同一反应管中用单向引物进行DNA延伸反应，带荧光素标记的某一3'－双脱氧核昔三磷酸在掺入DNA片段导致合成终止的同时，使该片段3'端标上了这种特定的荧光素。
同一反应管中大量的模板DNA经过20~30循环的单向延伸反应，最终会产生许多仅相差一个单核背酸的不同长度的单链DNA片段混合物，每个DNA片段3'末端的最后一个ddNTP，决定了该片段发出的荧光颜色。
每一管中混合存在的不同长度的单链反应产物可以通过凝胶电泳在同一个泳道有效分开。
检测器的激光束在凝胶的底部附近检测并记录通过泳道的每一条带所标记的荧光颜色，计算机阅读这四种颜色后得到并存储核酸序列。
与常规的DNA测序方法相比，高通量测序的原理是将DNA固定在芯片上，测序反应以大规模阵列形式排列，边合成边测序，不依赖千电泳，阵列上DNA合成时的单个碱基改变所发出的荧光信号被检测器捕获并转化为一个测序峰值，从而获得序列信息。
荧光信号可以由被荧光标记的dNTP产生，也可以由DNA合成时所触发的酶催化底物激发出的荧光形成。
目前应用的高通量测序技术以Roche公司的454焦磷酸测序技术、Illumina公司的Sole~a聚合酶合成测序技术和ABI公司的SOLiD连接酶测序技术为主，这些技术在测序开始时，均需要基千PCR扩增的信号放大过程。
新近发展起来的以对单分子DNA进行测序（非PCR扩增）的技术，真正达到了读取单分子荧光的能力。
高通量测序技术的实际应用价值是与其他基因组水平研究技术的联合。
例如，高通谥测序技术与转录组技术结合，可进行高通址的RNA测序，即RNA-seq。
通过对同一样品转录组的深度测序可以捕获低表达的基因，而对大盘样品同时测序可以获得样品之间的表达差异。
高通量测序技术与ChIP联合，形成ChIP-seq技术；与基因组甲基化检测技术结合，形成Methyl-seq技术；与CLIP技术结合，形成CLIP-seq技术。
联合应用RNA-seq、ChIP-seq、Methyl-seq、CLIP-seq，再应用有效的生物信息学方法，对获得的数据进行深入分析，可大大加深我们对复杂基因调控系统的网络结构和相互作用方式的认识。
高通量测序技术使得单细胞测序技术成为可能。
八、单细胞测序技术
是在单细胞水平对全基因组或转录组等进行扩增与测序的一项新技术。
其原理是将分离的单个细胞的微量全基因组DNA或转录组RNA进行扩增，获得高覆盖率的完整的基因组或转录组后进行高通量测序，用千揭示细胞群体的时空差异和细胞进化关系等。
每个细胞都是独一无二的，但我们之前的研究对象往往是细胞群体，忽略了这些细胞之间的异质性。
正因如此，单细胞基因组学和转录组学研究受到了越来越多的关注。
一个细胞里的DNA或RNA仅仅处在皮克(picograms)级的水平，这么少的量远远达不到现有测序仪的最低上样需求。
因此科学家们必须先对单细胞内的微量核酸分子进行扩增，而且必须保证尽可能少地出现技术误差，以便开展后续的测序及其他研究。
单细胞测序技术取得突破主要与下面几个方面有关：技术进步使全基因组及转录组扩增的效率大幅度提高；高通量测序技术使得测序的效率更高，成本更低；微流体技术(microfluidcs)或微孔板技术(microwell technology)以及更高精密的荧光活化细胞分选技术(fluorescence-acti vated cell sorting)等高效分离单细胞技术的不断涌现。
使用单细胞测序技术，能够解决：CD样本珍贵，能够利用的材料稀少的问题；＠揭示出每一个细胞的基因组都是独一无二的，同一样组织本中的单细胞基因组存在异质性；＠单细胞的基因组可以随着时间和空间进行随机的改变。
单细胞测序技术在医学领域里也有着广泛的应用前景，比如各种肿瘤和许多疾病的研究和诊断，孕妇胎儿的产前诊断等。
九、模式动物个体水平的基因操作技术
在细胞生物学研究中，除开展大蜇的体外(in vitro)实验研究之外，特别强调体内(in vivo)研究结果的价值。
体内研究主要在模式动物上进行。
生物医学研究中常用的模式动物有果蝇(Drosoph ila)、秀丽隐杆线虫(C.
elegans)、斑马鱼(Zebrafish)、爪蟾(Xenopus)和小鼠等。
基千模式动物个体水平的基因操作技术，特别是基因敲除(gene knock-out)技术在细胞的功能性基因研究中非常重要。
小鼠与医学的关系极为密切。
研究基因的功能，常需要在小鼠中引入一个额外的基因或对基因进行改变，来观察其效应。
进行这种基因操作的小鼠被称为转基因(transgeni c)小鼠。
目前用于制备转基因小鼠的主要方法有两种，一是把待研究的基因DNA直接注射到受精卵的细胞核中；另一是在培养的胚胎干细胞(embryonic stem cell, ES细胞）基因组中改变或者加入一个基因，随后把有基因改变的ES细胞注入胚泡，使其成为内细胞团的一部分。
后者是基因敲除的常用方法。
可以通过同源重组(h omologous recomb i nation)的方法，使导入ES细胞的外源性载体DNA插入到一个特定的预定位点。
同源重组是两个DNA分子在某相似序列的特定位点上的重组。
因此，导入的第三章细胞生物学的研究方法DNA必须包含足够的靶基因同源序列，才能保证其至少在一小部分培养的细胞基因组中的预定位点插入外源性基因。
这些带有特定基因突变或缺失的ES细胞被导入胚泡的内细胞团之后，在小鼠的后代中将产生一个携带特定基因突变或缺失的转基因小鼠（图3-18)。
一般地，通过这种方法获得的Fl代小鼠通常为嵌合体。
一旦突变基因进入生殖细胞，突变小鼠的杂合子可以通过杂交产生纯合体，当小鼠是失活基因纯合体的时候就称为基因敲除。
由此，基因敲除被定义为利用DNA同源重组原理、借助于遗传操作手段使有机体的某一特有基因完全失活。
通过观察基因敲除后动物的表型，即可明确基因的功能。
外显子L-J_＿克隆基因
抗药基因外显子打靶载体
外显子L,I…己．一月打靶载体
X勹尸显.$干X的靶基因
染色体上
突变的
染色体
三声三
嵌合鼠（生殖系中的突变基因）
图3-18基因敲出策略示意图如图所示，在外显子中插入抗药基因是便于后续过程中的筛选、鉴定CRISPR/Cas9基因编辑及相关技术的出现和发展，使得在胚胎干细胞基因组中敲除或者加入一个基因更加简易和高效。
基因改变的杂合子小鼠通过杂交可产生能存活的纯合体或纯合致死体。
胎死腹中的小鼠难以观察到表型，事实上一个基因可以在个体多种组织中甚至是不同发育时期表达。
因此，为研究基因的特定功能，需要在特定组织和（或）在发育的特定时间里敲除靶基因。
这种性质的基因敲除可通过CreloxP系统实现。
靶基因首先被插入到两个loxP序列（有34个碱基对）之间，把这个基因的转基因小鼠与另一个品系的携带Cre重组酶的转基因小鼠交配，loxP序列被Cre识别，2个loxP位点之间的所有DNA被切除3在小鼠后代中，如果Cre在所有的细胞中表达，那么所有细胞的靶基因均被切除。
然而，如果Cre基因的表达受控千组织特异性启动子，例如，它只在心脏组织中表达，靶基因将只在心脏组织中被切除，造成靶基因只在心脏组织中被敲除。
如果Cre基因被连在可诱导的启动子控制区之下，可以通过将小鼠暴露于诱导刺激条件下，随时切除靶基因。
尚须指出的是，很多单基因敲除的小鼠没有明显的表型异常或产生比预期少而轻的异常，这说明其他基因可以代替敲除基因的一些功能。
基因敲除技术在一般实验室中难以达到，通常是从专业实验室订购。
在获得基因敲除鼠之后特别是在后续的小鼠杂交过程中，常需要对后代小鼠进行验证。
主要的验证或鉴定方法是PCR和Southern印迹杂交(So u thern blot)。
Southern印迹杂交技术是检测基因组中特异DNA序列的方法：提取的DNA分子用一种或几种限制性内切酶消化成若干片段、并在琼脂糖凝胶电泳上分离，然后将变性处理后的凝胶中的单链核酸序列片段转移到硝酸纤维素膜或尼龙膜上，将印迹有单链核酸序列片段的硝酸纤维素膜或尼龙膜与目的基因探针杂交，通过显影观察条带的大小，就可对基因敲除小鼠的基因突变或缺失等进行鉴定。
推荐读物
[1]Huang B, Babcock H,Zhua ng X.
Breaking the diffraction barrier:super-resolution imaging of cells.
Cell,2010,143(7):1047-1058[2]陈宜张，林其谁生命科学中的单分子行为及细胞内实时检测北京：科学出版社，2005[3]Ga wad C, Koh W, Quake SR.
Single-cell genome sequencing:cun-ent state of the science.
Natw-e Review Genetics,2016,17(3):175-188········-···喊------人类对细胞、细胞内部的结构、细胞成分的功能及其相互关系的了解程度主要取决于所使用的研究手段和方法。
显微镜技术包括光学显微技术、电子显微镜技木、纳术显微技术，主要是在不同层次和水平对细胞及其成分进行形态学观察。
在体外成功地对细胞进行分离、在培养皿中培养并建立细胞系对于研究各种生物细胞的性质和功能具有重要作用。
离心方法是分离和提取细胞亚显微结构和大分子的重要手段之一；对蛋白质的分离主要依靠柱层析法，其中亲和层析效果最好；蛋白质电水是分离目的蛋白质，或对得到的纯化蛋白进行鉴定分析的传统而有效的手段。
细胞化学技术是一类将细胞形态观察和组分分析相结合的分析方法。
酶细胞化学技术、免疫细胞化学技术和放射性自显影技木都是细胞生物学常用的方法和手段。
而细胞内离子的实时梒剧和绿色荧光蛋白标记则是活细胞内分子示踪较常用的方法。
冷冻电镜技术的成熟使得结构生物学者跳过超大分子复合物结晶难的这层技木屏障，直接解析溶液状态的生物大分子三维结构，使得结构生物学领域的研究有了突破性进展。
生命科学的研究进入了后基因组学时代或功能基因组学时代。
基因扩增、克隆、梒测、表达等技术已成为基因研究的常规方法。
RNA干扰技木可比较简便地在细胞水平对特定基因表达进行降低或功能丧失的操作。
研究蛋白质相互作用是理解细胞生命过程的关键。
免疫凡淀和酵母双杂交技术是研究蛋白质相互作用的常用方法。
蛋白质与核酸的相互作用是基因表达调控的基础。
朵色质免疫彸丘I冗淀技术是一种在细胞内研究DNA与蛋白质相互作用的方去。
生物芯片技术能广泛地应用于DNA、第三章细胞生物学的研究方法RNA与蛋白质的研究。
蛋白质组学研究技术是诸多传统、现代研究技术的综合。
高通量测序技术与其他基因组水平的研究技术相结合，可大大推进我们对复杂基因表达调控系统的理解和认识。
单细胞测序技术的出现使得科学家能够对单个细胞进行基因组学和转录组学进行解析。
在细胞生物学研究中，除开展大量的体外实验研究之外，特别强调模式动物体内研究结果的价值。
基因功能的最终确定需要借助动物个体水平的基因敲除技术实现。
CRISPRA/Cas9基因编辑及其相关技术的不断改进使得人类认识和科学改造基因的手段也发生了革命性的变化。
（黄东阳）
第二篇细胞的结构与功能
第四章细胞膜与物质的穿膜运输
细胞膜(cell membrane)是包围在细胞质表面的一层薄膜，又称质膜(plasma membrane)。
细胞膜将细胞中的物质与外界环境隔开，维持细胞特有的内环境。
在原始生命物质进化过程中，细胞膜的形成是关键的一步，没有细胞膜的形成，细胞形式的生命就不能存在。
除质膜外，细胞内还有丰富的膜结构，它们形成了细胞内各种膜性细胞器，如内质网、高尔基复合体、溶酶体、各种膜泡等，称为细胞内的膜系统。
这些膜与质膜在化学组成、分子结构和功能活动方面具有很多共性。
目前把质膜和细胞内膜系统总称为生物膜(biomembrane)。
电子显微镜下，生物膜呈“两暗夹一明”的形态结构，又称为单位膜(unit membrane)（图4-1)。
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图4-1细胞膜的结构A单位膜的电镜照片；B细胞膜三维结构模式图细胞膜不是一种机械屏障，它不仅为细胞的生命活动提供了稳定的内环境，还行使着物质转运、信号传递、细胞识别等多种复杂功能，并且与生命科学中的许多基本问题，如细胞的增殖、分化、细胞的识别黏附、代谢、能量转换等密切相关，是细胞之间、细胞与细胞外环境之间相互交流的重要通道。
细胞膜的改变与多种遗传病、神经退行性疾病、恶性肿瘤等的发生相关。
因此，正确认识细胞膜的结构与功能对揭示生命活动的奥秘具有重要意义。
目前，对细胞膜的研究已深入到分子水平，对其化学组成和各组分的作用及不同组分间的相互作用有了新的认识，细胞膜的研究已成为当前细胞生物学和分子生物学的重要研究领域之一。
本章主要介绍细胞膜的化学组成、分子结构、细胞膜特性及其主要功能等。
由于细胞膜的许多特性和功能是各种生物膜所共有的，所以通过对细胞膜的了解，亦可对各种生物膜有一个基本认识。
第一节细胞膜的化学组成与生物学特性
对从多种细胞分离获得的纯净质膜及各种内膜的化学分析表明，不同类型的细胞其细胞膜的化学组成基本相同，主要由脂类、蛋白质和糖类三种物质组成。
脂类排列成双分子层即脂双层，构成膜的基本结构，形成了对水溶性分子相对不通透的屏障；蛋白质以不同方式与脂类结合，是膜的功能主体；糖类多分布于膜外表面，通过共价键与膜的某些脂类或蛋白质分子结合形成糖脂或糖蛋白。
此外，细胞膜中还含有少量水分、无机盐与金属离子等。
细胞膜具有多种复杂而重要的功能，主要是由于构成膜的三种主要成分各自具有特定的分子结构和生物学特性，并且三种成分之间有着巧妙的相互作用。
近年来日益广泛应用的新技术不断揭示有关膜结构和功能的新信息，如结构生物学能够解析膜蛋白的立体构象、活性结构域；分子生物学、基因组学和生物信息学等手段有助于预测或重构膜蛋白的结构。
—、细胞膜的化学组成
(—)膜脂构成细胞膜的结构骨架
细胞膜上的脂类称为膜脂(membrane lipid)，约占膜成分的50%，一个动物细胞的质膜中大约含有109个膜脂分子，在lµmxlµm脂双层范围内，大约有5xl06个膜脂分子。
它们主要有三种类型：磷脂(phospholipid)、胆固醇(cholesterol)和糖脂(glycolipid)，其中以磷脂含量为最多。
1磷脂是膜脂的主要成分大多数膜脂分子中都含有磷酸基团，被称为磷脂，约占膜脂的50%以上。
磷脂又可分为两类：甘油磷脂(phosphoglycerides)和鞘磷脂(sphingomyelin, SM)。
甘油磷脂主要包括磷脂酰胆碱（卵磷脂）(phosphatidylcholine, PC)、磷脂酰乙醇胺（脑磷脂）(phosphatid ylethanolamine,PE)和磷脂酰丝氨酸(phosphalidylserine, PS)。
此外，还有一种磷脂是磷脂酰肌醇(phosphatidylinosital, PI)，位于质膜的内层，在膜结构中含扯很少，但在细胞信号转导中起重要作用。
这些甘油磷脂主要在内质网合成。
甘油磷脂有着共同的特征：以甘油为骨架，甘油分子的l、2位胫基分别与脂肪酸形成酷键，3位轻基与磷酸基团形成酣键。
如果磷酸基团分别与胆碱、乙醇胺、丝氨酸或肌醇结合，即形成上述4种类型磷脂分子。
这些亲水的小基团在分子的末端与带负电的磷酸基团一起形成高度水溶性的结构域，极性很强，被称为头部基团(head group)或亲水头。
磷脂中的脂肪酸链长短不一，通常由l4~24个碳原子组成，一条经链不含双键（饱和链），另一经链含有1~2个顺式双键（不饱和链），顺式双键处形成一个约30°角的弯曲。
磷脂分子逐个相依地整齐排列构成细胞膜的骨架结构。
脂肪酸链是疏水的，无极性，称疏水尾。
由千磷脂分子具有亲水头和疏水尾，被称为两亲性分子(amphipathi c molec ule)或兼性分子（图4-2)。
鞘磷脂(sphingomyelin, SM)是细胞膜上唯一不以甘油为骨架的磷脂，在膜中含量较少，但在神经元细胞膜中含植较多，主要在高尔基复合体合成。
如神经鞘磷脂是丰度最高的一种鞘磷脂，它以鞘氨醇代替甘油，长链的不饱和脂肪酸结合在鞘氨醇的氨基上；分子末端的一个胫基与磷酸胆碱(phos phocholine)结合，另一个游离胫基可与相邻脂分子的极性头部、水分子或膜蛋白形成氢键（图4-3)。
目前研究发现，鞘磷脂及其代谢产物神经酰胺、鞘氨醇及l－磷酸鞘氨醇参与各种细胞活动，如细胞增殖、分化和凋亡等。
2.胆固醇能够稳定细胞膜和调节膜的流动性胆固醇是细胞膜中另一类重要的脂类，分子较小，散布在磷脂分子之间。
动物细胞膜中胆固醇含量较高，有的膜内胆固醇与磷脂之比可达I:I，植物细胞膜中胆固醇含昼较少，约占膜脂的2%。
胆固醇也是两亲性分子：极性头部为连接千固醇环（肖环）上的轻基，靠近相邻的磷脂分子的极性头部；中间为固醇环，连接一条短的疏水性胫链。
疏水的固醇环扁平富有刚性，固定在磷脂分子邻近头部的经链上，对磷脂的脂肪酸链尾部的运动具有干扰作用。
疏水的尾部经链埋在磷脂的疏水尾部中（图4-4)。
胆固醇分子对调节膜的流动性、加强膜的稳定性具有重要作用。
例如，一种中国仓鼠卵巢细胞突变株(M19)，不能合成胆固醇，体外培养时细胞会很快解体，只有在培养基中加入适量胆固醇并掺入到质膜中后，脂双层趋千稳定，细胞才能生存。
不同生物膜有各自特殊的脂类组成，如哺乳动物细胞膜上富含胆固醇和糖脂，而线粒体膜内富含心磷脂；大肠杆菌质膜则不含胆固醇。
而且不同类型的脂分子具有特定的头部基团及脂肪酸链，这赋予膜不同的特性。
3糖脂主要位千质膜的非胞质面糖脂也是亲水脂分子，由脂类和寡糖构成。
糖脂普遍存在千原核和真核细胞膜表面，含量占膜脂总噩的5％以下。
对千细菌和植物细胞，几乎所有的糖脂均是甘油磷脂的衍生物，一般为磷脂酰胆碱衍生的糖脂；动物细胞膜的糖脂几乎都是鞘氨醇的衍生物，结构似鞘磷脂，称为鞘糖脂。
糖脂的极性头部可由1~15个或更多个糖残基组成，两条经链为疏水的尾部（图4-5)。
，U气t;极性（亲水头）
尸，霍扂尸吼，霍震盓鹭
言严吼，
3细血杻芦霍：
键双比＼
非极性
（疏水尾）
出比比－2
庐一
人脂肪酸尾)
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脂肪酸尾)
3几八
脂肪酸尾
忙仁庐。
脂肪酸尾)
3八八八
磷脂酰乙醇胺
磷脂酰丝氨酸磷脂酰胆碱鞘磷脂
第四章细胞膜与物质的穿膜运输
半乳糖脑昔酷
人脂肪酸尾)
人脂肪酸尾)
GM1神经节节酣
膜上胆固醇分子亲水的头部朝向脂双层的外表A半乳糖脑昔脂；B.
G人1，神经节昔脂面，而大部分结构嵌入磷脂的脂肪酸尾部中。
Gal：半乳糖；Cle：葡萄糖；GalNAc:N－乙酰半胆固醇分子在脂双层间倾向千均匀分布乳糖胺；NANA:N－乙酰神经氨酸目前已发现40余种糖脂，它们的主要区别在于其极性头部不同。
最简单的糖脂是脑昔脂，其极性头部仅有一个半乳糖或葡萄糖残基，它是髓鞘中的主要糖脂。
比较复杂的糖脂是神经节昔脂，其极性头除含有半乳糖和葡萄糖外，还含有数目不等的唾液酸（也叫做N－乙酰神经氨酸，NANA)。
不同的细胞所含糖脂的种类不同，如神经节昔脂在神经元的质膜中最为丰富，占总脂类的5%～10%，人红细胞膜中含有ABO血型糖脂。
所有细胞中，糖脂均位于脂双层的非胞质面单层，糖基暴露于细胞表面。
据此推测，糖脂的作用与细胞同外环境的相互作用有关，可能作为细胞表面受体，参与细胞的识别、黏附及信号转导等。
膜脂都是两亲性分子，由千极性头部能与水分子形成氢键或静电作用而溶千水，非极性尾部不能与水分子产生相互作用而疏水。
所以当这些脂质分子被水环境包围时，它们就自发地聚集起来，使疏水的尾部藏在内部，亲水的头部露在外面与水接触。
实验中出现两种存在形式：O形成球状的分子团(micelle儿把尾部包藏在里面；＠形成脂双层(lipid bilayer)。
脂质分子在水环境中排列成双层，两层分子的疏水尾部被亲水头部夹在中间。
为了避免双分子层两端疏水尾部与水接触，其游离端往往能自动闭合，形成充满液体的球状小泡称为脂质体(liposome)（图4-6)。
所谓的脂质体是根据磷脂分子在水相中形成稳定的脂双层的现象制备的人工膜。
人工合成脂质体的直径约在25nm~1µm之间。
72第二篇细胞的结构与功能
脂质体可以用单一的或混合的磷脂来制备，同时还可以嵌入不同的膜蛋白。
作为膜研究的实验模型，将蛋白质插入脂质体中，可以在比天然膜更简单的环境中研究其功能；脂质体也可以作为运载体，把药物或DNA包含在其中，转移进细胞以研究其生物学作用；如果将相应的抗体构建到脂质体膜上，脂质体可选择性地结合到靶细胞膜表面，使药物定向作用于靶细胞。
大多数磷脂和糖脂在水溶液中自动形成脂双层结构。
脂双层具有作为生物膜理想结构的特点：O构成分隔两个水溶性环境的屏障。
脂双层内为疏水性的脂肪酸链，不允许水溶性分子、离子和大多数生物分子自由通过，保障了细胞内环境的稳定。
©脂双层是连续的，具有自相融合形成封闭性腔室的倾向，在细胞内未发现有游离边界，形成广泛的连续膜网。
当脂双层受损伤时通过脂分子的重新排布可以自动再封闭。
＠脂双层具有柔性是可变形的，如在细胞运动、分裂、分泌泡的出芽和融合及受精时都涉及膜的可变形特性。
（二）膜蛋白以多种方式与脂双分子层结合
虽然脂双层组成细胞膜的基本结构，但细胞膜的不同特性和功能却是由与细胞膜相结合的膜蛋白(membrane protein)决定的。
如膜蛋白中有些是运输蛋白，转运特定的分子或离子进出细胞；有些是结合于质膜上的酶，催化与其相关的生化反应；有些起连接作用，连接相邻细胞或细胞外基质成分；有些作为受体，接受周围环境中各种化学信号，并转导至细胞内引起相应的反应。
膜蛋白的量很大，人体内30％的蛋白质位于质膜上。
不同生物膜上膜蛋白的含撞及类型有很大差异，功能越复杂的膜其蛋白质含显越高。
如线粒体内膜上有电子传递链，氧化磷酸化相关蛋白位于其中，故膜蛋白质含量较高，约占75%。
而髓鞘主要起绝缘作用，膜蛋白的含蜇低于25%。
一般的细胞膜中蛋白质含量介千两者之间，约占50％左右。
根据膜蛋白与脂双层结合的方式不同，膜蛋白可分为三种基本类型：内在膜蛋白(intrin sic membrane protein)或整合膜蛋白(in tegral membrane prote i n)、外在膜蛋白(extrin si c memb团ne protein)和脂铀定蛋白(lipid anc hored prote i n)（图4-7)。
图4-7膜蛋臼在膜中的几种结合方式A~C穿膜蛋白，以一次或多次穿膜的Q螺旋或B筒形式；D位于胞质侧，通过暴露于蛋白质表面的Q－螺旋的疏水面与胞质面脂单层相互作用而与膜结合；E位于胞质侧的脂铺定蛋白，以共价键直接与胞质面脂单层中的脂肪酸链结合；F位千质膜外表面的脂铀定蛋白GPI;G、H膜外在蛋白，与膜脂的极性头部或内在蛋白亲水区以非共价键相互作用间接与膜结合1内在膜蛋白又称穿膜蛋白(tr·ansmembrane protein)，占膜蛋白总噩的70%~80%，也是两亲性分子。
分为单次穿膜（图4-7A)、多次穿膜（图4-7B)和多亚基穿膜蛋白三种类型。
单次穿膜蛋白的肤链只穿过脂双层一次，穿膜区一般含有20~30个疏水性氨基酸残基，以a－螺旋构象穿越脂双层的疏水区。
因为a－螺旋构象允许在肤链的相邻氨基酸残基中形成最大数蜇的氢键，从而形成稳定性高的结构；亲水的胞外区和胞质区则由极性氨基酸残基构成，它们暴露在膜的一侧或两侧，可与水溶性的物质（如激素或其他蛋白质）相互作用。
如细胞表面受体是穿膜蛋白，他们在细胞外侧与信号分子结合，在内侧又激活细胞内不同的信号分子。
一般肤链的N端位于细胞膜外侧，但也有相反定位的例@b,子（如转铁蛋白受体）。
多次穿膜蛋白含有多个由疏水性氨基酸残基组成的穿膜序列（可多达140。
第四章细胞膜与物质的穿膜运输
个），通过多个a－螺旋构象穿过脂双层。
目前通过DNA克隆和测序技术揭示了许多穿膜蛋白的氨基酸序列，所以从肤链的序列预测哪一段作为穿膜片段已经很容易。
如果一个片段含有高度疏水的氨基酸达20~30个就可以以a螺旋方式穿越脂双层。
大多数穿膜蛋白穿膜域都是a－螺旋构象，也有的穿膜蛋白以B－折叠片层(!3-pleated sheet)构象穿膜，在脂双层中围成筒状结构，称B筒(13-b祖Tel)（图4-7C)。
有些B筒在质膜上起运输蛋白的作用，被称为孔蛋白(porin)，主要存在于线粒体、叶绿体和一些细菌的外膜。
许多含B筒穿膜蛋白的结构用X线衍射晶体成像技术得到阐明，目前发现，围成B筒的B链最少是8条，最多可达22条，它们之间有氢键连接。
2.外在膜蛋白又称周边蛋白(perip h eral membrane protein)，占膜蛋白总量的20%～30%。
是一类与细胞膜结合比较松散的不插入脂双层的蛋白质，分布在质膜的胞质侧或胞外侧。
一些周边蛋白通过非共价键（如离子键或弱的静电作用）附着在脂类分子头部极性区或穿膜蛋白亲水区的一侧，间接与膜结合（图4-7G,H)；一些周边蛋白位于膜的胞质一侧，通过暴露于蛋白质表面的a螺旋的疏水面与脂双层的胞质面单层相互作用而与膜结合（图4-7D)。
周边蛋白为水溶性蛋白，它与膜的结合较弱，使用一些温和的方法，如改变溶液的离子浓度或pH，千扰了蛋白质之间的相互作用，即可将它们从膜上分离下来，而不需破坏膜的基本结构。
外在膜蛋白有多种功能，研究较清楚的是位千质膜内表面（胞质面）的外周蛋白，如红细胞的血影蛋白和铀蛋白，它们在红细胞膜内表面形成一个纤维网络，即膜＂骨架”，给膜提供机械支持，并为整合蛋白提供铀定位点。
它们在维持红细胞的双凹外形、抵抗其穿越毛细血管时的挤压力及维持红细胞膜的完整性方面具有重要作用。
很多遗传性疾病（如溶血性贫血）表现为红细胞脆性增加及形态异常的特征，这涉及引起血影蛋白或铀蛋白结构和功能改变的基因突变。
有的周边蛋白与膜之间是一种动态关系，根据功能的需要而募集到膜上或者从膜上释放出去。
质膜内表面的一些周边蛋白有的作为酶或传递细胞外信号的因子发挥作用。
与质膜外表面相连的一些周边蛋白通常是细胞外基质的主要成分。
3脂描定蛋白又称脂连接蛋白(lipid-linked protein)。
这类膜蛋白可位于膜的两侧，很像周边蛋白，但与其不同的是脂铀定蛋白以共价键与脂双层内的脂分子结合。
脂铀定蛋白以两种方式通过共价键结合千脂类分子。
一种位于质膜胞质一侧，一些细胞内信号蛋白直接与脂双层中的某些脂肪酸链（如豆范酸、棕桐酸或异戊二烯基）形成共价键而被铀定在脂双层上。
例如，大多数的Src激酶是通过N端的甘氨酸残基(Gly)与脂双层的胞质面脂单层中的豆范酸和棕桐酸分别形成共价键而牢固地附着在质膜上；Ras通过其在C端附近的一个或两个半胱氨酸残基(Cys)分别与异戊二烯基和棕桐酸形成共价键而被铀定在质膜的胞质面。
这种双重铀定有助于蛋白质更牢固地与膜脂结合（图4-7E)。
另外，在信号转导中起重要作用的C蛋白也是脂描定蛋白，绝大部分的立具有棕桐酰化修饰，且棕桐酰化的位点都在N端。
另一种方式是位于质膜外表面的一些蛋白质，通过与磷脂酰肌醇分子相连的寡糖链共价键结合而铀定到质膜上，这些磷脂酰肌醇分子位于脂双层外层中，所以它们又被称为糖基磷脂酰肌醇铀定蛋白(glycosylphosphatidylinositol link ed protein, GPI)。
GPI蛋白的结合方式表现为磷脂酰肌醇分子的两个脂肪酸链插入膜脂中；肌醇与长度不等的寡糖链结合；寡糖链末端的磷酸已醇胺与蛋白的C端共价结合。
这样有效地将蛋白质结合到质膜上（图4-7F)。
因此有人也把GPI归类为整合膜蛋白。
膜蛋白的这种铀定形式与穿膜蛋白相比，在理论上有许多优点。
由于它们在膜上的运动性增大，有更多的侧向运动能力，有利于和其他胞外信号分子更快地结合和反应。
GPI－铀定蛋白分布极广，目前大约有100多种蛋白已被确定是GPI-铀定蛋白，包括有多种水解酶、免疫球蛋白、细胞黏附分子、膜受体等。
为了研究膜蛋白的结构、性质和功能，首先需要将其从细胞膜上分离出来，纯化后进行研究。
由于穿膜蛋白具有疏水穿膜区，很难以可溶形式分离。
要分离内在膜蛋白，需使用能干扰疏水作用并能破坏脂双层的试剂，一般常使用去垢剂(detergen t)。
74第二篇细胞的结构与功能
十二烧基磺酸钠(SDS)为常用的离子型去垢剂，它是两亲性的脂质样分子，有一个带电的亲水区和一个疏水区（经链）。
当用高浓度的去垢剂与膜混合时，去垢剂分子的疏水区替代磷脂分子与穿膜蛋白的疏水区结合，也与磷脂分子的疏水尾部结合，由此把穿膜蛋白与磷脂分开。
由于SDS的极性端带电荷（离子型）更易溶于水，所以形成了去垢剂一蛋白质复合物进入溶液中而将膜蛋白分离出来。
蛋白质经分离、纯化后，就可以用多种手段进行分析，确定其相对分子量、氨基酸组成、氨基酸序列等。
SDS对蛋白质的作用较强烈，能使蛋白质解折叠引起变性，不利千对其进行功能研究。
为获得有功能的膜蛋白，可采用非离子型去垢剂。
Triton X-100是非离子型去垢剂，它的极性端不带电荷，它与SDS对膜蛋白的作用方式类似，也可使细胞膜崩解，但对蛋白质的作用比较温和。
它不仅用千膜蛋白的分离与纯化，也用于去除细胞内膜系统，以便对细胞骨架和其他蛋白质进行研究。
（三）膜糖类覆盖细胞膜表面
细胞膜中含有一定量的糖类，由于种属和细胞类型不同，糖类约占质膜重量的2%～10%。
如红细胞膜中的糖类占膜总重量的8%。
膜糖(membrane c扣·bohydrate)中93%的糖以低聚糖或多聚糖链形式共价结合千膜蛋白上形成糖蛋白，糖蛋白上的糖基化主要发生在天冬酰胺（N－连接），其次是在丝氨酸和苏氨酸（O－连接）残基上，并且经常几个位点同时发生糖基化。
7％的膜糖以低聚糖链共价结合于膜脂上形成糖脂。
大部分暴露千细胞表面的膜蛋白都带有多个寡糖侧链，而脂双层外层中每个糖脂分子只带1个寡糖侧链，质膜上所有的糖链都朝向细胞表面。
自然界中存在的单糖及其衍生物有200多种，在动物细胞膜中主要有7种：D－葡萄糖、D－半乳糖、D－甘露糖、L－岩藻糖、N－乙酰半乳糖胺，N－乙酰葡萄糖胺及唾液酸。
由于寡糖链中单糖的数瘟、种类、排列顺序以及有无分支等不同，低聚糖或多聚糖链出现了千变万化的组合形式。
如人类ABO四种血型抗原的差别就是血型糖蛋白在红细胞质膜外表面寡糖链的组成结构决定的。
唾液酸常见千糖链的末端，真核细胞表面的净负电荷主要由它形成。
在大多数真核细胞表面有富含糖类的周缘区，称为细胞外被(cell coat)或糖萼(glycocalyx)，用重金属染料钉红染色后，在电镜下可显示其为厚约10~2Onm的结构，边界不甚明确。
细胞外被中的糖类主要包括与糖蛋白和糖脂相连的低聚糖侧链，同时也包括被分泌出来又吸附于细胞表面的糖蛋白与蛋白聚糖的多糖侧链。
这些吸附的大分子是细胞外基质的成分，所以细胞膜的边缘与细胞外基质的界限是难千区分的。
现在细胞外被一般用来指与质膜相连接的糖类物质，即质膜中的糖蛋白和糖脂向外表面延伸出的寡糖连部分，因此，细胞外被实质上是质膜结构的一部分。
而把不与质膜相连接的细胞外狻盖物称为细胞外物质或胞外结构。
细胞外被的基本功能是保护细胞抵御各种物理、化学性损伤，如消化道、呼吸道等上皮细胞的细胞外被有助于润滑、防止机械损伤，保护黏膜上皮不受消化酶的作用。
糖链末端富含带负电荷的唾液酸，能捕集Na\Ca2＋等阳离子并吸引大量的水分子，使细胞周围建立起水盐平衡的微环境。
糖脂及糖蛋白中低聚糖侧链的功能大多还不清楚，但根据寡糖链的复杂性及其所处的位置提示它们参与细胞间及细胞与周围环境的相互作用，如参与细胞的识别、黏附、迁移等功能活动。
二、细胞膜的生物学特性
细胞膜是由脂双分子层和以不同方式与其结合的蛋白质构成的生物大分子体系，它不仅具有包围细胞质，形成＂屏障＂的作用，还执行物质运输、信号传递、细胞识别和能量转换等多种重要功能。
这和细胞膜的分子结构和组成特性有关，细胞膜的主要特性是膜的不对称性和流动性。
（一）膜的不对称性决定膜功能的方向性膜的不对称性(membrane asymmet ry)是指细胞膜中各种成分的分布是不均匀的，包括种类和数量上都有很大差异，这与细胞膜的功能有密切关系。
第四章细胞膜与物质的穿膜运输
1膜脂的不对称性多项实验分析了各种膜脂双层的化学组成，发现各种膜脂分子在脂双层内、外两单层中的分布是不同的。
例如，在人红细胞膜中，绝大部分的鞘磷脂和磷脂酰胆碱位千脂双层的外层中，而在内层中磷脂酰乙醇胺、磷脂酰丝氨酸和磷脂酰肌醇含量较多。
如图4-8所示，这些磷脂虽然在脂双层中都有分布，但含量比例上存在较大差异。
胆固醇在红细胞膜内、外脂单层中分布的比例大致相等。
细胞膜中糖脂均位千脂双层非胞质面。
另外，不同膜性细胞器中脂类成分的组成和分布不同。
25脂双层外层如质膜中一般富含鞘磷脂、磷脂酰胆碱和胆固醇等；核膜、内质网膜和线粒体外膜则富含磷脂酰胆碱、磷脂酰乙醇胺、磷脂酰肌醇；线粒体内膜富含心磷脂。
由于鞘磷脂在高尔基复合体中合成，所以其膜中鞘磷脂的含量约是内质网膜中的6。
倍。
正是由于存在膜脂各组分分布的差异，使细胞内的生物膜具有不同的特性和功能。
膜脂组分不对称性分布的生物学意义尚不完全明确，但已知不同的膜脂组分应与膜的特定功能相一致。
例如具有极性的小肠吸收上皮细胞，在细胞底侧面(basolateral s urface)的25脂双层内层质膜中，鞘脂与甘油磷脂、胆固醇之比是0.5:l.5:1，大致与非图4-8人红细胞膜中几种膜脂的不对极性细胞膜中的比值相同，但在朝向肠腔的游离面质膜中，称分布这三种膜脂之比为1:1:1。
其中鞘脂比例的增加，可能是鞘SM：鞘磷脂；PC：磷脂酰胆碱；PS：磷脂酰氨醇分子中自由胫基间广泛形成的氢键有利于增加膜的稳丝氨酸；PE：磷脂酰乙醇胺；PI：磷脂酰肌醇；CL：胆固醇定性，因为游离面质膜易受更多的刺激。
脂双层中的一些脂类分子（如磷脂酰肌醇）可以为特定蛋白质提供结合位点，对保持膜蛋白在脂双层中的正确定位和极性有重要作用。
另外，膜脂的不对称分布使脂双层内、外两层流动性有所不同。
2膜蛋白的不对称性膜蛋白分布是绝对不对称的，各种膜蛋白在质膜中都有一定的位置。
如血影蛋白分布千红细胞膜内侧面，酶和受体多位于质膜的外侧面，如5I-~亥昔酸酶、磷酸酣酶、激素受体生长因子受体等，而腺背酸环化酶则位于质膜的内侧胞质面。
穿膜蛋白穿越脂双层都有一定的方向性，这也造成其分布的不对称性。
例如，红细胞膜上的血型糖蛋白肤链的N端伸向质膜外侧，C端在质膜内侧胞质面；带3蛋白肤链的N端则在质膜内侧胞质面。
膜蛋白的不对称性还表现在穿膜蛋白的两个亲水端，其肤链长度、氨基酸的种类和顺序都不同，有的在膜外侧有活性位点，有的在膜内侧有活性位点。
3膜糖的不对称性膜糖类的分布具有显著的不对称性。
细胞膜糖脂、糖蛋白的寡糖侧链只分布于质膜外表面（非胞质面），而在内膜系统，寡糖侧链都分布于膜腔的内侧面（非胞质面）。
膜脂、膜蛋白及膜糖分布的不对称性与膜功能的不对称性和方向性有密切关系，具有重要的生物学意义，膜结构上的不对称性保证了膜功能的方向性和生命活动的高度有序性。
如红细胞膜表面糖脂的寡糖链决定了ABO血型；许多激素的受体位于质膜的外侧，接受细胞外信号并向细胞内传递；当细胞发生凋亡时（如衰老的淋巴细胞），原本位千脂双层内层的磷脂酰丝氨酸翻转到外层，成为巨噬细胞识别并吞噬凋亡细胞的信号。
（二）膜的流动性是膜功能活动的保证膜的流动性(flu心ty)是细胞膜的基本特性之一，也是细胞进行生命活动的必需条件。
膜是一个动态的结构，其流动性主要是指膜脂的流动性和膜蛋白的运动性。
1脂双层为液晶态二维流体细胞内外的水环境使得膜脂分子不能自脂双层中逸出，在温和的温度下(37°C），膜脂分子在脂单层(lipid leafle t)平面内可以前后左右运动和彼此之间交换位置，脂类是以相对流动状态存在，但分子长轴基本平行排列保持一定方向，此时的膜可以看作是二维流体。
研·qi作为生物膜主体的脂双层，它的组分既有固体分子排列的有序性，又有液体的流动性，这一两种特性兼有的居于晶态和液态之间的状态，即液晶态(liquid-c1-ystal s tate)是细胞膜极为重要的特性。
在生理条件下，膜大多呈液晶态。
在温度下降到一定程度(<25气），到达某一点时，脂双层的性质会明显改变，它可以从流动的液晶态转变为“冰冻＂的晶状凝胶，这时磷脂分子的运动将受到很大限制；当温度上升至某一点时又可以熔融为液晶态。
所以，把这一临界温度称为膜的相变温度。
由千温度的变化导致膜状态的改变称为”相变”(phase transi tion)。
在相变温度以上，膜处于流动的液膜的流动性是膜功能活动的保证。
如果膜是一种刚性、有序的结构则无法产生运动；而一个完全液态，亳无黏性的膜会使各种膜成分无序排列，无法组织成结构，也不能提供机械支持。
膜的液晶态在这两者之间达到完美折中。
除此之外，有了膜的流动性，膜蛋白可以在膜的特定位点聚集形成特定结构或功能单位，以完成如细胞连接建立、信号转导等多种功能活动。
许多基本的生命活动，包括细胞的运动、生长分裂，物质转运、分泌和吞噬等作用，都取决千膜组分的运动。
如果膜是一种刚性、非液态结构，这些行为都不可能发生。
2.膜脂分子的运动方式20世纪70年代，对人工合成的脂双层膜的研究证明，膜脂的单个分子能在脂双层平面自由扩散。
应用差示扫描量热术、磁共振、放射性核素标记等多种技术检测膜脂分子的运动，结果表明，在高于相变温度的条件下，膜脂分子具有以下几种运动方式（图4-9)。
(I)侧向扩散(lateral diffusion)：侧向扩侧向扩散散是指在脂双层的单分子层内，脂分子沿膜平面侧向与相邻分子快速交换位置，交换频\\率约107次／s。
侧向扩散运动是膜脂分子主I l翻转运动要的运动方式，实验表明，处千液晶态的脂双II层在30"C时其脂类分子的侧向扩散系数(D)/l约为I0-8cm2/s，此数值说明一个磷脂分子可以在1s内从细菌的一端扩散到另一端弯曲运动旋转运动(lµm)或在20s内迁移大约一个动物细胞直图4-9膜脂分子的几种运动方式径这样的距离。
这种运动始终保持脂类分子的排列方向，亲水的头部基团朝向膜表面，疏水的尾部朝向膜的内部。
(1)脂肪酸链的饱和程度：相变温度的高低和流动性的大小决定于脂类分子排列的紧密程度。
已知磷脂分子疏水尾部间的范德华力和疏水性相互作用使得它们相互聚集。
磷脂分子长的饱和脂肪酸链呈直线形，具有最大的聚集倾向而排列紧密成凝胶状态；而不饱和脂肪酸链在双键处形成折屈呈彷1，弯曲状，干扰了脂分子间范德华力的相互作用，所以排列比较疏松，从而增加了膜的流动性。
可以看第四章细胞膜与物质的穿膜运输77出，脂双分子层中含不饱和脂肪酸越多，膜的相变温度越低，其流动性也越大。
一些受外界环境温度影响的细胞，主要通过代谢来调节其膜脂脂肪酸链不饱和程度，如当环境温度降低时，细胞通过一种去饱和酶(desaturases)催化将单键去饱和形成双键，或通过磷脂酶和脂酰转移酶在不同磷脂分子间重组脂肪酸链以产生含两个不饱和脂肪酸链的磷脂分子，这是细胞适应环境温度变化而调节其流动性的主要途径。
(2)脂肪酸链的长短：脂肪酸链的长短与膜的流动性有关。
脂肪酸链短的相变温度低，流动性大。
这是因为脂肪酸链越短则尾端越不易发生相互作用，在相变温度以下，不易发生凝集而增加了流动性；长链尾端之间不仅可以在同一分子层内相互作用，而且可以与另一分子层中的长链尾端作用，使膜的流动性降低。
(3)胆固醇的双重调节作用：动物细胞膜含较多的胆固醇，与磷脂分子数相近，对膜的流动性起重要的双重调节作用。
当温度在相变温度以上时，由于胆固醇分子的固醇环与磷脂分子靠近极性头部的经链部分结合限制了这几个CH2的运动，起到稳定质膜、增加有序性的作用。
当温度在相变温度以下时，由于胆固醇位于磷脂分子之间隔开磷脂分子，可有效地防止脂肪酸链相互凝聚，干扰晶态形成，动物细胞膜中的胆固醇可以有效地防止低温时膜流动性的突然降低。
(4)卵磷脂与鞘磷脂的比值：哺乳动物细胞中，卯磷脂和鞘磷脂的含量约占膜脂的50%，其中卵磷脂的脂肪酸链不饱和程度高，相变温度较低，鞘磷脂则相反，其脂肪酸链饱和程度高，相变温度也高，且范围较宽(25~35"C)。
在37"C时，卵磷脂和鞘磷脂二者均呈流动状态，但鞘磷脂的黏度却比卵磷脂大6倍，因而鞘磷脂含量高则流动性降低。
在细胞衰老过程中，细胞膜中卯磷脂与鞘磷脂的比值逐渐下降，其流动性也随之降低。
(5)膜蛋白的影响：膜脂结合膜蛋白后对膜的流动性有直接影响。
膜蛋白嵌入膜脂疏水区后，使周围的脂类分子不能单独活动而形成界面脂（嵌入蛋白与周围脂类分子结合而形成），嵌入的蛋白越多，界面脂就越多，膜脂的流动性越小，但膜脂与某些内在蛋白的结合是可逆的。
另一方面，在含有较多内在蛋白的膜中，存在由内在蛋白分割包围的富脂区(lip吐rich region)，磷脂分子只能在一个富脂区内自由扩散，而不能扩散到邻近的富脂区。
用荧光素标记磷脂分子，研究磷脂分子在成纤维细胞质膜中的运动清况，发现大多数磷脂只能在直径约为0.5µm范闱的富脂区内自由运动。
除上述因素外，膜脂的极性基团、环境温度、pH、离子强度等均可对膜脂的流动性产生一定影响。
如环境温度越高，膜脂流动性越大，在相变温度范围内，每下降10"C，膜的黏度增加3倍，因而膜流动性降低。
4膜蛋白的运动性分布在膜脂二维流体中的膜蛋白也有发生分子运动的特性，其主要运动方式是侧向扩散和旋转运动。
这两种分子运动方式与膜脂分子相似，但移动速度较慢。
(1)侧向扩散：许多实验证明，膜蛋白在膜脂中可以自由漂浮和在膜表面扩散。
1970年，霍普金斯大学的L.
Frye和M.
Edidin用细胞融合和间接免疫荧光法证明，膜抗原（即膜蛋白）在脂双层二维平面中可以自由扩散。
他们把体外培养的入和小鼠的成纤维细胞进行融合，观察入－小鼠杂交细胞表面抗原分布的变化（图4-10)。
融合前，用发绿色荧光的荧光素标记小鼠成纤维细胞的特异性抗体，入成纤维细胞的特异性抗体用发红色荧光的荧光素标记。
被标记的抗体分别与小鼠和人成纤维细胞膜上的抗原相结合。
用灭活的仙台病毒介导两种细胞融合，刚发生融合时膜抗原蛋白只限于各自的细胞膜部分，人细胞一侧呈红色荧光，小鼠细胞一侧呈绿色荧光。
37"C继续培养40分钟后，两种颜色的荧光在整个杂交细胞膜上均匀分布。
这说明膜抗原蛋白在膜平面内经扩散运动而重新分布。
但在低温条件下(1"C），膜抗原则基本停止运动。
目前测定膜蛋白的侧向扩散常采用荧光漂白恢复(fluorescence photobleaching recove1-y, FPR)技术。
这种技术是研究膜蛋白和膜脂流动性的基本实验方法。
用荧光素标记膜蛋白或膜脂，然后用高能激光束照射细胞表面某一区域，使该区域内标记的荧光分子发生不可逆的埣灭，称为光漂白(photobleaching)，由于侧向扩散，周围带有荧光的膜蛋白或膜脂不断向漂白区迁移，漂白区的荧光强度又恢复到原有水平。
可用其恢复速度计笲膜蛋白或膜脂的侧向扩散速度。
不同膜蛋白其扩散速率不同，扩散常数(D)约为S xl0-9~Sxl0-11cm2/s。
所以一个分子巅为lOOkD的内在蛋白，其扩散系数仅为膜脂扩散系数的1/2左右。
(2)旋转运动(ro tational diffusion)：或称旋转扩散，膜蛋白能围绕与膜平面相垂直的轴进行旋转运动，但旋转运动的速度比侧向扩散更为缓慢。
不同膜蛋白旋转速率也有很大差异，这与其分子结构及所处不同的微环境有关。
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实际上不是所有的膜蛋白都能自由运动，有些细胞只有部分膜蛋白(30%~90%）处千流动状态。
运输、细胞识别、信息转导等功能都与膜的流动性有密切关系。
生物膜各种功能的完成是在膜的流动状态下进行的，若膜的流动性降低，细胞膜固化、黏度增大到一定程度时，许多穿膜运输中断，膜内的酶丧失活性，代谢终止，最终导致细胞死亡。
三、细胞膜的分子结构模型
前面已介绍了膜脂、膜蛋白的分子结构特点，但它们是如何排列和组织的？
这些成分之间如何相互作用？
这些对阐明膜的功能活动及机制十分重要。
在分离质膜以前，有关膜的分子结构理论是根据间接材料提出的。
1890年，苏黎世大学的E.
Overton发现溶于脂肪的物质容易穿过膜，非脂溶性的物质不易穿过细胞膜，他据此推测细胞的表面有类脂层，初步明确了细胞膜的化学组成。
1925年，E.
Gorte1和F.
Grendel从“血影”中抽提出磷脂，在水面上铺成单分子层，测得其所占面积与所用红细胞膜总面积之比在l.8:1至2.2:1之间，他们猜测实际的比值应该是2:1，因此，他们认为红细胞膜是双层脂分子组成。
这样就第一次提出了脂双分子层是细胞膜基本结构的概念。
脂双层的概念为后来大部分膜结构模型所接受，并在这一基础上提出了许多种不同的膜分子结构模型，现介绍几种主要的膜结构模型。
（一）片层结构模型具有三层夹板式结构特点
1935年，H.
Davson和J.
Danielli发现细胞膜的表面张力显著低于油－水界面的表面张力，已知脂滴表面如吸附有蛋白成分则表面张力降低，因此他认为，细胞膜不是单纯由脂类组成，推测质膜中含有蛋白质成分，并提出“片层结构模型”(lamella structure model)。
这一模型认为，细胞膜是由两层磷第四章细胞膜与物质的穿膜运输脂分子构成，磷脂分子的疏水经链在膜的内部彼此相对，而亲水端则朝向膜的外表面，内外侧表面还裂盖着一层球形蛋白质分子，形成蛋白质－磷脂－蛋白质三层夹板式结构。
后来，为了解释质膜对水的高通透性，Davson和Dani elli对其模型进行了修改，认为质膜上有穿过脂双层的孔，小孔由蛋白质分子围成，其内表面具有亲水基团，允许水分子通过。
这一模型的影响达20年之久。
（二）单位膜模型体现膜形态结构的共同特点
前面所介绍的对质膜化学性质与结构的认识，都是根据分析实验数据间接推论出来的，缺少直观资料。
由于细胞膜非常菏，在光学显微镜下无法直接观察清楚。
1959年，J.
D. Robertson使用电子显微镜观察各种生物细胞膜和内膜系统，发现所有生物膜均呈“两暗一明”的三层式结构，在横切面上表现为内外两层为电子密度高的暗线，中间夹一条电子密度低的明线，内外两层暗线各厚约2nm，中间的明线厚约3.5nm，膜的总厚度约为7.5nm，这种“两暗一明”的结构被称为单位膜。
因此，他们在片层结构模型基础上提出了“单位膜模型”(unit membrane model)。
这一模型认为磷脂双分子层构成膜的主体，其亲水端头部向外，与附着的蛋白质分子构成暗线，磷脂分子的疏水尾部构成明线。
这个模型与片层结构模型不同，认为脂双分子层内外两侧的蛋白质并非球形蛋白质，而是单条肤链以B片层形式的蛋白质，通过静电作用与磷脂极性端相结合。
单位膜模型提出了各种生物膜在形态结构上的共同特点，即把膜的分子结构同膜的电镜图像联系起来，能对膜的某些属性做出解释，在超微结构中被普遍采用，名称一直沿用至今。
但是这个模型把膜作为一种静态的单一结构，无法说明膜的动态变化和各种重要的生理功能，也不能解释为何不同生物膜的厚度不同。
（三）流动镶嵌模型是被普遍接受的模型
20世纪60年代以后，由于新技术的发明和应用，对质膜的认识越来越深入。
例如，应用冰冻蚀刻技术显示膜中有蛋白质颗粒存在；应用示踪法表明膜的结构形态不断发生流动变化；应用红外光谱、旋光色散等技术证明膜蛋白主要不是B－片层结构，而是a－螺旋的球形结构。
这些事实都对单位膜模型提出了修正，此阶段又相继提出了许多新的模型，其中受到广泛支持的是S.
J. Singer和G.
L Nicolson在1972年提出的“流动镶嵌模型”(fluid mosaic mod el)（动画4-1“细胞膜流动锁嵌模型”)。
这一模型认为膜中脂双层构成膜的连贯主体，它具有晶体分子排列的有序性，又具有液体的流动性；膜中蛋白质分子以不同形式与脂双分子层结合，有的嵌在脂双层分子中，有的则附着在脂双层的表面。
它是一种动态的、不对称的具有流动性结构，其组分可以运动，还能聚集以便参与各种瞬时的或非永久性的相互作用。
流动镶嵌模型强调了膜的流动性和不对称性，较好地解释了生物膜的功能特点，它是目前被普遍接受的膜结构模型（图4-11)。
流动镶嵌模型可以解释许多膜中所发生
的现象，但它不能说明具有流动性的质膜在
变化过程中怎样保持膜的相对完整性和稳定
性，忽视了膜的各部分流动性的不均匀性等，
因此又有人提出了一些新的模型。
如1975
年Wallac h提出了一种“晶格锁嵌模型”
(crys tal mosaic model)，认为生物膜中流动的
脂类是在可逆地进行无序（液态）和有序（晶
限制作用。
镶嵌蛋白和其周削的脂类分子形成膜中晶态部分（晶格），而具有“流动性”的脂类呈小片的点状分布。
因此脂类的“流动性”是局部的，并非整个脂类双分子层都在进行流动，这就比较合理地说明了生物膜既具有流动性、又具有相对完整性及稳定性的原因。
1977年，Jain和White又提出了＂板块镶嵌模型”(block mosaic model)，认为在流动的脂双层中存＼儿{t:在许多大小不同、刚性较大的能独立移动的脂类板块（有序结构的＂板块”)，在这些有序结构的板块之间存在流动的脂类区（无序结构的＂板块”)，这两者之间处于一种连贯的动态平衡之中，因而生物膜是由同时存在不同流动性的板块镶嵌而成的动态结构。
事实上，后两种模型与流动镶嵌模型并无本质区别，不过是对膜流动性的分子基础进行了补充。
（四）脂筏模型深化了对膜结构和功能的认识脂双层近似一个二维流体，里面镶嵌有许多的蛋白质，而在真实的细胞膜上，脂双层不是一个完全均匀的二维流体，一些脂质分子可以形成相对稳定的凝胶状态或液态有序状态。
近来发现膜质双层内含有由特殊脂质和蛋白质组成的微区(m i crodomain)，微区中富含胆固醇和鞘脂，其中聚集一些特定种类的膜蛋白。
由于鞘脂的脂肪酸尾比较长，因此这一区域比膜的其他部分厚，更有秩序且较少流动，被称为脂筏(lipid raft s)（动画4-2"脂筏＂）。
其周围则是富含不饱和磷脂的流动性较高的液态区。
近年发现脂筏不仅存在千质膜上，亦存在于高尔基复合体膜上。
认为脂筏最初可能在高尔基复合体上形成，最终转移到细胞质膜上（图4-12)。
脂筏
糖脂
脂双层具有不同的脂筏结构：外层的微区主要含有鞘脂、胆固醇及CPI－铀定蛋白，由于鞘脂含有长链饱和脂肪酸，流动性较差，而邻近的磷脂区其脂肪酸多不饱和，所以出现相分离；内层也有类似的微区，但与外层的脂质不完全相同，主要是在此区有许多酰化的铀定蛋白，特别是信号转导蛋白，如Src、G蛋白的Ga亚基、内皮型一氧化氮合酶(eNOS)等。
这种由鞘脂和胆固醇富集的微区，如同漂浮在脂双层上的＂脂筏“同时承载着执行特定生物学功能的膜蛋白。
据推测，一个直径100nm的脂筏可载有600个蛋白质分子。
从结构及组分分析认为，脂筏在膜内形成一个有效的平台，许多蛋白质聚集在脂筏内，便于相互作用；脂筏提供一个有利于蛋白质变构的环境，形成有效的构象。
目前比较公认的脂筏的功能是参与信号转导、受体介导的胞吞以及胆固醇代谢运输等。
从当前的研究来看，脂筏功能的紊乱已涉及HIV、肿瘤、动脉粥样硬化、Alzhe i mer病、疯牛病及肌营养不良等疾病。
对脂筏结构和功能的研究不仅加深了对许多重要的生命现象和病理机制的了解，而且也有助于了解细胞膜的结构和功能，将给膜生物学带来更多的信息与启示。
第二节小分子物质和离子的穿膜运输
细胞是生命的基本单位，它们在进行各种生命活动中必然要与外环境进行活跃的物质交换，通过质膜从环境中获取需要的营养物质和02，并将CO2等代谢产物排至细胞外。
物质从膜的一侧向另一侧的运输叫做“穿膜运输"(transmembran e tran sport)。
细胞膜作为细胞与细胞外环境间的半透性屏障，对穿膜运输的物质有选择和调节作用，以维持细胞相对稳定的内环境。
质膜的基本骨架是脂双分第四章细胞膜与物质的穿膜运输子层，其固有的疏水性对于大多数极性和水溶性分子构成了一道屏障，只有那些脂溶性、非极性或不带电的小分子物质能自由扩散通过质膜，而对带电的溶质分子和离子是高度不通透的，它们的穿膜转运由质膜上特殊的膜运输蛋白完成。
目前把小分子和离子通过脂双层的穿膜运输分为简单扩散、离子通道扩散、易化扩散和主动运输四种方式。
另外，细胞膜通过胞吞和胞吐作用进行大分子和颗粒物质的运输。
—、膜的选择性通透和简单扩散
物质穿膜运输通透性的高低决定于质膜固有的脂溶性和物质本身的特性。
在研究细胞膜对小分子和离子的通透性中常采用人工脂双层膜方法。
运用实验手段在水槽分隔板的小孔上覆盖人工脂双分子层，然后检测该脂双层两侧溶液中某种溶质的含量，可以测定这个模拟脂双层的通透性。
实验表明，如果给予足够长的时间，实际上任何不带电小分子都可以从高浓度向低浓度方向通过人工脂双层简单扩散(simple d i ffusion)是小分子物质穿膜运输的的脂双层最简单方式。
小分子的热运动可使分子以自由扩散的方图4-13人工脂双层对不同溶质的式从膜的一侧进入到另一侧，但必须满足两个条件：一是相对通透性溶质在膜两侧保持一定的浓度差，二是溶质必须能透过膜。
脂溶性物质如醇、苯、肖类激素以及02、CO心凡等就是通过简单扩散方式穿过细胞膜。
在简单扩散时，溶质分子通过膜脂分子间隙向低浓度一侧进行跨膜扩散，这一过程中，无生物学机制参与，无需代谢耗能，所需要的能霾来自浓度差本身的势能，故也称为被动扩散(passive diffusion)。
这种物质从高浓度向低浓度方向的穿膜运动，符合物理学上的简单扩散规律，最终消除两个区域间的浓度差。
物质经简单扩散转运的速率取决千被转运物质在膜两侧的浓度差和物质本身的特性。
另外，物质所在溶液的溫度愈高、膜的有效面积愈大，转运速度也愈高。
二、膜运输蛋白介导的穿膜运输
如上所述，只有脂溶性、非极性或不带电的小分子可以通过简单扩散方式穿膜转运。
对于大多数极性和水溶性物质细胞是通过膜上存在的特殊蛋白质进行跨膜转运的。
这类蛋白质称为膜运输蛋白(membrane transport protein)。
膜运输蛋白的分子数可占所有膜蛋白总数的15%-30%。
膜运输蛋白都是多次穿膜蛋白，通常每种膜运输蛋白只转运某一特定类别的溶质（如离子、单糖或氨基酸）。
根据介导物质运输的形式不同，膜运输蛋白分为两类：一类为载体蛋白(carrier protein)，也称为转运体(transporter)，另一类是通道蛋白(channel protein)。
载体蛋白的特点是与所运输的溶质分子专一结合，通过自身构象改变而运送该溶质过膜。
通道蛋白则形成一种水溶性通道贯穿脂双层，当通道受调控开放时允许特定的溶质（一般是无机离子）穿越细胞膜。
通道蛋白和某些载体蛋白介导溶质穿膜转运时不消耗能量，称其为被动运输(passive transport）。
在被动运输中，如果转运的溶质是不带电的非电解质，膜两侧的浓度梯度即膜两侧的浓度差，决定溶质的转运方向（顺浓度梯度）；如被转运的物质是电解质，其转运方向取决千该物质在膜两侧的浓度差和电位差，某物质在膜两侧的电位差和浓度差两个驱动力的代数和，称为该物质的电－化学驱动力(electrochemical driving force)。
另外，有机体所有细胞膜都具膜电位，因为在膜的外表面有一薄层正离子，内表面有一薄层负离子，形成了细胞膜两侧内负外正相对平稳的电位差（静息电位）。
所以膜电位通常有利于带正电的离子进入而不利于带负电的离子进入。
细胞也需要逆电化学梯度转运一些物质，这不仅需要运输蛋白的参与，还需要消耗能量（多数是ATP)。
这种由载体蛋白参与、消耗代谢能驱动物质逆电化学梯度的跨膜转运称为主动运输(acti ve transport)。
载体蛋白既可介导被动运输（易化扩散），也可介导逆电化学梯度的主动运输；而通道蛋白只能介导顺电化学梯度的被动运输（图4-14)。
被转运的分子。
三。
。一c.....。
蛋白1载体蛋白I T•-V
浓度梯度
脂双层
简单扩散通道介导。
。被顽转运
膜运输蛋白的活性和在细胞膜上的数目决定其物质转运能力。
载体蛋白的构象改变影响它们与所运物质的结合；通道蛋白的构象改变决定其开放或关闭状态。
因此，对载体蛋白活性的调节本质上是对蛋白构象改变的调控。
例如，依赖ATP直接供能的Na十－K泵、Ca2＋泵等就是经过磷酸化修饰后改变构象完成转运的。
细胞外的调控因素包括激素、神经递质、被运物质的电化学梯度等。
一些天然和人工小分子化合物可以激活或桔抗膜运输蛋白的活性；细胞内的询控因素包括酶、G蛋白、信号蛋白等。
对于离子通道而言，膜电位的变化是其最重要的调控因素之一。
膜运输蛋白的数目显然影响运输速率。
膜运输蛋白都是整合于来自高尔基复合体成熟面的膜泡的膜上，基础状态下膜泡停留在胞质中，在受到某种信号分子作用时，膜泡与质膜融合将膜运输蛋白转运至质膜上，这一过程被称为“上膜"(trafficking to the membrane）或“入膜"(inserting into the membrane)。
相反，位千质膜上的运输蛋白也可以通过胞吞被回收(retrieved)入细胞，随即被送到内体一溶酶体途径被降解，这种“下膜”或“内化”(internalization)的机制被用以负性调控质膜上运输蛋白的数目。
例如，抗利尿激素与肾脏集合管主细胞膜上的受体结合后促进水通道蛋白的表达和上膜；阻断抗利尿激素与其受体的结合可增加水通道蛋白的内吞。
抗利尿激素就是通过改变水通道蛋白的数量实现对原尿中水的重吸收。
(—)易化扩散是载体蛋臼介导的被动运输
一些非脂溶性（或亲水性）的物质，如葡萄糖、氨基酸、核昔酸以及细胞代谢物等，不能以简单扩散的方式通过细胞膜，但它们可在某些载体蛋白的介导下，不消耗细胞的代谢能量，顺物质浓度梯度.(.1或电化学梯度进行转运，这种方式称为易化扩散(facilitated d iffus ion)或帮助扩散。
由千易化扩散不第四章细胞膜与物质的穿膜运输消耗细胞的代谢能，这一点与简单扩散相同，二者都是被动运输。
易化转运蛋白可以在两个方向上同等介导物质的穿膜运输，净通量的方向取决于物质在膜两侧的相对浓度。
但在易化扩散中，转运特异性强，转运速率也非常快。
目前对载体蛋白在分子水平上如何发挥作用的细节还不清楚，一般认为，载体蛋白对所转运的溶质具有高度专一性，可以借助千其上的结合位点与某一物质进行暂时的、可逆的结合。
当载体蛋白一侧表面的特异结合位点，同专一的溶质分子结合形成复合体，即可引起载体蛋白发生构象变化，通过一定的易位机制，将被运送的溶质分子从膜的一侧移至膜的另一侧。
同时，随构象的变化，载体对该物质的亲和力也下降，于是物质与载体蛋白分离，溶质顺着浓度梯度从这里扩散出去，载体蛋白又恢复到它原有的构象（图4-15)。
溶质~入状态A贰声状态B
细胞外
胞质溶胶
介导被动转运结合溶质
的载体蛋白的部位
易化扩散具有以下特点：(1)结构特异性：每种易化扩散载体蛋白对其所运分子有一个或多个结合位点，只能识别具有特定化学结构的一种或一类底物。
(2)饱和现象：细胞膜中载体蛋白的数量和转运速率有限，当被转运的底物浓度增大到一定程度，使所有的结合位点被占满，底物的扩散速度达到最大值(vmax)，不再随底物的浓度增加而增大时，称为载体转运的饱和现象(saturation)。
最大扩散速度vmux能反映载体蛋白构象转化的最大速率。
扩散速度达v"lUX一半时(1/2vmax)时的底物浓度，称为米氏常数(Mi chealis constant,K"')，可反映载体蛋白对底物分子的亲和性，凡越小表明亲和力和转运效率越高，反之亦然。
(3)竞争性抑制：所运底物与载体蛋白的结合可被竞争性抑制物特异性地阻断（竞争同一结合位点并且被或者不被转运）；也可被非竞争性抑制物阻断（结合在载体蛋白的其他部位改变其构象）。
葡萄糖是人体最基本的直接能量来源，对千许多细胞包括红细胞而言，血糖和细胞外液中葡萄糖浓度高于细胞内，这些细胞膜上都含有一种向细胞内转运葡萄糖的膜蛋白，以易化扩散方式将葡萄糖转运入细胞。
目前发现人类基因组编码14种与葡萄糖转运相关的载体蛋白GLUT!-GLUT14，构成葡萄糖转运体(glucose transporter, GLUT)蛋白家族，它们具有高度同源的氨基酸序列，都含有12次穿膜的a螺旋。
GLUT!是首先在红细胞上发现的第一个成员，后来被证明普遍存在于绝大多数哺乳动物细胞，是基本的葡萄糖转运体。
对GLUTl的研究发现，多肤穿膜段主要由疏水性氨基酸残基组成，但有些a－螺旋带有Ser、Thr、Asp和Glu残基，它们的侧链可以和葡萄糖轻基形成氢键。
这些氨基酸残基被认为可以形成载体蛋白内部朝内或朝外的葡萄糖结合位点。
人红细胞膜上存约5万个葡萄糖载体蛋白，其数量相当于其膜蛋白总量的5%，最大转运速度约为每秒转运180个葡萄糖分子。
葡萄糖载体蛋白的三维结构尚未得到解析，因此葡萄糖转运机制还是一个谜。
动力学研究表明葡萄糖的转运是通过载体蛋白的两种构象交替改变而完成的，因为载体蛋白是一种12次穿膜蛋白，它们不可能通过在脂双层中来回移动或翻转以转运物质分子。
在第一种构象，葡萄糖结合位点朝向细胞外，结合葡萄糖之后，诱导其构象发生改变，使葡萄糖结合位点转向细胞内，释放葡萄糖入细胞，随后又恢复原先的构象，这样不断地将葡萄糖转运入细胞。
所以说GLUT蛋白构象的变化是其转运功能的基础。
GLUTs家族成员的差别主要在于组织分布的特异性、与葡萄糖分子的亲和性、转运动力学特性以及自身功能调控等方面。
如GLUTI分布于脑内神经元细胞，在轴突和树突上特别丰富。
GLUT3对葡萄糖分子有很高的亲和力（低Kn,），其亲和力高于GLUTl、GLU1'2和GLUT4；而且有更高的运输速率(carry ing capacity)，其运输速率可高出GLUTl和GLUT4至少5倍，说明GLUTI在结合和释放葡萄糖的两种构象之间的变换速率更高。
即使在血糖水平略低时也能以较高速率从细胞外液摄取葡萄糖，保障神经元的能量供应和脑功能活动。
GLUT2主要分布于肝细胞和胰岛B细胞，与葡萄糖的亲和力低于GLUTl，即GLUT2在较高血糖浓度时转运速率增加，而GLUTl在较低血糖浓度时转运速率就增加、在较高血糖浓度时因其结合葡萄糖的位点趋于饱和，表现为转运速率增加不多。
当餐后血糖从基础水平SmmoVL升至lOmmoVL时，肝细胞和胰岛B细胞运入葡萄糖的速率翻了1倍，而红细胞和表达GLUTl的细胞只略微增加。
肝细胞将转运进来的葡萄糖转化成糖原以备饥饿时分解利用，胰岛B细胞内因葡萄糖浓度的升高触发了胰岛素的分泌，血中胰岛素水平增高时，GLUT4痰泡可在几分钟内启动”上膜＂插入到肌细胞和脂肪细胞膜上，使GLUT4数目增加，促进这两种细胞增强葡萄糖的摄入而降低血糖，这一调控是胰岛素降低血糖的主要机制。
胰岛素缺乏或GLUT4数量或功能降低导致成人糖尿病(2型糖尿病）发生。
GLUT也是肿瘤细胞摄取葡萄糖的重要转运体。
肿瘤细胞生长快、代谢率高，以糖酵解方式代谢葡萄糖，这使它们摄取葡萄糖增加，需要相应增加GLUT的表达。
GLUT的高表达，与某些肿瘤的恶性表型和预后相关，这也是GLUT在医学研究中受到很多关注的原因之一。
（二）主动运输是载体蛋白逆浓度梯度的耗能运输被动运输只能顺浓度梯度穿膜转运物质，趋向千使细胞内外的物质浓度达到平衡，但实际上细胞内外许多物质浓度存在很大差异。
一般情况下，细胞内的K十浓度约为lOOmmoVL，而细胞外的K十浓度只有Smmol/L。
因此，在质膜两侧就有一个很＂陡＂的K十浓度梯度，有利于K十扩散到细胞外。
N旷在质膜两侧的分布正好相反，细胞外的浓度为150mmol/L，而细胞内则为10-20mmol/L。
Ca2＋在质膜两侧的分布的差别就更大，一般情况下，真核细胞细胞外的Ca2＋浓度要高千细胞内约10000倍。
这些浓度梯度由主动运输产生，以维持细胞内外物质浓度的差异，这对维持细胞生命活动至关重要（动画4-3“离子泵＂）。
主动运输是载体蛋白介导的物质逆电化学梯度、由低浓度一侧向高浓度一侧进行的穿膜转运方式。
转运的溶质分子其自由能变化为正值，因此需要与某种释放能量的过程相偶联，能量来源包括ATP水解、光吸收、电子传递、顺浓度梯度的离子运动等。
动物细胞根据主动运输过程中利用能量的方式不同，可分为ATP驱动泵（由ATP直接提供能量）和协同运输(ATP间接提供能量）两种主要类型。
1. ATP驱动泵常被称为ATP驱动蛋白或运输ATP酶(transport ATPase)，它们在膜的胞质侧具有一个或多个ATP结合位点，能够水解ATP使自身磷酸化，利用ATP水解所释放的能量将被转运分子或离子从低浓度向高浓度转运，所以常称之为＂泵＂。
根据泵蛋白的结构和功能特性，可分为4类：P型离子泵，V型质子泵，F－型质子泵和ABC转运体。
前3种只转运离子，后一种主要转运小分子（图4-16)。
(1)p型离子泵(P-class ion pump)：所有有机体都是依靠P型离子泵穿膜转运阳离子。
P型离子泵都有2个独立的大亚基（a亚基），具有ATP结合位点，绝大多数还具有2个小的B亚基，通常起调节作用。
在转运离子过程中，至少有一个a催化亚基发生磷酸化和去磷酸化反应，从而改变泵蛋白的构象，实现离子的穿膜转运。
由千在泵工作过程中，形成磷酸化中间体（天门冬氨酸残基作为磷酸化位点），“P”代表磷酸化，故名P型离子泵。
动物细胞的Na十－K＋泵、C汒泵和哺乳类胃腺壁细胞(parietal cells)上的H十－K+泵等都属于此种类型。
1)Na三伈泵：又称Na+-K+-ATP酶，是哺乳动物细胞膜中普遍存在的离子泵，由a亚基和B亚基岔今1构成。
a亚基分子量为120kD，是一个多次穿膜的膜整合蛋白，具有ATP酶活性。
B亚基分子扯为第四章细胞膜与物质的穿膜运输A.
p－型离子泵，B.
V－型质子泵；C.
F－型质子泵；D.
ABC转运体50kD，是具有组织特异性的糖蛋白，并不直接参与离子的穿膜转运，但能帮助在内质网新合成的a亚基进行折叠，当把Q亚基与B亚基分开时，Q亚基的酶活性即丧失，其他功能还不清楚。
Q亚基有3个Na十结合位点、2个K结合位点和一个ATP结合位点。
K结合位点可被乌本昔高亲和结合。
其作用过程如图4-17所示：在细胞膜内侧a亚基与ATP结合时，离子结合位点朝向细胞内，此时Q亚基与N旷亲和性较高与K十的亲和力低，使已结合的2个臣释放到细胞内，并与3个Na十结合；结合N旷后Q亚基的ATP酶活性被激活，ATP水解为ADP和磷酸，磷酸基团与a亚基上的一个天门冬氨酸残基共价结合使其磷酸化，ATP水解释放的能量驱动Q亚基构象改变，使离子结合位点朝向细胞外；这时a亚基对Na+的亲和性降低而对K十的亲和力增高，使巳结合的3个N旷释放到细胞外并与胞外2个K+结合；k＋与磷酸化的a亚基结合后促使其去磷酸化，再次与一分子ATP结合使蛋白构象又恢复原状，失去对K的亲和力，将K十释放到胞内，完成一个循环。
生物化学家].
C. S kou等人因揭示了Na+-K+泵的蛋白组分及工作原理而获得1997年诺贝尔化学奖。
图4-17Na+-K+ATP酶活动示意图1.
N旷结合到酶上；2酶磷酸化；3酶构象变化，Na十释放到细胞外；4.
K十与酶蛋白质结合；5酶去磷酸化；6酶构象恢复原始状态，伈释放到细胞内水解一个ATP分子，可输出3个Na+，转入2个K+o N旷依赖的磷酸化和K十依赖的去磷酸化如此有序地交替进行，每秒钟可发生约1000次构象变化。
当Na+-K+泵抑制剂乌本节在膜外侧占据k十的结合位点后，Na•-K+-ATP酶活性可被抑制；当抑制生物氧化作用的饥化物使ATP供应中断时，Na+-K+泵失去能量来源而停止工作。
大多数动物细胞要消耗ATP总量的20%-30%（神经细胞要占到约70%）用于维持Na•-K+泵的活动，从而保证细胞内低Na十高k十的离子环境。
这具有重要的生理意义，如调节渗透压维待恒定的细胞体积、保持膜电位、为某些物质的吸收提供驱动力和为蛋白质合成及代谢活动提供必要的离子浓度等。
2)Ca"泵：真核细胞胞质中含有极低浓度的Ca气,::;10-1mol/L)，而细胞外Ca2＋浓度却高得多（约10-3mol/L)。
细胞内外的Ca2＋浓度梯度部分是由膜上的Ca2＋泵维持的。
Ca2＋泵不仅位千质膜上，还集中于肌细胞的肌浆网和其他细胞的内质网膜上。
目前了解较多的是肌浆网上的C汒泵，巳获得了Ca2＋泵三维结构高分辨解析，它是10次穿膜的a-螺旋多肤链，大约由1000个氨基酸残基构成，与Na+－K+－ATP酶的a亚基同源，说明这两种离子泵在进化上有一定关系。
像Na+-K•泵一样，Ca2＋泵也是ATP酶，在C砍泵工作周期中，Ca2•-ATP酶也有磷酸化和去磷酸化过程，通过两种构象改变，结合与释放Ca2+。
肌浆网和内质网膜上的钙泵每水解一分子ATP，能逆浓度梯度转运2个Ca2＋进入肌浆网或内质网中；而质膜中的钙泵，每水解一分子ATP，可将结合的1个Ca2＋胞质转运至胞外。
两种钙泵的共同作用可使胞质中的游离Ca2＋保持在0.1-0.2µmol/L低的水平，仅为细胞外液浓度(1~2mmol/L)的万分之一。
细胞内外较大的Ca2+浓度差使得细胞对胞质内Ca2＋浓度的升高非常敏感，在细胞外信号作用时Ca2＋经钙通道顺其浓度梯度快速进入胞质内，骤然升高的Ca2•浓度成为促发和激活许多生理活动的关键因素，如肌肉收缩、腺上皮细胞分泌、神经递质释放以及某些酶蛋白和通道蛋白激活等。
C亡泵的活性受到钙调蛋白(calmodulin, CaM)的调控，钙调蛋白位于胞质基质、质膜和内质网膜，当胞质中Ca2＋浓度升高时，钙调蛋白与钙离子结合，然后作用千C汒泵使其别构性激活，结果Ca2＋迅速被泵出细胞或泵回肌质网，使胞质中钙离子浓度迅速降低，上述功能活动结束。
第四章细胞膜与物质的穿膜运输
自我保护。
第一个被鉴定的真核细胞ABC蛋白来自对肿瘤细胞和抗药性培养细胞的研究。
这些细胞高水平表达一种多药抗性运输蛋白(multidrug resistance protein, MDR)，这种蛋白能利用水解ATP的能量将多种通过质膜进入细胞的脂溶性药物泵到细胞外，减轻了药物对肿瘤细胞的毒性作用，使细胞对肿瘤化疗中常用的多种化疗药物同时发生抵抗。
研究表明该蛋白在各种肿瘤细胞中过度表达，有多达40％的人类恶性肿瘤可发生固有的或获得性的多药耐药，这成为肿瘤治疗的一大障碍。
ABC转运体在哺乳动物免疫监视中具有重要作用，来自细菌、病毒或其他病原微生物的蛋白降解产物，可被位于内质网膜上的ABC转运体转运至内质网腔，然后被递呈(present)在细胞膜表面作为抗原被细胞毒性T淋巴细胞识别。
2协同运输细胞所建立的几种浓度梯度，如Na+,K+和W浓度梯度，是储存自由能的一种方式。
储存在离子浓度梯度中的势能可以供细胞以多种途径来做功。
协同运输(cotransport)是一类由Na三代泵（或甘泵）与载体蛋白协同作用，间接消耗ATP所完成的主动运输方式。
物质穿膜运动所需要的直接动力来自膜两侧离子的电化学梯度中的能量，而维持这种离子电化学梯度是通过Na+-K+泵（或W泵）消耗ATP所实现的。
若用药物抑制Na十－K＋泵活动，相应的协同运输也逐渐减弱或消失。
动物细胞的协同运输是利用膜两侧的N旷电化学梯度来驱动，植物细胞和细菌是利用打电化学梯度来驱动。
根据溶质分子运输方向与Na十或甘顺电化学梯度转移方向的关系，又可分为共运输(symport)与对向运输(anti port）。
(1)共运输：是载体蛋白介导的两种溶质分子相同方向的联合转运。
在这种方式中，物质的逆浓度梯度穿膜运输与所依赖的Na十或W顺浓度梯度的运输两者方向相同。
如葡萄糖在小肠黏膜上皮的吸收和在近端肾小管上皮的重吸收都是通过Na+－葡萄糖转运体(Na+-glucose cotransporter)进行的。
在小肠中酶把多糖水解成单糖，小肠黏膜上皮细胞游离面上的Na+－葡萄糖转运体在质膜外表面分别结合2个Na十和1个葡萄糖分子，当Na勹顶浓度梯度进入细胞时，葡萄糖就利用N旷电化学梯度差中的势能，与Na十相伴随逆浓度梯度进入细胞。
转运体在A和B两种构象间转换，当Na十在胞质内释放后转运体蛋白构象发生改变，失去对葡萄糖的亲和性而与之分离，转运体蛋白构象又恢复原状，可反复工作（图4-18)。
研究表明N旷和葡萄糖在转运体上的结合是协同的，即其中一种的结合诱发转运体构象的改变，大大增加对另一种的亲和力，缺乏一种另一种无法结合到转运体上。
因为细胞外N旷浓度很高，葡萄糖也就很容易在A状态结合到转运体上。
进入细胞的Na十被Na+-K+-ATP酶泵出细胞外，以保持Na+的跨膜浓度梯度。
由此可见，这种运输所消耗的能量，实际上是由ATP水解间接提供的。
Na+－葡萄糖转运体在小肠是以2个Na+1个葡萄糖联合转运，在肾小管上皮则是以1个Na+1个葡萄糖联合转运的。
体内多种细胞的质膜上都有依赖N旷的同向转运体，各自负责运送一组特异糖类（如葡萄糖、果糖、甘露糖、半乳糖）、氨基酸、水溶性维生素进入细胞。
如小肠黏膜上皮中参与氨基酸和维生素吸收的Na+－氨基酸、Na+－维生素（维生素B!、维生素B2、维生素B6、维生素PP)同向转运体；肾小管上皮细胞的Na+-HC03-、Na+-K+-2C厂Na+-Ci-,K+-c1-同向转运体；甲状腺上皮细胞摄取I的Na十－I一同向转运体等都属于N旷驱动的共运输形式。
(2)对向运输：同一种转运体将两种不同的离子或分子分别向膜的相反方向的运输过程，由离子浓度梯度驱动。
脊椎动物细胞中有多种对向运输转运体：心Na+-Ca2+交换体。
几乎所有细胞都存在Na+-Ca2＋转运体，以转入3个N旷排除1个Ca2+的化学计晕联合转运。
心肌细胞在兴奋－收缩偶联过程中流入的Ca2＋主要通过Na+-Ca2＋转运体将其排除细胞；在小肠黏膜上皮细胞和肾近端小管细胞底侧膜Na+-Ca2＋转运体转运Ca2＋进入组织液然后入血，是Ca2＋吸收的重要载体蛋白。
(2)Na+-H'交换体。
这种交换蛋白偶联1个N旷顺浓度梯度流进与1个W泵出，可清除细胞代谢过程中产生的过多的H十以调节胞质内pH(=7.2)；肾近端小管的Na+－甘交换体向小管液中排出W以利于HC03一被重吸收，在排出固定酸和维持机体酸碱平衡中起重要作用。
＠Ci--HC03一交换体。
在细胞内HC03一升高时，将HC03运出细胞同时将Cl运入，从而介导HC03一和CO2的输出这在破骨细胞和胃泌酸活动中发挥基底面/Na+）/(Na+－K泵｝细胞外液体图4-18`小肠上皮细胞定向转运葡萄糖入血示意图小肠上皮细胞顶部质膜中的Na+－葡萄糖同向转运体，输入2N旷同时偶联转运l个葡萄糖分子进入细胞，使胞质内产生高葡萄糖浓度；底侧部质膜上的葡萄糖易化扩散载体蛋白顺浓度梯度转运葡萄糖离开细胞进入肠壁组织液然后入血，形成葡萄糖的定向转运；底侧膜上的Na+-K+泵将运人进胞内的Na十泵出细胞以维持Na十跨膜浓度梯度。
不同运输蛋白的特异性分布及上皮细胞间的紧密连接是葡萄糖定向转运的结构基础作用，红细胞中携带的CO2也是通过这种方式迅速排至血液。
人和其他哺乳动物胃液中的盐酸(HCl)也称为胃酸(gastric acid)，使胃液呈强酸性(pH0.91.5)，可杀灭随食物进入胃内的细菌、使蛋白质变性有利于水解、为胃蛋白酶功能活性提供合适的酸性环境。
盐酸是由胃腺中的壁细胞(pari etal cells)分泌，壁细胞邻近胃腔的顶部质膜含有H+-K+泵，把W逆巨大的浓度梯度主动转运至胃腔中，同时驱动k十进入细胞。
但由于细胞内[W]x[OH-］为常数，所以“多余的“OH一与从血液中扩散进入的CO2在碳酸酐酶的催化下结合形成HC03-,HC03一通过壁细胞底部质膜上的Cl--HC03一交换体顺浓度梯度运出细胞，而Cl一被反向转运进入细胞。
壁细胞顶部质膜上的钾通道和氯通道开放，细胞内的K勹顶浓度梯度进入胃腔，进入细胞内的C「通过氯通道进入胃腔，并与W形成HCl。
壁细胞底部质膜上的Cl--HC03一反相偶联载体就这样配合H十－K＋泵的活动参与胃酸的分泌（图4-19)。
治疗胃溃疡的药物奥美拉嗤因能与H+-K+泵特异性结合抑制其活性，成为常用的抑酸剂。
综上所述，细胞的许多功能活动包括肾小管和肠黏膜上皮细胞的吸收功能，需要多种转运蛋白的协同作用，而且不同转运蛋白在细胞膜上的不对称分布是定向转运的结构基础。
上述各种“主动运输”方式的特点是：心主动运输为小分子物质逆浓度或电化学梯度穿膜转运；＠需要消耗量，可直接利用水解ATP或利用来自离子电化学梯度提供能量；＠需要膜上特异性载体蛋白介导，这些载体蛋白不仅具有结构上的特异性（特异的结合位点），而且具有结构上的可变性即通过蛋白构象进行物质转运。
细胞根据生理活动的需要，通过各种不同的方式协同完成各种小分子物质的穿膜转运。
现将部分载体蛋白种类与功能总结于表4-1。
低低
第四章细胞膜与物质的穿膜运输
Cl通道
```三巨k十通道侧部细胞质I,-Hco,cr底部尸图4-19壁细胞分泌盐酸时其质膜上多种转运蛋白的协同作用壁细胞顶部质膜上的H-K•泵，进行H十K交换，把H十运出细胞即泌入胃腔。
壁细胞底部质+＋－膜上的Ci--HC03一交换体把HC03一运出细胞进入血液用以转移过多的OH，避免细胞内酸_碱平衡紊乱。
壁细胞顶部质膜上的钾通道和氯通道开放使转运进来的货运出、C「进入胃腔功能能量来源载体蛋白位置被动运输葡萄糖大多数动物细胞的质膜葡萄糖易化扩散运输蛋白无主动运输葡萄糖肾与肠上皮细胞顶部质膜N旷梯度N旷驱动的葡萄糖转运体Na+－W交换体动物细胞膜Na•梯度输出H+，调节胞内pHNa+-K+泵(Na+-K+-ATP酶）大多数动物细胞膜ATP水解主动输出Na十，输入K+C汒泵(Ca2+-ATP酶）真核细胞膜ATP水解主动运输Ca2•W泵(W-ATP酶）动物细胞溶酶体膜等ATP水解从胞质中主动输入H+（三）离子通道高效转运各种离子构成生物膜核心部分的脂双层对带电物质，包括Na+,K+,Ca2+,Ci-等极性很强的离子是高度不可透的，它们难以直接穿膜转运，但各种离子的穿膜速率很高，可在数毫秒内完成，在多种细胞活动中起关键作用。
这种高效率的转运是借助膜上的通道蛋白完成的。
目前已发现人类离子通道蛋白约有400余种，普遍存在于各种类型的细胞膜以及细胞内的膜上。
因为这些通道蛋白都与离子的转运有关，所以通道蛋白也称为离子通道(ion channel)。
1离子通道的特点离子通道为整合膜蛋白构成，与载体蛋白不同，它们可以在膜上形成亲水性的穿膜孔道，快速并有选择地让某些离子通过而扩散到质膜的另一侧。
通道蛋白有以下几个特点：心通道蛋白介导的是被动运输，通道是双向的，离子的净通量取决于电化学梯度（顺电化学梯度方向自由扩散），通道蛋白在转运过程中不与溶质分子结合。
＠离子通道对被转运离子的大小和所带电荷都有高度的选择性。
只有大小和电荷适宜的离子才能通过，如钾离子通道只允许k十通过，而不允许N旷通过。
＠转运速率高，通道可以在每秒中内允许lO6~108个特定离子通过，比载体蛋白所介导的最快转运速率高约100倍以上。
＠多数离子通道不是持续开放，离子通道开放受＂闸门＂控制，即离子通道的活性由通道开或关两种构象所调节，以对一定的信号做出适当的反应。
2离子通道的类型已经确认的大多数离子通道以开放构象或以关闭构象而存在，通道运输的原理是构象变化导致孔道的开放、失活或关闭。
通道的开放与关闭受细胞内外多种因素的调控，被称为＂门控”(gated)，如同一扇门的开启和关闭。
通常根据通道门控机制的模式不同和所通透离子的种类，将门控通道大致分为三大类。
(1)配体门控通道：配体门控通道(ligand-gated c hann e l)实际上是离子通道型受体，它们与细胞外的特定配体(ligand)结合后，发生构象改变，结果将“门“打开，允许某种离子快速穿膜扩散。
乙酰胆碱受体(ace tylcholine receptor, AChR)是典型的配体门控阳离子通道，第一个被提纯、测序、克隆的通道蛋白。
其大矗分布于骨骼肌神经肌接头处，当与神经末梢释放的神经递质乙酰胆碱结合后通道打开，将细胞外化学信号快速转化为电信号，实现了神经对肌肉的收缩支配。
它是由4种不同亚单位组成的五聚体穿膜蛋白(a沿裕），每个亚单位均由一个大的穿膜N端（约210aa),4段穿膜序列(Ml-M4)以及一个短的胞外C端组成。
各亚单位通过氢键等非共价键形成一个结构为a心裕的梅花状通道结构，乙酰胆碱(ACh)在两个a亚单位表面各有一个结合位点。
在无ACh结合的情况下，受体各亚基中的M2共同组成的孔区处于关闭状态，一旦AC h与受体结合，便会引起孔区的构象改变，通道打开。
一般可通过的阳离子是Na＼伈和Ca2+。
神经肌接头处肌细胞外为高浓度的Na+，所以乙酰胆碱受体开放导致一次N旷的大量内流，引起肌细胞膜的去极化，继而引发多种离子通道的依次激活开放，最终引起肌肉收缩（图4-20)。
乙酰胆碱受体是重要的药物靶点，箭毒植物马钱子(curare)中提取的d－筒箭毒碱能与乙酰胆碱竞争性结合AChR，使AChR失活阻断神经传导，因呼吸肌麻痹导致中毒死亡。
人工合成的箭毒类似物作为肌肉松弛剂应用于外科手术麻醉。
肉毒杆菌毒素(botulinum toxin)通过抑制突触前部乙酰胆碱释放，阻断了神经肌接头传导，可用于美容除皱和治疗肌肉痉挛、惊厥、多汗症等。
电压门控Ca2＋通道乙酰胆碱门控
阳离子通道、一一－--
\＼、^＿电压门控Ca2＋通道
电压门控Na前i”
肌浆网肌细胞膜
门控Ca2＋释放通道
静止的神经肌肉连接激活的神经肌肉连接
图4-20神经－肌接头处的离子通道协同活动示意图1神经冲动传至神经末梢细胞膜去极化，引起膜上电压门控Ca2•通道瞬时开放，外Ca“内流导致突触小泡内的乙酰胆碱释放至突触间隙；2乙酰胆碱与突触后肌细胞膜上的AChR结合，乙酰胆碱门控N旷通道开放，N旷内流引起细胞膜局部去极化；3局部去极化诱发电压门控Na十离子通道开放，大扯Na十涌入使细胞膜去极化扩散到整个肌细胞膜；4和5肌细胞膜去极化，动作电位引起肌膜特殊部位T管上电压门控Ca2•通道开放，相邻的肌浆网上Ca“通道开放，使得肌细胞内Ca"浓度突然增加，引起肌原纤维收缩（图未显示）
继AChR之后，又陆续发现了的其他神经递质的受体作为离子通道，如丫－氨基丁酸(GAB凡和GABAc)受体、甘氨酸(Gly)受体、5轻色胺(5-HT)受体以及一类谷氨酸门控阴离子通道(GluCl受体）。
例如，5-HT受体与ACh受体可选择性地通透Na\K＋和C砍等阳离子。
GAB凡和GABAc受体、第四章细胞膜与物质的穿膜运输Gly受体、GluCl受体则主要对C「通透。
从它们的氨基酸序列和整体结构的相似性足以证明它们有共同的进化起源。
离子通道典型位置功能
K飞参漏通道大多数动物细胞膜维持静息膜电位
电压门控N旷通道神经细胞轴突质膜产生动作电位电压门控k前通道神经细胞轴突质膜在一个动作电位之后使膜恢复静息电位电压门控Ca2.通道神经终末的质膜激发神经递质释放（将电信号转换为化学信号）
乙酰胆碱N旷和Ca“通道在神经－肌接头处质膜在靶细胞将化学信号转换为电信号GABA门控C「通道许多神经元的突触处质膜抑制性突触信号应力激活阳离子通道内耳听觉毛细胞感受声波震动（四）水通道介导水的快速转运水分子虽然可以以简单扩散方式通过细胞膜，但是扩散速度非常缓慢，但有许多细胞如肾小管和肠上皮细胞，血细胞，植物根细胞及细菌等对水的吸收极为快速。
长期以来，人们就猜想细胞膜上可能存在水的专一通道。
直到1988年，美国学者P.A驴·e在分离纯化红细胞膜Rh血型抗原核心多肤时偶然发现质膜上有构成水通道的膜蛋白，这种蛋白质被命名为水孔蛋白(aquaporin, AQP)，从而确认了细胞膜上有水转运通道蛋白的理论，Agre因此获得了2003年诺贝尔化学奖。
1水通道的分类目前发现哺乳动物水通道蛋白家族已有11个成员(AQPO-AQPlO)，根据其功能特性的差异分为两个家族：AQP l、2、4、5、6和AQPO基因结构类似，氨基酸序列30%-50％同源，只能通透水，属于经典的选择性水通道(orthodox aquapor ins); AQP3、7、9、10除对水分子通透外，对甘油和尿素等中性小分子也具有通透性，成为AQP家族的第二个亚家族一一水－甘油通道(aq uaglyceropori n)。
AQP8位于水选择型和甘油渗透型之间，功能尚不明确。
2水通道蛋白的结构水通道蛋白家族中AQP l的结构研究得比较清楚。
AQP l在质膜上是由四个对称排列的圆筒状亚基包绕而成的四聚体，每个亚基（即一个AQPl分子）的中心存在一个只允许水分子通过的中央孔，孔的直径约0.28nm，稍大于水分子直径。
一个AQPl分子是一条多肤链，AQPl分子的6个长a－螺旋构成基本骨架，其间还有两个嵌入但不贯穿膜的短a－螺旋几乎顶对顶地位于脂双层中。
在两个短螺旋相对的顶端各有一个在所有水通道家族蛋白中都保守存在的Asn-Pro Ala(NPA)基序(motif)，它们使得这种顶对顶结构得以稳定存在（图4-21)。
亲水性通道的壁由这6条兼性的a－螺旋围成，每个螺旋朝向脂双层一面由非极性氨基酸残基构成，他们通过范德华力和疏水性相互作用与脂肪酸链连接；朝向中央孔一面由极性氨基酸残基构成。
，日{t;K\孔···••·次:o.／孔A水通道4个亚基的中心分别存在水孔；B每个亚基含6条穿膜a－螺旋，两个短a－螺旋嵌入但不贯穿膜顶对顶位于脂双分子层中；C质膜中4个亚基组3.水通道对水分子的筛选机制AQPl等水孔蛋白形成对水分子高度特异的亲水通道，只允许水而不允许离子或其他小分子溶质通过。
这种严格的选择性主要是由于：(DAQP l中央孔通道的直径(0.28nm)限制了比水分子大的小分子通过；＠AQPl中央孔通道内溶质结合位点的控制。
当一个水分子要通过直径0.28nm的水通道时，它必须要剥除其周围与之水合的水分子，而通道管窄口周围的几种极性氨基酸残基上的碳基氧可与通过的水分子形成氢键，替代了水分子之间的氢键，使得这种去水合过程中需要的能量得到补偿。
而离子与水分子之间的水合作用比水分子之间大得多，AQPl水通道的通道管中，能替代水合水分子的叛基氧数量不足，离子只能脱去部分水分子，对千部分脱去水分子的离子水合物而言，水通道太窄无法通过。
一般认为，水通道是处于持续开放状态的膜通道蛋白，一个AQP l通道蛋白每秒钟可允许3xlO9个水分子通过。
水分子的转运不需要消耗能址，也不受门控机制调控。
水分子通过水通道的移动方向完全由膜两侧的渗透压差决定，水分子从渗透压低的一侧向渗透压高的一侧移动，直至两侧渗透压达到平衡，因此，水通道是水分子在溶液渗透压梯度的作用下穿膜转运的主要途径。
水通道大量存在于与体液分泌和吸收密切相关的上皮和内皮细胞膜上，其中AQPL是红细胞膜上的主要水通道，也分布于肾、脉络丛、毛细血管等多种组织细胞上。
AQP2只分布在肾集合管上皮主细胞顶端质膜，其分布数扯受抗利尿激素调控。
肾小管原尿中大量的水通过AQP2迅速被重吸收，AQP2基因的突变导致先天性肾性尿崩症。
AQPO分布于眼晶状体，参与晶状体的水代谢、维持其透明性，AQPO基因突变导致人类先天性白内障。
AQP4分布于脑内胶质细胞和脑室管膜细胞，AQP5分布于腺体、肺和角膜。
AQP参与机体的多种重要生理功能，如尿浓缩、保持水盐代谢平衡、各种消化液的分泌及胃肠道各段的体液吸收、调节脑室内液体平衡、促进房水分泌词节眼压等。
随若对水通道蛋白功能认识的不断深化，水通道正在作为治疗人类疾病的药物作用靶点而引起重视，水通道功能的调节剂可能为许多与体液代谢异常有关的疾病提供新的治疗途径。
第三节大分子和颗粒物质的穿膜运输
小分子物质和离子在膜运输蛋白的介导下进行穿膜运输，但膜运输蛋白不能转运大分子物质如蛋白质、多核节酸、多糖等。
大多数细胞都能摄入和排出大分子物质，有些细胞甚至能吞入大的颗粒，为完成这种功能，细胞进化出一套将细胞外环境中的物质以包入物形式进行摄取的机制。
大分子和颗粒物质被运输时并不直接穿过细胞膜，都是由膜包围形成艇泡，通过一系列膜襄泡的形成和融合来第四簟细胞膜与物质的穿膜运输完成转运过程，故称为毅泡运输(ves icular transpott)。
细胞摄入大分子或颗粒物质的过程称为胞吞作用(endocylosis)；细胞排出大分子或颗粒物质的过程称为胞吐作用(exocytosis)。
在此转运过程中涉及膜泡的组装、断裂、移位与融合等耗能过程，也属于主动转运。
这种运输方式常转运较大量的大分子或颗粒物质，又称为批量运输(bulk transport)。
小泡运输不仅发生在质膜，胞内各种膜性细胞器（如内质网、高尔基复合体、溶酶体等）之间的物质运输也是以这种方式进行的。
所以，小泡运输对细胞内外物质交换、信息交流均有重要作用。
本节主要介绍大分子与颗粒物质通过质膜进行的穿膜运输。
一、胞吞作用
胞吞作用又称内吞作用，它是质膜内陷，包围细胞外物质形成胞吞泡，脱离质膜进入细胞内的转运过程（动画4-4“细胞的内吞作用”)。
根据胞吞物质的大小、状态及特异程度不同，可将胞吞作用分为三种类型：吞噬作用、胞饮作用及受体介导的胞吞。
(—)吞噬作用是吞噬细胞摄入颗粒物质的过程
吞噬作用(phagocytosi s)由几种特殊细胞完成。
为细胞摄取较大的颗粒物质（无机尘粒、细菌、细胞碎片等）或多分子复合物进入细胞的过程。
细胞内陷或形成伪足包裹大分子或颗粒物质形成吞噬体进入细胞。
吞噬作用包括吸附和吞入两个相对独立的过程。
被吞噬的物质首先吸附在细胞表面，一般认为，吸附不具明显的专一性。
随之吸附区域的细胞膜向内凹陷形成毅，褒口部分的膜融合封闭形成膜泡，将颗粒物包裹后从膜上分离下来进入细胞，膜泡将与溶酶体融合被消化降解。
吞噬形成的膜泡称为吞噬体(phagosome)或吞噬泡(phagocytic vesicle)。
对颗粒物质的吞入是由质膜下肌动蛋白丝所驱动。
动物体内只有中性粒细胞、单核细胞及巨噬细胞具有吞鸥功能，它们广泛分布在血液和组织中，吞噬入侵的微生物、清除损伤、衰老和凋亡的细胞，如入的巨噬细胞每天通过吞噬作用清除约1011个衰老的红细胞。
所以吞噬作用在机体防御和稳定内环境中发挥重要作用。
（二）胞饮作用是细胞吞入液体和可溶性物质的过程胞饮作用(pinocytosi s)是细胞吞入大分子溶液物质或极微小颗粒物的活动。
当细胞周厮环境中某可溶性物质包括氨基酸、蛋白质等达到一定浓度时，引起细胞产生胞饮活动。
胞饮作用发生在质膜上的特殊区域，质膜下微丝的收缩使质膜内陷包围液体物质，接着形成一个没有外被包裹的膜性小泡，称为胞饮体(pinosome)或胞饮泡(pinocytic vesicle)，直径小于150nm。
根据细胞外物质是否吸附在细胞表面，将胞饮作用分为两种类型：一种是液相内吞(fiuid-phase endocytosis)，这是一种非特异的固有内吞作用，通过这种作用，细胞把细胞外液及其中的可溶性物质摄入细胞内。
另一种是吸附内吞(absorpt ion endocytos i s)，在这种胞饮作用中，细胞外大分子及／或小颗粒物质吸附在细胞表面（与糖蛋白的静电作用或与受体结合），因此具有一定的特异性。
胞饮泡进入细胞后与内体(endosome)融合或与溶酶体融合后被降解。
但也存在胞饮泡不与溶酶体融合而是穿过细胞质与另一侧的质膜融合胞吐，这个过程称为转胞吞作用(transcytosis)，如母鼠将抗体通过乳汁传递给仔鼠的过程。
胞饮作用所造成质膜的损失和吞进的细胞外液，由胞吐作用补偿和平衡。
胞饮作用几乎发生在所有类型的真核细胞中，但在能形成伪足和转运功能活跃的细胞中多见，如巨噬细胞、白细胞、毛细血管内皮细胞、肾小管上皮细胞、小肠上皮细胞等。
（三）受体介导的胞吞提高摄取特定物质的效率
受体介导的胞吞(receptor-mediated endocytosis)是细胞通过受体的介导选择性高效摄取细胞外特定大分子物质的过程。
有些大分子在细胞外液中的浓度很低，进入细胞需先与膜上特异性受体识别并结合，然后通过膜的内陷形成裂泡，粪泡脱离质膜而进入细胞。
这种作用使细胞特异性地摄取细胞外含量很低的成分，而不需要摄入大量的细胞外液，与非特异的胞吞作用相比，可使特殊大分子的内化效率增加1000多倍（动画4-5“受体介导的内吞作用”)。
1.有被小窝和有被小泡的形成细胞膜上有多种配体的受体，如激素、生长因子、酶和血浆蛋白的受体等。
受体集中在质膜的特定区域，称为有被小窝(coated pits)。
有被小窝具有选择受体的功能，该处集中的受体的浓度是质膜其他部分的10~20倍。
体外培养细胞中，有被小窝约占质膜表面积的2%。
电镜下有被小窝处质膜向内凹陷，直径约50-lOOnm，凹陷处的质膜内表面覆盖若一层毛剌状电子致密物，其中包括网格蛋白和衔接蛋白。
受体介导的胞吞，第一步是细胞外溶质（配体）同有被小窝重链轻链处的受体结合，形成配体－受体复合物，网格蛋白聚集在有被小窝的胞质侧，有被小窝形成后进一步内陷，与质膜断离后形成有被/小泡(coated vesi cle)进入细胞。
有被小泡负责将细胞外特性物II//j质向细胞内转运，其外表面包被由网格蛋白组装成的笼状篮网结构。
网格蛋白(clathrin)也称作成笼蛋白，是一种蛋白复合物，由.
3条重链和3条轻链组成。
重链是一种纤维蛋白，分子量180kD,轻链分子量为35kD，二者组成二聚体，三个二聚体又形成三腿蛋I白复合体(triskelion)，是包被的结构单位（图4-22)。
由三腿蛋白复合体聚合成六角形或五角形的篮网状结构，覆盖于有被小窝茵4-22三腿蛋臼荽合体模式图（或有被小泡）胞质一侧的表面。
三腿蛋白复合体具有自我装配的能力，它们在试管中能自动装配成封闭的篮网结构。
网格蛋白的作用主要是牵拉质膜向内凹陷，参与捕获特定的膜受体使其聚集于有被小窝内（图4-23)。
有被小窝货物分子
白蛋动发
胞质溶胶
衔接蛋白j裸露的转运小泡
有被小泡
在有被小泡的蛋白包被中，还有一种介千网格蛋白与配体－受体复合物之间的衔接蛋白(adapti n)参与包被的形成。
目前发现，网格蛋白没有特异性，本身不起捕获特异性转运分子的作用。
衔接蛋白既能结合网格蛋白，又能特异性地结合跨膜受体胞质面的尾部肤信号(peptide signal)，从而通过网格蛋白包被小泡实现受体介导的选择性运输。
2.无被小泡形成并依次与内体和溶酶体融合当配体与膜上受体结合后，网格蛋白聚集在膜的胞质侧，通过一些六边形转变成五边形的网格，促进网格蛋白外被弯曲转变成笼形结构，牵动质膜凹陷。
有一种小分子GTP结合蛋白一发动蛋白(dynamin)，在深陷的有被小窝颈部组装形成环，发动蛋白水解与其结合的GTP后发生构象改变引起颈部溢缩，将有被小泡从质膜上切离下来，形成网格蛋白包被小泡(clathrin coated ves icle）。
一旦小泡从质膜上脱离下来，几秒钟后脱去包被变成表面光滑的无被小泡，网格蛋白分子返回到质膜下方，参与形成新的衣被小泡重复使用。
无被小泡继而与早期内体(early en dosome)融合。
内体是动物细胞质中经胞吞作用形成的一种由膜包围的细胞器，其作用是运输由胞吞作用新摄入的物质到溶酶体被降解。
内体膜上有ATP驱动的质子泵，将甘泵入内体第四章细胞膜与物质的穿膜运输腔中，使腔内pH降低(pH5~6)。
大多数情况下，内体的低pH改变了受体和配体分子的亲和状态，从而释放出与其结合的配体分子。
受体与配体分离后，内体以出芽的方式形成运载受体的小毅泡，返回质膜，受体重新利用，开始下一轮的内吞作用。
含有配体的内体将与溶酶体融合，内吞的物质被溶酶体酶降解消化。
动物细胞对许多重要物质的摄取都是依赖千受体介导的胞吞，大约有50种以上的不同蛋白质、激素、生长因子、淋巴因子以及铁、维生素B12等通过这种方式进入细胞。
流感病毒和AIDS病毒(HIV)也通过这种胞吞途径感染细胞的。
动物细胞通过受体介导的胞吞摄入所需的大部分胆固醇。
胆固醇是构成生物膜的主要成分，还是很多重要生物活性分子的前体化合物，如类固醇激素、游离胆固醇维生素D和胆酸等。
胆固醇在肝脏中合成并包装磷脂成低密度脂蛋白(low density lipoprolein, LDL)在血液中运输。
LDL为球形颗粒，直径约为22nm，中心含有大约1500个酷化的胆固醇分子，其外包围着800个磷脂分子和500个游离的胆固醇分子。
载脂蛋白ApoB lOO是细胞膜上LDL受体的配体，它将酷化胆固醇、磷脂、游离胆固醇组装成球形颗粒（图4-24)。
LDL受体是由839个氨基酸组成的单次穿膜糖蛋白，当细胞需要利用胆固醇时，细胞即合成LDL受体，并将其镶嵌到质膜中，受体介导的LDL胞吞过程如图4-25所示。
如果细胞内游离胆固醇积累过多时，细胞通过反馈调节，停止胆固醇及LDL受体的合成。
正常人每天降解45％的LDL，其中2/3经由受体介导的胞吞途径摄入细胞而被降解利用。
如果细胞对LDL的摄入过程受阻，血液中胆固醇含扯过高易形成动脉粥样硬化，是家族性高胆固醇血症发病的主要原因。
LDL受体质膜
胞质溶胶
胞吞作用
有被小
忍勺'-11受体有被小泡]色）去外被/早期内体二一一，＿的转运小泡图4-25LDL受体介导的LDL胞吞过程受体向有被小窝集中与LDL结合，有被小窝凹陷、缢缩形成有被小泡进入细胞；有被小泡迅速脱去外被形成无被小泡；无被小泡与内体融合，在内体酸性环境下LDL与受体解离；受体经转运毅泡返回质膜被重新利用。
含LDL的内体与溶酶体融合，LDL被降解释放出游离胆固醇和脂肪酸被细胞利用经典实验：LDL受体的发现－－－－－－－－－－－－－-------------------------｀、｀研究背景家族性高胆固醇血症(FH)是一种常染色体显性遗传病。
患者血浆胆固醇水平异常增高，可达正常值的6~10倍，大多数患者发生动脉粥样硬化并死于早发性心脏病。
1972年开始，美国得克萨斯大学达拉斯医学院的M.
S. Brown和J.
L. Goldstein展开了对这种疾病的研究工作。
他们推断胆固醇的过量产生是由于胆固醇生物合成的调节机制发生缺陷引起的。
基于这种假设，他们从正常个体和FH患者的皮肤分离出成纤维细胞进行培养，进行胆固醇生物合成调节的研究，并在成纤维细胞上发现了LDL受体。
对LDL受体的鉴定，引发了一系列突破性实验，在随后的研究中Brown和Goldstein等揭示了受体介导的内吞途径。
实验内容
Brown和Goldstein等首先梒测成纤维细胞中HMG-CoA还原酶（胆固醇合成的限速酶）的调节作用。
在培养正常成纤维细胞的培养基中加入LDL，栓剧发现HMG-CoA还原酶活性下降，相应成纤维细胞中胆固醇合成水平也降低。
而FH患者的成纤维细胞在加入LDL后，HMG-CoA还原酶活性无改变，其活性是正常对照组成纤维细胞的40~60倍。
实验又从细胞培养的笫6天起，换成无LDL的培养基，发现正常对照组HMG-CoA还原酶的活性逐渐增高，细胞也合成了更多的胆固醇。
相比之下，FH患者的成纤维细胞对培养基中LDL的存在与否无反应。
结果表明，正常细胞通过调节HMG-CoA还原酶的活性（改变胆固醇的合成量）以适应环境中LDL浓度的改变；FH患者细胞不能感受环境中LDL的含量变化，HMG-CoA还原酶的活性持续保持高水平。
培养基中的LDL为什么能够影响培养细胞的HMG-CoA还原酶活性？
为了回答这个问题，Brown和Goldstein开始研究细胞和脂蛋白之间的相互作用。
他们将放射性12s I标记的LDL分别加入到正常和FH患者的成纤维细胞培养基中，发现正常细胞与标记LDL的结合量随肴孵育时间而增多，如果再加入额外的未标记的LDL则减少细胞与标记LDL的结合；如果加入其他的脂蛋白并不影响正常细胞与标记LDL的结合。
这一结果表明，正常细胞与LDL的结合是通过LDL与细胞表面上有限的位点特异的相互作用，具有高度的亲和性和特异性。
与正常成纤维细胞的结果相反，FH患者的细胞几乎没有结合LDL的能力。
这表明正常成纤维细胞拥有特异的LDL受体，而FH患者的细胞没有这种受体或受体有缺陷。
Brown和Gol dstein得出结论：在FH细胞观察到的LDL结合缺陷可能是FH的主要致病原因，外原性LDL不能抑制FH患者细胞的HMG-CoA还原酶，导致产生了过量的胆固醇。
另有实验显示，结合到正常成纤维细胞的LDL与细胞膜的片段成分有关，表明LDL受体是一种细胞表面蛋白。
发表论文
Brown MS, Goldstein JL.
Familial hypercholesterolemia:defective binding of lipoproteins to cultured fibroblasts associated with impaired regulation of3-hydroxy-3-methylglu t缸yl coenzyme A reductase activity.
Proc Natl Acad Sci,USA,1974,71:788-792随着LDL受体的鉴定，Brown和Goldstein又证明结合到细胞表面的LDL迅速内化并在溶酶体中释放旂离胆固醇；在与R.
Anderson的合作中，他们进一步证实LDL受体是在有被小窝处通过胞吞作用内化的。
另外，他们也证明LDL受体在细胞内与配体解离后再循环到质膜上。
实验的最初目的是研究胆固醇生物合成的调节，但最后却阐明了一条真核细胞摄入特定大分:子的主要途径。
LDL受体发现后，相继发现了VLDL受体和清道夫受体。
脂蛋白受体的发现，:是脂类代谢研究的里程碑，推动了脂蛋白、载脂蛋白的深入研究。
:Brown和Goldstein也因为在胆固醇代谢调节方面作出的重大贡献，于1985年荻得诺贝尔生理学与医学奖。
第四章细胞膜与物质的穿膜运输
二、胞吐作用
胞吐作用又称外排作用或出胞作用，指细胞内合成的物质通过膜泡转运至细胞膜，与质膜融合后函筏心回将物质排出细胞外的过程，与胞吞作用过程相反（动画4-6“细胞的外排作用”)。
胞吐作用是将细胞分泌产生的酶、激素及一些未被分解的物质排出细胞外的重要方式。
根据方式的不同，胞吐作用分为连续性分泌和受调分泌两种形式。
（一）连续性分泌是不受调节持续不断的细胞分泌连续性分泌(constitutive secre tion)又称固有分泌，是指分泌蛋白在粗面内质网合成之后，转运至高尔基复合体，经修饰、浓缩、分选，形成分泌泡，随即被运送至细胞膜，与质膜融合将分泌物排出细胞外过程。
在这个连续稳定的过程中，新合成的膜蛋白和膜脂不断地供给质膜更新；分泌到细胞外的成分包括细胞外基质各组分、质膜外周蛋白等参与细胞各种生命活动。
这种分泌途径普遍存在千动物细胞中。
（二）受调分泌是细胞外信号调控的选择性分泌
受调分泌(regulated secretion)是指分泌性蛋白合成后先储存千分泌艇泡中，只有当细胞接受到细胞外信号（如激素）的刺激，引起细胞内Ca2＋浓度瞬时升高，才能启动胞吐过程，使分泌埏泡与细胞膜融合，将分泌物释放到细胞外。
这种分泌途径只存在于分泌激素、酶、神经递质的细胞内（图4-26)。
新合成的供连续性
分泌的可溶性蛋白＼、
/,连续性分泌非调节性忆`、＼／
膜融合
蛋白
胞质溶胶
一激素或神经递质一类的信号
信号转导.
受调分泌
珍勹叱.·.
分泌小泡贮藏膜融合高尔基体分泌蛋白
真核细胞质膜对大分子和颗粒物质运输的胞吞和胞吐作用都是通过膜泡形式进行的，而且转运的膜泡只与特定的靶膜融合，从而保证了物质有序的跨膜运输。
此外胞吞作用导致质膜成分减少会通过质膜其他部位的胞吐作用补充，这种动态平衡对质膜成分的更新和维持细胞的生存、生长是必不可少的。
第四节细胞膜异常与疾病
细胞膜是维持细胞内环境稳定，进行多种生命活动和保持与环境协调的重要结构。
只有细胞的结构和功能正常，细胞才能进行物质运输、代谢、能蜇转化、信息传递和运动等基本功能活动。
膜结构成分的改变和功能异常，往往会导致细胞乃至机体功能紊乱并引起疾病的发生。
下面介绍几种与载体蛋白、离子通道和膜受体异常相关的疾病。
一、载体蛋白异常与疾病
1.胱氨酸尿症是载体蛋白异常性疾病胱氨酸尿症(cystinuria)是一种遗传性肾小管膜转运异常疾病，由于肾小管重吸收胱氨酸减少，尿中含量增加引起尿路中胱氨酸结石形成。
目前了解到，近端肾小管上皮细胞上的rBAT和BATl蛋白是参与转运胱氨酸及二氨基氨基酸（赖氨酸、精氨酸及鸟氨酸）的载体蛋白，当编码这两种蛋白的基因(SLC3A l和SLC7A9)发生突变时引起载体蛋白缺陷，出现肾小管对原尿中这四种氨基酸重吸收障碍，患者尿中这些氨基酸水平增高而在血液中低于正常值。
这四种氨基酸中只有胱氨酸不易溶于水（在pH5~7时，尿中胱氨酸饱和度为0.3-0.4g/L)，当患者尿中出现大量胱氨酸超过其饱和度时，胱氨酸从尿液中结晶析出，形成尿路结石。
同时这种患者小肠黏膜上皮细胞的主动转运机制可能也有类似缺陷，但这种吸收和转运缺陷一般不造成营养不良，而是以肾结石引起的肾功能损伤为主。
2.肾性糖尿是葡萄糖载体蛋白异常性疾病肾性糖尿(renal glycosuria)是由千肾小管上皮细胞葡萄糖重吸收障碍，引起在血糖正常情况下尿中出现葡萄糖。
正常情况下葡萄糖经肾小球滤出后，绝大部分在近端肾小管经钠驱动葡萄糖载体蛋白重吸收。
患者由于肾小管上皮细胞膜上这种转运葡萄糖的载体蛋白功能缺陷，致使葡萄糖的重吸收障碍引起糖尿。
正常人在近端肾小管重吸收葡萄糖的最大量是250mg-350mg/min，当这种重吸收功能降低时就会出现肾性糖尿。
二、ABC转运体蛋白异常与疾病
目前发现一些严重的遗传性疾病是由编码ABC转运体蛋白基因突变所引起，其中痰性纤维化(cys tic fibrosis, CF)是目前研究最清楚的ABC转运体蛋白相关常染色体隐性遗传病。
CF患者由于大量黏液阻塞外分泌腺，引起慢性阻塞性肺部疾病和胰腺功能不全，主要表现为慢性咳嗽、大量黏痰及反复发作的难治性肺部感染；胰腺外分泌不足、长期慢性腹泻吸收不良综合征；汗液高盐为主要特征。
在高加索入群，发病率约为1/2500。
在北欧，致病基因携带者比例为1/25。
CF患者在东方人中罕见。
艇性纤维化是由毅性纤维化穿膜转导调节因子(CITR)基因突变引起的。
CFTR在结构上属于ABC转运体家族成员，但确是一种受cAMP棚节的氯离子通道，广泛表达于呼吸道、胰腺、胃肠道、汗腺和唾液腺等多种分泌型和吸收型细胞的顶部质膜上。
与一般的氯离子通道不同，CITR的激活是在cAMP介导下发生磷酸化，引起通道开放，每分钟向胞外转运约106个Cl一。
作为氯离子跨上皮转运的通道，C门R调节釭的转运速度，并通过对其他离子通道的调节作用，参与决定这些部位盐的转运、液体的流动和离子浓度。
CF患者中约70％出现~F508型基因突变，表现为CFTR第508为氨基酸苯丙氨酸缺失。
这种缺失导致蛋白质折叠错误出现异常结构，变异的蛋白质有的滞留在内质网很快被降解，不能到达上皮细胞膜表面；有的即使能与细胞膜结合，其半衰期也比野生型短很多，而且在膜上变异的C门R不易激活。
有的CF患者的质膜上完全缺失CITR，导致病情非常严重。
C门R出现功能障碍，一方面导致er向细胞外转运减少，另一方面使上皮N旷通道(epithelial Na+channel, ENaC)活性增强，促进了Na十的过度吸收，从而伴随水的过度吸收。
这样就造成呼吸道表面黏液水化不足黏度增大，纤毛摆动困难不能向外排除分泌物，易引发黏液阻塞性细菌感染。
胰腺、胆管、肠等细胞也存在类似的机制，因而产生相应的临床症状。
三、膜受体异常与疾病
膜受体除在信号转导过程中起重要作用外，有些在穿膜物质转运中也是不可缺少的，膜受体异常会引起被转运物质积累，导致相应疾病发生。
家族性高胆固醇血症(familial hypercholesterolemia)是一种常染色体显性遗传病，患者编码LDL受体的基因发生突变，出现LDL受体异常。
由于细胞不能摄取LDL颗粒，引起血胆固醇浓度升高，患«、,｀者会过早发生动脉粥样硬化和冠心病。
LDL受体异常主要包括受体缺乏或受体结构异常。
有的患者第四童细胞膜与物质的穿膜运输合成的LDL受体数目减少，如重型纯合子患者LDL受体只有正常人的3.6%，他们的血胆固醇含量比正常人高6~10倍，常在20岁前后出现动脉粥样硬化。
轻型杂合子患者受体数目只有正常人的1/2,可能在40岁前后发生动脉粥样硬化、冠心病。
也有一些患者LDL受体数目正常，但与LDL结合部位有缺陷，不能与LDL结合；或者受体与有被小窝结合部位缺陷，不能被固定在有被小窝处，如受体胞质结构域中807位正常的酪氨酸被半胱氨酸替代，这种单个氨基酸序列的改变使受体失去了定位于有被小窝的能力；有的受体与LDL结合、内移均正常，但在内体中不能与LDL分离，一同被溶酶体酶降解而不能再循环到细胞膜上。
这些都会造成LDL受体介导的胞吞障碍，出现持续的高胆固醇血症。
[3J Murata K, Mitsuoka K, Hirai T, et al.
Structural determinants of water permeation though aquaporin.
Nature,2000,47:599-605.
细胞膜是围绕在细胞表面的一层薄膜，构成细胞与外界环境的屏障，在维持细胞内环境的稳定和多种生命活动中起重要作用。
不同类型的细胞其细胞膜的化学组成基本相同，主要由脂类、蛋白质和糖类组成。
膜脂主要包括磷脂、胆固醇和糖脂。
磷脂分子是含量最多的脂类，具有一个极性头和两个疏水尾，在水溶液中能自动形成脂双分子层，构成膜的基本骨架。
胆固醇分子较小，散布在磷脂分子之间，能调节膜的流动性和稳定性。
膜糖类通过共价键与脂分子和蛋白结合，分布于质膜的外侧面，参与细胞与环境的相互作用。
膜的重要功能主要由膜蛋白完成，有的膜蛋白通过a－螺旋一次或多次穿膜而镶嵌在脂双层中，称为膜内在蛋白或整合蛋白；有的蛋白依靠电荷和氢键的作用与整合蛋白或膜脂的极性头部结合，称为周边蛋白；脂描定蛋白很像周边蛋白，可位于膜的两侧，以共价键与脂双层内的脂分子结合。
细胞膜的主要特性是不对称性和流动性，脂双分子层中，两个脂单层的膜脂和膜蛋白组成不同，形成了膜的不对称性，各种膜成分的不对称分布保证了细胞功能活动的有序性。
膜的流动性包括膜脂的流动性和膜蛋白的运动性，膜脂的流动性主要与脂分子泾链饱和程度和长度及脂分子的性质有关，膜脂和膜蛋白在膜中均可以侧向移动，各种膜功能的完成均是在膜的流动状态下进行的。
流动镶嵌模型目前被普遍接受，认为细胞膜是嵌有球形蛋白质的脂类二维流体，强调了膜的流动性和不对称性，较好地解释了细胞膜的结构和功能特点。
物质穿膜运输是细胞膜的基本功能。
目前已知细胞对小分子和离子的穿膜运输有几条不同的途径：通过脂双层的简单扩散、离子通道扩散、易化扩散和主动运输。
前三种为被动运输，物质从高浓度向低浓度方向运输，动力来自浓度梯度，不需提供能量。
主动运输是由膜运输蛋白介导，逆物质电化学梯度的穿膜转运，需要与某种能量释放过程相偶联。
膜运轮蛋白分为载体蛋白和通道蛋白，前者可介导被动运输和主动运输，后者只介导被动运输。
每种载体蛋白能与特定的溶质分子结合，通过构象改变介导溶质分子穿膜运输。
通道蛋白形成亲水的穿膜通道，允许适宜大小的分子和离子通过，分为：配体门控通道、电压门控通道、和应力激活通道等。
协同运输是由Na十-K＋泵与载体蛋白协同作用，依靠间接消耗ATP完成物质的穿膜转运，根据溶质分子转运的方向，可分为共运输和对向运输。
细胞通过胞吞作用和胞吐作用进行大分子和颗粒物质的裳泡运轮。
胞吞作用分为三种类型：吞噬作用、胞饮作用及受体介导的胞吞3大多数细胞都能通过胞饮作用非特异地吞入胞外溶液和一些大分子。
吞噬作用由吞噬细胞完成，在免疫防御和维持内环境的稳定中发挥重要作用。
受体介导的胞吞是细胞通过受体的介导高效特异性地摄取胞外低浓度物质的方式。
胞吐作用分为连续性分泌和受调分泌两种形式。
胞吞作用和胞吐作用不仅参与物质运输而且对膜成分的更新和流动具有重要作用。
膜结构成分的改变和功能异常，往往导致细胞乃至机体功能紊乱并引发疾病。
如载体蛋白异常、离子通道缺陷、膜受体异常等会引发多种遗传性疾病。
正确认识细胞膜的结构与功能，对揭示生命活动的奥秘、探讨疾病发生的机制具有重要意义。
（徐晋）
第五章细胞的内膜系统与囊泡转运
内膜系统(endomembrane system)，是细胞质中那些在结构、功能及其发生上相互密切关联的膜性结构细胞器之总称。
其主要包括：内质网、高尔基复合体、溶酶体、各种转运小泡以及核膜等功能结构（图5-1)。
除此之外，晚近看法认为过氧化物酶体的发生与内质网等有关，为了讲述的方便，同时按照多数学者的习惯划分，我们将该结构放在本章中一并加以介绍和讨论。
细胞膜
糙面内质网分泌小泡
内膜
核被膜［外膜
高尔基复合体
内膜系统的出现，不仅是真核细胞与原核细胞之间在形态、结构上相互区别的重要标志之一，而且也被认为是细胞在其漫长的历史演化进程中，内部结构不断分化完善，各种生理功能逐渐提高的结果。
由之所产生、形成的房室性区域化(compartmentali zation)效应，使细胞内不同的生理、生化反应过程得以彼此独立、互不干扰地在特定的区域内进行和完成，并有效地增大了细胞内有限空间的表面积，从而极大地提高了细胞整体的代谢水平和功能效率（动画5-1“内膜系统蛋白合成、加工及转运的系统工程”，动画5-2“内膜系统脂质合成、加工及转运的系统工程”)。
第一节内质网
早在19世纪末，C.
Garni er在对动物体内具有旺盛分泌活动的唾液腺和胰腺等组织细胞进行光镜观察时就注意到：该类细胞中存在一个呈现为丝条状形态结构的嗜碱性特化区域。
这些丝条状的结构，随着动物的生理及细胞活动状态的不同而处于一种动态的变化过程。
亦即，当动物严重饥饿或细胞中形成大瞿酶原颗粒后，丝条状结构减少，甚至消失；当动物进食后或细胞进行活跃的分泌活动时，它又会重新出现。
据此，Garnier将此种结构称之为动质(ergastoplasm)，并推测，其可能与消化液的合成、分泌有关。
1945年，K.
R. Porter等人通过对动质的电镜观察首次发现：光镜下呈现丝条状的动质结构，实际上是聚集、分布于细胞核附近内质区的一些由小泡、小管相互吻合，彼此连接形成的网状结构。
他们根据动质这种特殊的胞内区域分布和电镜结构特征，遂将之易名为内质网(endoplasmic1的culu m, ER)，并被沿用至今。
1954年，Porter和G.
E. Palade等的研究证实：内质网是一类由大小、形态各异的膜性痪泡所构成的细胞器；此后更多的观察研究资料进一步表明，内质网并非仅仅分布于细胞核周围的内质区，而且常常扩展、延伸至靠近细胞膜的外质区；它不仅普遍地存在千几乎所有动物的不同组织细胞类烈，同时也常见于各种植物的绝大多数组织细胞之中。
20世纪60年代以前，对内质网的研究主要着重于其在细胞内的分布状况及形态结构方面。
之后，由于同位素标记示踪放射自显影技术、电镜细胞化学和免疫细胞化学等技术的应用，使得对于内质网的功能及与之相关的大分子定位等也有了较为全面的了解。
一、内质网的形态结构与类型
（－）内质网是细胞质内由单位膜围成的三维网状膜系统内质网广泛分布于除成熟红细胞以外的所有真核细胞的胞质中。
内质网以平均膜厚度约5~6nm的小管(ER tubule)、小泡(ER vesicle)或扁弱(ER lamina)为其基本”结构单位”(unit structure)。
这些大小不同、形态各异的膜性管、泡和扁毅，在细胞质中彼此相互连通，构成了一个连续的膜性三维管网结构系统。
在整体结构上，可与高尔基复合体、溶酶体等内膜系统的其他组分移行转换；在功能上则与这些结构密切相关。
内质网还可向内延伸，与细胞核外膜直接连通。
因而，有人认为：核膜是在间期细胞中包裹核物质的内质网的一部分。
在不同的组织细胞中，或同一种细胞的不同发育阶段以及不同生理功能状态下，内质网往往会呈现出其形态结构、数量分布和发达程度的差别。
例如，大鼠肝脏细胞中的内质网主要是由一组扁平痪泡(5~10个）层叠排列，并通过它们边缘的小管相互连通而成。
这些扁艇的表面附着有很多核糖体颗粒，在连通扁艇的小管周围，经常可见散在的小泡结构（图5-2A）。
在睾丸间质细胞中的内质网则由众多的分支小管或小泡构筑呈网状结构形式（图5-2B)。
我国学者宋今丹在电镜标本制作过程中，以高猛酸钾处理细胞，在培养的猴肾上皮细胞中观察到内质网以细胞核为中心向周围铺展的全貌性网状结构。
后来人们以交联荧光的抗体标记内质网上的标志性蛋白，千荧光显微镜下观察到：在培养的哺乳动物细胞和生活的植物细胞中，内质网通常围绕细胞核向外周铺展延伸到细胞边缘乃至细胞突起中，形成较密集的复杂网状立体结构形态（图5-2C)。
横纹肌细胞中的肌质网(sarcoplasm ic reticulum)是光面内质网的又一种形态结构存在形式，其在每一个肌原纤维节中连成一网状单位（图5-2D)。
一般而言，在不同种生物的同类组织细胞中，它们的内质网基本是相似的。
然而，在同一组织细胞中，内质网的数量及结构的复杂程度，则往往与细胞的发育进程成正相关。
亦即，与细胞的生长发育相伴，内质网的数量、结构也在逐渐地发生着从少到多、从简单到复杂、从单管少痰的稀疏网状到复管多损的密集网状的变化。
（二）糙面内质网和光面内质网是内质网的两种基本类型根据电子显微镜观察的资料，通常把内质网划分为两种基本类型，即所谓的糙面内质网(rough endoplasmic reticulum, RER)和光面内质网(smooth endoplasmic reticulum, SER)。
此外，在某些特殊的正常细胞类型或发生了某种病变的细胞中，内质网也可呈现出其他的结构形态。
1.糙面内质网的主要形态特征是表面有核糖体附着糙面内质网又称颗粒内质网(granu lar endoplasmic reticulum, GER)，以其网膜胞质面有核糖体颗粒的附着为主要形态特征，并因此而得名。
在结构形态上，糙面内质网多呈排列较为整齐的扁平袭状（图5-3)；在功能上，糙面内质网主要和外输性蛋白质及多种膜蛋白的合成、加工及转运有关。
因此，在具有肤类激素或蛋白分泌功能的细胞中，粗面内质网高度发达；而在肿瘤细胞和未分化细胞中则相对少见。
2.光面内质网呈表面光滑的管泡样网状形态结构光面内质网也称无颗粒内质网(agranular endoplasmic reticulum, AER)。
电镜下呈表面光滑的管、泡样网状形态结构（图5-4)，并常常可见与粗面内质网相互连通。
第五章细胞的内膜系统与赵泡转运103
细胞膜
线粒体
图5-2内质网的形态结构A鼠肝细胞内质网形态结构模式图；B睾丸间质细胞中内质网形态透射电镜图；C.动植物细胞中内质网形态结构图（荧光标记内质网）；D横纹肌细胞中肌质网立体结构形态模式图图5-3糙面内质网的形态结构A糙而内质网透射电镜图；B.糙面内质网立体结构模式图图5-4光面内质网的形态结构A光面内质网透射电镜图；B光面内质网与糙面内质网结构关系示意图光面内质网是一种多功能的细胞器。
在不同细胞或同一细胞的不同生理时期，其结构形态、胞内空间分布及发达程度差异甚大，并常常表现出完全不同的功能特性。
两种类型的内质网在不同组织细胞中的分布状况各不相同。
有的细胞中皆为租面内质网；有的细胞中全部为光面内质网；还有些细胞中则是二者以不同的比例共存，并且可以随着细胞不同发育阶段或生理功能状态的变化而相互发生类型的转换。
（三）－某些特殊组织细胞中存在内质网的衍生结构除了上述两种基本形态结构类型的内质网之外，在某些特殊组织细胞中还存在着一些由内质网局部分化、衍生而来的异拟结构。
比如，见千视网膜色素上皮细胞中的髓样体(myelo id body)、出现千生殖细胞、快速增殖细胞、某些哺乳类动物的神经元和松果体细胞以及一些癌细胞中的孔环状片层体(ann ulate lame llae)等。
这些异型结构亦可被看作是内质网的第三种结构类型形式（图5-5)。
＿、内质网的化学组成
内质网通常可占到细胞全部膜相结构组成的50％左右；占细胞总体积的10％以上；相当于整个细胞质址的15%-20%。
应用超速分级分离的方法，可从细胞匀浆中分离出直径在100nm左右的球痪状封闭小泡，人们称之为微粒体(mi crosome)（图5-6A)。
生化分析及体外实验证明：微粒体不仅包含有内质网膜与核糖体两种基本组分，而且可行使内质网的一些基本功能。
由此推断：微粒体是细胞匀浆过程中，由破损的内质网碎片所形成的小型密闭痪泡，而非细胞内的固有功能结构组分。
通过离心分离技术获得的微粒体包括颗粒型和光滑型两种类型（图5-6B)。
目前，对内质网的化学特征与生理功能的了解和认识，大多是通过对微粒体的生化、生理分析而获得的。
(—)脂类和蛋白质是内质网的主要化学组成成分同细胞膜等其他膜相结构一样，内质网膜也以脂类和蛋白质为其结构的主要化学组成成分。
综合不同动物组织细胞来源的微粒体分析资料显示，内质网膜脂类含揽约30%-40%，蛋白质含员在。
第五章细胞的内膜系统与丛泡转运105
网质内面糙
停留悬浮千低浓度梯度的
.离心分离000。
O1光滑型微粒体
光体
停留悬浮千高浓度荒糖
I梯度的颗粒型微粒体
图5-6微粒体的形态及类型A从细胞匀浆中分离出的微粒体电镜观察形态图；B运用庶糖浓度梯度离心分离技术可获得颗粒型和光滑型两种不同的微粒体60%-70％之间。
在此仅以大鼠肝细胞和胰腺细胞来源的微粒体为例，来说明内质网的脂类和蛋白质组成情况：内质网膜的类脂双分子层组成包括磷脂、中性脂、缩酘脂和神经节昔脂等。
其中以磷脂含輩最多。
不同磷脂的百分比含量大致为：卯磷脂55％左右；磷脂酰乙醇胺20%～25%；磷脂酰肌醇5%~10%；磷脂酰丝氨酸5%～10%；鞘磷脂4%～7%。
内质网膜含有的蛋白质及酶类是非常复杂、多样的。
在对大鼠肝细胞与胰腺细胞内质网膜蛋白质进行的十二烧基硫酸钠－聚丙烯酰胺凝胶电泳(SOS-PAGE)分析研究中，可分别观察到33条和30条不同的多肤带纹；它们的相对分子质量大小从15-150kD不等。
（二）内质网含有以葡萄糖－6-磷酸酶为主要标志性酶的诸多酶系内质网膜中含有的酶蛋白至少在30种以上。
根据它们的功能特性，大致可划分为以下几种类型：(I)与解毒功能相关的氧化反应电子传递酶系：主要由细胞色素p450、NADPH－细胞色素p450还原酶、细胞色素b5、NADH－细胞色素从还原酶和NADH－细胞色素c还原酶等组成。
此外尚有参与蛋白质加工转运的多种酶类。
表5-1列举出目前了解较多的一些内质网膜酶蛋白的分布与定位情况。
106第二篇细胞的结构与功能
酶分布定位
NADH细胞色素b5还原酶胞质面
细胞色素b5胞质面
5'－核昔酸酶胞质面GDP－甘露糖基转移酶胞质面葡萄糖－6－磷酸酶网腔面乙酰苯胺－水解酣酶网腔面NADPH－细胞色素还原酶胞质面ATP酶胞质面核昔焦磷酸酶胞质面核昔二磷酸酶网腔面6－葡萄糖睦酸酶网腔面（三）网质蛋白是内质网网腔中普谝存在的一类蛋白质网质蛋白(reticulo-plasmin)是普遍存在于内质网网腔中的一类蛋白质。
它们的共同特点是在其多肤链的狻基端(C端）均含有一个KDEL(Lys-Asp-Glu-Leu，即赖氨酸-天冬氨酸－谷氨酸－亮氨酸）或HOEL(His-Asp-Glu-Leu，即组氨酸天冬氨酸谷氨酸亮氨酸）的4氨基酸序列驻留信号(retenti on signal)。
网质蛋白可通过驻留信号与内质网膜上相应受体的识别结合而驻留于内质网腔不被转运。
目前已知的网质蛋白有：（一）糙面内质网的主要功能是进行蛋白质的合成、加工修饰、分选及转运许多蛋白质都是在糙面内质网中合成的，包括：心外输性或分泌性蛋白质，如肤类激素、细胞因千抗体、消化酶、细胞外基质蛋白等；＠膜整合蛋白质，如膜抗原、膜受体等；＠构成细胞器中的驻留蛋白(re tention protein)，像定位千糙面内质网、光面内质网、高尔基复合体、溶酶体等各种细胞器中的可溶性驻留蛋白。
在此主要以分泌性蛋白为例，介绍在糙面内质网的蛋白质合成过程，并简要说明膜彸O,t整合蛋白的嵌插机制。
第五章细胞的内膜系统与汉泡转运
SRP-R是内质网的一种膜整合蛋白。
由于该蛋白能够通过与SRP的识别而使得核糖体结合附着千内质网上，因此也称之为停靠蛋白质(docking protein)或船坞蛋白质。
3)在信号肤的引导下，合成中的肤链，通过由核糖体大亚基的中央管和转运体易位蛋白共同形成的通道，穿膜进入内质网网腔。
随之，信号肤序列被内质网膜腔面的信号肤酶切除，新生肤链继续延伸，直至完成而终止。
最后，完成肤链合成的核糖体大、小亚基解聚，并从内质网上解离（图5-7C)。
转运体是糙面内质网膜上的一种亲水的蛋白通道。
其外径大约8.5nm左右，中央孔直径平均为2nm。
有学者认为：内质网上的转运体是一种动态结构，并以两种可转化的构象形式存在。
即当它和信号肤结合时，处于一种开放的活性状态；在蛋白质多肤链被完全转移之后，则转变为无活性的关闭状态（图5-7C)。
有关转运体的存在及其与蛋白质穿膜转运之间的关系，已经获得有力的实验证据支持。
处千蛋白转运功能活性状态下的转运体中央孔道，常常被正在通过的延伸中的多肤链所充塞；用噤呤霉素(p u romycin)处理，使新生的多肤链从核糖体上解离释放下来，可用电生理学方法检测出流过转运体中央孔道的离子流。
但是，如果用高盐溶液冲洗，使核糖体从内质网膜上脱落时，转运体即处千关闭状态，也就无法检测到内质网膜上转运体孔道的存在。
这表明：核糖体的结合，是转运体孔道开放所必须的条件。
转运体不仅是新生分泌蛋白质多肤链合成时进入内质网腔的通道，而且还能够利用水解GTP将内质网腔中的损伤蛋白质转运到细胞质溶质中去。
在哺乳动物，内质网转运体主要是由一种与蛋白分泌相关的多肤Sec61p组成的亲水性复合结构体。
肤链穿过内质网的转移机制及与之相关的信号肤、SRP、SRP-R及转运体的相互作用如图5-7所示。
108第二扁细胞的结构与功能
多）汰亚单位
B SRP｀结合位点
SRP从信号肤－核糖体复合体上解离返回胞质溶胶；5'被阻遏的肤链合成继续进行；新生肤链在信号肤SRP识别并结合形成的SRP核糖体牵引下通过开启了的转运休进人内匝网腔倌号肤与核糖休复合结构使翻译哲时终止mRNA,细胞质溶质内质网膜上的蛋白质转运体被解离的信号肤/转运体关闭图5-7信号肤介导核糖体附着千内质网与新生肤链穿膜转移过程示意图A.
S RP结构示意图；B核糖体的附着与肤链的合成延仲，C转运体与肤链的穿膜转移(2)新生多肤链的折叠与装配：多肤链的氨基酸组成和排列顺序，决定了蛋白质的基本理化性质；而蛋白质功能的实现，却打接依赖于多肤链依其特定的方式盘旋、折叠所形成的高级三维空间结构。
内质网为新生多肤链的正确折控和装配提供了有利的环境。
在内质网腔中，丰富的氧化型谷胱甘肤(GSSG)，是有利于多肤链上半胱氨酸残基之间二硫键形成的必要条件；附着于网膜腔面的蛋白二硫键异构酶，则使得二硫键的形成及多肤链的折控速度大大地加快。
存在千内质网中的免疫球蛋白重链结合蛋白(BiP)、内质蛋白、钙网蛋白及钙连蛋白等，均能够与折秏错误的多肤和尚未完成装配的蛋白亚单位识别结合，并予以滞留，同时还可促使它们的重新折叠、装配与运输。
因此将这类能够帮助多肤链转运、折拧和组装的结合蛋白称做“伴侣＂蛋白第五章细胞的内膜系统与钺泡转运(chaperone protein)或“分子伴侣”(molecular chaperone)一因它们虽然能够通过与多肤链的识别结合来协助它们的折叠组装和转运，但其本身却并不参与最终产物的形成而得名。
作为分子伴侣蛋白的共同特点是在其狻基端有KDEL驻留信号肤，它们能够和内质网膜上的相应受体结合而驻留于网腔（不被转运出去）。
正因为这样，因此普遍认为：分子伴侣蛋白也是细胞内蛋白质质批监控的重要因子。
内质网腔内未折叠蛋白的积聚，可通过未折叠蛋白反应(u nfolded protein response, UPR)使内质网分子伴侣表达升高，从而有利于蛋白质的正确折叠和组装。
关于UPR的机制，目前认为内质网腔内积聚的未折叠蛋白，通过活化具有激酶性质的内质网跨膜蛋白等级联反应，促进UPR特异性转录因子与编码内质网分子伴侣基因的启动子结合而上调其表达。
(3)蛋白质的糖基化：所谓糖基化(glycosylalion)，是指单糖或者寡糖与蛋白质之间通过共价键的结合形成糖蛋白的过程。
由附着型核糖体合成并经由内质网转运的蛋白质，其中大多数都要被糖基化。
发生在糙面内质网中的糖基化主要是霖糖与蛋白质天冬酰胺残基侧链上氨基基团的结合，所以亦称之为N－连接糖基化(N-l inkecl glycosylalion)。
催化这一过程的糖基转移荫是存在千糙面内质网网膜腔面的一种膜整合蛋白质。
发生在内质网中的蛋白质N-连接糖基化修饰，均开始千一个共同的前体一种由N－乙酰葡萄糖胺、甘露糖和葡萄糖组成的14毋糖。
霖糖首先与内质网膜中的嵌入脂质分子磷酸多粘醇(do!icol)连接并被其活化，然后在糖基转移酶的催化下转移连接到新生肤链中特定三肤序列Asn-X-Se1或Asn X-Thr(X代表除Pro之外的任何炭基酸）的天冬酰胺残基上。
(4)蛋白质的胞内运输：山附若型核糖体合成的各种外输性蛋白质，经过在糙面内质网中的修饰加工后最终被内质网膜包裂，并以“出芽＂的方式形成膜性小泡而转运。
经由糙面内质网的蛋白质胞内运输主要有两个途径：第一条途径是经过在内质网腔的糖基化等作用，以转运小泡的形式进入高尔基复合体，进一步加工浓缩并最终以分泌颗粒的形式被排吐到细胞之外。
这也是最为普遍和最为常见的蛋白分泌途径。
第二条途径仅见于某些哺乳动物的胰腺外分泌细胞，其大致过程是：来自糙面内质网的分泌蛋白以膜泡形式直接进入一种大浓缩泡，进而发育成酶原颗粒，然后袚排出细胞。
通过上述两条不同途径，可见蛋白质分泌的共同特点，即所有分泌蛋白的胞内运输过程，始终是以膜泡形式完全隔离于细胞质基质进行转运的［动画5-4"粗面内质网内蛋白质的折叠及修饰加工（二硫键形成、糖基化修饰）”］。
2信号肤指导的穿膜驻留蛋白插入转移的可能机制穿膜驻留蛋白，尤其是多次穿膜蛋白的插入转移，远比可溶性分泌蛋白的转移过程更为复杂。
(I)单次穿膜蛋白插入转移的机制：单次穿膜蛋白插入内质网膜有两种可能的机制：是新生肤链共翻译插入(colran slalion insertion)机制。
此机制比较简单。
一些新生的单次穿膜驻留蛋白既含有位千肤链N－端的起始转移信号肤，同时还含有存在于多肤链中的一段由特定氨基酸序列组成的疏水区段一停止转移序列(s lop transfer sequence)。
该序列与内质网膜有极高的亲和性，可与内质网膜脂双层结合。
在由信号肤引导的肤链转移过程中，当停止转移序列进入转运体并与其相互作用时，转运体即由活性状态转换为钝化状态而终止肤链的转移；N－端起始转移信号肤从转运体上解除释放；停止转移序列形成单次跨膜a－螺旋结构区，使得蛋白肤链的C－端滞留于细胞质一侧。
二是由内信号肤(inte rn a l signal peptide)介导的内开始转移肤(internal sla rl-lran sfer peptide)插入转移机制。
所谓内信号肤，即位于多肤链中间的信号肤序列。
内信号肤具有与N端信号肤同样的功能。
随着合成肤链的延长，当内信号肤序列被合成并到达转运体时，即被保留在类脂双分子层中，成为单次跨膜的O'.－螺旋结构。
在由内信号肤引导的插入转移过程中，插入的内开始转移肤能够以方向不同的两种形式进入转运体。
如果在内信号肤疏水核心氨基端有比其狻基端更多的带正电荷氨基酸序列组成，这时插入的方向为狻基端进入内质网腔面；反之则其插入方向相反（图5-8)。
(2)多次穿膜蛋白质的转移插入：多次穿膜蛋白质的转移插入过程虽然远比单次跨膜蛋白要复Q杂得多，但是其基本机制是大致相同的。
在多次穿膜蛋白肤链上，常常有两个或者两个以上的疏水性开始转移肤结构序列和停止转移肤结构序列。
一般认为，多次跨膜蛋白是以内信号肤作为其开始转移信号的。
',经典实验：信号肤假说----------..
六夕匕旦
研九月早
,20世纪50年代的研究表明，分泌蛋白是由膜结合型核糖体合成的，并在其合成的过程中!发生了穿膜转移。
然而，当时无法解释的现象是：为什么合成分泌蛋白的核糖体是膜结合型的i核糖体，而合成胞质蛋白的核糖体却不与膜结合。
为了解释这一现象，G.
Blobel和D.
Sabatini!于1971年提出假说，认为：O将要在膜结合型核糖体上进行翻译的mRNA，在其翻译起始位点:的3'瑞含有一些独特的密码子；＠这样一来，在翻译形成的多肤链的氨基末瑞，会添加上一段独特的序列（即信号肤）；＠这段信号肤能够使核糖体附着于膜上。
1975年，Blobel和:B.
Dobbers tein报道的一系列实验结果为上述观点提供了重要证据。
他们对上述观点进行了补充后，最终形成了“信号肤学说”。
实验内容
研究表明，骨髓瘤是一种B林巴细胞肿瘤，能够大量分必免疫球蛋白（因此常被用作研究分泌蛋白的模型）。
C. Milstein实验室的研究显示，对免疫球蛋白轻链的mRNA进行体外翻译所得到的蛋白质，其氨基末端比细胞分必的免疫球蛋白轻链多了约20个氨基酸。
该结果提示，这些氨基酸可能介导了核糖体与膜的结合。
为验证这一假设，Blobel和Dobberstein利用骨髓瘤细胞，对膜结合型核糖体合成轻链的过程进行了研究。
正如所料，利用并离核糖体在体外翻译轻链mRNA所生成的蛋白质，其分子量大于细胞所分泌的轻链蛋白；而利用骨髓瘤细胞中的膜结合型核糖体对该轻链mRNA进行体外翻译，所生成的蛋白质则与细胞分泌的轻链蛋白大小相同。
他们进一步的研究表明，膜结合型核糖体合成的轻链蛋白能够抵抗蛋白酶的消化作用，而且合成的轻链蛋白与微粒体结合在一起，这提示，由核糖体合成的轻链蛋白可能已经被转运到了微拉体中。
上述结果表明，在新合成的多肤链的穿膜转运过程中，其氨基末端的信号肤被微粒体中的蛋白酶切割去除。
这些结果在细节上对信号肤假说进行了补充。
正如Blobel和Dobbers tein所述，信号肤假说的基本观点是：对于编码穿膜转移蛋白质的mRNA而言，其起始密码子的下并i',紧邻着一段独特的编码序列（编码信号肤）。
第五章细胞的内膜系统与汲泡转运
发表论文
Blobel G, Dobberstein B.
Transfer of proteins across membranes.
I. Presence of proteolytically processed and unprocessed nascent immunoglobulin light chains on membrane-bound ribosomes of murine myeloma.
J Cell Biol,1975,67(3):835-851.
后续影响
继Blobel提出信号肤引导核糖体结合到内质网的信号肤假说之后，相继于新合成的细胞核蛋白质中鉴定出核输入信号(nucle缸import s i gnal)，也称为核定位信号(nuclear localization signal, NLS)，以及过氧化物酶体引导信号(peroxisomal即geting signal, PTS)、蛋白质中的转运肤(transit peptide/transit sequence)等。
正是由于蛋白多肤中这些信号序列的差异，最终决定了蛋白质合成起始后继续合成的不同形式和各自的运输途径及去向，由此提出了决定细胞内蛋白质（包括游离核糖体合成蛋白、膜结合型核糖体合成蛋白）去向的分拣信号(sorting s i gnal)。
这些内容构成了真核细胞内蛋白质合成、分选及运输的现代细胞生物学基础。
鉴于信号肤假说不仅在分泌蛋白向内质网转移的过程中得到了印证，也为理解蛋白质向细胞内其他膜性结构定向转运的机制提供了理论支持，Blobel也因此荣膺1999年的诺贝尔生理学或医学奖。
、、、｀---•------－．．一一一·---•---..--·一．－----·----－．一一一．一一·一．一一一一·一·---..__..--•-...--------·---·一一一一．．一一．．一一一．一一一一一一一一一--------------------------------------一一一．一一一．．会----了＇，3糙面内质网是蛋白质分选的起始部位蛋白质的合成都是从胞质中游离的核糖体上开始的，如果待合成蛋白质N端无信号肤，那么它们将继续在胞质中的游离核糖体上合成，直至合成结束。
通过这种方式合成的胞内蛋白包括：心非定位分布的细胞质溶质驻留蛋白；＠定位性分布的胞质溶质蛋白，它们同其他成分一起装配形成特定的复合体（或细胞器），如中心粒及中心粒周围物质；＠细胞核中的核蛋白(nucleoprotein)，如构成染色质的组蛋白、非组蛋白及核基质蛋白等，它们通过核孔复合体转运入核；＠线粒体、质体等半自主性细胞器所必须的核基因组编码蛋白。
一旦待合成蛋白的N端有信号肤序列，通过信号肤，在翻译的同时进入内质网，然后经过各种加工和修饰，使不同去向的蛋白质带上不同的标记，最后经过高尔基复合体反面网络进行分拣，包装到不同类型的小泡，并运送到目的地，包括内质网、高尔基复合体、溶酶体、细胞质膜、细胞外和核膜等。
该过程称为蛋白质分选。
因此，信号肤被视为蛋白质分选的初始信号。
从膜结合型核糖体合成蛋白质角度来看，可以说糙面内质网是蛋白质分选的起始部位。
除信号肤等信号序列之外，信号斑(signal patch)也是重要的蛋白质分选转运信号。
信号斑是指新生蛋白质多肤链合成后折叠时，在其表面由特定氨基酸序列形成的三维功能结构。
与信号肤的区别是：心构成信号斑的氨基酸残基（或序列片段）往往相间排列存在千蛋白质多肤链中，彼此相距较远；＠在完成蛋白质的分拣、转运引导作用后通常不会被切除而得以保留；＠信号斑可识别某些以特异性糖残基为标志的酶蛋白，并指导它们的定向转运。
（二）光面内质网是作为胞内脂类物质合成主要场所的多功能细胞器光面内质网是细胞内脂类合成的重要场所。
然而，不同细胞类型中的光面内质网，因其化学组成上的某些差异及所含酶的种类不同，常常表现出完全不同的功能作用。
1光面内质网参与脂质的合成和转运脂类合成是光面内质网最为重要的功能之一。
经由小肠吸收的脂肪分解物甘油、甘油一酷和脂肪酸，进入细胞之后，在内质网中可被重新合成为甘油三酷。
一般认为，在光面内质网合成的脂类常常会与糙面内质网来源的蛋白质结合形成脂蛋白，然后经由高尔基复合体分泌出去。
比如，在正常肝细胞中合成的低密度脂蛋白(low-density lipoprotein, LDL)和极低密度脂蛋白(ver-y-low-dcnsity lipoprotein, VLDL)等物质，被分泌后可携带、运输血液中的胆固醇和甘油三醋以及其他脂类到脂肪组织。
如果阻断脂蛋白经由高尔基复合体的运输途径，就会造成脂类在内质网中的积聚引起脂肪肝。
在类固醇激素分泌旺盛的细胞，其发达的光面内质网中存在着与类固醇代谢密切相关的关键酶。
112第二篇细胞的结构与功能
这说明，脂肪的合成、类固醇的代谢是在光面内质网中进行的。
除线粒体特有的两种磷脂外，细胞所需要的全部膜脂几乎都是由内质网合成的。
内质网脂质合成的底物来源千细胞质基质；催化脂质合成的相关酶类是定位于内质网膜上的膜镶嵌蛋白；脂质合成起始并完成千内质网膜的胞质侧，其主要过程是：(1)首先是脂酰基转移酶(acyl transferase)催化脂酰辅酶A(fatty acyl CoA)与甘油－3－磷酸反应，把2个脂肪酸链转移、结合到甘油－3－磷酸分子上形成磷脂酸(phosphat心c acid);(2)继而在磷酸酶的作用下，使磷脂酸去磷酸化生成双酰甘油；(3)然后再由胆碱磷酸转移酶(chol in e phosphotransferase)催化，在双酰甘油上添加结合一个极性基团，最终形成由一个极性头部基团和两条脂肪酸链疏水尾部构成的双亲性脂类分子。
通过以上过程合成的极性甘油二脂双亲媒性脂类物质，借助千翻转酶（fl i ppase)的作用，很快被转向内质网腔面；最终再被输送到其他的膜上。
就目前所知，脂质由内质网向其他膜结构的转运主要有两种形式：一是以出芽小泡的形式转运到高尔基复合体、溶酶体和质膜；一是以水溶性的磷脂交换蛋白(p hospholipid exchange protein, PEP)作为载体，与之结合形成复合体进入细胞质基质，通过自由扩散，到达缺少磷脂的线粒体和过氧化物酶体膜上。
体外实验显示：每一种磷脂交换蛋白只能专一性地识别一种磷脂，以单分子形式，从内质网膜提取并进行膜间的磷脂分子载运转移。
2光面内质网参与糖原的代谢内质网参与了糖原的分解过程。
肝细胞中光面内质网上存在与碳水化合物代谢反应功能相关的酶类，主要包含葡萄糖－6－磷酸酶、B－葡萄糖醋酸酶、葡萄糖醋酸转移酶和GDP－甘露糖基转移酶等。
在肝细胞光面内质网胞质面附着的糖原颗粒可被糖原磷酸化酶(glycogenphospho1ylase)降解，形成1－磷酸葡萄糖，然后在细胞质溶胶中的磷酸葡萄糖变位酶(phosphoglucomutase)的作用下转化为6－磷酸葡萄糖。
最后，被光面内质网网腔面上的葡萄糖－6－磷酸酶催化，发生去磷酸化；去磷酸化后的葡萄糖，更易于透过脂质双层膜，然后经由内质网被释放到血液中。
至于内质网是否也参与了糖原的合成过程，目前还存在着截然不同的两种观点。
认为内质网参与糖原合成的观点指出：在肝细胞中，糖原颗粒常与光面内质网伴存，当糖原颗粒量多时，光面内质网被遮盖而不易辨认；在动物被禁食几天后，糖原减少，光面内质网明显，提示糖原的合成似与光面内质网有关。
但另一些研究发现，光面内质网上无催化糖原合成的糖原合酶(glycogen synthase)，糖原合酶的功能是催化尿昔二磷酸葡萄糖(UDPG)中的葡萄糖基与糖原引物的非还原端分支上的葡萄糖基聚合，从而延长糖链；UDPG并不与内质网膜结合，而是结合在糖原颗粒上。
此外，如果把UDPG加到引物糖原上，便可参与糖原的合成。
这说明糖原的合成与光面内质网无关。
3.光面内质网是细胞解毒的主要场所肝脏是机体中外源性、内源性毒物及药物分解解毒的主要器官组织。
肝脏的解毒作用主要由肝细胞中的光面内质网来完成。
在肝细胞光面内质网上，含有丰富的氧化及电子传递酶系，包括细胞色素p450、NADPH－细胞色素p450还原酶、细胞色素65、NADH－细胞色素b5还原酶、NADPH－细胞色素c还原酶等。
其解毒的基本机制是：在电子传递的氧化还原过程中，通过催化多种化合物的氧化或轻化，一方面，使得毒物、药物的毒性作用被钝化或者破坏；另一方面，则由千胫化作用而增强了化合物的极性，使之更易于排泄。
当然，这种氧化作用也可能会使某些物质的毒性增强。
内质网电子传递链与线粒体电子传递链的不同之处是：其一，链的组成比线粒体较短；其二，它所催化的反应，实质上都是在作用物分子中加入一个氧原子。
因此，有人也把内质网电子传递链酶系称作胫化酶或加单氧酶(monooxygenase)系。
还有人称之为混合功能氧化酶(m i xed function oxidase)。
4光面内质网是肌细胞Ca2＋的储存场所在肌细胞中，十分发达的光面内质网特化为一种特殊。
的结构一—肌质网。
第五章细胞的内膜系统与忒泡转运113
通常状况下，肌质网网膜上的Ca2+-ATP酶把细胞质基质中的Ca2＋泵入网腔储存起来；当受到神经冲动的刺激或者细胞外信号物质的作用时，即可引起Ca2＋向细胞质基质的释放。
在肌质网腔中存在的钙结合蛋白浓度为30~lOOmg/ml；每个钙结合蛋白分子可与30个左右的Ca2＋结合，这就使得内质网中的Ca2＋浓度高达311111101/L。
内质网中高浓度的Ca2＋和钙离子结合蛋白的存在，还能够阻止内质网运输小泡的形成。
这说明，Ca2＋浓度的变化，可能对运输小泡的形成具有一定的调节作用（动画5-5"滑面内质网调控细胞浆钙离子的浓度（钙库）”）。
5.光面内质网与胃酸、胆汁的合成与分泌密切相关在胃壁腺上皮细胞中，光面内质网可使Cl一与W结合生成HCl；在肝细胞中，光面内质网不仅能够合成胆盐，而且，可通过葡萄糖酢酸转移酶的作用，使非水溶性的胆红素颗粒形成水溶性的结合胆红素。
（三）内质网应激
内质网是有极强稳态系统的膜性细胞器。
在各种生理病理条件下，如缺氧、氧化应激、病毒感染、营养不足、化学药物等均可扰乱内质网稳态，导致内质网内C汒平衡紊乱、未折叠或错误折叠蛋白在内质网腔中积累聚集，形成内质网应激(endoplasmic reticulum stress, ERS)。
适度的内质网应激有利于细胞在外界刺激下恢复细胞的内稳定，是真核细胞的一种自我保护性反应，而长时间或严重的内质网应激会导致内质网功能受损，导致细胞凋亡。
内质网应激主要激活三条信号通路：未折叠蛋白反应、内质网超负荷反应(ER overload response, EOR)和固醇调节级联反应(s terol regulatory element binding protein, SREBP)。
前两者均是蛋白质加工紊乱所致，SREBP的激活则是在内质网表面合成的胆固醇损耗所致。
目前研究发现内质网应激与多种疾病相关，例如动脉粥样硬化、非酒精性脂肪肝、溃疡性结肠炎、糖尿病、心血管疾病、骨质疏松症、肿瘤、神经退行性疾病如阿尔茨海默病和帕金森病等。
第二节高尔基复合体
1898年，意大利学者C.
Go胆用银染技术对猫头鹰脊髓神经节进行光镜观察时首次发现：在细胞核周围的细胞质基质中，存在一种嗜银的网状结构，并称之为内网器(in ternal reticular a pparatu s)。
此后，在多种细胞中也相继发现了类似的结构。
后来的学者，为了纪念高尔基，就用高尔基体(Golgi body)取代了内网器这一名称。
20世纪50年代，随着电子显微镜及其超薄切片技术的应用和发展，不仅证明了高尔基体的真实存在，而且使得入们对其有了新的、更为深入和清楚的认识；并根据高尔基体在电镜下的亚显微形态结构特点，将之更名为高尔基复合体(Golgi complex)。
—、高尔基复合体的形态结构
(—)高尔基复合体是由三种不同类型的膜性霹泡组成的细胞器电镜观察表明，高尔基复合体是一种膜性的痪、泡结构复合体。
在其整体形态上，不同裂、泡具有明显的极性分布特征。
据此，将高尔基复合体划分为三个组成部分（图5-9):1扁平蠹泡现统称为猪泡(cisterna)，是高尔基复合体中最具特征的主体结构组分。
通常，每3~8个略呈弓形弯曲的扁平娱泡整齐地排列层叠在一起，构成高尔基复合体的主体结构－~高尔基体堆(Golgi slack)。
呈扁平状的高尔基渚泡褽腔宽约15~2Onm；相邻毅间距20-30nm。
其凸面朝向细胞核，称之为顺面(cis-face)或形成面(forming face)；凹面侧向细胞膜，称作反面(t ra凡s-face)或成熟面(mature face)。
形成面膜厚约6nm，与内质网膜厚度相近似；成熟面膜厚约8nm，与细胞膜厚度相近。
2小禄泡现统称为小泡(vesicle)，聚集分布于高尔基复合体形成面，是一些直径为40-80nm的膜泡结构，包括两种类型：相对较多的一类为表面光滑的小泡；较小的一类是表面有绒毛样结构的。
114第二篇细胞的结构与功能
分泌泡
膜面间反中顺;｝
网膜尔中基间高基面尔反高
小；泡忆
图5-9高尔基复合体的结构A高尔基复合体透射电镜图；B高尔基复合体结构模式图有被小泡(coated vesicle)。
一般认为这些小型裂泡是由其附近的糙面内质网芽生、分化而来，并通过这种形式把内质网中的蛋白质转运到高尔基复合体中来。
因此，也被称作为运输小泡(transfervesicle)。
它们可通过相互融合，形成扁平状高尔基湘泡。
一方面完成了从内质网向高尔基复合体的物质转运；另一方面，也使扁平状高尔基渚泡的膜结构及其内含物不断地得以更新和补充。
3.大襄泡现统称为液泡(vacuole)，直径为0.1~0.5µ,m，是见千高尔基复合体成熟面的分泌小泡(secretory vesi cle)。
系由扁平状高尔基涨泡末端膨大、断离而形成。
不同分泌小泡在电镜下所显示的不同电子密度，可能是它们不同成熟程度的反映。
（二）高尔基复合体具有显著的极性
无论是常规的电镜观察图像，还是应用重金属选择性浸染新技术结合多角度观察、拍摄图像重组的高尔基复合体三维结构模型以及单克隆抗体免疫电镜技术的研究，均显示高尔基复合体具有明显的极性形态结构特征。
构成高尔基复合体主体的湘泡，从形成面到成熟面可呈现为典型的扁平毅状、管状或管、艇复合形式等不同的结构形态；各层膜娱的标志化学反应及其所执行的功能亦不尽相同。
因此，现在一般将高尔基复合体膜握层依次划分为顺面高尔基网(cis-Golgi network)、高尔基中间膜痪(med i al Golgi s tack)和反面高尔基网(trans-Golgi network)等三个具有其各自功能结构特征的组成部分（图5-10)。
顺面高尔基网靠近内质网一侧，呈连续分支的管网状结构，显示嗜俄反应的化学特征。
一般认为，该结构区域的功能有两个：第一是分选来自内质网的蛋白质和脂类，并将其大部分转入到高尔基中间膜袭，小部分重新送返内质网而成为驻留蛋白；第二是进行蛋白质修饰的O～连接糖基化以及穿第五章细胞的内膜系统与汉泡转运膜蛋白在细胞质基质侧结构域的酰基化。
所谓O－连接糖基化与发生在内质网中的N－连接糖基化不同，其寡糖连接部位是蛋白质多肤链中丝氨酸等氨基酸残基侧链的OH基团。
高尔基中间膜禄是位于顺面高尔基网状结构和反面高尔基网状结构之间的多层间隔痰、管结构复合体系。
除与顺面网状结构相邻的一侧对NADP酶反应微弱外，其余各层均有较强的反应。
中间膜痰的主要功能是进行糖基化修饰和多糖及糖脂的合成。
高尔基反面网状结构朝向细胞膜一侧，在其形态结构和化学特性上具有不同细胞间的差异性和多样性。
该结构的主要功能是对蛋白质进行分选，最终使得经过分选的蛋白质，或被分泌到细胞外，或被转运到溶酶体。
另外，某些蛋白质的修饰作用也是在此进行和完成的。
比如蛋白质酪氨酸残基的硫酸化、半乳糖a-2,6位的唾液酸化及蛋白质的水解等。
（三）高尔基复合体在不同的组织细胞中呈现不同的分布形式高尔基复合体在不同的组织细胞中具有不同的分布特征。
例如，在神经细胞中的高尔基复合体一般是围绕细胞核分布；在输卵管内皮、肠上皮黏膜、甲状腺和胰腺等具有生理极性的细胞中，其常常在细胞核附近趋向于一极分布；在肝细胞中，则沿胆小管分布在细胞边缘；在精、卵等少数特殊类型的细胞和绝大多数无脊椎动物的某些细胞中，可见到高尔基复合体呈分散的分布状态。
另有研究结果显示，在非极性的动物间期细胞中，高尔基复合体往往位千中心粒附近。
如果用秋水仙碱处理细胞，高尔基复合体会失去原有的典型结构特征，并出现弥散性分布；去除秋水仙碱后，其又能够很快恢复到原来的结构和分布状态。
这表明：高尔基复合体在中心粒附近的分布与微管相关。
此外，高尔基复合体的数量和发达程度，也因细胞的生长、发育分化程度和细胞的功能类型不同而存在较大的差异，并且会随着细胞的生理状态而变化。
一般而言，在分化发育成熟且具有旺盛分泌功能活动的细胞中，高尔基复合体较为发达。
二、高尔基复合体的化学组成
（一）脂类是高尔基复合体膜的基本成分
作为一种膜性结构细胞器，脂类是高尔基复合体结构最基本的化学组分。
从大鼠肝细胞分离的高尔基复合体，其脂类总含量约45%；大量的分析资料表明，高尔基复合体膜的脂类成分含量介千质膜与内质网膜之间（表5-2)。
脂类及其含量（％）
膜的类型
总脂含量磷脂酰乙醇胺卵磷脂神经鞘磷脂磷脂酰丝氨酸胆固醇质膜4034.432.019.24.60.51高尔基复合体4536.531.414.24.70.47内质网膜6135.847.83.45.60.12（二）高尔基复合体含有以糖基转移酶为标志的多种酶蛋白体系在细胞不同结构区域中，酶的分布种类及含量，往往反映着该结构区域的主要功能特性。
一般认为，糖基转移酶(glycosyltransferase)是高尔基复合体中最具特征性的酶。
它们主要参与糖蛋白和糖脂的合成。
同时，在高尔基复合体中还存在着其他的一些重要的酶类，它们是：心包括NADH－细胞色素c还原酶和NADPH－细胞色素还原酶的氧化还原酶；＠以5'－核昔酸酶、腺昔三磷酸酶、硫胺素焦磷酸酶为主体的磷酸酶类；＠参与磷脂合成的溶血卵磷脂酰基转移酶和磷酸甘油磷脂酰转移酶；＠由磷脂酶人与磷脂酶A2组成的磷脂酶类；＠酪蛋白磷酸激酶；＠a－甘露糖昔酶等。
根据J.
E. Roth man等人近些年来的研究报道：通过密度梯度离心技术可分离出3种不同密度的高尔基复合体碎片；而每一种密度的碎片都分别与一组酶相关联。
密度最大者含有磷酸转移酶，它们能催化磷酸酶与溶酶体蛋白的结合；中等密度者含有甘露糖甘酶和N－乙酰葡萄糖胺转移酶；而半乳糖基转移酶及唾液酸基转移酶则主要存在于低密度碎片。
这也证明了在高尔基复合体中至少具有3种不同结构和功能分化的高尔基膜损。
也正是基于此研究结果，Rothman等人提出了高尔基复合体叠层存在生化区隔化或房室化的新观点。
此后的免疫细胞化学电镜技术研究分析发现：N－乙酰葡萄糖胺转移酶I只存在于高尔基体叠层中央的2~3个扁痪中；半乳糖基转移酶也仅存千反面扁檄中；而磷酸转移酶则几乎可以肯定地存在于顺面扁痪之中。
这一发现，为高尔基复合体叠层的生化区隔化或房室化提供了新的证据。
表5-3是常见千高尔基复合体中的一些主要的酶类及其分布。
乙酰葡萄糖胺转移酶I甘露糖背酶II NAOP酶系磷脂酶腺昔酸环化酶5'－核昔酸酶脂肋酰基转移酌甘露糖酶I酸性磷酸酶核昔二磷酸酶唾液酸转移酶硫胺素焦磷酸酶半乳糖基转移酶高尔基复合体中含有极为丰富的蛋白质和较为多样的酶类。
凝胶电泳分析显示，高尔基复合体
蛋白的组成含量和复杂程度亦介于内质网和细胞膜之间，其中一些蛋白质与内质网是相同的。
因此，有理由推断：高尔基复合体是构成质膜和内质网之间相互联系的一种过渡性细胞器。
三、高尔基复合体的功能
作为内膜系统的主要结构组成之一，高尔基复合体不仅和内膜系统其他结构组分一起构成了胞内物质转运的特殊通道，而且也是胞内物质合成、加工的重要场所。
其主要的功能作用包括：(—)高尔基复合体是细胞内蛋白质运输分泌的中转站早在20世纪60年代中期，G.
E. Palade和J.
D. Jami eso n等人，运用放射性同位素标记示踪技术，注射3H标记的亮氨酸千豚鼠胰腺细胞，3分钟后，3廿亮氨酸即出现于内质网中；约20分钟后，从内质网进入到高尔基复合体；120分钟后，3廿亮氨酸出现、存在千细胞顶端的分泌泡中并开始释放。
该实验清楚地显示了分泌蛋白在细胞内的合成及其转运途径。
此后的研究进而证明，除了外输性分泌蛋白之外，胞内溶酶体中的酸性水解酶蛋白、多种细胞膜蛋白以及胶原纤维等细胞外基质成分也都是经由高尔基复合体进行定向转送和运输的。
因此，可以说高尔基复合体是细胞内蛋白质运输分泌的中转站。
外源性分泌蛋白具有连续分泌(continuous sec retion)和非连续分泌(disco n ti nu ou s secretion)两种不同的排放形式。
前者又称恒定型分泌(cons tituti ve secreti o n)，是指外输性蛋白质在其分泌泡形成之后，随即排放出细胞的分泌形式；而后者则是先储存于分泌泡中，需要时再排放到细胞外的分泌形式（动画5-6“高尔基复合体是蛋白成熟的场所”)。
（二）高尔基复合体是胞内物质加工合成的重要场所1糖蛋白的加工合成内质网合成并经由高尔基复合体转送运输的蛋白质，绝大多数都是经过。
第五章细胞的内膜系统与众泡转运117
糖基化修饰加工合成的糖蛋白，主要包括N－连接糖蛋白和O－连接糖蛋白两种类型。
前者，其糖链合成与糖基化修饰始于内质网，完成于高尔基复合体；后者，则主要或完全是在高尔基复合体中进行和完成的。
O－连接糖基化霖糖链结合的蛋白质多肤链中的氨基酸残基通常有丝氨酸、苏氨酸和酪氨酸（或胶原纤维中的轻赖氨酸与胫脯氨酸）。
除了蛋白聚糖外，几乎所有0-连接霖糖中与氨基酸残基侧链OH直接结合的第一个糖基都是N－乙酰半乳糖胺（蛋白聚糖中第一个糖基通常是木糖）；组成0－连接霖糖链中的单糖组分，是在糖链的合成过程中一个个地添加上去的。
表5-4是N－连接糖蛋白与0连接糖蛋白之间的主要差别。
N－连接糖蛋白O－连接糖蛋白
糖基化发生部位糙面内质网高尔基复合体连接的氪基酸残基天冬氨酸丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸、轻赖（脯）氨酸连接基团NH2-O H第一个糖基N-乙酰葡糖胺半乳糖、N－乙酰半乳糖胺糖链长度5~25个糖基l~6个糖基糖基化方式森糖链一次性连接单糖基逐个添加将细胞置于含有用3H标记的甘露糖培养基中短期培养，然后进行放射自显影示踪测定发现：银染颗粒仅出现于内质网中；用3H-N－乙酰葡萄糖胺培养标记，银粒在内质网和高尔基复合体中同时出现；而用半乳糖和3H－唾液酸糖标记培养，则只在高尔基复合体中发现了银粒的存在。
这说明，甘露糖、N－乙酰葡萄糖胺位千糖蛋白驿聚糖链的核心，存在于内质网腔；而半乳糖、唾液酸则位千寡糖链的远端，存在于高尔基复合体中。
因此，高尔基复合体不仅具有对于内质网来源的蛋白质的修饰加工作用，而且还是糖蛋白中多（霖）糖组分及分泌性多糖类合成的场所。
在糖蛋白的形成过程中，对糖蛋白中寡糖链的修饰加工，是高尔基复合体的主要功能之一。
由内质网转运而来的糖蛋白，在进入高尔基复合体后，其寡糖链末端区的寡糖基往往要被切去，与此同时，百添加上新的糖基，比如UDP－半乳糖、UDP－葡萄糖和UDP－唾液酸等。
蛋白质糖基化的重要意义在于：心糖基化对蛋白质具有保护作用，使它们免滥水解酶的降解；＠糖基化具有运输信号的作用，可引导蛋白质包装形成运输小泡，以便进行蛋白质的靶向运输；＠糖基化形成细胞膜表面的糖被，在细胞膜的保护、识别以及通讯联络等生命活动中发挥重要作用（动画5-7“高尔基复合体是蛋白质糖基化修饰加工的流水线”)。
2蛋白质的水解加工对蛋白质的水解修饰，是高尔基复合体物质加工修饰功能的另一种体现形式。
某些蛋白质或酶，只有在高尔基复合体中被特异性地水解后，才能够成熟或转变为其作用的活性存在形式。
例如人胰岛素，在内质网中是以由86个氨基酸残基组成，含有A、B两条肤链和起连接作用的C肤所构成的胰岛素原的形式而存在。
当它被转运到高尔基复合体时，在水解切除C肤后才成为有活性的胰岛素。
还有，胰高血糖素、血清白蛋白等的成熟，也都是经过在高尔基复合体中的切除修饰完成的。
此外，业已证实，溶酶体酸性水解酶的磷酸化、蛋白聚糖类的硫酸化等，均在高尔基复合体的转运过程中发生和完成。
（三）高尔基复合体是胞内蛋白质的分选和膜泡定向运输的枢纽高尔基复合体在细胞内蛋白质的分选和膜泡的定向运输中具有极为重要的枢纽作用。
其可能的机制是：通过对蛋白质的修饰、加工，使得不同的蛋白质带上了可被高尔基复合体网膜上专一受体识别的分选信号，进而选择、浓缩，形成不同去向的运输和分泌小泡。
这些分泌小泡的运输主要有三条可能的途径和去向（图5-ll)：CD经高尔基复合体单独分拣和包装的溶酶体酶，以有被小泡的形式被转运到溶酶体；＠分泌蛋白以有被小泡的形式运向细胞膜或被分泌释放到细胞外；＠以分泌小泡的形。
118第二篇细胞的结构与功能式暂时性地储存于细胞质中，在有需要的情况下，再被分泌释放到细胞外去（动画5-8“高尔基复合体是蛋白质分选的场所（溶酶体酶蛋白的形成及分选机制）”）。
混合蛋白质分拣
l l I1溶酶体信号定向转运l
-6-P受体七
«\\A3连续分泌晌\
，细胞膜
\·1（入J/，..＼\；\\＼`:;-·,细胞质溶质细胞外空间＂．高，京如网．不间－C丿反面可-,|2非连续分泌l内质网I高尔基网高尔基网图5-11经高尔基复合体分拣形成的蛋白质运输小泡三种可能的转运途径与去向溶酶体(l ysosome)是内膜系统的另一种重要结构组分。
有关溶酶体可能存在的最早证据资料，是1949年C.
de Duve在对大鼠肝组织匀浆细胞组分进行差速离心分离分析研究时意外地获得的。
他们在寻找与糖代谢有关的酶时发现，作为对照的酸性磷酸酶活性主要集中在线粒体分离层。
引起研究者注意的另一个实验现象是：酸性磷酸酶活性在蒸熘水提取物中高千庶糖渗透平衡液抽提物；在放置一段时间的抽提物中高于新鲜制品，而且酶的活性与沉淀的线粒体物质无关。
由此他们推断：在线粒体分离层组分中可能存在另一种细胞器。
这一推断，在1955年由de Duve和A.
Novikoff等对鼠肝细胞的电镜观察中得以证实。
并因其内含多种水解酶而被命名为溶酶体。
—、溶酶体的形态结构和化学组成
（一）溶酶体是一种具有高度异质性的膜性结构细胞器溶酶体普遍地存在于各类组织细胞之中。
电镜下可见系由一层单位膜包裹而成。
膜厚约6nm，通常呈球形。
其大小差异显著，一般直径为0.2-0.8µm，最小者直径仅0.
OSµm，而最大者直径可达数微米（图5-12)。
典型的动物细胞中约含有几百个溶酶体，但是，在不同细胞中溶酶体的数偏差异是巨大的。
一般而言，在溶酶体中可含有60多种能够分解机体中几乎所有生物活性物质的酸性水解酶，这些酶作用的最适pH通常在35~5.5。
表5-5为溶酶体含有的几种主要酶类及其作用底物。
但是，在每一个溶酶体中所含有的酶的种类却是有限的；不同溶酶体中所含有的水解酶亦并非完全相同。
也因此而使它们表现l l出不同的生化或生理性质。
总而言之，溶酶体在其形态大小、数200nm量分布、生理生化性质等各方面都表现出了高度的异质性(het-图5-12溶酶体形态结构的&:~":rogenous)。
第五章细胞的内膜系统与众泡转运119
（二）溶酶体的共同特征是含有酸性水解酶尽管溶酶体是一种具有高度异质性的细胞器，但是却也具有许多重要的共性特征：(1)所有的溶酶体都是由一层单位膜包裹而成的裂球状结构小体；(2)均含有丰富的酸性水解酶，包括蛋白酶、核酸酶、脂酶、糖昔酶、磷酸酶和溶菌酶等多种酶类。
其中，酸性磷酸酶是溶酶体的标志酶；
(3)溶酶体膜中富含两种商度糖基化的穿膜整合蛋白l gpA和lgpB。
它们分布在溶酶体膜腔面，可能有利于防止溶酶体所含的酸性水解酶对其自身膜结构的消化分解；(4)溶酶体膜上嵌有质子泵，可依赖水解ATP释放出的能批将H十逆浓度梯度地泵入溶酶体中，以形成和维持溶酶体埏腔中酸性的内环境。
（三）溶酶体膜糖蛋白家族具有高度同源性在多种脊椎动物中已鉴定出了一个溶酶体膜糖蛋白家族－溶酶体结合膜蛋白(lysosoma l-associaled membrane protein, LAMP)或溶酶体整合膜蛋白(lysosomal integral membrane prote in, LIMP)。
该类蛋白的肤链组成结构包括：一个较短的N－端信号肤序列、一个高度糖基化的腔内区、一个单次跨膜区和一个山10个左右的氨基酸残基组成的C－端胞质尾区。
相关的蛋白质克隆实验表明：在不同物种的同类蛋白质及同一物种的不同蛋白质之间，特别是在其功能结构区，具有高度的氨基酸序列组成同源性。
在典型的溶酶体膜糖蛋白结构的糖基化蛋白核心上，连接于蛋白质多肤链中天冬酰胺的霖糖成分可占到糖蛋白重址的50%；在群糖链的末端均含有唾液酸。
这种高度的糖基化使得蛋白质的等电点极低而呈酸性。
溶酶体整合膜蛋白高度保守的C－端胞质尾区区段可能是该类蛋白质从高尔基复合体向溶酶体运输的通用识别信号。
因为，如果改变或破坏C－端的结构组成，就会阻止它们向溶酶体的定向转运。
这也提示：N－糖基化并非是这些蛋白质必需的转运信号。
二、溶酶体的形成与成熟过程
溶酶体的形成是一个由内质网和高尔基复合体共同参与，集胞内物质合成加工、包装、运输及结构转化为一体的复杂而有序的过程。
就目前的普遍认识，以溶酶体酶蛋白在附着型多聚核糖体上的合成为起始，溶酶体的形成主耍经历以下儿个大的阶段：1酶蛋白的N糖基化与内质网转运合成的酶蛋白前休进入内质网网腔，经过加工、修饰，形成＼－连接的甘碌糖糖蛋白；再被内质网以出芽的形式包裹形成膜性小泡，转送运输到高尔基复合体的形成面。
2酶蛋白在高尔基复合体内的加工与转移在高尔基复合体形成面娱腔内磷酸转移酶与N－乙酰葡萄糖胺磷酸糖甘酶的催化下，寡糖链上的甘霹糖残基磷酸化形成甘露糖－6－磷酸(mannose-6-phosphate, M-6-P)，此乃溶酶体水解酶分选的重要识别信号。
胞外区3.酶蛋白的分选与转运当带有M-6P标记的溶酶体水解酶前体到达高尔基复合体成熟面时，被高尔基复合体网膜痰腔面的受体蛋白所识别、结合，随即触发高尔基复\a合体局部出芽和网膜外胞质面网格蛋白的组装，并最终以表面狻有网格蛋白的有被小泡(coated ves icle)形式与高尔基复合体袭膜断离。
以M-6-P为标志的溶酶体酶分选机制
是目前了解比较清楚的一条途径，但并非溶酶体酶分选的唯一途径。
有实验提示，在某些细胞中可能还存在着非M-6-P依赖的其他分选机制。
4内体性溶酶体的形成与成熟断离后的有被小泡，很快脱去网格蛋白外被形成表面光滑的无被运输小泡，它们与细胞质内的晚期内体（也称晚期内吞体）融合，形成内酸性水解酶的释体性溶酶体。
内体(endosome)，是由细胞的胞吞作用酸性水解酶形成的一类异质性脱衣被膜泡，依其发生阶运输小1段而分为早期内体(ea rly endosome)和晚期内体（图5-13)。
所谓早期内体是指经由胞吞作用入胞后最初的脱衣被膜泡，其痪腔中M-6-P受体人心＾o~多受体含有胞吞物质，是一个pH和细胞外液大致相当的碱性内环境。
晚期内体是相对千早期内体而言。
当早期内体通过分拣、分离出带有质膜受体的再循环内体(recycli n g e ndosome)后，即完成内体性溶酶体了从早期内体向晚期内体的转化，而再循环图5-13内体性溶酶体的形成过程示意图内体则返回并重新融入到质膜中。
由早期内体分化形成的晚期内体相对靠近于细胞核一侧，它们和来源千高尔基复合体的那些含有酸性水解酶的运输小泡融合之后，在其战膜上质子泵的作用下，将胞质中的甘泵入，使其腔内pH从7.4左右下降到6.0以下。
在改变了的酸性内环境条件下，溶酶体酶前体从与之结合的M-6-P膜受体上解离，并通过去磷酸化而成熟；同时，膜M-6-P受体则出芽形成运输小泡，重新回到高尔基复合体成熟面的网膜上。
经历这些系列变化之后，最终形成内体性溶酶体。
内体性溶酶体的发生形成过程如图5-13所示。
三、溶酶体的类型
关于溶酶体类型的划分，目前存在两种不同的分类体系，兹分别介绍如下：(—)溶酶体以其功能状态的不同可区分为三种基本类型根据溶酶体的不同发育阶段和生理功能状态，一般将之划分为初级溶酶体、次级溶酶体和三级溶酶体三种基本类型。
1初级溶酶体初级溶酶体(primary lysosome)是指通过其形成途径刚刚产生的溶酶体。
所以，也有原溶酶体(prolo-lysosome)、前溶酶体(prelysosome)之称。
初级溶酶体膜厚约6nm，在形态上一般为不含有明显颗粒物质的透明圆球状。
但是，在不同的细胞类型或者在同一细胞类型的不同发育时期，可呈现为电子致密度较高的颗粒小体或带有棘突的小泡。
初级溶酶体毅腔中的酶通常处于非活性状态，因此也有入称之为无活性溶酶体(inactive lysosome)。
2次级溶酶体当初级溶酶体经过成熟，接受来自细胞内、外的物质，并与之发生相互作用时，即成为次级溶酶体(secondru-y lysosome)。
因此，所谓的次级溶酶体，实质上是溶酶体的一种功能作用状态，故又被称作消化泡(digest ive vacuole)。
次级溶酶体体积较大，外型多不规则，袭腔中含有正在被消化分解的物质颗粒或残损的膜碎片。
依据次级溶酶体中所含作用底物之性质和来源的不同，又把次级溶酶体分为不同的类型，给予不同的称谓：3三级溶酶体三级溶酶体(le山ary lysosome)又称后溶酶体(post-lysosome)或终末溶酶体(telolysosome)，是指次级溶酶体在完成对绝大部分作用底物的消化、分解作用之后，尚会有一些不能被消化、分僻的物质残留于其中，随着酶活性的逐渐降低以至最终消失，进入了溶酶体生理功能作用的终末状态。
此时又被易名为残余体(resid u al body)。
这些残余体，有些可通过细胞的排遗作用，以胞吐的方式被清除、释放到细胞外去；有些则可能会沉积于细胞内而不被外排。
例如，常见于脊椎动物和人类神经细胞、肝细胞、心肌细胞内的脂褐质(Iipofuscin)；见于肿瘤细胞、某些病毒感染细胞、大肺泡细胞和单核吞噬细胞中的髓样结构(myelin fi gure)及含铁小体(si derosome)。
它们会随个体年龄的增长而在细胞中累积。
不同的残余体，不仅形态差异明显，而且也有不同的内含残留物质。
脂褐质是由单位膜包裹的非规则形态小体，内含脂滴和电子密度不等的深色调物质。
含铁小体内部充满电子密度较高的含铁颗粒，颗粒直径约为50-60nm。
当机体摄入大量铁质时，在肝、肾等器官组织的巨噬细胞中常会出现许多含铁小体。
髓样结构之大小差异在0.3-3µm之间。
其最显著的特征是内含板层状、指纹状或同心层状排列的膜性物质。
溶酶体的类型是相对于溶酶体的功能状态而入为划分的；不同的溶酶体类型，只是同一种功能结构不同功能状态的转换形式。
图5-14表示溶酶体系统的这种功能类型转换关系。
（二）溶酶体以其形成过程的不同可区分为两大类型近年来，基千对溶酶体形成过程的认识，又有人提出了新的溶酶体分类体系。
根据这一分类体系，溶酶体被划分为内体性溶酶体(endo lysosome，也称内溶酶体）和吞噬性溶酶体两大类型。
前者，被认为是由高尔基复合体芽生的运输小泡并入经由细胞胞吞（饮）作用形成的内体晚期阶段即晚期内体(lale endosome)所形成；后者则是由内体性溶酶体和自噬体或异噬体相互融合而成（动画5-9"溶酶体的类型及发生过程”)。
四、溶酶体的功能
溶酶体内含60多种酸性水解酶，具有对几乎所有生物分子的强大消化分解能力。
溶酶体的一切细胞生物学功能，无不建立在这种对物质的消化和分解作用基础之上。
（一）溶酶体能够分解胞内的外来物质及清除衰老、残损的细胞器溶酶体能够通过形成异噬性溶酶体和自噬性溶酶体的不同途径，及时地对经胞吞（饮）作用摄入的外来物质或细胞内衰老、残损的细胞器进行消化，使之分解成为可被细胞重新利用的小分子物质，并透过溶酶体膜释放到细胞质基质，参与细胞的物质代谢。
这不仅使可能影响细胞正常生命活动的外来异物和丧失了功能的衰老、残损的细胞器得以清除，有效地保证了细胞内环境的相对稳定，也有利于细胞器的更新替代。
（二）溶酶体具有物质消化与细胞营养功能
溶酶体作为细胞内具有消化功能的细胞器，在细胞饥饿状态下，可通过分解细胞内的一些对于细胞生存并非必需的生物大分子物质，为细胞的生命活动提供营养和能噩，维持细胞的基本生存。
事实上，在原生动物，其从外界摄入的各种营养物质，就是完全依赖溶酶体的分解消化作用才被细胞有机体吸收利用的。
（三）溶酶体是机体防御保护功能的组成部分
细胞防御是机体免疫防御系统的重要组成部分，而溶酶体强大的物质消化和分解能力则是细胞实现其免疫防御功能的基本保证和基本机制。
通常，在巨噬细胞中均具有发达的溶酶体，被吞噬的细菌或病毒颗粒，最终都是在溶酶体的作用下而得以杀灭，并被分解消化的。
（四）溶酶体参与某些腺体组织细胞分泌过程的调节溶酶体常常在某些腺体组织细胞的分泌活动过程中发挥着重要的作用。
例如，储存于甲状腺腺体内腔中的甲状腺球蛋白，首先要通过吞噬作用进入分泌细胞内，在溶酶体中水解成甲状腺素，然后才被分泌到细胞外。
（五）溶酶体在生物个体发生与发育过程中起重要作用溶酶体的重要功能不仅体现在细胞生命活动之始终，而且也体现于整个生物个体的发生和发育过程。
对于有性生殖生物而言，如果说受精卯是生命个体发育的开始，那么生殖配子的形成就是个体发生的前提。
在动物精子中，溶酶体特化为其头部最前端的顶体(acrosome)，当精子与卵子相遇、识别、第五章细胞的内膜系统与众泡转运123接触时，稍子释放顶体中的水解酶，溶解、消化围绕卯细胞的滤泡细胞及卵细胞外被，从而为精核的入卵受精打开一条通道。
在无尾两栖类动物个体的变态发育过程中，其幼体尾巴的退化、吸收；脊椎动物生长发育过程中骨组织的发生及骨质的更新；哺乳动物子宫内膜的周期性萎缩、断乳后乳腺的退行性变化、衰老红细胞的清除以及某些特定的细胞编程性死亡等，都离不开溶酶体的作用。
第四节过氧化物酶体
过氧化物酶体(peroxisome)是在1954年由J.
Rhodin首次发现千鼠肾脏肾小管上皮细胞中的亚微结构。
此后几十年的大量观察研究表明，该结构是普遍地存在于各类细胞之中的一种固有的细胞内结构小体。
一、过氧化物酶体的基本理化特征
过氧化物酶体最先被称作微体(m i crobody)，也是由一层单位膜包裂而成的膜性结构细胞器。
因为过氧化物酶体在形态、结构和物质降解功能上与溶酶体的类似以及其本身的异质性，以致在相当长的一段时间内不能够把它们与溶酶体区分开来。
直至20世纪70年代，人们才逐渐确认过氧化物酶体是完全不同于溶酶体的另一种细胞器，并根据其内含氧化酶和过氧化氢酶的特点而命名为过氧化物酶体。
(—)过氧化物酶体是一类具有高度异质性的膜性球器状细胞器电镜下可见过氧化物酶体在形态上多呈圆形或卯圆形，偶见半月形和长方形；其直径变化在0.2-I.7µm之间（图5-15)。
过氧化物酶体不同于溶酌体等类似的膜泡结构小体的最为突出的特征有二：心过氧化物酶体中常常含有电子致密度较高、排列规则的品格结构。
此乃尿酸氧化酶所形成，被称作类核体(nucleoid)或类品体(crystallo id)。
©在过氧化物酶体界膜内表面可见一条称之为边缘板(margina l plate)的高电子致密度条带状结构。
该结构的位置与过氧化物酶体的形态有关：如果存在于一侧，过氧化物酶体会呈半月形；倘若分布在两侧，过氧化物酶体则为长方形（动画5-L O”过氧化物酶体的形态特征（异质性单层膜小体含类晶体）”。
（二）过氧化物酶体膜具有较高的物质通透性与其他各种膜性结构细胞器一样，脂类及蛋白质也
是过氧化物酶体的主要化学结构组分。
其膜脂主要为磷脂酰胆碱和磷脂酰乙醇胺；膜蛋白包括多种结构蛋白和酶蛋白。
过氧化物酶体膜不仅可允许氨基酸、庶糖、乳酸等小分子物质的自由穿越，而且，在一定条件下甚至可允许一些大分子物质的非吞噬性穿膜转运，从而保证了过氧化物酶体反应底物及代谢产物的通常运输，表现出具有较高的物质通透性之特征。
（三）过氧化物酶体含有以过氧化氢酶为标志的40多种酶过氧化物酶体的异质性不仅表现为形态、大小的多图5-15过氧化物酶体电镜图样性，而且也体现千不同的过氧化物酶体所含酶类及其生理功能的不同。
迄今为止，已经鉴定的过氧化物酶体酶就多达40余种，但是至今尚未发现一种过氧化物酶体含有全部40多种酶。
根据不同酶的作用性质，可把过氧化物酶大体上分为三类：1.氧化酶类包括尿酸氢化酶、D－从基酸氧化酶、L－氨基酸氧化酶等黄素腺啋呤二核昔酸(flavi n aden ine dinucl eotide, FAD)依赖氧化酶类。
各种氧化酶约占过氧化物酶体酶总址的50%～60%。
尽管各种氧化酶的作用底物互不相同，但是，它们共同的基本特征是：在对其作用底物的氧化过程中能够把氧还原成过氧化氢。
这一反应通式可表示如下：2.过氧化氢酶类过氧化氢酶约占过氧化物酶体酶总址的40％左右；因其几乎存在千各类细胞的过氧化物酶体中，故而被看作过氧化物酶体的标志性酶。
该酶的作用是将过氧化氢分解成水和氧气，即：3过氧化物酶类过氧化物酶可能仅存在于如血细胞等少数几种细胞类型的过氧化物酶体之中。
其作用与过氧化氢酶相同，即可催化过氧化氢生成水和氧气。
此外，在过氧化物酶体中还含有苹果酸脱氢酶、拧檬酸脱氢酶等。
二、过氧化物酶体的功能
（一）过氧化物酶体能有效地清除细胞代谢过程中产生的过氧化氢及其他毒性物质过氧化物酶体中的氧化酶，可利用分子氧，通过氧化反应祛除特异有机底物上的氢原子，产生过氧化氢；而过氧化氢酶又能够利用过氧化氢去氧化诸如甲酸、甲酸、酚、醇等各种反应底物。
氧化酶与过氧化氢酶催化作用的偶联，形成了一个由过氧化氢协调的简单的呼吸链（图5-16)。
这不但是过氧化物酶体独有的重要特征之一，而且也是过氧化物酶体主要功能的体现，即可以有效地消除细胞代谢过程中产生的过氧化氢及其他裔性物质，从而起到对细胞的保护作用。
这种反应类型，在肝、肾组织细胞中显得尤为重要。
比如，饮酒进入人体的乙醇，主要就是通过此种方式被氧化解碍的。
氧化酶、---~-~2比0。
2-H202过氧化氢酶O在氧化酶的作用下，使底物R儿将电子父给氧，生成过氧化氢(H202)；过氧化氢再被过饥化氢酶还原成水；＠还原的电子来自多种小分子R比之一种(R—比）；＠如果没有其他供体，则还原的屯子可来自于过氧化氢本身（二）过氧化物酶体能够有效地进行细胞氧张力的调节尽管过氧化物酶体只占到细胞内氧耗址的20%，但是，其氧化能力却会随氧浓度的增高而增强。
因此，即便细胞出现高浓度氧状态时，也会通过过氧化物酶体的强氧化作用而得以有效调节，以避免细胞遭受高浓度氧的损害。
（三）过氧化物酶体参与对细胞内脂肪酸等高能分子物质的分解转化过氧化物酶体的另一功能是分解脂肪酸等高能分子，或使其转化为乙酰辅酶A，并被转运到细胞质基质，以备在生物合成反应中的再利用；或者向细胞直接提供热能。
三、过氧化物酶体的发生
关于过氧化物酶体的发生，目前存在两种不同的观点。
早前，人们根据一些形态观察获得的实验资籵，认为过氧化物酶体的发生和形成过程相似于溶酶体，即过氧化物酶体的酶蛋白是在糙面内质网上的附着核糖体合成，经过在内质网腔中的加工修饰后，以转运小泡的形式转移、分化形成的。
而现在则有证据显示：过氧化物酶体的发生与线粒体相类似，是由原有的过氧化物酶体分裂而来。
分裂产生的子代过氧化物酶体经过进一步的装配，最后形成成熟的过氧化物酶体细胞器。
更有实验证明：过氧化物酶体基质蛋白是合成于胞质中游离的核糖体上，然后，在其肤链某一端特定的过氧化物酶体蛋白分选信号序列(peroxisomal t狙ge t ing signal, PTS)或导肤(leader peptid e)的引导下进入到过氧化物酶体中的；过氧化物酶体膜整合蛋白也是在游离核糖体上合成的。
但是，无论上述哪种观点，都不排除和否认内质网在过氧化物酶体形成过程中的作用。
首先，构成过氧化物酶体的膜脂，可能是在内质网上合成，再通过磷脂交换蛋白或膜泡运输的方式完成其转运的；其次，在胞质中游离核糖体上合成的过氧化物酶体膜整合蛋白，可能通过三种不同的途径嵌入过氧化物酶体的脂质膜中。
这三种可能的途径分别是：心在过氧化物酶体进行分裂增殖之前直接嵌入；＠嵌入来自于内质网的过氧化物酶体膜脂转移小泡，并随同转移小泡一起加入到过氧化物酶体；＠嵌入正在从内质网膜上分化，但是又尚未完全分离的过氧化物酶体脂膜，然后与过氧化物酶体膜脂一起以转移小泡的形式被转运到过氧化物酶体（动画5-11“过氧化物酶体的发生”)。
第五节嘉泡与囊泡转运
痪泡，也称为小泡(vesicle)，是真核细胞内十分常见的由单位膜包围而成的含有特殊内含物的膜泡结构。
袋泡从几十纳米到数百纳米不等，可呈小的球形或较大的无规则形状。
在所有具有内膜系统结构的细胞中，就必然地会有痪泡的形成出现。
内膜系统是一个庞大复杂的功能结构体系，构成内膜系统的各主要细胞器都具有它们各自相对独特的结构存在形式和主要的生理功能。
襄泡虽然不像内质网、高尔基复合体、溶酶体和过氧化物酶体那样作为一种相对稳定的细胞内困有结构而存在，但是却依然是细胞内膜系统不可或缺的重要功能结构组分。
誕泡的形成出现，都会伴随着细胞内物质的定向运输活动过程，因此也被称为转运找泡(transport vesicle)。
由痪泡介导的运输方式称为痰泡运输(membrane traffic)或袋泡转运(vesicul出transport)。
高尔基复合体一、蠹泡在胞内蛋白质运输中的作用不论是在游离核糖体还是膜结合型核糖体上合成的蛋白质，在其合成结束后，必须被输送到其发挥功能的细胞区室。
正是由于新合成蛋白质多肤链中信号序列的差异，最终决定了蛋白质合成起始后继续合成的不同形式和各自的运输途径及去向。
胞内的蛋白质运输主要有3条不同途径（图5-17)。
早期内体和线粒体的。
(3)小泡运输(vesicu l扣lransporl)：又称娱泡运输或痪泡转运，是由不同膜性运输小泡承载的一种蛋白质运输形式。
其实质是由膜包裹、以出芽的方式从供体细胞器或质膜断裂形成痪泡，携带运送的物质到达受体细胞器或质膜并与之融合而完成转运的过程。
膜性细胞器之间的蛋臼分子转移、细胞的分泌活动及细胞膜的大分子和颗粒物质转运，都是以这种运输形式来实现。
毅泡运输是真核细胞特有的一种细胞物质内外转运形式。
褒泡类型多样，结构特殊，有着十分精密复杂的产生、形成过程。
在细胞生命活动中由之所承载和往返穿梭进行的物质运输，不但涉及蛋白质的修饰、加工和装配，同时还涉及内膜系统不同功能结构间通过相互转换的定向物质转运过程及其复杂有效的分子调控机制。
近些年来，对千森泡的研究，受到了人们越来越多的关注。
二、囊泡的类型与来源
碌泡虽然可被视为是内膜系统重要的整体功能结构组分之一，但是与内质网、高尔基复合体、溶酶体及过氧化物酶体等膜性细胞器不同，它们并非是一种相对稳定的细胞内固有结构，而只是细胞内物质定向运输的载体和功能表现形式。
痪泡类型多样，结构特殊，有着十分粘密复杂的产生、形成过程。
不同类型的痪泡介导不同的运输过程。
据研究推测，承担细胞内物质定向运输的戏泡类型至少有IO种以上。
其中网格蛋白有被小泡(clalhrin-coaled vesicle)、COP I有被小泡(COP I-coaled vesicle)和COP lI有被小泡(CO P JI-coa led vesicle)是目前了韶较多的三种戚泡类型（动画5-12”有被谈泡的形成过程及运输方向“)。
(—)网格蛋白有被小泡产生于高尔基复合体及细胞膜网格蛋白有被小泡可以出芽的方式产生千高尔基复合体，也可由细胞膜受体介导的细胞内吞作川而形成（图5-18)。
由高尔基复合体产生的网格蛋白小泡，主要介导从高尔基复合体向溶酶体、胞内体或质膜外的物质输送转运；而通过细胞内吞作用形成的网格蛋自有被小泡则是将外来物质转送到细胞质，或者从胞内体输送到溶酶体。
晚内体
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分泌小泡
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内质网高尔基复合体
网格蛋白有被小泡的产生，是一个非常复杂的过程，涉及多种蛋白的参与和作用。
网格蛋白有被小泡直径一般在50~100nm之间。
如图5-19所示，该类戏泡的结构特点有二：一是外被以由网格蛋自纤维构成的网架结构，亦囚此而得名；二是在网格蛋白结构外框与痪膜之间约20nm的间隙中埴充拟盖着大址的衔接蛋白(adap lin)。
网格蛋白(clathrin)是一种蛋白复合物，由3条蜇链和3条轻链组成。
重链和轻链组成二聚体，三个二聚体又形成了包被小泡的结构——三腿蛋白复合物(tri s k e li on)（见第四章图4-22)。
第五章细胞的内膜系统与社泡转运127
受体转运分子
0.2µm发动蛋白（亦称缢断蛋白）
图5-19网格蛋白有被小泡之形态及结构特征A网格蛋白有被小泡形态特征电镜图；B网格蛋白有被小泡结构特征示意图衔接蛋白是有被小泡的包被组成成分，介千网格蛋白与配体－受体复合物之间，参与包被的形成并起连接作用。
衔接蛋白一方面形成相对于外侧网格蛋白框架而言襄泡的内壳结构，另一方面还介导网格蛋白与娱膜穿膜蛋白受体的连接。
因此，碌泡就是依靠衔接蛋白来捕获转运分子的。
目前发现，细胞内至少有4种不同的衔接蛋白，它们选择性地通过与不同受体－转运分子复合体的结合，形成特定的转运誕泡，进行不同的物质转运。
对其中3种衔接蛋白(AP l、AP2和AP3)的性质研究较多。
API参与反面高尔基复合体的网格蛋白有被痰泡的出芽；AP2则参与从细胞质膜形成的网格蛋白有被痪泡的组装；AP3是在酵母和小鼠中鉴定到的一种衔接蛋白，参与某些蛋白从反面高尔基体到液泡、溶酶体的运输。
在娱泡的形成中，除网格蛋白与衔接蛋白之外，发动蛋白或缢断蛋白(dynami n)细胞质中一种可结合并水解GTP的特殊蛋白质也具有极其重要的作用。
发动蛋白由900个氨基酸组成，在膜溪芽生形成时，发动蛋白与GTP结合，并在外凸（或内凹）芽生膜裴的颈部聚合形成环状；随着其对GTP的水僻，发动蛋白环向心缢缩，直至娱泡断离形成。
而一旦毅泡芽生形成，便会立即脱去网格蛋白外被，转化为无被转运小泡，开始其转运运行。
（二）COP Il有被小泡产生千内质网、介导从内质网到高尔基复合体的物质转运COP Il有被小泡由糙面内质网所产生，因狻盖有衣被蛋白Il(coatomer protein Il, COP Il)而得名，属于非网格蛋白有被裳泡类型。
COP Il有被小泡最先被发现于酵母细胞糙面内质网与胞质及ATP的共孵育实验。
利用酵母细胞突变体进行研究鉴定，发现COP II衣被蛋白由5种亚基组成。
包括小分子GTP结合蛋白Sarl,Sec23/Sec24复合物、Secl3/Sec3l复合物和大的纤维蛋白Secl6。
其中的汕蛋白属于一种小的GTP结合蛋白，它可通过与GTP或GDP的结合，来调节痪泡外被的装配与去装配。
汕蛋白亚基与GDP的结合，使之处千一种非活性状态；当取而代之与GTP结合时，Sa]蛋白就会被激活，并导致其结合于内质网膜，同时引发其他蛋白亚基组分在内质网膜上聚合、装配、出芽，随即断离形成COP II有被小泡。
（图5-20)COP Il有被小泡主要负责介导从内质网到高尔基复合体的物质转运（图5-21)。
实验证明，应用COP II有被小泡衣被蛋白COP Il的抗体，能够有效地阻止内质网膜小泡的出芽。
有人采用绿色荧光蛋白(gree n fluoresce nt protein, GFP)标记示踪技术观察COP Il有被小泡的转运途径发现：当COP II有被小泡在内质网生成之后，在向高尔基复合体的转移途中，常常数个彼此先行融合，形成所谓的“内质网－高尔基体中间体”(ER-to-Golgi intermed iate compartment)，然后再沿微管系统继续运行，最终到达C非活化的可溶性Sar I-GDP D GDPSarl-GEF货物图5-20COP II有被小泡的形态结构及组装形成过程示意图A.
COP II有被小泡形态特征电镜图；B.
COP II有被小泡的结构组成；C.
COP II的组装激活；D.
COP II的装配管状小泡丛，)COPI外被-(。
,,/泣返转运第五章细胞的内膜系统与忒泡转运129高尔基复合体之顺面（形成面）。
COP II有被小泡在抵达其靶标之后、与靶膜融合之前，即由结合的GTP水解，产生Sar-GDP复合物，促使娱泡包被蛋白发生去装配，导致嵌泡脱去衣被成为无被转运小泡。
COP II有被小泡的物质转运具有选择性。
实现这种选择的机制是：COP II蛋白能够识别结合内质网穿膜蛋白受体胞质侧一端的信号序列；而内质网穿膜蛋白受体网腔侧的一端，则又与内质网网腔中的可溶性蛋臼结合。
由此可见，COP II蛋白对于泌泡的选择性物质运输具有非常重要的作用。
（三）COP I有被小泡的主要功能是回收转运内质网逃逸蛋臼COP I有被小泡首先发现于高尔基复合体，其毅盖有衣被蛋白I(coa tomer protein I, COP I),亦属千非网格蛋白有被娱泡类型。
它们主要负责内质网逃逸蛋白的捕捉、回收转运以及高尔基复合体膜内蛋白的逆向运输(retrograde transport)。
同时，有证据表明：COP I有被小泡也能够行使从内质网到高尔基体的顺向转移(anterograde transport)。
顺向转移一般不能直接完成，在痪泡的转移运行过程中，往往需要通过“内质网－高尔基体中间体”这一中间环节的中转（图5-22)。
分泌蛋白
受体蛋白
灼二刁了
内质网顺面中间反面高尔基网高尔基网高尔基网
图5-22示COP I有被小泡的形态结构及其在内质网与高尔基复合体之间的运行A.
COP I有被小泡形态特征电镜图；B.
COP I在内质网与高尔基复合体之间的运行COP I衣被蛋白覆盖千碌泡表面，是一种由7个亚基(mB、'Y、8、C、;等）组成的多聚体。
在早前的研究中，人们用不能被水解的GTP类似物处理细胞，引起COP I有被小泡在细胞中的聚集。
然后采用密度梯度离心技术，使之从细胞匀浆中分离出来。
经鉴定分析，先后发现了COP I有被小泡衣被蛋白的Q、B、丫、8、e、[等几种蛋白亚基成分。
其中的a蛋白（也称ARF蛋白）类似于COP II中的汕蛋白亚基，即作为一种GTP结合蛋白，可调节控制衣被蛋白复合物的聚合、装配及膜泡的转运。
COP I衣被小泡形成的大致过程是：心游离于胞质中的非活化状态ARF蛋白与GDP解离并与GTP结合形成GTP-ARF复合体；＠GTP-A{F复合体作用于高尔基复合体膜上的ARF受体；＠COPI,蛋白亚基聚合，同ARF一起与高尔基体襄膜表面其他相关蛋白结合作用，诱导转运襄泡芽生。
而一旦COP I有被小泡从高尔基顺面膜痪生成断离出来，COP I衣被蛋白即可解离。
体外实验证明：CTP的存在，是COP I衣被蛋白发生聚合与解离的必要条件。
三、囊泡转运
（一）囊泡转运是细胞物质定向运输的基本途径
无论何种类型的娱泡，其痪膜均来自于细胞器膜。
娱泡的产生方式，是由细胞器膜外凸或内凹芽生(b udding)而成。
体外研究结果显示：褒泡的芽生是一个主动的自我装配过程；参与这一过程的各种组分，在进化上是十分保守的。
因为，从酵母或植物细胞中提取的胞质溶胶，同样能够启动动物细胞中高尔基复合体的损泡出芽生成。
而所谓的襄泡转运(vesicular transpor t)，则是指裴泡以出芽的方式，从一种细胞器膜产生、脱离后又定向地与另一种细胞器膜相互融合的过程。
娱泡的产生形成过程，总是伴随着物质的转运；娱泡的运行轨道及归宿，取决于其所转运物质的定位去向。
比如，细胞内所合成产生的各种外输性蛋白及颗粒物质，总是先进入内质网，然后以痰泡的形式输送到高尔基复合体，再直接地或经由溶酶体到达细胞膜，最终通过胞吐作用（或出胞作用）分泌释放出去。
而细胞通过胞吞作用摄入的各种外来物质，总是以嵌泡的形式，自外而内，从细胞膜输送到胞内体或溶酶体。
细胞通过胞吞作用摄取重要营养物质如维生素、脂类和铁等经内体或溶酶体重新运输到胞质供细胞利用，一些物质如吞噬的细菌、病毒等异物也可以从细胞膜经内体等向溶酶体等进行向内运输并被降解。
由此可见，由袋泡转运所承载和介导的双向性物质运输，不仅是细胞内外物质交换和信号传递的一条重要途径，而且也是细胞物质定向运输的一种基本形式。
通过痪泡运输的物质主要有两类：一类是位于袭泡膜上的膜蛋白如膜受体、离子通道蛋白和脂类等，可参与细胞器的组成或特定细胞功能（如细胞代谢和信号转导等）。
另一类是娱泡所包裹的内含物，如神经递质、激素、各种酶和细胞因子等，这些物质可发挥降解蛋白质或脂类等的功能；或可被分泌到细胞外，发挥调节自身或其他细胞的功能。
（二）囊泡转运是—个高度有序并受到严格选择和精密控制的物质运输过程不同来源、不同类型的磁泡，承载和介导不同物质的定向运输。
它们必须沿正确的路径，以特定的运行方式，方可抵达、铀泊于既定的靶标，并通过膜的融合释放其运载物质。
一般认为，毅泡如果在较短距离内转运，其主要以简单弥散的方式运行，比如从内质网到高尔基复合体的娱泡转运就是通过这种方式进行的；当转运距离较长时，痪泡运行则需要借于类似骨骼肌纤维中的运动蛋白的协助才能完成。
比如在一个长的神经细胞中，源千高尔基复合体的痪泡向细胞轴突远（末）端的转移就是如此。
痪泡转运不仅仅只是物质的简单输送，而且还是一个严格的质量检查、修饰加工过程。
举例来说：进入内质网的蛋白质，首先要被决定其去、留问题；之后，那些外输的蛋白质，往往还要经过一定的修饰加工和质量检查，才能以痪泡的形式被转运到高尔基复合体。
有时候，某些内质网驻留蛋白或不合格的外输蛋白可能会从内质网逃逸外流，但是，它们在进入高尔基复合体后也还是会被甄别、捕捉，并由COP I有被娱泡遣返回来。
事实上，无论何种来源类型、哪些形式途径的痪泡转运，都是高度有序、受到严格选择和精密控制的物质运输过程。
（三）特异性识别融合是囊泡物质定向转运和准确卸载的基本保证娱泡运输是一个十分复杂的过程，主要包括如下关键步骤：心粱泡的形成：涉及供体膜的出芽、装配和断裂，形成不同的包被裂泡（前面巳述及）；＠粱泡运输：可由马达蛋白驱动，以微管为轨道进行（参见细胞骨架相关章节）（动画5-13"裂泡运输与细胞骨架”)；＠转运砐泡与特定的靶细胞膜描定和融合。
最终达到对物质运输的目的。
而转运痪泡抵达靶标之后与靶膜的融合，是一个涉及多种蛋白的识别与铀泊结合、装配与去装配的复杂调控过程，具有高度的特异性。
而这也正是物质定向运输和鼻，准确卸载的基本保证机制。
第五章细胞的内膜系统与在泡转运131
翋泡与靶膜的识别是它们之间相互融合的基础。
这个重要的过程主要依靠两类蛋白的参与：心Rab蛋白引导痰泡到达正确靶膜的特定靶点；＠由可溶性N－乙基马来酰亚胺敏感因子结合蛋白受体(solubl e N-ethyl maleimide-sensilive factor attachment protein receptor, SNAREs)介导痰泡膜与靶膜之间的融合（动画5-14"翍泡膜与靶向膜上分子的特异识别机制）。
1. SNAREs蛋白家族介导嘉泡与靶膜之间相互融合虽然目前对千嵌泡与靶膜的识别的机制还知之甚少，但是，其无疑与毅泡表面的特异性标记分子和靶膜上的相应受体密切相关。
近些年来，SNAREs家族在襄泡运输及其选择性铀泊融合过程中的作用引起了人们的极大关注。
痪泡相关膜蛋白(vesicle-associated membran e protein, VAMP)和突触融合蛋白(syntax.in)是该蛋白家族的一对成员，负责介导细胞内的艇泡转运。
研究发现：在转运艇泡表面有一种VAMP类似蛋白，被称之为媒泡SNAREs(ves icle-SNAREs, v-SNAREs)；突触融合蛋白是存在于靶标细胞器膜上SNAREs的对应序列，被称之为靶SNAREs(target-SNAREs, t-SNAREs)。
此二者互为识别，特异互补。
越来越多的研究表明介导转运誕泡与靶膜融合的主要机制是通过v-SNARE/t-SNARE蛋白之间那种“锁－钥＂契合式的相互作用，决定痰泡的铀泊与融合。
事实上，存在于神经元突触前质膜上的突触融合蛋白和能够与之特异性结合的突触小泡膜上的嫘泡相关膜蛋白已被分离鉴定（图5-23)。
这两种蛋白的相互作用，可介导膜的融合和神经递质的释放。
突触艇泡
细胞质
神经细胞质膜
目前普遍认为：所有转运娱泡以及细胞器膜上都带有各自特有的一套SNAREs互补序列，它们之间高度特异的相互识别和相互作用，是使转运毅泡得以在靶膜上铀泊停靠，保证痪泡物质定向运输和准确卸载的基本分子机制之一。
2. Rab蛋白家族在殴泡转运与融合中起调节作用Rab蛋白家族为一个大的GTP结合蛋白家族，是参与娱泡转运识别、铀泊融合调节的蛋白因子。
目前已发现大约70个家庭成员。
研究发现每一种细胞器的胞质面至少含有一种Rab蛋白。
Rab蛋白的这种选择性分布使其成为理想的鉴定细胞器的分子，例如RabS定位于早期内体、高尔基复合体，Rab9则定位千晚期内体、高尔基复合体等。
不同Rab蛋白经活化传送定位千不同膜性结构中主要用于促进和调节艇泡的停泊和融合。
Rab蛋白被称为袋泡融合的“定时器”。
Rab蛋白结合GTP激活可位于细胞质膜、内膜和转运艇泡膜上，调节SNARE复合体的形成。
不同Rab蛋白可作用于不同的效应因子(effector)，帮助运输小泡的聚集和靠近靶膜，促进SNARE介导的膜融合过程（图5-24)。
许多运输小泡只有在含有特定的Rab和SNARE之后才能形成。
如在早期内体中有RabS存在。
实验证明没有RabS参与，内体不能形成，即痰泡不能融合。
Rabl调节内质网到高尔基复合体转运溪泡的砚合过程。
酵母Sec4基因编码的蛋白与细胞Rab蛋白同源。
如果将Sec4突变，则非网格蛋白有被痪泡的脱衣被转运融合过程就会受阻失常。
白蛋应效
靶膜货物一｀
无呻
反面高尔(©
网状结构
高尔基体
顺面高尔基网状结构
中间膜痪
COPII亚单位
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内质网－高尔基体
COP I亚单位
中间体
泡襄
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酶被衣
泡埏
有小白被蛋有
第五章细胞的内膜系统与五泡转运133
（四）囊泡转运是实现细胞膜及内膜系统功能结构转换和代谢更新的桥梁细胞膜和内质网是袭泡转运的主要发源地，而高尔基复合体则构成了襄泡转运的集散中心。
伴随物质的合成运输，由内质网产生的转运痪泡融汇到高尔基复合体，其粪膜成为高尔基复合体形成面膜的一部分；由高尔基复合体成熟面持续地产生和分化出的不同分泌翍泡，或被直接输送到细胞膜，或经由溶酶体最终流向和融入细胞膜。
细胞膜来源的痰泡转运，则以胞内体或吞噬（饮）体的形式与溶酶体发生融合转换。
由此可见，不断地产生、形成，存在和穿梭千质膜及内膜系统结构之间的翋泡转运，它们在承载和介导细胞物质定向运输功能的同时，又不断地被融汇更替、转换易名，从一种细胞器膜到另一种细胞器膜，形成了一个有条不紊、源源不断的膜流（图5-25)，并藉此进行着细胞膜及内膜系统不同功能结构之间的相互转换与代谢更新。
第六节细胞内膜系统与医学的关系
早在1858年，当时的病理学家R.
Virchow就提出了病理过程是进行于细胞和组织之中的著名论断。
作为生命的基本单位，细胞生命活动现象，是其内部各种功能结构生理状况的综合体现。
反之，细胞内部各种功能结构的生理状态，也必然会影响到细胞的总体生命活动；它们的任何异常，都会直接引起细胞生命活动的紊乱或导致细胞的病理改变。
内膜系统是真核细胞内最为重要的功能结构体系之一，因此，也就毫不例外地和细胞的一系列病理过程以及多种人类疾病密切相关。
内膜系统，不仅是细胞生物学自身研究的主要课题，而且也是现代医学科学研究的重大问题之一。
—、内质网的病理变化
内质网是极为敏感的细胞器，许多不良因素都可能会引起内质网形态、结构的改变，并导致其功能的异常。
（一）内质网最常见的病理改变是肿胀、肥大或囊池塌陷内质网的肿胀主要是由于钠离子和水分的渗入、内流所造成的一种水解变性。
在低氧、辐射、阻塞等情况下，也会引起肿胀的发生。
极度的肿胀，最终会导致内质网的破裂。
由低氧、病毒性肝炎引起的糙面内质网的肿胀，还常常伴随着附着核糖体颗粒的脱落和萎缩。
膜的过氧化损伤所致的合成障碍造成的内质网改变往往表现为内质网翍池的塌陷；而肝细胞在1型糖原累积病及恶性营养不良综合征时，则表现为内质网膜断离伴随核糖体脱落的典型形态改变。
（二）内质网襄腔中包涵物的形成和出现是某些疾病或病理过程的表现特征在药物中毒、肿瘤所致的代谢障碍情况下，可观察到一些有形或无形的包涵物在内质网中的形成出现；而在某些遗传性疾病患者，由于内质网合成蛋白质的分子结构异常，则有蛋白质、糖原和脂类物质在内质网中的累积。
（三）内质网在不同肿瘤细胞中呈现多样性的改变内质网是细胞生理功能特性的敏感指标。
在具有不同生物学特性的癌变细胞中，内质网的形态结构与功能也呈现出多样性的改变。
通常，在低分化癌变细胞中，内质网比较稀少；在高分化癌变细胞中，其比较丰富发达的内质网遍布细胞质中。
低侵袭力癌细胞中内质网较少，葡萄糖－6－磷酸酶活性呈下降趋势，但是分泌蛋白、尿激酶合成相对明显增多；高侵袭癌细胞中，内质网相对发达，分泌蛋白、驻留蛋白、B－葡萄糖醋酸昔酶等的合成均比低侵袭癌细胞显著增高。
有人认为，孔环片层也是肿瘤细胞中常见的内质网改变，但是关于孔环片层的来源却还存在不同的看法。
有学者认为，孔环片层是内质网的异型结构形态；另有学者认为，孔环片层是核膜的特化结构。
134第二篇细胞的结构与功能
二、高尔基复合体的病理形态变化
(—)功能亢进导致高尔基复合体的代偿性肥大
当细胞分泌功能亢进时，往往伴随高尔基复合体结构的肥大。
有人在大鼠肾上腺皮质的再生实验中注意到：再生过程中，腺垂体细胞分泌促肾上腺皮质激素的高尔基复合体处于旺盛分泌状态时，其整个结构显著增大；再生结束后，随着促肾上腺皮质激素分泌的减少，其高尔基复合体结构又恢复到常态。
（二）毒性物质作用导致高尔基复合体的萎缩与损坏脂肪肝的形成，是由于乙醇等毒性物质的作用，造成肝细胞中高尔基复合体脂蛋白正常合成分泌功能的丧失所致。
在这种病理状态下，可观察到：肝细胞高尔基复合体中脂蛋白颗粒明显减少甚至消失；高尔基复合体自身形态萎缩，结构受到破坏。
（三）肿瘤细胞分化状态影响高尔基复合体形态
正常情况下，在分化成熟、分泌活动旺盛的细胞中高尔基复合体较为发达，而在尚未分化成熟或处于生长发育阶段的细胞中，高尔基复合体则相对较少。
通过对各种不同肿瘤细胞的大量观察研究结果表明，高尔基复合体在肿瘤细胞中的数扯分布、形态结构以及发达程度，也因肿瘤细胞的分化状态不同而呈现显著差异。
例如，在低分化的大肠癌细胞中，高尔基复合体仅为聚集、分布在细胞核周围的一些分泌小泡；而在高分化的大肠癌细胞中，高尔基复合体则特别发达，具有典型的高尔基复合体形态结构。
三、溶酶体与疾病
溶酶体在细胞生命活动中具有多方面的重要生物学功能。
通常把由千溶酶体的结构或功能异常所引起的疾病统称为溶酶体病。
近些年来，人们对于溶酶体与入类某些疾病的关系，进行了颇为广泛深入的探讨和研究，也取得了一定的成果。
（一）溶酶体酶缺乏或缺陷疾病多为—些先天性疾病目前已经发现有40余种先天性溶酶体病系由溶酶体中某些酶的缺乏或缺陷所引起。
现举两例简单介绍如下：1泰萨克斯病泰萨克斯病(Tay-Sac h s di sease)旧称家族性黑喙性痴呆。
由于患者缺乏氨基已糖酶A，阻断了GM2神经节背脂的代谢，导致了GM2的代谢障碍，使得在脑及神经系统和心脏、肝脏等组织的大量累积所致。
2. JI型糖原累积病lI型糖原累积病(type JIglycogenosis, Pompe d i sease)是由于缺乏仅糖节酶，以致糖原代谢受阻而沉积于全身多种组织。
其主要受累器官组织有：脑、肝、肾、肾上腺、骨骼肌和心肌等。
此外，某些药物也会引起获得性溶酶体酶缺乏相关疾病。
比如，磺胺类药物会造成巨噬细胞内pH的升高，使得酸化降低，导致所吞噬的细菌不能被有效地杀灭而引发炎症。
还有，像抗疤疾、抗组胺及抗抑郁之类的药物，会因其在溶酶体中的蓄积，或引起某些细胞代谢中间产物在溶酶体中的蓄积，从而直接或间接地导致溶酶体病的发生。
获得性溶酶体酶缺乏疾病是比较少见的。
（二）溶酶体酶的释放或外泄造成的细胞或组织损伤性疾病由于受到某些理化或生物因素的影响，使得溶酶体膜的稳定性发生改变，导致酶的释放，结果造成细胞、组织的损伤或疾病。
1硅沉着病硅沉着病是一种与溶酶体膜受损导致溶酶体酶释放有关的常见职业病。
其发病机制是：吸入肺中的砂尘颗粒，被肺组织中的巨噬细胞吞噬，形成吞噬体；进而与内体性溶酶体（或初级溶酶体）融合为吞噬性溶酶体。
带有负电荷的砂尘颗粒在溶酶体内形成砂酸分子，以非共价键与溶酶体膜受体或膜上的阳离子结合，影响到膜的稳定性，使得溶酶体酶和砂酸分子外泄，造成巨噬细胞第五章细胞的内膜系统与设泡转运135的自溶。
一方面，外泄的溶酶体酶消化和溶解周围的组织细胞；另一方面，释放出的不能被消化分解的砂尘颗粒又被巨噬细胞所吞噬，重复上述过程。
结果诱导成纤维细胞增生，升分泌大量胶原物质，造成肺组织纤维化，降低肺的弹性，引起肺功能障碍甚至丧失。
2痒风痛风是以高尿酸血症为主要临床生化指征的嗦呤代谢紊乱性疚病。
当尿酸盐的生成与排除之间平衡失调、血尿酸盐升高时，尿酸盐会以结晶形式沉积于关节、关节周围及多种组织，并被白细胞所吞噬。
被吞噬的尿酸盐结晶与溶酶体膜之间形成的氢键结合，改变了溶酶体膜的稳定性；溶酶体中水解酶和组胺等可致炎物质释放，在引起白细胞自溶坏死的同时，引发所在沉积组织的急性炎症。
被释放的尿酸盐又继续在组织沉积。
当沉积发生在关节、关节周围、滑痰、胞鞘等组织时，会形成异物性肉芽肿；而在肾脏，则可能导致尿酸性肾结石或慢性间质性肾炎。
此外，溶酶体酶的释放，与类风湿性关节炎疾病发生、休克发生后的细胞与机体的不可逆损伤等都有着密切的关系。
四、过氧化物酶体与疾病
（一）原发性过氧化物酶体缺陷所致的遗传性疾病与原发性过氧化物酶体缺陷相关的大多是一些遗传性疾病。
例如：1遗传性无过氧化氢酶血症该类患者细胞内过氧化氢酶缺乏，抗感染能力下降，易发口腔炎等疾病。
2. Zellweger脑肝肾综合征这是一种常染色体隐性遗传病。
患者肝、肾细胞中过氧化物酶体及过氧化氢酶缺乏，唬珀酸脱氢酶－黄素蛋白与CoQ之间的电子传递障碍；临床表现为严重肝功能障碍、重度骨骼肌张力减退、脑发育迟缓及癫病等综合症状。
（二）疾病过程中的过氧化物酶体的病理改变
过氧化物酶体的病理性改变可表现为数械、体积、形态等多种异常。
比如，在患有甲状腺功能亢进、，慢性酒精中毒或慢性低氧症等疾病时，可见患者肝细胞中过氧化物酶体数址增多；而在甲状腺功能低下、肝脂肪变性或高脂血症等情况下，则过氧化物酶体数量减少、老化或发育不全。
这也提示：甲状腺激素与过氧化物酶体的产生、形成和发育具有一定的关系。
过氧化物酶体数目、大小以及酶含批的超常变化亦常见于病毒、细菌及寄生虫感染、炎症或内毒素血症等病理清况以及肿瘤细胞中。
基质溶解是过氧化物酶体最为常见的异常形态学变化。
其主要形式是：在过氧化物酶体内形成、出现片状、小管状结晶包涵物。
此种改变往往发生千缺血性组织损伤。
五、囊泡转运与疾病
痪泡转运在细胞乃至整个机体进行正常的生命活动中起着至关重要的作用。
一旦袋泡转运障碍，将会导致多种细胞器缺陷和细胞功能紊乱。
痪泡转运与许多重大疾病（如神经退行性疾病、糖尿病等代谢性疾病、免疫缺陷、肿瘤等）的发生发展密切相关。
有研究结果显示：在阿尔茨海默病(Alzheimer disease, AD)患者的大脑神经细胞中，内体运输途径受到阻碍。
有研究表明，BIN1是继ApoE后第二个发现的与患AD有关的易感基因，BIN l可以负性调控内吞途径。
BIN I的缺失可通过增加微管蛋白tau聚集蛋白的内化和向内体的运输而诱导产生更多的神经纤维缠结。
弱泡转运失调还可损害神经细胞正常的生理功能，如神经元突触泡的运输和神经递质的释放c癌细胞中袋泡运输系统的失调与癌症的发生发展息息相关。
Rab GTP酶及其效应蛋白是痰泡转运的调控者。
越来越多的研究表明，Rab蛋白作为Ras家族的一员与肿瘤的发生发展密切相关。
Rab蛋白在肺癌、乳腺癌、肝癌及食管癌等肿瘤组织中表达明显升高，且多数Rab蛋白促进了肿瘤的发生发展。
有研究显示，在一些肿瘤细胞可通过高表达Rab促进各种金属蛋白酶的分泌，加快细胞外基质的降解从而促进癌细胞转移。
例如，乳腺癌细胞中Rab7和Rab8有助于MTl-MMP的分泌。
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Nature,2016,529(7586):326-335.
小结
内膜系统是指细胞内那些在结构、功能，乃至发生起原上密切关联的膜性结构细胞器，包括内质网、高尔基复合体、溶酶体、过氧化物酶体、各种转运小泡等。
内膜系统的出现是真核细胞区别于原核细胞的重要标志之一。
内质网是以大小、形状各异的管、泡或扁裳为基本结构单位构成的一个彼此相互连通的膜性管网系统。
它在整体结构上可与高尔基复合体、，容酶体等内膜系统的其他组分移行转换，在功能上则与这些结构密切相关，在内膜系统中占据中心地位。
作为一种膜性结构，脂类和蛋白质是内质网的基本化学组成成分。
与其复杂多样的功能相适应，内质网含有以葡萄糖－6－磷酸酶为主要标志的至少30多种以上的酶或酶系。
有核糖体附着的内质网，即糙面内质网，多呈排列较为整齐的扁平囊状，其主要功能是在信号肤引导下合成分泌蛋白、膜蛋白及存在于内膜性细胞器中的可溶性驻留蛋白，是细胞内蛋白质分选的起始部位；无核糖体附着的内质网，即光面内质网，多呈管泡样网状结构，其是作为细胞内脂类物质合成主要场所的多功能细胞器。
高尔基复合体是由三种不同大小类型的小泡、漪泡及夜泡组成的膜性结构复合体。
在其整体形态结构和化学特性上，均表现出明显的极性特征，可划分力顺面高尔基网、高尔基中间膜裳、反面高尔基网三个有功能结构特征的组成部分。
组成高尔基复合体的脂类、蛋白质成分的含量和复杂程度介于内质网和细胞膜之间，由此高尔基复合体被视为构成质膜与内质网之间相互联系的一种过渡性细胞器。
糖基转移酶是高尔基复合体中最具特征性的标志酶。
高尔基复合体的主要功能为：对内质网来原的蛋白质的修饰加工；糖蛋白中多（寡）糖组分及分泌性多糖类的生物合成；和内膜系统其他结构组分一起构成了胞内物质转运的特殊通道，尤其是在细胞内蛋白质的分选和膜泡的定向运输中起枢纽作用。
溶酶体是由一层单位膜包裘而成的膜性球囊状结构细胞器。
溶酶体在其形态大小、数量分布以及生理生化性质等方面，都表现出了高度的异质性。
含有丰富、多样的酸性水解酶，是溶酶体最为显著的标志性特征。
根据溶酶体的不同生理功能状态，可将之划分为初级溶酶体、次级溶酶体和三级溶酶体；基于溶酶体的形成过程，又可将之划分为内体性溶酶体和吞噬性溶酶体两大类型。
内体性溶酶体被认为是由高尔基复合体芽生的运输小泡和经由细胞胞吞（饮）作用形成的内体合并而成；吞噬性溶酶体是由内体性溶酶体与来自胞内外的作用底物相互融合而成。
溶酶体内含60多种酸性水解酶，具有强大的对物质消化和分解的作用。
过氧化物酶体是由一层单位膜包裹的、内含氧化酶和过氧化氢酶的膜性结构细胞器。
过氧化氢酶约占过氧化物酶体酶总量的40%，因其几乎存在于各类细胞的过氧化物酶体中，故被看作过氧化物酶体的标志性酶。
过氧化物酶体具有解毒、调节细胞氧张力以及参与脂肪酸等高能分子的分解等重要功能作用。
裳泡，也称小泡，是真核细胞中十分常见的膜泡结构，为细胞内膜系统不可或缺的重要功能结构组分和细胞内物质定向运输的载体。
目前了解较多的三种囊泡类型有网格蛋白有被小泡、COP I和COP II有被小泡。
COP II有被小泡由糙面内质网所产生，主要负责介导从内质网到高尔基复合体的物质转运；COP I有被小泡首先发现于高尔基复合体，主要负责内质网逃逸蛋白的捕捉、回收转运以彸；勹，及高尔基复合体膜内蛋白的逆向运输；网格蛋白有被小泡可产生于高尔基复合体，也可由细胞膜受体介导的细胞内吞作用而形成。
由高尔基复合体产生的网格蛋白裳泡，主要介导从高尔基复合体向，容酶体、胞内体或质膜外的物质输送转运；而通过细胞内吞作用形成的网格蛋白囊泡则是将外来物质转送到细胞质，或者从胞内体输送到溶酶体。
由囊泡转运所承载和介导的双向性物质运输，不仅是细胞物质定向运输的一种基本形式，也是细胞内外物质交换一条重要途径。
不断地产生、形成，存在和穿梭于质膜及内膜系统结构之间的裳泡转运，它们在介导细胞物质定向运输功能的同时，又不断地被融汇更替、转换易名，从一种细胞器膜到另一种细胞器膜，形成了一个有条不紊、源源不断的膜流，并借此进行着细胞膜及内膜系统不同功能结构之间的相互转换与代谢更新。
内膜系统是真核细胞内最为重要的功能结构体系之一，因此，其结构与功能的异常也就必然地和细胞的一系列病理过程以及多种人类疾病密切相关。
（边惠洁史岸冰）
第六章线粒体与细胞的能量转换
地球上一切生命活动所需要的能量主要来源于太阳能，但不同类型的生物体吸收能量的机制不同。
光能转变为化学能只发生在植物和某些细菌中，它们能通过光合作用，将无机物（如CO2和H20)转化成可被自身利用的有机物，这类生物是自养生物(autotroph)。
动物细胞则以自养生物合成的有机物为营养，通过分解代谢而获得能量，因而被称为异养生物(he terotroph)。
动物细胞主要依靠细胞内的线粒体来实现这一能量转换。
线粒体（单数mitochondion；复数mitochondria)是一个敏感而多变的细胞器，普遍存在于除哺乳动物成熟红细胞以外的所有真核细胞中。
细胞生命活动所需能量的80％是由线粒体提供的，所以它是细胞进行生物氧化和能量转换的主要场所，也有人将线粒体比喻为细胞的“动力工厂(power s tation)”。
此外，线粒体与细胞内氧自由基的生成、细胞死亡以及许多人类疾病的发生有密切的关系。
第一节线粒体的基本特征一、线粒体的形态、数量和结构(—)线粒体的形态、数量与细胞的类型和细胞的生理状态有关光镜下的线粒体呈线状、粒状或杆状等，直径0.5-1.0µm。
不同类型或不同生理状态的细胞，线粒体的形态、大小、数鼠及排列分布并不相同。
例如，在低渗环境下，线粒体膨胀如泡状；在高渗环境下，线粒体又伸长为线状。
线粒体的形态也随细胞发育阶段不同而异，如人胚肝细胞的线粒体，在发育早期为短棒状，在发育晚期为长棒状。
细胞内的渗透压和pH对线粒体形态也有影响，酸性时线粒体膨胀，碱性时线粒体为粒状。
线粒体的数量可因细胞种类而不同，最少的细胞只含1个线粒体，最多的达50万个，其总体积可占细胞总体积的25%。
这与细胞本身的代谢活动有关，代谢旺盛时，线粒体数量较多，反之线粒体的数量则较少。
酉气｀．．（二）线粒体是由双层单位膜套叠而成的封闭性膜襄结构霎木内勾部勹二尸言言了二二勹勹言言二1f1？
勹二二1外膜是线粒体外层单位膜外膜(outer membrane)厚约5~7nm，光滑平整。
在组成上，外膜的1/2为脂类，1/2为蛋白质。
外膜上镶嵌的蛋白质包括多种转运蛋白，它们形成较大的水相通道跨越脂质双层，使外膜出现直径2~3nm的小孔，允许通过分子量在10000以下的物质，包括一些小分子多肤。
2.内膜的内表面附着许多颗粒内膜(inner membrane)比外膜稍菏，平均厚4.5nm，也是一层单位膜。
内膜将线粒体的内部空间分成两部分，其中由内膜直接包围的空间称内腔，含有基质，也称基质腔(matrix space)；内膜与外膜之间的空间称为外腔，或膜间腔(intermembrane space)。
内膜上有大量向内腔突起的折叠(infold ing)，形成崝(cristae）。
崝与崝之间的内腔部分称崝间腔(intercristae s pace)，而由千崝向内腔突进造成的外腔向内伸入的部分称为皓内空间(i n t racri stae s p ace)。
内膜的第六章线粒体与细胞的能归转换139图6-1线粒体由双层膜套壺而成左为线粒体在细胞内的分布；又为线粒体结构化学组成中20％是脂类，80％是蛋白质，蛋白质的含量明显高于其他膜成分。
内膜通透性很小，分子量大于150的物质便不能通过。
但内膜有高度的选择通透性，膜上的转运蛋白控制内外腔的物质交换，以保证活性物质的代谢。
内膜（包括贿）的内表面附着许多突出于内腔的颗粒，每个线粒体大约有104~105个，称为基粒(elementru-y pru·ticle)。
基粒分为头部、柄部、基片三部分，由多种蛋白质亚基组成。
圆球形的头部突入内腔中，基片嵌于内膜中，柄部将头部与基片相连。
基粒头部具有酶活性，能催化ADP磷酸化生成ATP，因此，基粒又称ATP合酶(ATP synthase)或ATP合酶复合体(ATP synt hase complex)。
3内外膜相互接近所形成的转位接触点是物质转运到线粒体的临时性结构利用电镜技术可以观察到在线粒体的内、外膜上存在着一些内膜与外膜相互接触的地方，在这些地方，膜间隙变狭窄，称为转位接触点(translocation contac t site)（图6-2)，其间分布有蛋白质等物质进出线粒体的通道蛋白和特异性受体，分别称为内膜转位子(trans locon of the inner membrane, Tim)和外膜转位子(translocon of the outer membrane, Tom)。
有研究估计鼠肝I I细胞中直径lµm的线粒体有100个左右的转位接触点，用0.2µm免疫电镜的方法可观察到转位接触点处有蛋白质前体的图6-2内膜和外膜形成转位接触点积聚，显示它是蛋白质等物质进出线粒体的通道。
黑色箭头所指为转位接触点；红色箭头所4基质是氧化代谢的场所线粒体内腔充满了电子指为通过转位接触点转运的物质密度较低的可溶性蛋白质和脂肪等成分，称之为基质(matrix)。
线粒体中催化三狻酸循环、脂肪酸氧化、氨基酸分解、蛋白质合成等有关的酶都在基质中，参与物质的代谢。
此外还含有线粒体独特的双链环状DNA、核糖体，这些构成了线粒体相对独立的遗传信息复制、转录和翻译系统。
因此，线粒体是人体细胞除细胞核以外唯一含有DNA的细胞器，每个线粒体中可有一个或多个DNA拷贝，形成线粒体自身的基因组及其遗传体系。
5.基粒的化学本质是ATP合酶线粒体内膜（包括鳍）的内表面上突起的圆球形颗粒称为基粒，其化学本质是ATP合酶或ATP合酶复合体（详见本章第二节）。
二、线粒体的化学组成
线粒体干重的主要成分是蛋白质，约占65%-70%，多数分布于内膜和基质。
线粒体蛋白质分为两类：一类是可溶性蛋白，包括基质中的酶和膜外周蛋白；另一类是不溶性蛋白，为膜结构蛋白或膜镶140第二篇细胞的结构与功能嵌酶蛋白。
脂类占线粒体干重的25%-30%，大部分是磷脂。
此外，线粒体还含有DNA和完整的遗传系统多种辅酶（如CoQ、FMN、FAD和NAD筹）、维生素和各类无机离子。
线粒体含有众多酶系，目前已确认有120余种，是细胞中含酶最多的细胞器。
这些酶分别位于线粒体的不同部位，在线粒体行使细胞氧化功能时起重要作用。
有些酶可作为线粒体不同部位的标志酶，如内、外膜的标志酶分别是细胞色素氧化酶和单胺氧化酶等；基质和膜间腔的标志酶分别为苹果酸脱氢酶和腺昔酸激酶等。
三、线粒体的遗传体系
线粒体虽然有自己的遗传系统和自己的蛋白质翻译系统，且部分遗传密码也与核密码有不同的编码含义，但它与细胞核的遗传系统构成了一个整体。
（一）线粒体DNA构成了线粒体基因组线粒体DNA(mitochondrial DNA, mtDNA)通常是裸露的，不与组蛋白结合，存在于线粒体的基质oxidoreductase1, NDl)、ND2、ND3、ND4L、ND4、ND5细胞色素c氧化酶1(cy tochrome c oxidase I, COXI)、COXRR、COXIII、细胞色素b的亚基、ATP合酶的第6亚单位(A6)和第8亚单位(A8)及14个tRNA等（图中的大写字母表示其对应的氨基酸）；轻链编码了ND6及8个tRNA。
在这37个基因中，仅13个是编码蛋白质的基因，13个序列都以ATG（甲硫氨酸）为起始密码，并有终止密码结构，长度均超过可编码50个氨基酸多肤所必须的长度，由这13个基因所编码的蛋白质均已确定，其中3个为构成细胞色素C氧化酶(COX)复合体（复合体N)催化活性中心的亚单位(COX I、COXRR和COXIII)，这三个亚基与细菌细胞色素c氧化酶是相似的，其序列在进化过程中是高度保守的；还有2个为ATP合酶复合体（复合体V)凡部分的2个亚基(A6和A8);7个为NADH CoQ还原酶复合体（复合体I)的亚基(NDl、ND2、ND3、ND4L、ND4、ND5和ND6)；还有1个编码的结构蛋白质为CoQH2－细胞色素c还原酶复合体（复合体III)中细胞色素b的亚基（图6-4)；其他24个基因编码两种rRNA分子（用千构成线粒体的核糖体）和22种tRNA分子（用于线粒体mRNA的翻译）。
线粒体基因组与核基因组相比，经济或紧凑了许多，核基因组中的非编码序列高达90%，而在线粒体基因组中只有很少非编码的序列。
（二）重链和轻链各有一个启动子启动线粒体基因的转录线粒体基因组的转录是从两个主要的启动子处开始的，分别为重链启动子(heavy-s trandpromoter, HSP)和轻链启动子(light-strand promoter, LSP)。
线粒体转录因子1(mitochondrial第六童线粒体与细胞的能量转换141图6-4呼吸链蛋白质的组成显示每个复合体都由多条多肤链（大部分由核基因组编码，少部分由线粒体基因组编码）组成transcription factor1, mtTF A)参与了线粒体基因的转录调节。
mtTFA可与HSP和LSP上游的DNA特定序列相结合，并在mtRNA聚合酶的作用下启动转录过程。
线粒体基因的转录类似原核生物的转录，即产生一个多顺反子(polycistronic transcription)，其中包括多个mRNA和散布于其中的tRNA，剪切位置往往发生在tRNA处，从而使不同的mRNA和tRNA被分离和释放。
重链上的转录起始位点有两个，形成两个初级转录物。
初级转录物I开始于tRNAphe，终止千16S rRNA基因的末端，最终被剪切为tRNAph\tRNA`a\l2S rRNA和16S rRNA。
初级转录物11的起始位点比初级转录I的起始位点要稍微靠下一点，大约在12S rRNA基因的5'端，它的转录通过初级转录物I的终止位置持续转录至几乎整个重链，主要编码tRNA和mRNA。
通常情况下，剪切在新生的转录链上就开始了。
剪切的mRNA与tRNA位置是非常精确的，因为每个mRNA的5'端与tRNA的3'端是紧密相连的。
转录物I的转录比转录物11的转录要频繁得多，前者约是后者的10倍，这样rRNA和2个tRNA将比其他mRNA和tRNA要合成得多。
轻链转录物经剪切形成8个tRNA和1个mRNA，其余几乎不含有用信息的部分被很快降解。
与核合成mRNA不同，线粒体mRNA不含内含子，也很少有非翻译区。
每个mRNA5'端起始密码的三个碱基为AUG（或AUA), UAA的终止密码位于mRNA的3'端。
某些情况下，一个碱基U就是mtDNA体系中的终止密码子，而后面的两个A是多聚腺嗦呤尾巴的一部分，这两个A往往是在mRNA前体合成好之后才加上去的。
加工后的mRNA的3'端往往有约55个核昔酸多聚A的尾部，但是没有细胞核mRNA加工时的帽结构。
所有mtDNA编码的蛋白质也是在线粒体内并在线粒体的核糖体上进行翻译的。
线粒体编码的RNA和蛋白质并不运出线粒体外，相反，构成线粒体核糖体的蛋白质则是由细胞质运入线粒体内的。
用于蛋白质合成的所有tRNA都是由mtDNA编码的。
值得一提的是线粒体基因中两个重叠基因，一个是复合物I的ND4L和ND4，另一个是复合物V的ATP酶8和ATP酶6（图6-5)。
多肤链
PK W TKICSLHSLPPQS*CCAAAATGAACGAAAATCTGTTCGCTTCATTCATTGCCCCCACAATCCTAGGCCT线粒体mRNA翻译的起始氨基酸为甲酰甲硫氨酸，这点与原核生物类似。
另外线粒体的遗传密码也与核基因不完全相同（表6-1)，例如UGA在核编码系统中为终止密码，但在人类细胞的线粒体编码系统中，它编码色氨酸。
核密码子编码线粒体密码子编码氨基酸
密码子氨基酸哺乳动物果蝇链抱酶菌酵母植物UGA终止密码子色氨酸色氨酸色氨酸色氨酸终止密码子AGA、AGG精氨酸终止密码子丝氨酸精氨酸精氨酸精氨酸AUA异亮氨酸甲硫氨酸甲硫氨酸异亮氨酸甲硫氨酸异亮氨酸AUU异亮氨酸异亮氨酸甲硫氨酸甲硫氨酸甲硫氨酸异亮氨酸CUU、CUC亮氨酸亮氨酸亮氨酸亮氨酸苏氨酸亮氨酸CUA、CUG（三）线粒体DNA的两条链有各自的复制起始点环形的入类线粒体DNA的复制类似千原核细胞的DNA复制，但也有自己的特点。
典型的细菌（如E.
coli)环形基因组有一个复制起始点(origin)，并从某一位点进行双向复制，因此子链DNA的合成既需要DNA聚合酶（以母链为模板在RNA引物上合成子链DNA)，也需要RNA聚合酶（催化合成短的RNA引物），并以相反的方向同时进行。
人类mLDNA也是单一的复制起始，mtDNA的复制起始点被分成两半，一个是在重链上，称为重链复制起始点(o rigin of heavy-strand replication,011)，位于环的顶部，LRNA Pl比基因(557)和tRNA",＇＇基因(16023)之间的控制区／歹三）
(co ntrol regi on)，它控制重链子链DNA的自我复制；另一·个是在轻链上，称为轻链复制起始点(origin of light-strand0°L：勹replication,01)，位千环的“8“点钟位置，它控制轻链子链DNA的自我复制。
这种两个复制点的分开导致mtD NA的复制机制比较特别，需要一系列进入线粒体的核编码蛋白的协助（图6-6)。
与细菌DNA一样，mtDNA的复制也需要RNA引物作
为DNA合成的起始，线粒体的RNA聚合酶从位于011和
tRNAPI比基因之间的3个上游保守序列区段(conserved se-图6-6线粒体DNA的复制quence blocks, CSB I、II皿）之一附近开始合成一段分子显相对较大的RNA引物，后者与相应的轻链互补结合，并暂时替代(displacement)控制区的重链，所形成的环状结构称D环(di splaceme nt loop)；轻链的复制要晚于重链，等重链合成一定的长度后，轻链才开始合成。
一般情况下，重链的合成方向是顺时针的；轻链的合成方向是逆时针的。
两个合成方向相反的链不断地复制直到各自半环的终了，单股的母环形成一个连锁的对环(a catenated pair of rings)，后者在mtDNA拓朴异构酶的作用下去连锁，释放出新合成的子链，整个复制过程约持续2个小时，比一般的复制时间要长（线粒体：16568bp/2h；大肠杆菌400万bp/40min)。
mtDNA复制与核DNA复制并不同步，并不严格限制在细胞周期的S期内，复制活动贯穿于整个细胞周期。
就单独的mtDNA分子而言，在同一个复制周期时段内可能有的mtDNA复制了两次而另一些根本不进行复制。
四、线粒体核编码蛋白质的转运
线粒体中有大约有1000个基因产物，其中仅37个基因产物由线粒体基因组编码，因此线粒体内大多数蛋白都是核基因组编码的。
这些线粒体蛋白在胞质中合成，之后被运进线粒体。
核编码蛋白进入线粒体的过程中需要分子伴侣蛋白的协助。
绝大多数线粒体蛋白被输入到基质中，其余部分蛋第六章线粒体与细胞的能足转换143白输入到膜间腔以及插入到内膜和外膜上。
（一）核编码蛋白向线粒体基质中的转运
1核编码蛋白进入线粒体时需要信号序列输入到线粒体的蛋白都在其N－端具有一段信号序列，研究最多的是基质导入序列(matrix-t argeting sequence, MTS)这是一段由20~50个氨基酸残基组成的疏水序列，带正电荷，富含精氨酸、赖氨酸、丝氨酸和苏氨酸，少见天冬氨酸和谷氨酸。
线粒体外膜和内膜上的受体能识别并结合序列不同但具有相似结构的MTS。
这些序列包含了所有介导在细胞质中合成的前体蛋白输入到线粒体基质的信号。
2.前体蛋白在线粒体外保持非折叠状态当线粒体蛋白可溶性前体(soluble precursor of mitochond rial protein)在核糖体内形成以后，少数前体蛋白与一种称为新生多肤相关复合物(nascent-associated complex, NAC)的分子伴侣蛋白相互作用，NAC增加了蛋白转运的准确性；而绝大多数的前体蛋白都要和一种称为热激蛋白70(heat shock protein70, h sp70)的分子伴侣结合，从而防止前体蛋白形成不可解开的构象，也可以防止已松弛的前体蛋白聚集(aggregati on)。
此外，在哺乳动物的胞质中还存在着两种能够准确结合线粒体前体蛋白的因子：前体蛋白的结合因子(presequence-binding factor, PBF)和线粒体输入刺激因子(mitochondrial import stimulatory factor, MSF)，前者能够增加hsc70对线粒体蛋白的转运；后者不依赖于hsc70，常单独发挥着ATP酶的作用，为聚集蛋白的解聚提供能量。
通常定位到内膜的前体蛋白如内膜ATP/ADP反向转运体与MSF所形成的复合体能进一步与外膜上的一套受体Tom37和Tom70相结合，然后Tom37和Tom70把前体蛋白转移到第二套受体Tom20和Tom22，同时释放MSF；而绝大多数与hsc70结合的前体蛋白常不经过受体Tom37和Tom70，直接与受体Tom20和Tom22结合，与前体蛋白结合的受体Tom20和Tom22与外膜上的通道蛋白Tom40（第三套受体）相耦联，后者与内膜的接触点(Tim23/17受体系统）共同组成跨膜转运通道（图6-7)，非折叠的前体蛋白通过这一通道转移到线粒体基质。
胞质
膜间腔+A甲:,,
基质
图6-7线粒体内、外膜上的Tom和Tim受体系统显示了它们参与核基因组编码多肤链通过膜进入线粒体的过程3分子运动产生的动力协助多肤链穿过线粒体膜前体蛋白一旦和受体结合后，就要和外膜及内膜上膜的通道发生作用才可进入线粒体。
穿膜转运需要用到线粒体基质中的分子伴侣mlhsp70。
S. M.
Simon等提出的布朗棘轮模型(Brownian Rachet model)（图6-8)机制将mt h sp70描绘成类似于肌球蛋白和肌动蛋白相互牵拉作用的“转运发动机”，认为在蛋白质转运孔道内，多肤链做布朗运动摇摆不定，一旦前导肤链自发进入线粒体腔，立即有一分子mthsp70结合上去，防止前导肤链退回细胞质；同时mthsp70通过变构产生拖力，促使前导肤链进入，并迫使后面的肤链解链以进入转运轨道。
随着肤链进一步伸入线粒体腔，肤链会结合更多的mthsp70分子。
转运所需能噩依靠水解ATP提供。
144第二筒细胞的结构与功能
线粒体内膜
4.多肤链需要在线粒体基质内重新折叠才形成有活性的蛋白质蛋白质穿膜转运至线粒体基质后，必须恢复其天然构象以行使功能。
当蛋白穿过线粒体膜后，大多数蛋白的基质导入序列被基质作用蛋白酶(matrix processing protease, MPP)所移除。
入们还不知道确切的蛋白水解时间，但这种水解反应很可能是一种早期事件，因为此类MPP定位于线粒体内膜上。
在大多数情况下，输入多肤的最后折叠还需要另外一套基质分子伴侣如hsc60、hsclO的协助。
经过上述过程，线粒体蛋白质顺利进入线粒体基质，并成熟形成其天然构象。
（二）核编码蛋白向线粒体其他部位的转运核编码的线粒体蛋白除了向线粒体的基质转运外，还包括向线粒体的膜间腔、内膜和外膜的转运。
通常这些蛋白除了具有MTS外，还具有第2类信号序列，它们通过与进入线粒体基质类似的机制进入线粒体，而后通过二次定位到达最终目的地。
五、线粒体的起源
线粒体可能起源于与古老厌氧真核细胞共生的早期细菌。
在之后的长期进化过程中，二者共生联系更加密切，共生物的大部分遗传信息转移到细胞核上，这样留在线粒体上的遗传信息大大减少，即线粒体起源的内共生学说（图6-9)。
许多证据支持这一假说：线粒体的遗传系统与细菌相似；线粒体的蛋白质合成方式与细菌相似，如核糖体为70S，抑制蛋白质合成的机制等。
也有学者提出了非共生假说，认为原始的真核细胞是一种进化程度较高的需氧细菌，参与能量代谢的电子传递系统、氧化外侧分裂环内MD－环（未知）
动物、真菌和植物
磷酸化系统位千细胞膜上。
随着不断进化，细胞需要增加其呼吸功能，因此不断地增加其细胞膜的表面积，增加的膜不断地内陷、折叠、融合，并被其他膜结构包裹（形成的双层膜将部分基因组包围在其中），形成功能上特殊（有呼吸功能）的双层膜性痰泡，最后演变为线粒体。
六、线粒体的分裂与融合
线粒体是动态的细胞器。
如果在显微镜下观察活细胞中的线粒体，可见它们在持续不断地进行分裂与融合。
线粒体可以相互融合连接形成网络状结构，也可以分裂形成彼此分散存在的个体，这种动态变化被称为线粒体动力学(mi tochoncL.·i al dynamics)。
分裂与融合相互协调、平衡，不仅塑造了线粒体的形态，也影响到线粒体功能的维持，使细胞能有效应对时刻变化的生理环境。
由千线粒体具有双层膜结构，线粒体的融合与分裂需要外膜与内膜的共同参与，并且需要一系列蛋白分子进行精确介导和调控（表6-2)。
酵母哺乳动物定位作用
Dnml DRPl胞质和外膜外膜分裂
Fisl FISl外膜外膜Dnml/DRPI受体
Mdvl/Caf4胞质和外膜连接Fl sl和Dnml的衔接蛋白
MFF外膜可能的外膜DRPl受体
Fzol MFN l、MFN2外膜外膜融合
Ugo I外膜外膜融合，连接Fzol和Mgml
Mgml OPAi内膜和膜间腔内膜融合
（一）线粒体是通过分裂方式实现增殖的
目前普遍认为线粒体是以分裂的方式进行增殖的。
G. A t t狙小等(1975)认为，线粒体的生物发生过程分两个阶段。
在第一阶段，线粒体进行分裂增殖；第二阶段包括线粒体本身的分化过程，建成能够行使氧化磷酸化功能的结构。
线粒体的分裂增殖和分化阶段分别接受细胞核和线粒体两个独立的遗传系统控制。
但是，关于线粒体如何进行分裂增殖的，目前尚未完全明了。
一般认为它可能包括以下三种分裂方式：CD出芽分裂。
线粒体分裂时先从线粒体上长出膜性突起，称为“小芽"(b udd i ng)，随后小芽不断长大，并与原线粒体分离，再经过不断”发育”，最后形成新的线粒体；©收缩分裂。
这种分裂方式是线粒体在其中央处收缩形成很细的＂颈＂，最后断裂，形成两个线粒体；＠间壁分裂。
这种分裂方式是线粒体的内膜向中心内褶形成分隔线粒体结构的间壁，随后再一分为二，形成两个线粒体。
无论是哪一种分裂机制，线粒体的分裂都不是绝对均等的。
例如经过复制的mtDNA在分裂后的线粒体中的分布就是不均等的。
另一方面线粒体分裂还受到细胞分裂的影响。
介导线粒体分裂过程的主要蛋白有Dnml/DRPl、凡s1/FISI,MFF等。
在哺乳动物的线粒体分裂时，胞质中的DRP l会与线粒体外膜上的FIS1或其他受体蛋白结合，形成多聚体环状结构，逐渐缩窄，将线粒体一分为二（图6-10)。
（二）mtDNA随机地、不均等地被分配到新的线粒体中在同一线粒体中，可能存在有不同类型的mtDNA，即野生型和突变型mtDNA。
分裂时，野生型和突变型mtDNA发生分离，随机地分配到新的线粒体中；同时，同一细胞中，也可能存在着带有不同mtDNA的线粒体，如野生型和突变型线粒体。
分裂时，野生型和突变型mtDNA（或线粒体）发生分离，随机地分配到新的线粒体（或细胞）中；使子线粒体（或子细胞）拥有不同比例的突变型mtDNA分子，这种随机分配导致mtDNA异质性变化的过程称为复制分离。
在连续的分裂过程中，异质性细胞中突变型mtDNA和野生型mtDNA的比例会发生漂变，向同质性的方向发展。
分裂旺盛的细胞往往有排斥突变mtDNA的趋势，经无数次分裂后，细胞逐渐成为只有野生型mtDNA的同质性细胞。
突变mtDNA具有复制优势，在分裂不旺盛的细胞（如肌细胞）中逐渐积累，形成只有突变型mtDNA的同质性细胞。
漂变的结果是细胞表型也随之发生改变。
（三）线粒体融合也是由一系列相关蛋白介导的过程线粒体的融合有利于促进线粒体的相互协作，可以使不同线粒体之间的信息和物质得到相互交换，如膜电位快速传递以及线粒体内容物的交换。
伴随着细胞的衰老，mtDNA会累积很多的突变，线粒体的融合可以使不同线粒体的基因组交换进行充分的DNA互补，并有效地修复这些DNA突变，保证线粒体正常的功能。
在研究果蝇线粒体时发现的FZOl是第一个被分离出的介导线粒体融合的蛋白，主要介导线粒休外膜的融合，在酵母和哺乳动物中均发现了蛋白同源物。
而线粒体内膜的融合主要由Mgm l介导（图6-11)。
另外，线粒体膜电位也会影响线粒体的融合与分裂。
实验显示如果分裂后新形成的子代线粒体具有较高的膜电位，线粒体将能够进行下一次的融合、分裂循环；如果子代线粒体的膜电位下降，出现去极化，线粒体将发生自噬而被清除。
七、线粒体的功能
营养物质在线粒体内氧化并与磷酸化耦联生成ATP是线粒体的主要功能。
此外，线粒体还在摄取Ca2＋和释放Ca2＋中起着重要的作用，线粒体和内质网一起共同调节胞质中的C汒浓度，从而调节细胞的生理活动。
生命活动中重要过程—细胞死亡也与线粒体有关。
在某些情况下，线粒体是细胞死亡的启动环节；而在另一些情况下，线粒体则仅仅是细胞死亡的一条“通路”（详见第十六章）。
线粒体在能翟代谢和自由基代谢过程中产生大量超氧阴离子，并通过链式反应形成活性氧(reactive oxygen species, ROS)，当ROS水平较低时，可促进细胞增生；而ROS水平较高时，使得线粒体内膜彸乞，非特异性通透性孔道(mitochondri al permeab山ty tran sition pore, MPTP)开放，不仅导致跨膜电位崩溃，第六章线粒体与细胞的能豆转换也使细胞色素c外涌，再启动caspase的级联活化，最终由caspase-3启动凋亡（动画6-2"线粒体把化学键的能批转化成生物能扯ATP的过程”)。
第二节细胞呼吸与能量转换
较高等的动物都能依靠呼吸系统从外界吸取02并排出CO2。
从某种意义上说细胞中也存在有这样的呼吸作用，即在细胞内特定的细胞器（主要是线粒体）内，在02的参与下，分解各种大分子物质，产生CO2；与此同时，分解代谢所释放出的能僵储存于ATP中，这一过程称为细胞呼吸(cellular respi ration)，也称为生物氧化(b iolog ical ox idat ion)或细胞氧化(cellular oxidation)。
细胞呼吸是细胞内提供生物能源的主要途径，它的化学本质与燃烧反应相同，最终产物都是CO2和H20，释放的能批也完全相等。
但是，细胞呼吸具有以下特点：O细胞呼吸本质上是在线粒体中进行的一系列由酶系所催化的氧化还原反应；
＠所产生的能虽储存于ATP的高能磷酸键中；＠整个反应过程是分步进行的，能扯也是逐步释放的；＠反应
../2令｝是在恒温(37气）和恒压条件下进行的；＠反应过程中细胞质AD+
需要H20的参与。
细胞呼吸所产生的能垃并不像燃烧所产生的热能
那样散发出来，而是储存于细胞能噩转换分子ATP中。
丿ATP是一种高能磷酸化合物，细胞呼吸时，释放的能量可通过ADP的磷酸化而及时储存于ATP的高能磷酸键中作为备用；反之，当细胞进行各种活动需要能量时，又可去磷酸化，断裂一个高能磷酸键以释放能量来满足机体需要。
ATP的放能、储能反应简式如下：A-P~P~P去磷酸化A-P-P+P]＋能量28@随着细胞内不断进行的能盘释放和储存，ATP与ADP不停地进行着互变。
因为ATP是细胞内能量转换的中间携带者，所以被形象地称为“能扭货币"。
ATP是细胞生命活动的直接供能者，也是细胞内能量获得、图6-12葡萄糖氧化的三个步骤转换储存和利用等环节的联系纽带。
ATP中所携带的能量来源千糖、氨基酸和脂肪酸等的氧化，这些物质的氧化是能量转换的前提。
以葡萄糖氧化为例，从糖酵解到ATP的形成是一个极其复杂的过程，大体分为三个步骤：即糖酵解(glycolys i s)、三狻酸循环(tric扣boxyli c acid cycle, TCA cycle)和氧化磷酸化(oxidative phosphorylation)（图6-12)。
蛋白质和脂肪的彻底氧化只在第一步中与糖有所区别。
一、葡萄糖在细胞质中的糖酵解
糖酵解在细胞质中进行，其过程可概括为以下方程式：C6H,206+2NAD++2ADP+2Pi糖酵解酶系c2CH3CHOHCOOH+2NAD++2ATP完成无氧氧化2CH3CH20H+2C02+2NAD•+2ATP1分子葡萄糖经过十多步反应，生成2分子丙酮酸，同时脱下2对H交给受氢体NAD十携带，形成2分子NADH+H飞NA订能可逆地接受2个电子和1个H+，另l个订则留在溶质中。
在糖酵解过程中一共生成4分子ATP，但由于要消耗2分子ATP，所以净生成2分子的ATP。
若从糖原开始糖酵解，因不需消耗1分子ATP使葡萄糖磷酸化，则总反应净生成3分子ATP。
这种由高能底物水解放能，直接将高能磷酸键从底物转移到ADP上，使ADP磷酸化生成ATP的作用，称为底物水平磷酸化(substrate-level phosphorylation)。
糖酵解产物丙酮酸的代谢去路，因不同生活状态的生物而异。
专性厌氧生物在无氧情况下，丙酮酸可由NADH+H飞共氢而还原为乳酸或乙醇，从而完成无氧氧化过程。
专性需氧生物NADH NAD+在供氧充足时，丙酮酸与NADH+H飞名作为天冬氨酸草酰乙酸\u_j:,:-苹果酸有氧氧化原料进入线粒体中。
丙酮酸进入线—飞吓二粒体的机制尚不完全明了，可能以其自身的脂溶性通过线粒体内膜；NADH＋甘本身不能-线粒体内膜透过线粒体内膜，故NADH+H'进入线粒体的方式较为复杂，必须借助于线粒体内膜上J特异性穿梭系统进入线粒体内。
肝脏、肾脏和心肌线粒体转运NADH+W的主要方式如草酰乙酸二（回＼苹果酸氢酶作用，使草酰乙酸接受2个H而成为苹图6-13线粒体内膜的穿梭机制果酸；苹果酸经内膜上苹果酸心－酮戊二酸逆向运输载体的变构作用转入线粒体内；进入线粒体的苹果酸在苹果酸脱氢酶作用下，以NAD十为受氢体形成草酰乙酸和NADH+H气而草酰乙酸不能经内膜回到胞液，于是它与谷氨酸经谷－草转氨酶的作用而相互转变为天冬氨酸和a－酮戊二酸，这两者都能在逆向运输载体的帮助下透过内膜进入胞质中去；线粒体内消耗的谷氨酸则由胞液内的谷氨酸与外出的天冬氨酸通过谷氨酸－天冬氨酸逆向运输载体实现交换运输以取得补充。
另外，在脑和昆虫的飞翔肌中还存在一种a－磷酸甘油穿梭系统。
在线粒体基质中丙酮酸脱氢酶体系作用下，丙酮酸进一步分解为乙酰辅酶A,NA厅作为受氢体被还原：二、线粒体基质中的三狻酸循环在线粒体基质中，乙酰CoA与草酰乙酸结合成拧檬酸而进入拧檬酸循环，由于拧檬酸有3个狻基，故也叫三狻酸循环(TCA循环）（图6-14)。
循环中，拧檬酸经过一系列酶促的氧化脱氢和脱狻反应，其中的2个碳原子氧化形成CO2，从而削减了2个碳原子。
在循环的未端，又重新生成草酰乙酸，而草酰乙酸又可和另1分子乙酰CoA结合，生成拧檬酸，开始下一个循环，如此周而复始。
整个过程中，总共消耗了3分子H20，生成1分子的GTP（可转换为1分子的ATP)、4对H和2分子CO2。
脱下的4对H，其中3对以NAD+为受氢体，另l对以FAD为受氢体。
FAD能可逆地接受2个H，即2个质子和2个电子，转变成还原态FADH20ATP/ADP及NADH/NAD十比值高时均能降低三狻酸循环的速度。
三狻酸循环总的反应式为：2CH2COSCoA+6NAD++2FAD+2ADP+2Pi+6H20--+4C02+6NADH+6W+2FADH2+2HSCoA+2ATP三狻酸循环是各种有机物进行最后氧化的过程，也是各类有机物相互转化的枢纽。
除了丙酮酸三°;i团[:H:0囡t：。
田NAHD言0;外，脂肪酸和一些氨基酸也从细胞质进入线粒体，并进一步转化成乙酰CoA或三狻酸循环的其他中间体。
三狻酸循环的中间产物可用来合成包括氨基酸、叶啾及晓唗核昔酸在内的许多物质。
只有经过三狻酸循环，有机物才能进行完全氧化，提供远比糖无氧酵解所能提供的多得多的能量，供生命活动的需要。
三、氧化磷酸化耦联与ATP形成
氧化磷酸化是释放代谢能的主要环节，在这个过程中，NADH和FADH2分子把它们从食物氧化得来的电子转移到氧分子。
这一反应相当千氢原子在空气中燃烧最终形成水的过程，释放出的能量绝大部分用于生成ATP，少部分以热的形式释放。
(—)呼吸链和ATP合酶复合体是氧化磷酸化的结构基础1呼吸链是一系列能够可逆地接受和释放甘和e一的酶体系1分子的葡萄糖经无氧氧化、丙酮酸脱氢和三狻酸循环，共产生了6分子的CO2和12对H，这些H必须进一步氧化成为水，整个有氧氧化过程才告结束。
但H并不能与02直接结合，一般认为H须首先离解为甘和e_，电子经过线粒体内膜上酶体系的逐级传递，最终使1/202成为0气后者再与基质中的2个W化合生成H20。
这一传递电子的酶体系是由一系列能够可逆地接受和释放甘和e一的化学物质所组成，它们在内膜上有序地排列成相互关联的链状，称为呼吸链(respiratory chain)或电子传递呼吸链(electron transport respiratory c hain)。
只传递电子的酶和辅酶称为电子传递体，它们可分为醋类、细胞色素和铁硫蛋白三类化合物；既传递电子又传递质子的酶和辅酶称为递氢体。
除了泛酰（辅酶Q,CoQ)和细胞色素C(Cyt C)之外，呼吸链其他成员分别组成了I、Il、III、W四个脂类蛋白质复合体，它们是线粒体内膜的整合蛋白（表63)。
CoQ是脂溶性的蛋白质，可在脂双层中从膜的一侧向另一侧移动；细胞色素c是膜周边蛋白，可在膜表面移动。
2. ATP合酶复合体催化ATP的合成线粒体内膜（包括峭）的内表面附有许多圆球形基粒。
基粒由头部、柄部和基片3部分组成：头部呈球形，直径约8~9nm；柄部直径约4nm，长4.5~5nm；头部与柄部相连凸出在内膜表面，柄部则与嵌入内膜的基片相连。
进一步研究表明，基粒是将呼吸链电子传递过程中所释放的能量（质子浓度梯度和电位差）用千使ADP磷酸化生成ATP的关键装置，是由多种多肤构成的复合体，其化学本质是ATP合酶或ATP合酶复合体，也称F。
F, ATP合酶（图6-15)。
150第二篇细胞的结构与功能
(1)头部具有酶活性：又称耦联因子F!，是由五种亚基组成的Ct3[33"/姊多亚基复合体，分子狱360000。
纯化的F1可催化ATP水解，但其在自然状态下（通过柄部与基片相连）的功能是催化ATP合成。
a、B、8三种亚基较大，a、B可能是表现活性的主要部分；8则与基片膜蛋白相结合，作为耦联因子凡与E相耦联的门户；丫、8亚基较小，也与凡相连。
E因子可被E抑制蛋白(F, inh心Lory protein)结合从而抑制ATP的合成。
(2)柄部连接头部与基片：这是一种对霖霉素敏感的蛋白质(OSCP)，相对分子量18000。
OSCP能与霖霉素特异结合并使森霉素的解耦联作用得以发挥，从而抑制ATP合成。
C环旋转(3)基片是质子（H勹流向E的穿膜通道：又称耦联因子F。
，是由至少4种多肤组成的疏水蛋白，相对分图6-15ATP合酶复合体分子结构示意图子罹70000。
其亚基类型与组成在不同物种中差别很显示其由头部、丙部和基片3部分组成大。
凡镶嵌千内膜的脂双层中，不仅起连接F1与内膜的作用，而且还是质子(H+)流向E的穿膜通道。
（二）氧化过程伴随着磷酸化的耦联经糖酵解和三狻酸循环产生的NADH和FAD凡是两种还原性的电子载体，它们所携带的电子经线粒体内膜上的呼吸链逐级定向传递给02，本身则被氧化（图6-16)。
由于电子传递所产生的质子(W)浓度梯度和电位差，其中所蕴藏的能拭被F。
F,ATP合酶用来催化ADP磷酸化而合成ATP，这就是氧化磷酸化耦联或氧化磷酸化作用。
在正常情况下，氧化水平总是和磷酸化水平密切耦联的。
根据对相邻电子载体的氧化还原电位和质子数的测定表明，呼吸链中有3个主要的质子由基质转运到膜间腔的部位，即NADH-FMN，细胞色素b-细胞色素c之间，细胞色素a-02之间。
由这些质子在线粒体膜间腔和线粒体基质之间形成的浓度梯度和电位差，足以使2.5分子ADP磷酸化生成2.5分子的ATP。
载氢体NADH和FADH2进入呼吸链的部位不同，所形成的ATP也有差异。
1分子NADH+W经过电子传递，释放的能量可以形成2.5分子ATP；而1分子FADH2所释放的能量则能够形成1.5分子ATP。
综上所述，葡萄糖完全氧化所释放的能扯主要通过两条途径形成ATP：心底物水平磷酸化生成4分子ATP，其中在糖酵解和三狻酸循环中分别生成2分子ATP;＠氧化磷酸化生成28个ATP分子。
在葡萄糖的氧化过程中，一共产生12对H，其中的10对以NAD十为载氢体，经氧化磷酸化作用可生成25个ATP分子，2对以FAD为载氢体进入电子传递链，经氧化磷酸化作用可生成3个ATP分子，共产生28个ATP分子。
因此，1分子葡萄糖完全氧化共可生成32分子ATP，其中仅有2分子ATP是在线粒体外通过糖酵解形成的。
葡萄糖有氧氧化的产能效率大大高出无氧酵解的能量利用效率。
电子传递链
4日L..－内膜
尸一§一
外膜一
氧化磷酸化
（三）电子传递时叮穿膜形成电化学梯度
关于电子传递同磷酸化的耦联机制至今尚未彻底阐明，曾先后有过许多假说，目前被广泛接受的是英国化学家P.
Mitchell(1961)提出的化学渗透假说(chemjosmotic couplin g hypothes i s)。
该假说认为氧化磷酸化耦联的基本原理是电子传递中的自由能差造成甘穿膜传递，暂时转变为横跨线粒体内膜的电化学质子梯度(electrochemical proton gradient)。
然后，质子顺梯度回流并释放出能量，驱动结合在内膜上的ATP合酶，催化ADP磷酸化合成ATP。
这一过程可综合如下：CD NADH或FAD比提供一对电子，经电子传递链，最后为02所接受；＠电子传递链同时起H十泵的作用，在传递电子的过程中伴随着H十从线粒体基质到膜间腔的转移；＠线粒体内膜对甘和OH一具有不可透性，所以随着电子传递过程的进行，甘在膜间腔中积累，造成了内膜两侧的质子浓度差，从而保持了一定的势能差；＠膜间腔中的甘有顺浓度返回基质的倾向，能借助势能通过ATP酶复合体凡上的质子通道渗透到线粒体基质中，所释放的自由能驱动F。
F l ATP合酶合成ATP。
化学渗透假说有两个特点，一是需要定向的化学反应；二是突出了膜的结构。
该学说可以解释氧化磷酸化过程中的许多特性，也得到了很多实验结果的支持。
但是也仍存在一些难以用化学渗透假说解释的实验结果，因此还必须不断地修改和完善。
相继有人提出了一些新的理论，包括变构假说、碰撞假说等，但都存在一定的问题。
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………
－－－－－－－－经典实验：化学渗透假说的提出----------------------------到了20世纪50年代，所有的研究都已经证明氧化磷酸化的过程涉及电子经过一系列的::传递，最后达到分子氧的过程。
但是从这些电子传递反应中荻得了电子的氧是如何转换为能量分子ATP的仍然是个谜。
在糖酵解过程中，ADP可以吸收某些中间化合物的高能磷酸键转换成ATP，因此推则在电子传递过程中可能会产生一个中间产物进而驱动ATP的生成。
因此,在20世纪50年代～60年代期间，寻找这种带有高能磷酸键的中间产物成了这一领域的中心:课题，但遗憾的是并没有发现这类物质的存在；相反，另一些证据显示磷酸化过程与＂膜“有密切的关系，并且这一过程可以被一些破坏膜结构的化学物质所阻断。
鉴于此，P.
Mitchell提出:了＂跨膜电化学梯度驱动ATP形成的能量耦联机制”。
152第二篇细胞的结构与功能
实验内容
化学参透假说的基本观点是：＂跨膜的质子电化学梯度”将电子传递与ATP形成耦联起来。
M i tchell提出电子的转运产生了质子电化学梯度，而质子按势能的跨膜回流驱动了ATP的合成。
这一假说解释了为什么未能找到所谓的高能”中间”化合物，以及膜的完整性对ATP合成的必要性，但这与当时化学界昔遍观点并不相符。
在1961年发表的论文中，Mi tc he ll用哲学观点阐述他的这一革命性假说：生物化学家们普遍接受的观点是代谢是膜转运的原因；而他提出的假说则认为代谢和膜转运互为因果，不仅代谢可以导致膜转运的发生，而且转运也可以启动膜代谢。
发表论文
Mitchell P.
Coupling of phosphorylation to electron and hydrogen transfer by chemiosmolic type of mechan ism.
Nature,1961,191:144-148.
后续影响Mi tchell的假说被争论了数年，但随后越未越多的研究逐步证实了这一假说，并被生物学界所接受，假说也变成了理论。
现在，这一理论不仅解释了ATP的合成，而且也解释了通过分解ATP而驱动物质的跨膜转运这一生物学机制。
Mitchell因此于1978年荻得了诺贝尔奖。
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在此模型中，ADP和Pi合成ATP的反应不粒体外，可是线粒体内膜具有高度不透性，因此这些物质进出线粒体俙要依靠专门的结构。
线粒体内膜上有一些专一性转运蛋白同这些物质进出线粒体有关，例如其中的一种为腺昔酸转移酶能利用内膜内外W梯度差把ADP和P i运进线粒体基质，而把ATP输往线粒体外。
第三节线粒体与疾病线粒体通过合成ATP而为细胞提供能址，调节细胞质的氧化－还原(redox)状态，也是细胞内氧自第六章线粒体与细胞的能蛊转换153由基产生的主要来源，后者则与细胞的许多生命活动有关。
因此维持线粒体结构与功能的正常，对于细胞的生命活动至关重要。
而在特定条件下线粒体与疾病的发生有着密切的关系，一方面是疾病状态下线粒体作为细胞病变的一部分，是疾病在细胞水平上的一种表现形式；另一方面线粒体作为疾病发生的主要动因，是疾病发生的关键，主要表现为mtDNA突变导致细胞结构和功能异常。
—、疾病过程中的线粒体变化
线粒体对外界环境因素的变化很敏感，一些环境因素的影响可直接造成线粒体功能的异常。
例如在有害物质渗入（中毒）、病毒入侵（感染）等情况下，线粒体亦可发生肿胀甚至破裂，肿胀后的体100积有的比正常体积大3~4倍。
如人体原发性肝癌细胞癌变过程中，线粒体崝的数目逐渐下降而最终q成为液泡状线粒体；细胞缺血性损伤时的线粒体也会出现结构变异如凝集、肿胀等；坏血病患者的病变组织中有时也可见2~3个线粒体融合成1个大的线粒体的现象，称为线粒体球；一些细胞病变时，。
一一一
一一
可看到线粒体中累积大噩的脂肪或蛋白质，有时可线粒体病患者见线粒体基质颗粒大量增加，这些物质的充塞往往年龄影响线粒体功能甚至导致细胞死亡；如线粒体在微
波照射下会发生亚微结构的变化，从而导致功能上的改变；钡化物、co等物质可阻断呼吸链上的电子
I传递，造成生物氧化中断、细胞死亡；随着年龄的增长，线粒体的氧化磷酸化能力下降（图6-18)等等。
VNQl线粒体病患者早衰患者正常。
在这些情况下，线粒体常作为细胞病变或损伤时最敏感的指标之一，成为分子细胞病理学检查的重要依据。
图6-18线粒体病患者的mtDNA状态与氧化磷功能的完善还依赖千细胞核和细胞质的协调。
当酸化能力突变线粒体DNA进行异常复制时，机体的免疫系统并不能对此予以识别和阻止，于是细胞为了将突变的线粒体迅速分散到子细胞中去，即以加快分裂的方式对抗这种状态，以减轻对细胞的损害，但持续的损害将最终导致疾病的发生。
这类以线粒体结构和功能缺陷为主要疾病原因的疾病常称为线粒体疾病(mitochondrial disorders)。
线粒体疾病主要影响神经、肌肉系统，所以有时也统称为线粒体脑肌病(mitochondrial encephalomyopath y)，但不同的疾病，或同一疾病不同的个体都有不同的临床表现。
由于受精卵中绝大多数的线粒体都来自于卵子细胞，由线粒体DNA突变引起的线粒体遗传性疾病在遗传方式上表现出明显的母系遗传特征。
目前，mtDNA全序列已经被弄清楚，利用现代生物学技术可以使线粒体疾病得到明确诊断。
三、线粒体融合和分裂异常相关的疾病
线粒体融合和分裂异常或者编码参与线粒体融合和分裂蛋白的基因发生突变，就可能导致疾病的发生。
如参与线粒体分裂的Drpl基因发生突变时，导致婴儿出生后大脑发育障碍，视神经萎缩同时并伴有其他一些严重的并发症。
当线粒体分裂被扰乱时，会导致一些常见的线粒体功能失常，如线粒体膜电位缺失，ROS增高以及线粒体DNA丢失等。
而介导细胞融合的蛋白Opal和Mfn2的突变会引起Kjer病（常染色体显性视神经萎缩症）和2A型胖骨肌萎缩症。
因此，细胞内线粒体不断进行的融合和分裂并保持动态平衡对维持细胞的正常生命活动具有重要的意义。
四、线粒体疾病的治疗
线粒体疾病的治疗尚待突破。
目前线粒体疾病治疗的基本措施包括：补充疗法、选择疗法和基因疗法。
所谓补充疗法是给患者添加呼吸链所需的辅酶，目前运用较广泛的是辅酶Q，其在线粒体脑肌病(Kearns-Sayre syndrome)、心肌病及其他呼吸链复合物缺陷的线粒体病的治疗中都有一定作用，同时在对缓解与衰老有关的氧化／抗氧化平衡异常也发挥了功效。
另外，辅酶Q、L－肉胆碱、抗坏血酸（维生素C)、2－甲基萦酰（维生素K3)和二氯乙酰酸也能暂时缓解部分线粒体病的症状。
所谓选择疗法是选用一些能促进细胞排斥突变线粒体的药物对患者进行治疗以增加异质体细胞中正常线粒体的比例，从而将细胞的氧化磷酸化水平升高至阙值以上。
一种可能的药物是氯霉素，作为ATP合成酶的抑制剂，连续低剂量使用此药能促进对缺陷线粒体的排斥。
所谓线粒体基因治疗是将正常的线粒体基因转入患者体内以替代缺陷mtDNA发挥作用。
现在认为有3种线粒体基因治疗方法可行，即胞质mtDNA表达法、线粒体转染法和异质性细胞正选择法。
小结
----------------－一一·细胞能量的摄取、转换、储存与利用是细胞新陈代谢的中心问题，正常的细胞能量代谢使细胞内部形成一个协调的系统。
线粒体是细胞内参与能量代谢的主要结构，它由双层单位膜构成，内膜上分布着具有电子传递功能的蛋白质系统和使ADP+Pi生成ATP的ATP合酶复合体；线粒体还具有自己相对独立的遗传体系，但又依赖于核遗传体系，所以具有半自主性。
线粒体基质进行着复杂的物质代谢，主要特点是脱氢和脱狻。
脱下的氢由受氢体携带至线拉体内膜的电子传递链上传递，最后将电子交给氧，而质子则转移至膜间腔，质子在内膜两侧所形成的电梯度和浓度梯度足以使ATP合酶复合体通过特定的机制合成细胞的能量分子ATP。
ATP分子作为能量”货币＂，实现供能与耗能间的能量流通，完成包括生物合成、肌肉收缩、神经传导、体温维持、细胞分裂、生物发光、细胞膜主动运输等在内的一系列细胞内部活动和整体的功能，以维持细胞整体的生存。
在病理状态下，细胞能量代谢会发生崩溃，从而导致细胞内部的结构、功能改变，甚至引发临床疾病的发生。
因此，探讨细胞的能量代谢已经成为生物学、医学的热点之一。
（左彶）
第七章细胞骨架与细胞的运动
卧烘窥口
细胞骨架(cyloskeleton)是指真核细胞质中的蛋白质纤维网架体系，它对于细胞的形状、细胞的运动、细胞内物质的运输、细胞分裂时染色体的分离和胞质分裂等均起着重要的作用。
20世纪50年代，在超簿切片的电子显微镜观察中首次看到了微管。
但是由于以往电镜制样一般采用锁酸或高猛酸钾低溫固定细胞，导致骨架系统的大部分结构遭到了破坏，直到1963年采用戊二醒并在室温下固定的方法后，才广泛地观察到各类骨架纤维的存在，真正把它们当作一类细胞器并正式命名为细胞骨架。
细菌体内不存在细胞骨架，因此细胞骨架的发生可能是真核细胞进化的决定性因素。
细胞骨架的多功能性依赖千三类蛋白质纤维（图7-1)，它们分别是微管、微丝及中间纤维。
每一种纤维由各自的蛋白质亚单位形成，三类骨架成分既分散地存在于细胞中，又相互联系形成一个完整的骨架体系。
该体系是一个高度动态结构，可随着生理条件的改变不断进行组装和去组装，并受各种结合蛋白的调节以及细胞内外各种因素的调控。
早期的细胞骨架研究主要是形态观察及细胞内的分布和定位，近年来对细胞骨架的研究巳从形态观察为主迅速推进到分子水平，骨架蛋白及骨架结合蛋白的结构及功能分析、骨架纤维的动态装配、基因表达调节等成为细胞骨架研究的重要内容。
早期发现的细胞骨架主要是指存在于细胞质内的微管、微丝和中间纤维，称为细胞质骨架。
后来又发现细胞核内也存在着细胞骨架，主要包括核基质、核纤层和染色体骨架等，称为细胞的核骨架，与细胞质骨架共同称为广义的细胞骨架。
本章将重点介绍细胞质骨架的结构与功能。
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微管I I微丝中间纤维
图7-1细胞骨架的三种类型上图：细胞骨架在细胞内分布示意图；中图：电镜下的细胞骨架结构；下图：根据电镜观察结果绘制的细胞骨架结构模式图微管(microtubul e)是真核细胞中普遍存在的细胞骨架成分之一，它是由微管蛋白和微管结合蛋白组成的中空圆柱状结构，在不同类型细胞中有相似结构。
微管主要存在于细胞质中，控制着膜性细胞器的定位及胞内物质运输。
微管还能与其他蛋白质共同装配成纤毛、鞭毛、基体、中心体、纺锤体等结构参与细胞形态的维待、细胞运动和细胞分裂等。
本节着重介绍微管的结构，并讨论它们的聚合与解聚的调控机制及微管的功能。
—、微管蛋白与微管的结构
微管存在于所有的真核细胞中，以脊椎动物的脑组织最多。
微管是直径为24-26nm的中空小管（图7-2)，内径约为15nm，壁厚约5nm。
微管以微管蛋白a、B异二聚体为基本构件。
A微管中微管蛋白二聚体头尾相接形成原纤25nm维，再经过原纤维的两端和侧面增加二聚J_体扩展成为片层，当片层达到13根原纤维夕时即合拢成一段微管，然后新的异二聚体再不断增加到微管的两端使之不断延长。
微管具有极性，其两端的增长速度不同，增B.-1、
长速度快的一端为正端，另一端则为负端。
微管极性的分布走向与细胞器定位分布、
15nm r'`25nm物质运输方向等微管功能密切相关。
微管由微管蛋白（也称管蛋白，tubulin)
分子组成。
微管蛋白的主要成分为a管蛋图7-2微管的结构白(ex.-tubulin)和B管蛋白(!3-tubulin)，约占A.微管结构模式图；B.微管横切面电镜图像（右）和其模型图微管总蛋白含量的80%-95%，近年来人们又发现了微管蛋白家族的第三个成员一1微管蛋白，该成员定位于微管组织中心(microtubule organizing center, MTOC)，对微管的形成、微管的数量和位置、微管极性的确定及细胞分裂起重要作用。
微管在细胞中有三种不同的存在形式：单管、二联管和三联管（图7-3)。
单管由13根原纤维组成，是细胞质中主要的存在形式，分散或成束分布，但不稳定，易受低温、钙离子等因素的影响而发生解聚。
二联管由A、B两根单管组成，A管有13根原纤维，B管有10根原纤维，与A管共用3根原纤维，主要分布于纤毛和鞭毛内。
三联管由A、B、C三根单管组成，A管有13根原纤维，B管和C管均由10根原纤维组成，分别与A管和B管共用3根原纤维，主要分布于中心粒及鞭毛和纤毛的基体中。
二联管和三联管是比较稳定的微管结构。
单管二联管三联管
二、微管结合蛋白
在细胞内，微管除了含有微管蛋白外，还含有一些同微管相结合的辅助蛋白，这些蛋白质总是与微管共存，参与微管的装配，称为微管结合蛋白(microtubule assoc iat ed protein, MAP)，它们不是构成微管壁的基本构件，而是在微管蛋白装配成微管之后，结合在微管表面的辅助蛋白。
一般认为，微管结合蛋白由两个区域组成：一个是碱性的微管结合区域，该结构域可与微管结合，可明显加速微管的成第七童细胞骨架与细胞的运动157核作用；另一个是酸性的突出区域，以横桥的方式与其他骨架纤维相连接，突出区域的长度决定微管在成束时的间距大小。
微管结合蛋臼主要包括MAP-1, MAP-2, tau和MAP-4，前三种微管结合蛋白主要存在于神经元中。
MAP-4在神经元和非神经元细胞中均存在，在进化上具有保守性。
不同的微管结合蛋白在细胞中有不同的分布区域，执行特殊功能。
这在神经细胞中表现尤为突出，用特异性微管结合蛋白荧光抗体可显示神经细胞中微管结合蛋白的分布差异：tau只存在于轴突中，而MAP-2则分布千胞体和树突中。
神经细胞微管结合蛋白的分布差异与神经细胞树突和轴突区域化以及感受、传递信息有关。
三、微管的装配与动力学
除了特化细胞的微管外，大多数微管都是不稳定的，能够很快地组装或去组装。
自发现微管以来，对微管蛋白如何组装成微管提出了一系列理论模型，以描述微管蛋白组装成微管的动力学性质。
但目前普遍认为，微管的装配主要表现为动态不稳定性(dynamic in s tability)，即增长的微管末端有微管蛋白－GTP帽(tubulin-GTP cap)，在微管组装期间或组装后GTP被水解成GDP，从而使GDP-微管蛋白成为微管的主要成分。
微管蛋白－GTP帽及短小的微管原纤维从微管末端脱落则使微管解聚（动画7-1“微管的聚合与解聚”)。
微管的装配过程可分为三个时期：成核期、聚合期和稳定期。
成核期(nucleation phase)又称为延迟期(la g phase)，在该期a和B微管蛋白聚合成短的寡聚体(oligmer)结构，即核心形成，接着二聚体在其两端和侧面增加使之扩展成片状带，当片状带加宽至13根原纤维时，即合拢成一段微管。
由于该期是微管聚合的开始，速度较慢，为微管聚合的限速过程，因此称为延迟期。
聚合期(polymeri za ti on phase)又称延长期(elongation phase)，该期中细胞内高浓度的游离微管蛋白聚合速度大千解聚速度，新的二聚体不断加到微管正端，使微管延长，直至游离的微管蛋白下降，解聚速度逐渐增加。
在稳定期(stead y state phase)又称为平衡期(equilibrium phase)，胞质中游离的微管蛋白达到临界浓度，微管的组装（聚合）与去组装（解聚）速度相等。
(—)微管装配的起始点是微管组织中心立三三三三三言三言产三言薹管动力学中具有重要作用。
"I-微管蛋白环形复合体('Y-tubulin ring complex,'Y-TuRC)可形成一含有158第二篇细胞的结构与功能（二）微管的体外装配在适当的条件下，微管能进行自我装配，其装配受到微管蛋白的浓度、pH和温度的影响。
微管动态不稳定性行为的发生需要水解GTP提供能量，因此，GTP是调节微管体外组装的主要物质。
在影响微管聚合的主要条件中，尤以微管蛋白的浓度及GTP的存在最为重要。
在体外，只要微管蛋白异二聚体达到一定的临界浓度（约为lmg/ml)，在有Mg2+存在（无Ca2＋汃适当的pH(pH6.9)和温度(37°C)的缓冲液中，异二聚体即聚合成微管。
同时需要由GTP提供能量，＂B－微管蛋白异二聚体同GTP结合后而被激活，引起微管蛋白分子的构象呈直线型，从而使异二聚体聚合成微管，而GTP则分解为GDP和磷酸。
当微管蛋白的聚合迅速进行时，微管蛋白分子添加到微管上的速度大于它们所携带的GTP水解速度，因此新生成的微管上全是GTP－微管蛋白亚基。
正因为GTP－微管蛋白亚基之间结合得比较牢固，结果在微管末端形成一个称为GTP帽的结构，它可防止微管的解聚。
当微管生长较慢时，GTP帽中的亚基会在新的携带有GTP的亚基结合上来以前，就水解它自己的GTP成GDP，这样就失去GTP帽，携有GDP的亚基由千对微管聚合体的结合不紧密而很快从游离端上释放出来，这样微管就不停的缩短。
因此，当微管两端的微管蛋白具有GTP帽（与GTP结合）时，微管继续聚合；而具有GDP帽（与GDP结合）时，将改变异二聚体的构象使原纤维弯曲而不能形成微管的管壁，微管则趋向于解聚（图7-5)。
细胞内微管的这两种状态（聚合和解聚）是不断发生的，因为细胞内不断有微管解聚，又不断有新微管的聚合。
，之结合GTP的
<－、/微管蛋白分子
』上一一4-----、;＿
结合GTP的微管蛋白分子添加到微管末端
..、结合GDP的、微管蛋白分子
GTP帽增长的微管缩短的微管
原纤维中异二聚体亚单位重复排列具有极性，使细胞内所有由微管构成的结构也具有极性。
在一定条件下，微管两个端点的装配速度不同，表现出明显的极性。
微管的一端发生GTP和微管蛋白的添加，使微管不断延长，称为正端；而在另一端具有GDP的微管蛋白发生解聚而使微管缩短，则为负端微管的这种装配方式又称为踏车运动(treadmilling)。
（三）微管的体内装配
在细胞内微管形成时，"{-Tu RC存在于微管组织中心，'Y-TuRC就像一颗种子，成为更多异二聚体结合上去的核心，微管从此生长、延长。
a/B微管蛋白异二聚体结合到'Y-TuRC上，通过微管蛋白彼此间相互作用而稳定，形成一短的微管。
由于"{-TuRC像帽子一样戴在微管的负端而使微管负端稳定3"{-TuRC组织微管形成的能力可能受细胞周期调节的影响而开闭。
最明显的模式是：在间期组织微管形成的能力被关闭，而在化期到M期的转换时期，一种涉及细胞周期调节的激酶可能使Y－微管蛋白或"{-TuRC中的某些蛋白质磷酸化，从而开放'Y-TuRC组织形成微管的能力。
（四）很多因素影响微管组装和解聚造成微管不稳定性的因素很多，包括GTP浓度、压力、温度、pH、离子浓度、微管蛋白临界浓度、药物等。
有些微管特异性药物在微管结构与功能研究中起重要作用，这些药物主要有：紫杉醇(taxol)、第七章细胞骨架与细胞的运动159秋水仙素(cochicine)和长春新碱(vinblastine)等。
紫杉醇能和微管紧密结合防止微管蛋白亚基的解聚，加速微管蛋白的聚合。
与紫杉醇作用相反，秋水仙素能结合和稳定游离的微管蛋白，使它无法聚合成微管，引起微管的解聚。
长春新碱能结合微管蛋白异二聚体，抑制它们的聚合作用。
四、微管的功能
(—)微管构成细胞内的网状支架，支持和维持细胞的形态维持细胞形态是微管的基本功能。
微管本身不能收缩，但具有一定的强度，能够抗压和抗弯曲，这种特性给细胞提供了机械支持力。
例如在血小板中有一束微管环形排列于血小板周围，维持血小板的圆盘形结构。
当血小板暴露于低温中，环形微管即消失，血小板变成不规则的球形，但将血小板再加热时，环形微管重新出现，血小板又恢复它的圆盘形结构。
秋水仙素、长春新碱等抗分裂剂能与微管蛋白异二聚体中的一个单体特异结合，从而阻止其聚合，使微管解聚，因此这些药物也可使血小板失去其圆盘形结构。
这些现象都表明，环形微管是血小板骨架的主要组成部分，它们在血小板中的排列对维持血小板的形状有重要作用。
另外，微管对千细胞突起部分，如纤毛、鞭毛、轴突的形成和维持也具有重要作用。
（二）微管参与中心粒、纤毛和鞭毛的形成
在光学显微镜下，中心体位于细胞核附近，由中心粒和中心粒周围物质共同组成。
在电镜下，中心粒是由9组三联体微管围成的一个圆筒状结构，在各种细胞中基本相同。
中心体是动物细胞中主要的微管组织中心。
在细胞分裂间期，中心体形成胞质微管，构成细胞骨架的主要纤维系统，一方面作为细胞内物质运输的轨道基础，另一方面对细胞形状的维持和改变也起到必不可少的作用；在M期，经过复制的中心体形成纺锤体的两极，指导有丝分裂事件的进行，与纺锤丝的排列和染色体的移动有密切关系。
纤毛(cilia)和鞭毛(flagella)具有运动功能，用来划动其表面的液体，是细胞表面的特化结构。
纤毛和鞭毛在来源和结构上基本相同。
所不同的是，就一个细胞而论，纤毛短而多，而鞭毛则长而少。
纤毛和鞭毛都是以微管为主要成分构成的，并且有特殊的结构形式，大多数属于9+2类型。
纤毛和鞭毛的横断面电镜观察可见中央有两条微管，称为中央微管。
中央微管的外周包围一层蛋白性质的鞘，称为中央鞘(central sheath）。
外周则以9组二联管围绕。
二联管两两之间以微管连接蛋白相连。
外周二联管和中央鞘之间也有连接，称为放射辐条(radial spoke)。
放射辐条由A管伸出，近中央鞘一端膨大，称为辐头。
A管上还伸出动力蛋白臂(dynein arm)，其头部具有ATP酶活性，可为纤毛与鞭毛的运动提供动力。
鞭毛与纤毛的基体(basal body)由三联管组成，与中心粒相似。
基体的中央无微管（图7-6)（动画7-3"纤毛、鞭毛及中性粒的结构”)。
连丝蛋白
中央微管
I I100nm l A管B管l
B外周二联管
图7-6纤毛与鞭毛的结构A纤毛横切而电镜照片；B纤毛结构示意图160第二筒细胞的结构与功能（三）微管参与细胞内物质运输微管在核的周围分布密集，并向胞质外周伸展。
在线粒体周围也有微管的存在，有的微管直接连到高尔基复合体小泡上；核糖体可系在微管和微丝的交叉点上。
所以，细胞内的细胞器移动和胞质中的物质转运都和微管有着密切的关系。
例如，神经细胞合成的蛋白质等物质沿神经轴索快速运送至远端的神经末梢，细胞的分泌颗粒和色素细胞的色素颗粒沿微管运输，线粒体的快速运动也是沿微管进行的。
微管参与细胞内物质运输的任务主要由微管马达蛋白(motor prote i n)来完成，马达蛋白是指介导细胞内物质沿细胞骨架运输的蛋白（图7-7)（动画7-4“马达蛋白与细胞内物质运输＂）。
目前发现有几十种马达蛋白，可以归属于三大家族：动力蛋白(dynein)家族、驱动蛋白(k inesin)和肌球蛋白(myos i n)家族。
其中驱动蛋白和动力蛋白是以微管作为运行轨道，而肌球蛋白则是以肌动蛋白纤维作为运行轨道。
胞质动力蛋白和驱动蛋白各有两个球状ATP结合头部和一个尾部，其头部与微管是以空间结构专一的方式结合的，因此只有当驱动蛋白和动力蛋白以正确的姿势”指向“微管时才能结合上去；而马达蛋白（驱动蛋白和动力蛋白）的尾部通常是与细胞组分如小泡或细胞器稳定结合的，因此也就决定了马达蛋白所运载的＂货物“种类。
驱动蛋白和动力蛋白的头部是具有ATP水解活性的酶(ATP酶），这一酶解反应所产生的能量可提供这两者的头部作一个循环的构象改变，完成一套与微管结合、解离、再结合的动作，从而使蛋白沿着微管移动。
货物
马达蛋白头：：飞；占仁`......
微管
驱动蛋白是一类微管激活的ATP酶，可沿微管由负端向正端移动，在胞内物质运输中具有重要作用。
在神经细胞中，驱动蛋白已被证明沿着轴突的微管＂轨道”负责快速轴突运输，线粒体快速移动，分泌小泡前体和各种轴突组成物运输到达神经末梢。
动力蛋白是一个由9~12个亚基组成的蛋白质复合体，具有ATP酶活性，可沿微管由正端向负端移动，为细胞内物质运输和纤毛运动提供动力。
间期细胞中胞质动力蛋白的一个主要作用是参与细胞器的定位和转运。
（四）微管维持细胞内细胞器的定位和分布
微管及其相关的马达蛋白在真核细胞膜性细胞器的定位上起着重要作用。
细胞中线粒体的分布与微管相伴随，游离核糖体附着于微管和微丝的交叉点上，微管使内质网在细胞质中展开分布，使高尔基复合体在细胞中央靠近细胞核而定位于中心体附近。
如果用秋水仙素处理细胞，破坏微管的装配，那么这些细胞器的有序空间排列就会改变，如内质网砃塌，由千内质网与核被膜相联系，千是便积聚到核附近；高尔基复合体分俯成小的毅泡，分散在整个细胞质中。
当把秋水仙素去除以后，则细胞器的分布重新恢复正常。
（五）微管参与染色体的运动，调节细胞分裂
微管是构成有丝分裂器的主要成分，可介导染色体的运动。
有丝分裂前期，染色体的动粒(kin e tochore)出现并逐渐成熟，当核膜开始崩解时，微管侵入核区，染色体一端的动粒可捕获从纺锤体极伸出的微管，形成侧位连接，并沿着单根微管的侧面向极区方向滑动。
由千极区的微管密集，这一运动使动粒容易获得更多的微管。
这些微管与动粒形成端位连结，并通过在动粒一端的聚合延伸而推动染色体向纺锤体中部移动。
同时另一侧姐妹染色单体上的动粒也与来自另一极的微管结合。
有丝分裂后期只有在所有染色体都达到赤道板平衡后才会开始，任何一个染色体未与微管连接或未达到平衡位置，分裂后期都将被延迟。
（六）微管参与细胞内信号传导
已证明微管参与hedgehog、JNK、Wnt、ERK及PAK蛋白激酶信号转导通路。
信号分子可直接与微管作用或通过马达蛋白和一些支架蛋白来与微管作用。
微管的信号转导功能具有重要的生物学作用，它与细胞的极化、微管的不稳定动力学行为、微管的稳定性变化、微管的方向性及微管组织中心的位置均有关。
经典实验：驱动蛋白的分离·-－－-－－－－－－－－－－－-－－－－－-－－－－－-－－．．一一一一一一一．．一一一一一一．．．一一一一一研究背景细胞器的运输及其定位机制是细胞生物学的关键性问题。
1982年，R.
Allen等人应用显微摄影技术观察到，在乌贼神经细胞的轴突中，细胞器可沿胞质中的细丝进行移动。
随后，通过电子显微镜证实这些细丝是微管，但是与微管结合并参与细胞器运输的马达蛋白(motor protein)的性质不清。
当时被发现的唯一的一种微管马达蛋白是轴突动力蛋白(axonemal dynein)，而这种微管马达蛋白仅存在于纤毛和鞭毛中。
在1985年，R.
D. Vale等人分离出了一种新的马达蛋白一驱动蛋白(k in es in)，该蛋白触发了细胞中的细胞器沿着微管的移动。
实验内容
先前的体外实验表明，ATP的存在对微管的运动是必需的，微管的运动可以被ATP同型物一腺符酰亚胺二磷酸(AMP-PNP)所阻断；在AMP-PNP存在的情况下，尽管微管的运动被阻断，但细胞器仍然与微管相结合，提示在这种情况下，与细胞器运动相关的马达蛋白也同微管结合。
基于这些知识，为了分离这种未知的马达蛋白，Vale等在AMP-PNP存在的情况下，将微管与从乌贼神经轴突中提取的胞质蛋白共同孵育，首先使这种未知的马达蛋白与微管相结合，然后在该体系中加入ATP,ATP的水解则使该蛋白从微管上解离下来。
再经过凝胶过滤分析，就得到了一个分子量为l lOkD的蛋白质。
他们用同样方法，还从牛脑中纯化出一种类似的马达蛋白。
这些新的蛋白质在酶促动力学和结构方面与先前分离的动力蛋白(dynein)明显不同，是一个新的微管马达蛋白家族成员，他们将其命名为驱动蛋白(kines in)，在希腊语中kinein意为＂移动(move)"。
发表论文
Vale RD, Reese TS, Sheetz MP.
Identification of a novel force-generating pl"otein, kinesin, involved in microtubule-based motility.
Cell,1985,42:39-50.
后续影响
马达蛋白在囊泡运输和细胞器的运动过程中所发挥的作用是细胞生物学的核心问题之一。
后续的实验陆续证实，驱动蛋白使裳泡和细胞器沿着微管向微管正端方向运动，而动力蛋白则使囊泡和细胞器向微管的负端运动。
马达蛋白除了负责裳泡运输和细胞器的运动外，对于有丝分裂过程中朵色体的分离和重新分布也具有重要作用。
驱动蛋白的发现拓展了人们对基于微管运动的真核细胞生命活动机制的认识。
162第二篇细胞的结构与功能
第二节微丝
微丝(mi crofilament, MF)又称肌动蛋白丝(act i n filament)，是由肌动蛋白(ac tin)组成的细丝，普遍存在千真核细胞中，在肌肉细胞中，肌动蛋白占细胞总蛋白的10%，在非肌肉细胞中占1%~5%。
它以束状、网状或散在等多种方式有序地存在于细胞质的特定空间位置上，并由此与微管和中间纤维共同构成细胞骨架，参与细胞形态维持以及细胞运动等生理功能。
和微管一样，微丝是不稳定的，但它在细胞中也能形成如肌肉细胞中的收缩单位一样稳定的结构。
微丝与许多种肌动蛋白结合蛋白相结合，使它能够在细胞内行使多种功能。
—、肌动蛋白与微丝的结构
微丝的主要成分是肌动蛋白，在电镜下是一种细丝状结构，直径5~8nm，与微管相比，肌动蛋白微丝更纤细柔顺。
单个微丝通常比微管短很多，在细胞内单条微丝并不是独立行动的，而是形成横向连接的聚合物或形成束，这样要比单个微丝更结实。
每一个肌动蛋白分子是由375个氨基酸组成的单链多肤，与一分子ATP紧密相连。
肌动蛋白单体外观呈哑铃形，称为G－肌动蛋白（球形－肌动蛋白）。
每个G－肌动蛋白由两个亚基组成，它具有阳离子(M矿和K十或Na十汃ATP（或ADP)和肌球蛋白结合位点。
微丝是由G－肌动蛋白单体形成的多聚体，也称为F－肌动蛋白（纤维状－肌动蛋白）。
肌动蛋白单体具有极性，装配时首尾相接，故微丝也有极性。
肌动蛋白微丝也和微管一样是极性结构，有两个在结构上不相同的末端，相对迟钝和生长慢的负端(m inus end)及一个生长快的正端(plus end)（图7-8)。
负端又称为指向端”(point end)，正端又称为＂秃端＇（barbed end)。
一个细胞内的微丝总长度比微管总长度长至少30倍以上，反映了这两种细胞骨架聚合体在组装及功能上的差别。
肌动蛋白分子
正端
负端A B负端l l
A. G－肌动蛋白三维结构；B.
F－肌动蛋白结构模型；C.
F－肌动蛋白电镜照片纯化的肌动蛋白在体外能够聚合形成肌动蛋白纤维，但是这种纤维不具有相互作用的能力，也不能行使某种功能。
在显微镜下观察，它们只是杂乱无章的堆积而不像活细胞中肌动蛋白纤维能够组织成各种组织，如束状、薄网状等。
体外组装的肌动蛋白纤维本身同活体中的肌动蛋白纤维之间没有差别，只是组织结构不同。
体内的肌动蛋白纤维是由不同的肌动蛋白纤维结合蛋白将肌动蛋白纤维第七章细胞骨架与细胞的运动163组织成各种不同的结构，从而执行不同的功能。
肌细胞和非肌细胞中都有微丝结合蛋白，至少已分离出100多种。
表7-1是常见的几类主要的微丝结合蛋白。
目前发现，微丝结合蛋白具有多种功能，但它们与肌动蛋白相互作用的方式却十分简单。
这些微丝结合蛋白主要与微丝的装配及微丝的功能有关。
（一）单体隔离蛋白
抑制蛋白和胸腺素能够与单体肌动蛋白结合，并且抑制它们的聚合，将具有这种作用的蛋白质称为肌动蛋白单体隔离蛋白(monomer seq uestering protein)，这种蛋白质在非肌细胞中负责维持高浓度的单体肌动蛋白。
没有单体隔离蛋白，细胞质中可溶性的肌动蛋白几乎全部组装成肌动蛋白纤维。
改变细胞质中单体隔离蛋白的浓度或改变它们的活性，就会使细胞质中肌动蛋白单体－聚合体的平衡发生变化，它们的活性和浓度决定着肌动蛋白是趋于聚合还是解聚。
（二）交联蛋白交联蛋白(cross linkin g protein)的主要功能是改变细胞内肌动蛋白纤维的三维结构。
每一种交联蛋白都有两个或两个以上与肌动蛋白结合的位点，这样，能够使两个或多个肌动蛋白纤维产生交联，使细胞内的肌动蛋白纤维形成网络结构。
有些交联蛋白是杆状的，能够弯曲，由这种交联蛋白形成的网络结构具有相当的弹性，因而能够抵抗机械压力。
有些交联蛋白是球状的，能够促使肌动蛋白成束排列，如微绒毛中的肌动蛋白束就是靠这种蛋白交联的。
（三）末端阻断蛋白末端阻断蛋白(end blocking protein)通过与肌动蛋白纤维的一端或两端的结合调节肌动蛋白纤维的长度。
加帽蛋白与肌动蛋白纤维的末端结合之后，相当于加上了一个帽子。
如果一个快速生长的肌动蛋白纤维在（＋）端加上了帽子，那么在（－）端就会发生解聚。
某些加帽蛋白能够促使新的纤维形成，同时抑制已存在微丝的生长，这样导致细胞内有大量较短微丝的存在。
（四）纤维切割蛋白
纤维切割蛋白(fi lament severing protein)能够与已经存在的肌动蛋白纤维结合并将它一分为二。
由千这种蛋白质能够控制肌动蛋白丝的长度，因此大大降低了细胞中的黏度。
经这类蛋白质作用产生的新末端能够作为生长点，促进肌动蛋白的装配。
切割蛋白可作为加帽蛋白封住肌动蛋白纤维的末端。
（五）肌动蛋白纤维解聚蛋白肌动蛋白纤维解聚蛋白(actin filament depolymerizing prote i n)主要存在千肌动蛋白丝骨架快速变化的部位，它们与肌动蛋白丝结合，并引起肌动蛋白丝的快速解聚形成肌动蛋白单体。
（六）膜结合蛋白膜结合蛋白(membrane binding protein)是非肌细胞质膜下方产生收缩的机器。
在剧烈活动时，由收缩蛋白作用于质膜产生的力引起质膜向内或向外移动（如吞噬作用和胞质分裂）。
这种运动是由肌动蛋白纤维直接或间接与质膜相结合后所形成的。
直接的方式有与膜整合蛋白的结合，间接的方式有与外周蛋白的结合。
两个典型的例子是红细胞膜骨架和细胞的整联蛋白连接。
这两种情况下，肌动蛋白丝通过膜结合蛋白与细胞质膜连接成一个网络结构。
三、微丝的装配机制
在多数非肌肉细胞中，微丝是一种动态结构，在一定条件下，不断进行聚合和解聚，并与细胞的形态维持及细胞运动有关。
(—)微丝的组装过程分为成核、聚合和稳定三个阶段体外实验表明，球形肌动蛋白组装成肌动蛋白纤维需要ATP和一定的盐浓度（主要是M忙和K勹，其组装过程也分三个阶段：即成核期、聚合期和稳定期。
成核期是微丝组装的限速过程，需要一定的时间，故又称延迟期，此期球状肌动蛋白开始聚合，其二聚体不稳定，易水解，只有形成三聚体才稳定，即核心形成。
一旦核心形成，球状肌动蛋白便迅速地在核心两端聚合，进入聚合期。
微丝两端的组装速度有差异，正端的组装速度明显快于负端，约为负端的10倍以上。
微丝延长到一定时期，肌动蛋白渗入微丝的速度与其从微丝上解离的速度达到平衡，此时即进入平衡期，微丝长度基本不变，正端延长长度等于负端缩短长度，并仍在进行着聚合与解聚活动（图7-9)（动画7-5“微丝的组装过程”)。
（二）微丝的组装可用踏车模型和非稳态动力学模型来解释微丝的组装可用踏车模型和非稳态动力学模型来解释。
目前认为踏车模型在微丝组装过Q。
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G-actin成核期延长期稳定期
第七章细胞骨架与细胞的运动
程中可能起主导作用。
微丝可以在任何一端以添加肌动蛋白单体的方式增长，但由千微丝具有极性，新的肌动蛋白单体加到微丝两端的速度不同，速度快的一端为正端，速度慢的一端为负端，表现出显著的踏车现象。
在微丝装配时，肌动蛋白分子添加到肌动蛋白丝上的速率正好等于肌动蛋白分子从肌动蛋白丝上解离的速率时，微丝净长度没有改变，这种过程称为肌动蛋白的踏车行为（图7-10)。
又产、产、／
图7-10踏车行为模式图微丝两端聚合加入和解聚释放的亚单位速度达到平衡，微丝长度不变裸露的微丝就像不带结合蛋白的微管一样，呈固有的不稳定性，而且两端都可以解聚，在解聚时正端的速度比负端的速度要快得多。
ATP主要调节微丝组装的延长期，每一个游离的肌动蛋白单体带有一个紧密结合的ATP，一旦肌动蛋白单体聚合到肌动蛋白丝上它就水解为ADP，就像GTP对千微管一样，肌动蛋白丝中的ATP水解为ADP，减弱了单体之间的结合力，也就降低了聚合体的稳定性。
因此核昔酸的水解促进了解聚，帮助细胞中已形成的微丝解聚。
非稳态动力学模型认为ATP是调节微丝组装的动力学不稳定性行为的主要因素。
微丝组装的延长期通过ATP来调节，一个球状肌动蛋白分子可结合1分子ATP，结合ATP的肌动蛋白（即ATP－肌动蛋白）对纤维状肌动蛋白末端的亲和性高，当ATP－肌动蛋白结合到末端后，肌动蛋白的构象发生改变，ATP水解为ADP+Pi。
ADP－肌动蛋白对纤维末端的亲和性低，容易从末端脱落，使纤维缩短。
ATP－肌动蛋白浓度与其聚合速度呈正比，当ATP－肌动蛋白高浓度时，ATP－肌动蛋白在末端聚合的速度便升高，由千ADP－肌动蛋白对末端的亲和力小，结果ADP－肌动蛋白不断从末端解聚脱落，使纤维缩短。
因此，就每一根纤维来说，其长度一般不是固定不变的，而是呈动力学不稳定状态，其长度总在延长与缩短的变化之中。
微丝同微管一样，在体内装配时也有成核作用。
所不同的是肌动蛋白纤维的成核作用发生在质膜，因而在很多细胞中肌动蛋白纤维在质膜下的一层由微丝和各种微丝结合蛋白组成的网状结构往往密度较高，称为细胞皮层(cell cortex)或肌动蛋白皮层(actin cortex)。
该结构具有很高的动态性，与肌动蛋白一起为细胞膜提供强度和韧性，并维持细胞的形态。
如细胞皮层可推动细胞膜形成细长的微刺(microspike)，在神经细胞轴突的生长端可形成更长的微穗称丝状伪足(filopodia)，还可形成片状伪足(lamellipodia)（图7-11)。
（三）微丝的组装受多种因素影响
微丝的装配除了受G－肌动蛋白临界浓度的影响，还受ATP、Ca2•,Na+、K浓度和药物的影响。
在含有ADP和Ca“以及低浓度的Na•,K•的溶液中，微丝趋于解聚而形成肌动蛋白单体；而在含有ATP、M矿和高浓度的Na\K十的溶液中，肌动蛋白单体则装配成微丝。
另外，微丝结合蛋白对微丝的组装图7-11细胞中的肌动蛋白束A微绒毛；B.细胞质中的收缩束；C.运动细胞前缘的片状伪足和丝状伪足；D细胞分裂时的收缩环也有惆控作用。
同微管一样，肌动蛋白也受某些药物分子的影响。
主要有细胞松弛素B(cytochalasin B)和鬼笔环肤(phalloidin)，它们与肌动蛋白特异性结合，影响着肌动蛋白单体－多聚体的平衡。
细胞松弛素B是第一个用千研究细胞骨架的药物，它是真菌分泌的生物碱。
细胞松弛素及其衍生物在细胞内通过与微丝的正端结合起抑制微丝聚合的作用。
当将细胞松弛素加到活细胞后，肌动蛋白纤维骨架消失，使动物细胞的各种活动瘫痪，包括细胞的移动、吞噬作用、胞质分裂等。
它对微管没有作用，也不抑制肌收缩，因肌纤维中肌动蛋白丝是稳定的结构，不发生聚合与解聚的动态平衡。
鬼笔环肤是从毒蘑菇(ama nita)分离的毒素，它同细胞松弛素的作用相反，只与聚合的微丝结合，而不与肌动蛋白单体分子结合。
它与聚合的微丝结合后，抑制了微丝的解体，因而破坏了微丝的聚合和解聚的动态平衡。
四、微丝的功能
（一）微丝构成细胞的支架并维持细胞的形态在细胞中，微丝不能单独发挥作用，必须形成网络结构或束状结构才能发挥作用。
细胞的特化结构包括微绒毛(microvilli)和应力纤维(s tress fiber)。
微绒毛是质膜顶端表面的指状形突起（见图7-llA)，在微绒毛中，由微丝形成的微丝束构成了微绒毛的骨架，另外还有一些微丝结合蛋白，在调节微绒毛长度和保持其形状方面具有重要作用。
微绒毛的核心是由20~30个同向平行的微丝组成的束状结构，其中有绒毛蛋白和毛缘蛋白(fimbrin)，它们将微丝连接成束，赋予微绒毛结构刚性。
另外还有肌球蛋白－I(myosin-I)和钙调蛋白(calmodulin)，它们在微丝束的侧面与微绒毛膜之间形成横桥连接，提供张力以保持微丝束处于微绒毛的中心位置。
微绒毛在小肠吸收上皮细胞最多，使细胞的吸收面积增大20倍，对千增强消化和吸收功能具有重要意义。
应力纤维也叫张力纤维，是真核细胞中广泛存在由微丝束构成的较为稳定的纤维状结构，在细胞内紧邻质膜下方，常与细胞的长轴大致平行并贯穿细胞的全长。
这些微丝束具有极性，一端与质膜的特定部位相连，另一端插入到细胞质中，或与中间丝结合。
应力纤维具有收缩功能，但不能产生运动，而只能用于维持细胞的形状和赋予细胞韧性和强度。
（二）微丝参与细胞运动
许多动物细胞在进行位置移动时多采用变形运动的方式。
如变形虫、巨噬细胞和白细胞以及器官发生时的胚胎细胞等，这些细胞含有丰富的微丝，依赖肌动蛋白和微丝结合蛋白的相互作用，可进行变形运动。
这些细胞通过肌动蛋白聚合使细胞表面形成突起，如片状伪足或丝状伪足。
当片状伪足或丝状伪足接触到一片合适的表面时，它们就黏附在上面，这时称为整联蛋白(integrin)的穿膜蛋。
拉力，利用这一铀着点把自己的身体拉向前。
（三）微丝参与细胞分裂二完成胞质的分裂过程，把两个细胞分隔开。
（四）微丝参与肌肉收缩调节轻链
真核细胞中很多与微丝相结合的蛋白都是在
骨骼肌收缩的基本结构单位一肌小节(sar
白丝。
白就与胞外基质中的分子或与另一细胞表面上的分子结合。
同时整联蛋白在胞内面紧紧抓住肌动蛋白丝，从而为细胞内部的肌动蛋白丝系统创造了一个牢靠的描着点。
细胞然后通过内部的收缩产生动物细胞有丝分裂末期，继核分裂完成后，在即将分离的两个子细胞之间肌动蛋白微丝与肌球蛋白－II组装形成瞬时性收缩束以维持特殊的功能，然后解体。
最突出的是有丝分裂的动物细胞质膜下皮层由微丝与肌球蛋白－II形成的腰带状束，称为收尾头颈',缩环(coractilering)（见图7-llD)。
收缩环产生nt的动力将质膜向内拉，细胞的腰部紧缩最终一分为肌细胞中首先发现，肌细胞的收缩是实现有机体的一切机械运动和各脏器生理功能的重要途径。
图7-12肌球蛋白分子comere)的主要成分是肌原纤维。
电镜下观察证明肌原纤维由粗肌丝(thickmyofilament)和细肌丝(thin myofilament)组成。
粗肌丝直径约为10nm，长约1.5mm，由肌球蛋白(myosin)组成（图7-12)。
细肌丝直径约为5nm，由肌动蛋白、原肌球蛋白(tropomyosin)和肌钙蛋白(troponin)组成，又称肌动蛋myosin租丝与肌动蛋白细丝相互交错，myosin粗丝为双极对称的组装形式，分布在中线两侧肌细filament F.胞的收缩机制可用滑动丝模型(slidingmodel)来解释（图7-13)。
1954年A.Huxl提出肌ey收缩的滑动丝模型，认为肌细胞收缩是由千粗肌丝与细肌丝之间相互滑动的结果。
肌细胞收缩的分一_B子基础是：肌球蛋白的头部与邻近的细肌丝结合并发生一系列的构象变化，触发肌球蛋白头部沿着细肌丝正端“行走”，从而导致肌肉的收缩。
肌节粗丝（肌球蛋白丝）细丝（肌动蛋白丝）
·一一一1-－－－－i-'
l--—-，一肛…叩叩闺咖咖叩一一I-放松ll收缩盲－---l叩一一一1一」-一二-－一二:一一—_＿＿＿－二（五）微丝参与细胞内物质运输微丝在微丝结合蛋白介导下可与微管一起进行细胞内物质运输，例如小泡的运输，通过肌球蛋白－I微丝结合，将小泡沿微丝的（－）端向（＋）端移动。
另外，肌球蛋白－I的尾部与质膜结合，利用其头部可将微丝从一个部位运向另一个部位。
（六）微丝参与细胞内信号传递细胞表面的受体在受到外界信号作用时，可触发质膜下肌动蛋白的结构变化，从而启动细胞内激酶变化的信号传导过程。
第三节中间纤维
中间纤维(intermediate filaments, IF)广泛存在于真核细胞中，最早在平滑肌细胞内发现，由千其介千肌肉细胞ac t i n细丝与肌球蛋臼粗丝之间而得名“中间”。
中间纤维是三类细胞骨架纤维中结构最为复杂的一种。
浓盐溶液与非离子性去污剂处理可使细胞内其余大部分的细胞骨架消失，唯独保留中间纤维，可见中间纤维在三类细胞骨架纤维中最为坚韧和持久。
—、中间纤维的结构和类型
(—)中间纤维是丝状蛋白多聚体中间纤维的直径为10nm，是一种坚韧、耐久的蛋白质纤维。
它相对较为稳定，既不受细胞松弛素的影响也不受秋水仙素的影响。
中间纤维的单体（亚基）是蛋白质纤维分子，已经发现50多种，它们都有共同的结构特点：由头部(N端）、中间杆状区和尾部(C端）组成。
杆状区为Q'.－螺旋区，内含4段高度保守的Q'.－螺旋段，它们之间被3个短小间隔区隔开。
亚基装配时靠Q'.－螺旋配对形成二聚体。
在杆状区两侧的N端的头部和C端的尾部通常折叠成球状结构（图7-14)。
杆状区
头部
角蛋白＼袍佟＝己＠？
波形蛋白
神经纤维蛋白
核纤层蛋白
虽然a－螺旋区高度保守，但N端的头和C端的尾都是高度可变的，不同类型的中间纤维亚基在头部和尾部的大小和氨基酸组成方面有很大区别，具有不同的组成和化学性质。
中间纤维分子质批的大小主要取决千尾部的变化，而结构的关键区域在于杆状区，它们表现出形成多级螺旋所需的分子形式。
（二）中间纤维蛋白的类型和分布较为复杂根据中间纤维氨基酸序列的相似性，可分为六种类型（表7-2):根据氨基酸序列，角蛋白可分成两种主要类型：I型（酸性）和Il型（中性／碱性）角蛋白(keratin)，存在千上皮细胞内。
III型中间纤维蛋白包括多种类型，其中，波形蛋白存在于间充质来源的细胞；结蛋白是肌细胞特有的，在骨骼肌、心肌和平滑肌中表达；胶质原纤维酸性蛋白特异分布于神经胶质细胞；外周蛋白(peripherin)存在于中枢神经系统神经元和外周神经系统感觉神经元中；W型神经丝蛋白主要分布在脊椎动物神经元轴突中；V型核纤层蛋白存在于内层核膜的核纤层；VI型巢蛋白分布千神经干细胞。
细胞内中间纤维的成分经常会有变化，例如，在许多上皮来源的细胞开始只有角蛋白，而后出现波形蛋白；胶质细胞开始只有胶质细胞原纤维酸性蛋白，后来出现波形蛋白，但它们是分别排列的，说I'明中间纤维的种类和成分可随细胞的生长或成熟而改变。
部＼4尾
二、中间纤维的装配和调节
与肌动蛋白和微管蛋白单体的球状分子不同，中间纤维蛋白单体分子大多数是长丝状，称丝状蛋白(fibrou s pro tein)，有氨基末端的头部、狻基末端的尾部和一个中间杆状区域。
中间杆状区域由展开的a－螺旋区组成，a－螺旋区含有纵排的重复组件，称为七位复件(heptad repeat)，为具有特色的氨基酸序列。
这种七位氨基酸元件，能促进两个平行的中间纤维蛋白单体的a－螺旋杆之间形成卷曲的螺旋(coiled-coil)二聚体。
在细胞骨架许多种别的长形蛋白，如tropo肌球蛋白和肌球蛋白分子尾部形成的超螺旋二聚体结构中也含有七位复件。
组装的下一步是两个超螺旋二聚体以反向平行相连，形成四聚体(te tramer)亚单位。
细胞内存在少量可溶性四聚体，说明它们是中间纤维组装的基础亚单位。
二聚体的反向平行排列说明四聚体以及由其形成的高级结构中间纤维都是非极化结构，也就是说在纤维两端是相同的，在沿着纤维长轴上具有对称性。
这一特点使中间纤维显然不同于有极性的、功能依赖于极性的微管及肌动蛋白微丝。
中间纤维组装的最后步骤仍不甚清楚，可能是由四聚体以简单结合反应加到伸长中的中间纤维上；结合反应沿中间纤维长轴排列，按螺旋形式包裹在一起。
各种中间纤维蛋白，其分子的中间杆状区的结构是高度保守的，它们在组装中调节纤维之间侧位的相互作用；而中间纤维分子的球状头部与尾部结构区的大小与氨基酸序列有较大差别，但不影响纤维的主轴结构。
头部或尾部往往从纤维的表面突出，可以调节中间纤维与其他成分之间的相互作用。
这一结构类型意味着中间纤维可以由广泛分子量的蛋白质（从约IO000到200000)形成。
在多数情况下，细胞内几乎全部的中间纤维蛋白分子呈完全聚合态，只有很少的游离性四聚体。
尽管如此，细胞仍旧能够调节其中间纤维的组装，并且决定其数噩、长度和位置（图7-15)（动画7-6”中间纤维的的装配”)。
中间纤维装配的调控机制与其蛋白氨基末端头部结构域内特殊氨基酸如丝氨酸残基的磷酸化相关。
目前认为，中间纤维蛋白丝氨酸和苏氨酸残基的磷酸化作用是中间纤维动态调节最常见最有效的调节方式。
最显著的例子是在有丝分裂时，形成核纤层的蛋白亚单位磷酸化，使核纤层完全解体；当分裂完成时，特殊丝氨酸去磷酸化，核纤层再形成。
胞质内的中间纤维在细胞分裂时，或对某些细胞外信号进行应答时，也可以进行彻底的重组装。
虽然上述改变一般是由亚单位磷酸化的增强，其他因素也可能起到辅助调节作用。
170第二篇细胞的结构与功能
两个和多个四聚体排列形成更大聚合重叠的中间纤维-----,--;~,--,',-夕,.，'---－夕一一--,-,,,
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夕夕·,,,',图7-15中间纤维的装配模型A中间纤维蛋白单体；B超螺旋二聚体；C两个超螺旋二聚体交错形成四聚体；D两个四聚体组装在一起；E八个四聚体装配形成中间纤维中间纤维在胞质中形成精细发达的纤维网络，外与细胞膜及细胞外基质相连，中间与微管、微丝和细胞器相连，内与细胞核内的核纤层相连，因此，中间纤维也具有多种功能，而且中间纤维发挥功能具有时空特异性。
(—)中间纤维在细胞内形成一个完整的网状骨架系统中间纤维外与质膜和细胞外基质有直接的联系，内与核膜、核基质联系，贯穿整个细胞起着广泛的骨架功能。
该骨架具有一定的可塑性，对维持细胞质的整体结构和功能的完整性有重要作用。
因此中间纤维在细胞内外起着多方面结构的构成与功能联系的作用，特别与细胞核的定位和固定有关。
（二）中间纤维为细胞提供机械强度支持中间纤维在那些容易受到机械应力的细胞质中特别丰富。
体外实验证实，中间纤维比微管和微丝更耐受剪切力，在受到较大的剪切力时产生机械应力而不易断裂，在维持细胞机械强度方面有重要作用（图7-16)。
（三）中间纤维参与细胞连接一些器官和皮肤的上皮细胞通过桥粒和半桥粒连接在一起。
桥粒介导细胞与细胞之间的黏附，半桥粒介导细胞与细胞外基质之间的黏附。
中间纤维参与黏若连接中的桥粒连接和半桥粒连接，在有中间纤维的细胞｝没有中间纤维的细胞痉二二三细胞保持完整连在一起细胞破裂第七章细胞骨架与细胞的运动这些连接中，中间纤维在细胞中形成一个网络，既能维持细胞形态，又能提供支持力。
（四）中间纤维参与细胞内信息传递及物质运输由于中间纤维外连质膜和胞外基质，内穿到达核骨架，因此形成一个跨膜的信息通道。
中间纤维蛋白在体外与单链DNA有高度亲和性，中间纤维有明显的在核外周聚集的特点，可能与DNA的复制和转录有关。
此外，近年来研究发现中间纤维与mRNA的运输有关，胞质mRNA铀定于中间纤维，可能对其在细胞内的定位及是否翻译起重要作用。
（五）中间纤维维持细胞核膜稳定
在细胞核内膜的下面有一层由核纤层蛋白组成的网络，对于细胞核形态的维持具有重要作用，而核纤层蛋白是中间纤维的一种。
组成这种网络结构的核纤层蛋白A和C，它们交连在一起，然后通过核纤层蛋白B附着到内核膜上，在内核膜上有核纤层蛋白B的受体。
此外，中间纤维在胞质溶胶中也组成网络结构，分布在整个细胞中，维持细胞的形态。
（六）中间纤维参与细胞分化
微丝和微管在各种细胞中都是相同的，而中间纤维蛋白的表达则具有组织特异性，表明中间纤维与细胞分化可能具有密切的关系。
这方面研究主要是在胚胎发育和上皮分化的方面，对其详细了解还有待千进一步研究。
第四节细胞的运动
单个细胞的移动方式有多种，极少数细胞通过纤毛和鞭毛进行运动，如纤毛虫借助纤毛进行移动和摄取食物，精子依靠鞭毛的摆动在液体中游动。
但绝大多数动物细胞是通过爬行的方式在细胞外基质或固体表面上运动。
例如，在胚胎发育过程中，动物体结构的形成是由胚胎细胞向特定靶部位的迁移和上皮层细胞的协同运动来共同完成，最典型的例子是神经崝细胞在整个胚胎发育过程中从神经管长距离迁移到各部位，形成不同类型的细胞；巨噬细胞和白细胞从血液循环中运动到炎症部位，吞噬并消灭微生物；同样成纤维细胞在结缔组织中的迁移有助于创伤组织的修复和重塑；在许多肿瘤细胞中，癌细胞的运动会导致原发肿瘤向周圃组织的侵袭及通过血管或淋巴管引起机体其他部位的转移。
（动画7-7“微丝的动态聚散及细胞的迁移运动”)一些细胞通过纤毛和鞭毛进行运动，如精子靠鞭毛的摆动进行游动，动物呼吸管道上皮细胞靠纤毛的规律摆动向气管外转运痰液。
每根纤毛都以一种猛烈抽打的方式来运动，就像我们游蝶泳时那样（图7-17A)。
鞭毛通常要比纤毛长，它是用来推动整个细胞的，不做抽打运动，沿着长度方向传播规律性的波动，类似正弦曲线传播运动波，从而推动细胞在液体中穿行（图7-17B)。
图7-17纤毛和鞭毛的运动纤毛和鞭毛的运动是一种简单的弯曲运动，其运动A一根纤毛的拍打运动；B海鞘精子鞭毛机制一般用微管滑动模型解释：心动力蛋白头部与相邻反复的波浪形运动（引自Alberts B,2008)微管的B微管接触，促进与动力蛋白结合的ATP水解，并。
172第二篇细胞的结构与功能
释放ADP和P]，改变了A微管动力蛋白头部的构象，促进头部朝向相邻二联管的正极滑动，使相邻二联管之间产生弯曲力；＠新的ATP结合，促使动力蛋白头部与相邻B管脱离；＠ATP水解，其放出的能量使动力蛋白头部的角度复原；＠带有水解产物的动力蛋白头部与相邻二联管上的另一个位点结合，开始下一个循环（图7-18)。
@@勹A二二二二二白臂的再结合
二、微丝与细胞运动
细胞运动是一个高度协同的复杂过程，细胞主要依赖于肌动蛋白和微丝结合蛋白的相互作用进行移动。
这种运动可以分为三个过程（图7-19):CD细胞在它的前端或前沿伸出突起，也叫伪足；＠这些突起附着在其爬行的表面上；＠细胞的其余部分通过铀着点上的牵引力将自己向前拉。
肌动蛋白皮层
基质
处千牵引力之下的皮层1在正端聚合的肌动蛋白伸出片状伪足所有这三个过程都涉及肌动蛋白丝，但是其方式不同。
第一步通过肌动蛋白聚合使细胞表面形成突起。
成纤维细胞在爬行过程中，其前缘规律性地伸出菏菏的片状伪足，片状伪足中含有致密的肌动蛋白丝网络，大部分纤维的正端接近细胞质膜。
很多细胞也会伸出纤细而坚挺的突起，称为丝状伪足，它们不仅分布在细胞的前缘，而且也分布在细胞表面的其他部分。
丝状伪足宽0.
Iµ,m，长5～10µm，由10~20根松散的肌动蛋白丝纤维束组成，同样正第七章细胞骨架与细胞的运动端朝向质膜。
发育中神经细胞的生长锥甚至可以长出50µm长的丝状伪足，它可以帮助细胞探索周围环境，发现到达目标的正确途径。
丝状伪足和片状伪足都是试探性的可移动结构，其形成和回缩的速度都极快。
肌动蛋白丝在质膜下聚合生长驱使细胞质膜向外突出，形成丝状伪足或片状伪足。
肌动蛋白丝在细胞前缘的形成和生长是由微丝结合蛋白所介导的，它有助于肌动蛋白在质膜下成核。
一组称为ARP2/3(ac tin-related proteins2/3)复合物的微丝结合蛋白促进分枝状肌动蛋白丝的形成。
ARP2/3复合物在生长的肌动蛋白纤维的负端形成一个核心，肌动蛋白纤维由此向正端快速生长。
这些蛋白形成一个复合体并以70°角结合在原有的肌动蛋白纤维上，促进成核并形成新的肌动蛋白纤维，这样就可使单独的纤维形成树枝状的网络。
在其他微丝结合蛋白的帮助下，这个网络在前端聚合，在后端解聚，推动片状伪足向前移动（图7-20)。
细胞前缘t新生肌动蛋白丝
厂卢。
『：一
Arp2/3复合物去组装蛋白肌动蛋白单体加帽蛋白
笫二步当片状伪足或丝状伪足接触到适当的表面时，它们就黏附在上面，这时称为整联蛋白的穿膜蛋白就与胞外基质中的分子或与另一细胞表面上的分子结合，这个运动着的细胞就在基质或另一个细胞上面爬行。
同时，在爬行细胞膜的内表面整合蛋白紧紧抓住肌动蛋白丝，从而为爬行细胞内部的肌动蛋白丝系统提供了一个牢固的铀着点。
第三步，细胞通过内部的收缩产生拉力，利用铀着点将胞体向前拉动。
该过程依赖于肌动蛋白与肌球蛋白的相互作用。
但目前尚不清楚这种拉力是如何产生的，是通过收缩胞质中的肌动蛋白丝束呢？
还是通过收缩细胞皮层中的肌动蛋白丝网，或是两者兼而有之呢？
有待于进一步研究。
三、细胞运动的调节机制
(—)细胞外信号可以引起细胞骨架的重排
细胞外信号可以调节微丝结合蛋白的活性，使细胞可以通过细胞骨架的重排对外界环境做出应答。
许多镶嵌在质膜中的受体蛋白的活化可以引发细胞骨架的重排。
所有这些信号均由一类称为RhoGTP酶的家族所介导。
该家族的成员主要是：Cdc42、Rae和Rho。
这类蛋白可以在活性的GTP结合状态和非活性的GDP结合状态之间不断转换，从而控制细胞骨架重排。
Rho家族不同成员的激活可通过不同方式影响肌动蛋白丝的排列方式。
例如，GTP结合蛋白Cdc42的活化可以导致肌动蛋白的聚合，从而形成丝状伪足；GTP结合蛋白Rae的活化促进片状伪足和膜褶皱的形成；活化的Rho既可以启动肌动蛋白纤维通过肌球蛋白纤维成束形成应力纤维，又可通过蛋白质的结合形成点状接触（图7-21)。
肌动蛋白染色．肌动蛋白染色
这些复杂结构的显著变化是由千这些RhoGTP酶分子与不同的靶蛋白相互作用的结果，包括控制肌动蛋白结构和动力学的蛋白激酶及其辅助蛋白。
下面简单介绍引起细胞表面突起形成、细胞黏附及细胞胞体迁移的信号转导机制。
1.肌动蛋白聚合使细胞表面形成突起WASP(Wiskolt-A ldrich syndrome prote i n)是调节细胞运动的关键分子，也是Rae和Cdc42下游的重要效应分子，Rae和Cdc42通过活化WASP家族成员诱导伪足的形成和基质的降解。
ARP2/3复合物和肌动蛋白单体通过与活化的WASP家族狻基端结构域相结合，促进肌动蛋白成核。
此外，Rae和Cdc42通过活化p21活化激酶(p2l-activated kinase, PAK),磷酸化filamin，促进肌动蛋白网络形成；同时，活化的PAK还可激活LIMK，磷酸化cofilin使其失活而抑制肌动蛋白的解聚，稳定肌动蛋白细胞骨架。
微丝组装的成核过程还衙要formin的参与。
2细胞的黏附迁移的细胞头部与细胞外基质(ECM)的黏附和尾部去黏附的不断交替使得细胞向前迁移。
细胞表面的整联蛋白受体与ECM中特异的配体结合，通过整联蛋白聚集成簇而形成黏着斑复合体，而整联蛋白受体的胞内区与桩蛋白(paxillin)，纽蛋白(vinculin)和踝蛋白(talin)等多种肌动蛋白结合蛋白相互作用形成分子桥，并与细胞骨架相连，提供细胞迁移的铀着位点。
活化的第七章细胞骨架与细胞的运动175Rael和Cdc42，通过激活PAK!磷酸化下游的黏着斑激酶(focal adhesion kinase, FAK)，活化的FAK作为分子支架招募胞质内桩蛋白，纽蛋白和踝蛋白等，促进黏着斑复合体的形成。
3细胞胞体前移RhoA激活Rho－激酶(ROCK), ROCK活化后通过抑制肌球蛋白轻链磷酸酶(myosin light chain phosphatase, MLCP)活性从而增强肌球蛋白轻链磷酸化水平，导致细胞收缩能力增强。
Cdc42的作用与之类似。
另一方面，Rae会激活PAKl，活化的PAKl通过磷酸化肌球蛋白轻链激酶(myosin light c加n kinase,MLCK)使之失活来降低肌球蛋白轻链的磷酸化水平，使细胞收缩力减弱运动受阻。
但是PAKl也能直接磷酸化肌球蛋白轻链，增加细胞收缩力。
究竟是哪种作用占优势，取决于PAK l的空间分布和它的活性。
（二）细胞外信号可以指导细胞运动的方向
细胞运动需要在特定方向上进行极化。
组织中有导向的细胞分裂以及连续、有组织性的多细胞结构的形成都需要对细胞极化过程进行精密调控。
通过对酵母、果蝇和蠕虫，以及脊椎动物的研究表明，细胞骨架在细胞极化过程中具有主导作用，触发极化的许多分子在进化上是保守的。
物理性或化学性的外界环境改变能够引起细胞的极化并产生运动。
趋化(c hemotaxis)是指在可扩散化学因子的调控下，细胞向某个方向的运动。
研究最多的例子是中性粒细胞向细菌感染部位的趋化运动。
中性粒细胞表面的受体蛋白可以监测到来源于细菌蛋白的浓度极低的N－甲酰化肤（只有原核细胞从甲酰甲硫氨酸开始进行蛋白质合成）。
这些受体甚至可以监测出细胞两侧这些可扩散肤1％的浓度差异，从而引导中性粒细胞向细菌靶点移动。
与它相似的例子是阿米巴向cAMP移动，当受体与配体相结合时，受体附近的肌动蛋白被激活，并在局部发生聚合反应。
肌动蛋白的聚合反应依赖于单体Rh o家族GTP酶。
在酵母中，应答细胞向着信号方向伸出突起，细胞向一侧伸出突起间接地引发了细胞中“牵引机器”的再定位，由此细胞一路”嗅＂着向发出信号的部位移动。
吸附在细胞外基质或细胞表面的非扩散性化学因子也可以影响细胞移动的方向。
受体被信号所激活后，除了可引起方向性的肌动蛋白聚合，还可导致细胞黏附增强。
大多数动物细胞的长距离迁移，包括神经峭细胞和神经生长索，依赖千可扩散的和非扩散性的信号因子的协同作用来决定细胞运动的方向。
第五节细胞骨架与疾病
细胞骨架对细胞的形态改变和维持、细胞内物质运输、细胞的分裂与分化等具有重要作用，是生命活动不可缺少的细胞结构，它们的异常可引起很多疾病，包括肿瘤、一些神经系统疾病和遗传性疾病等。
不同细胞骨架在细胞内的特异性分布可用于对一些疑难疾病进行诊断，也可根据细胞骨架与疾病的关系来设计药物。
—、细胞骨架与肿瘤
在恶性转化的细胞中，细胞常表现为细胞骨架结构的破坏和微管解聚。
在肿瘤细胞的浸润转移过程中，某些细胞骨架成分的改变可增加癌细胞的运动能力。
恶性肿瘤的主要特点是细胞形态发生改变，增殖快，有侵袭组织及向周围及远处转移的能力，这些特征都与微管和微丝的变化有关。
在体外培养的多种人癌细胞中，免疫荧光染色显示微管和微丝发生明显改变：微管数址减少，网架紊乱甚至消失；微丝应力纤维破坏和消失，肌动蛋白发生重组，形成小体，聚集分布在细胞皮层，由千其形状为小球形或不规则，被命名以＂肌动蛋白小体”、“皮层小体”和“面包圈”、`｀玫瑰花”小体等。
这些细胞骨架成分的改变增加了癌细胞的运动能力。
因此，微管和微丝可作为肿瘤化疗药物的作用靶点，如长春新碱、秋水仙素和细胞松弛索及其衍生物等作为有效的化疗药物可抑制细胞增殖，诱导细胞凋亡。
另外，不同类型的中间纤维严格分布于不同类型的细胞中，而绝大多数肿瘤细胞通常继续表达其0.
来源细胞特征性的中间纤维类型，即便在转移后，仍表达其原发肿瘤的中间纤维类型。
因此可用于正确区分肿瘤细胞的类型及其来源，对肿瘤诊断有重要作用。
二、细胞骨架蛋白与神经系统疾病
许多神经系统疾病与细胞骨架蛋白的异常表达有关，例如，在阿尔茨海默病(Alzheiner diseases, AD)，也称老年痴呆症患者的神经元中，可见到不溶性神经纤维缠结(insoluble neurofibrillai y tangles, NFT)。
NFT为纤维性结构，主要由高磷酸化状态的tau蛋白组成。
tau蛋白是一种微管结合蛋白，过度磷酸化的tau蛋白对微管的亲和力降低，从而使微管的稳定性降低。
AD患者的神经元中微管蛋白的数量并无异常，但存在微管聚集缺陷。
在肌萎缩性侧索硬化症(amyotrophic lat eral sclerosis, ALS)和幼稚性脊柱肌肉萎缩症(i nfantile spinal muscle atrophy)，神经原纤维在运动神经元胞体和轴突近端的堆积是其神经元退化的早期表现，随后运动神经元丧失，导致骨骼肌失去神经支配而萎缩，造成瘫痪，最终死亡。
此外，包括亨廷顿舞蹈病(Huntingto n disease, HD)在内的一组多聚谷氨酰胺疾病(polyglutamine disease)的共同特点是，细胞质内缠结含有微管蛋白和微丝聚合蛋白Slal。
这些成分多与胞质内运输器有关，说明细胞骨架的损坏可能造成聚集物的形成，对细胞有毒性作用。
三、细胞骨架与遗传性疾病
一些遗传性疾病的患者常有细胞骨架的异常或细胞骨架蛋白基因的突变。
如人类遗传性疾病单纯性大庖性表皮松解症(epid ermolysi s bullosa simplex)，就是由于表皮细胞层表达的角蛋白基因突变而破坏了这类细胞的角蛋白中间纤维网，因此对机械性损伤非常敏感，即一点轻微的压挤便可使突变的基底细胞破坏，使患者的皮肤起疤。
在入类或在小鼠中，凡带有这种突变基因的个体都变得很脆弱，以致死于机械创伤。
此外，Wi skott Aldrich综合征(Wiskott Aldrich Syndrome, WAS)是X连锁隐性遗传的免疫缺陷疾病，临床表现有血小板减少、湿疹、反复感染，并发不同程度的细胞免疫和体液免疫缺乏。
研究表明，WAS患者T淋巴细胞的细胞骨架异常，血小板和淋巴细胞变小，微绒毛数量减少，形态变小。
进一步研究表明引起WAS的根源是微丝的异常。
纤毛不动综合征是一种由纤毛结构缺陷引起的常染色体隐性遗传性病，家族中的近亲婚配，可能为发病原因。
除了会导致男性不育外，还会引起下列疾病：慢性支气管炎、支气管扩张、慢性鼻窦炎、中耳炎、内脏逆位等。
精子鞭毛与纤毛虽然它们的长度及运动方式不同，但核心结构均是轴丝，由于轴丝结构复杂，所以其中任何一处发生异常均可引起精子鞭毛摆动及纤毛运动障碍。
其中，最常见的病理变化是动力蛋白臂异常，其次为放射辐和中心微管异常，甚至有的患者纤毛或鞭毛无中心微管或无轴丝。
据统计，纤毛不动综合征占男性不育因素的l.14%。
推荐读物
[1]Webb DJ, Parsons]T, Honvitz AF.
Adhesion assembly, disassembly and turnover in migrating cells—over and over and over again.
Nat Cell Biol,2002,4:E97-l00[2]Wehrle-Haller B.
Structure and function of focal adhesions.
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小结
细胞骨架是指真核细胞质中的蛋白质纤维网架体系。
通常所说的细胞骨架主要是指存在于细胞质内的微管、微丝和中间纤维，称为细胞质骨架6后来又发现细胞核内也存在着细胞骨架，主要包括核基质、核纤层和朵色体骨架等，与细胞质骨架共同称为广义的细胞骨架。
微管是由微管蛋白和微管结合蛋白组成的中空圆柱扶结构，在不同类型细胞中有相似结构。
微管是一种动态结构，主要存在于细胞质中，控制着膜性细胞器的定位及胞内物质运输。
微管还能与其o·;1?
他蛋白质共同装配成纤毛、鞭毛、基体、中心体、纺锤体等结构，参与细胞形态的维持、细胞运动和细胞第七章细胞骨架与细胞的运动177分裂等。
微丝是由肌动蛋白组成的细丝，它以束状、网状或散在等多种方式有序地存在于细胞质的特定空间位置上。
微丝是一种动态结构，可与许多种微丝结合蛋白相结合，参与细胞形态维持、细胞的运动、肌肉收缩和细胞质的分裂等活动。
中间纤维是三类细胞骨架纤维中结构最为复杂的一种，可分为六种类型。
中间纤维在细胞内形成一个完整的网状骨架系统，为细胞提供机械强度支持。
中间纤维还与细胞连接以及细胞内信息传递及物质运输、细胞分化有关。
有些细胞靠纤毛、鞭毛进行运动，是由微管1司的相互滑动来实现的。
一些单个细胞的运动，如细胞迁移时伪足的形成就是由微丝完成的。
而在此过程中细胞骨架的重排以及细胞移动的方向受到细胞外信号精密调控，并由微管和微丝来协同完成。
细胞骨架的异常可引起很多疾病，包括肿瘤、一些神经系统疾病和遗传性疾病等。
不同细胞骨架成分在细胞内的特异性分布可用于对一些疑难疾病的诊断，也可根据细胞骨架与疾病的关系来设计药物。
（李丰）
第八章胞核
细胞核是真核细胞内最大、最重要的结构，它使核内物质稳定在一定区域，建立遗传物质稳定的活动环境。
细胞核是遗传信息储存、复制和转录的场所，遗传信息指导细胞内蛋白质合成，从而调控细胞增殖、生长、分化、衰老和死亡，所以细胞核是细胞生命活动的指挥控制中心。
真核细胞中，除哺乳动物的成熟红细胞和高等植物韧皮部的成熟筛管等少数细胞之外，都含有细胞核。
一般来说，细胞失去细胞核后，由于不能执行正常的生理功能，将导致细胞死亡。
细胞核的形态与细胞的形态有一定的关系。
在圆形、卵圆形、多边形的细胞中，细胞核的形态一般为圆球形；在柱形、梭形的细胞中，则A呈椭圆形；在细长的肌细胞中呈杅状；但也有少数细胞的细胞核呈不规则状，如白细胞的细胞核呈马蹄形或多叶形。
在一些异常细胞如肿瘤细胞中，常可见畸形核。
细胞核的大小为细胞总体积的10%左右，但在不同生物及不同生理状态下有所差异，高等动物细胞核的直径一般为5~10µm，高等植物细胞核的直径一般为5~20µm。
常用细胞核与细胞质的体积比，即核质比(nuclear-cytoplasmic raB tio)来表示细胞核的相对大小：核质比＝细胞核的体积细胞体积－细胞核体积核质比大表示核相对较大，核质比小则表示核相对较小。
核仁大多数细胞为单核，但也有双核和染色外核膜膜多核的，如肝细胞、肾小管细胞和软骨细胞有双核，而破骨细胞的核可达几百个。
糙面内质网细胞核通常位于细胞的中央，但也可因细胞中分泌颗粒的形成或包含物的推挤而发生位移。
在含有分泌颗粒的腺细胞图8-1细胞核结构A大鼠胰腺细胞核电镜照片；B间期细胞核结构模式图中，核多偏于细胞的一端。
N：细胞核；NE：核膜细胞核的形态结构在细胞周期中变化很大，分裂间期的细胞核称为间期核，只有在间期才能看到完整的细胞核。
间期核由核膜、染色质、核仁和核基质（核骨架）等构成（图8-1)。
细胞进入分裂期后，核膜裂解、核仁消失、核的各种组分重新分配，因此看不到完整的细胞核。
第八章细胞核179
第一节核膜
核膜(nuclear membrane)又称核被膜(nuclear envelope)，是细胞核与细胞质之间的界膜。
它将细胞分成核与质两大结构与功能区域：DNA复制、RNA转录与加工在核内进行，蛋白质翻译则在细胞质中进行。
—、核膜的化学组成
核膜的主要化学成分是蛋白质和脂类，此外，还有少量核酸成分。
核膜中的蛋白质约占65%～75%，通过电泳分析可鉴别出核膜含有20多种蛋白质，分子盘为16000-160000，包括组蛋白、基因调节蛋白、DNA和RNA聚合酶、RNA酶等。
核膜所含的酶类与内质网极为相似，如内质网的标记酶G6PD也存在于核膜。
与电子传递有关的酶类，如NADH细胞色素c还原酶、NADH细胞色素从还原酶、细胞色素p450等，均见千内质网及核膜上，但其含量有差异，如内质网上细胞色素p450的含量高千核膜。
核膜中所含的脂类也与内质网相似，都含有卵磷脂和磷脂酰乙醇胺，以及胆固醇、甘油三酷等。
但其含榄有差别，核膜所含的不饱和脂肪酸的含量都较低，而胆固醇和甘油三酷的含量却较高。
这种结构成分的相似性和特异性，不仅说明核膜与内质网的密切关系，同时也说明两者也具有各自的结构特点。
二、核膜的结构
在电镜下，核膜是由内外层核膜、核周隙、核孔复合体和核纤层等结构组成（图8-2)。
细胞质基质
细胞核
核孔复合体//>＿＿j
胞质环胞质纤丝
环状亚单位\/外核膜
腔内亚单位核周隙
核纤丝|50nm|
图8-2核膜的结构A核膜的电镜照片；B核膜的结构示意图（主要展示核孔复合体的结构模型）
180第二筒细胞的结构与功能因内、外核膜的组成成分和结构都有差异，因此核膜是一种不对称的双层膜结构。
（一）外核膜与糙面内质网相连续
外核膜(outer nucl ear membrane)为核膜中面向胞质的一层膜，在形态和生化性质上与细胞质中的糙面内质网膜相近，并与糙面内质网相连续。
外核膜外表面有核糖体附着，可进行蛋白质的合成。
外核膜与细胞质相邻的表面可见中间纤维、微管形成的细胞骨架网络，这些结构的存在起着固定细胞核并维持细胞核形态的作用。
（二）内核膜表面光滑包围核质
内核膜(inner nucl ear membrane)与外核膜平行排列，表面光滑，无核糖体附着，核质面附着一层结构致密的纤维蛋白网络，称为核纤层，对核膜起支持作用。
（三）核周隙为内、外核膜之间的缓冲区内、外层核膜在核孔的位置互相融合，两层核膜之间的腔隙称为核周隙(perinuclear space)，宽约20~40nm，这一宽度常随细胞种类不同和细胞的功能状态不同而改变。
核周隙与糙面内质网腔相通，内含有多种蛋白质和酶类。
因内、外核膜在生化性质及功能上呈现较大的差别，因此，核周隙成为内、外核膜之间的缓冲区。
（四）核孔复合体是由多种蛋白质构成的复合结构在内外核膜的融合之处形成环状开口，称为核孔(nuclear pore)。
核孔的数目、疏密程度和分布形式随细胞种类和生理状态不同而有很大的变化，一般来说，动物细胞的核孔数多于植物细胞；代谢不活跃的细胞中核孔数较少，例如晚期有核红细胞与淋巴细胞的核孔数为l~3个／µm2；但在RNA转运速度高，蛋白质合成旺盛的细胞中核孔数目较多，例如在肝、肾等高度分化但代谢活跃的细胞中，核孔数为l2~20个／µm2o核孔并非单纯由内外两层核膜融合形成的简单孔洞，而是由多种蛋白质以特定方式排列形成的复合结构，称为核孔复合体(nuclear pore complex, NPC)（图8-3)（动画8-1"核孔复合体及功能”)。
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人i~~，图8-3核孔要合体结构电镜照片A核孔复合体胞质面的结构；B.核孔复合体核质面的结构（引自：Lodish H, Berk A, Matsudaira P, et al.
Molecular Cell Biology.5th ed.
New York:W.
H. Freeman and company,2003)关于核孔复合体的结构一直是一个令人感兴趣的问题，许多研究者利用树脂包埋超薄切片技术、负染色技术以及冷冻蚀刻技术等方法研究核孔复合体的形态结构，提出了不同的核孔复合体模型。
但由千分离纯化核孔复合体的难度较大，迄今对核孔复合体的描述仍没有完全统一的模型。
目前比较普遍被接受的是捕鱼笼式(fish-trap)核孔复合体模型（图8-2)。
该模型认为核孔复合体的基本结构包括以下四个部分：心胞质环(cytoplasmic ring)：位千核孔复合体结构边缘胞质面一侧的环状结构，与柱状亚单位相连，环上对称分布8条短纤维，并伸向细胞质；＠核质环(nucleoplasmic ring)：位于核孔复合体结构边缘核质面一侧的孔环状结构，与柱状亚单位相连，在环上也对称分布8条长约100nm的纤维伸向核内，纤维末端形成一个由8个颗粒组成的直径约60nm的小环，构成捕鱼笼似的结构，称核篮(nucl ear b asket)；＠辐(spoke)：是由核孔边缘伸向中心的结构，呈辐射状八重对称分布，把胞质环、核质环和中央栓连接在一起。
辐的结构较复杂，可进一步分为三个结构域：柱状亚单位(column subunit)，位于核孔边缘，连接胞质环与核质环，起支撑作用；腔内亚单位(luminal subunit)，位于柱状亚单位外侧，与核膜的核孔区域接触，穿过核膜伸入双层核膜的核周隙，起铀定核孔复合体的作用；环状亚单位(annular subunit)，位于柱状亚单位之内，是靠近核孔复合体中心部分，由颗粒状结构环绕形成；＠中央栓(central plug)：又称中央颗粒(central granule)，位于核孔复合体的中心，是呈颗粒状或棒状的运输蛋白质，其在核质交换中发挥一定的作用。
核孔复合体主要由蛋白质组成，迄今已鉴定的脊椎动物的核孔复合体蛋白质成分已达到十多种，其中gp210和p62是最具代表性的两个成分，它们核纤层分别代表着核孔复合体蛋白的两种类型。
gp210内核膜代表着一类结构性穿膜蛋白，是第一个被鉴定出来染色质的核孔复合体蛋白，位于核膜的＂孔膜区”，在描定核孔复合体的结构上起重要作用。
p62代表一类B功能性的核孔复合体蛋白，对核孔复合体行使主动运输的功能非常重要。
（五）核纤层是紧贴内核膜的纤维蛋白网
核纤层(nuclear lami na)是位于内核膜内侧与染色质之间的一层由高电子密度纤维蛋白质组成的网络片层结构。
在细胞分裂中对核膜的破裂和重建起调节作用。
核纤层的厚蒲随细胞不同而异，lµm一般厚10-20nm，在有些细胞中可达30-100nm图8-4核纤层的分布与超微结构（图8-4)。
A.核纤层分布示意图；B核纤层的超微结构核纤层的主要化学成分是核纤层蛋白(larrrin)。
在哺乳类细胞中，核纤层是由3种属于中间纤维性质的多肤组成，分别称为核纤层蛋白A、B、C。
通过克隆并分析编码核纤层蛋白的mRNA，从序列分析中推论核纤层蛋白具有中间纤维蛋白的a－螺旋区同源的氨基酸顺序。
Lamin A和Lamin C是由同一基因编码的不同的加工产物。
两种蛋白质之间仅在—COOH末端不同，它们都有一段由350个氨基酸残基组成的多肤序列，该序列与中间纤维蛋白的a－螺旋区约有28％的氨基酸相同。
而核纤层蛋白与波形蛋白之间在同源区域则有70％的氨基酸相同，其同源性高千不同的中间纤维蛋白之间的同源程度。
因此，核纤层蛋白实际上是一种中间纤维蛋白。
核纤层与核膜、核孔复合体及染色质在结构和功能上有密切的联系（图8-5)。
1核纤层在细胞核中起支架作用用高盐溶液、非离子去污剂和核酸酶去除大部分核物质，只有核孔复合体与核纤层存留，但仍能维持核的轮廓。
此外，核纤层与核骨架及穿过核膜的中间纤维相连，使胞质骨架和核骨架形成一连续网络结构。
2核纤层与核膜的崩解和重建密切相关真核细胞在细胞分裂过程中核膜经历崩解与重建的变化，内核膜下的核纤层也经历解聚与聚合的变化。
生化分析表明，Lamin A、Lamin B和Lamin C均有亲膜结合作用，其中以Lam i n B与核膜的结合力最强。
同时，在内核膜上有Lami n B受体，可为Lamin B提供结合位点，从而把核膜固定在核纤层上。
细胞分裂前期，核纤层蛋白磷酸化，核纤层可逆性去组装，发生解聚，使核膜破裂。
此过程中Lamin A与Lamin C分散到细胞质中，Lamin B因与核膜结合力强，解聚后即与核膜小泡结合，这些小泡在细胞分裂末期是核膜重建的基础。
细胞分裂末期，核纤层蛋白发生去磷酸化，核纤层蛋白又重新在细胞核的周围聚集，核膜再次形成。
说明核纤层蛋白的磷酸化与去磷酸化在细胞的有丝分裂过程中与核膜的崩解与重建密切相关。
3.核纤层与染色质凝集成染色体相关核纤层蛋白可与染色质上的一些特殊位点相结合，为染色质提供了结构支架。
细胞分裂间期，染色质与核纤层紧密结合，因此不能螺旋化成染色体；而在细胞有丝分裂前期，随着核纤层蛋白的解聚，染色质与核纤层蛋白的结合丧失，染色质逐渐凝集成染色体。
把La min A抗体注入分裂期细胞，抑制核纤层蛋白的重新聚合时，会阻断分裂末期染色体解旋成染色质，使染色体停留在凝集状态。
说明核纤层对细胞分裂结束后染色质、细胞核的形成非常重要。
核纤层与染色质的相互作用有助千维待和稳定间期染色质高度有序的结构，而高度有序的染色质结构对于基因表达的调控非常重要。
4.核纤层参与DNA的复制利用爪赡卵母细胞核重建体系的研究发现，重建的没有核纤层的细胞核，虽然细胞核里具有DNA复制过程所需要的蛋白质和酶，但却不能进行DNA的复制，这表明只有染色质而无完整的核膜是不能复制DNA的，提示核纤层参与了DNA的复制。
三、核膜的功能
核膜作为细胞核与细胞质的界膜，在稳定核的形态和成分，控制核质之间的物质交换，参与生物大分子的合成及细胞分裂等方面起着十分重要的作用。
（一）核膜为基因表达提供了时空隔离屏障原核细胞因缺乏核膜，遗传物质DNA分子是分布千细胞质中的，RNA转录及蛋白质合成也均发生于细胞质，在RNA3'端转录尚未结束时，其5'端即已被核糖体结合，并开始进行蛋白质的合成，致使RNA转录本在进行翻译以前，因时间及空间的缺乏，不能有效地被剪切、修饰。
真核细胞中，核膜将核物质与细胞质物质限定在各自特定的区域，使DNA复制、RNA转录及蛋白质合成在时空上相互分隔进行，建立了遗传物质稳定的活动环境。
真核生物的基因结构复杂，转录后需要经过复杂的加工，所以核膜的出现保证了RNA转录后先进行加工、修饰，才能输入细胞质中，进而指导和参与蛋白质的合成，使遗传信息的表达悯控过程更加精确、高效（图8-6)。
（二）核膜参与蛋臼质的合成外核膜的表面附着核糖体，可进行蛋白质的合成。
通过免疫电镜技术证实，抗体的形成首先出现在核膜的外层。
外膜的附着核糖体也能合成少狱膜蛋白。
（三）核孔复合体控制着核－质间的物质交换核孔复合体作为被动扩散的亲水通道，其有效直径为9~10nm，有的可达12.5nm。
实验表明，水分子和某些离子，以及一些小分子，如单糖、双糖、氨基酸、核背和核昔酸等，可以自由扩散，穿梭于核质之间。
但对千绝大多数大分子物质的核－质分配则需要经核孔复合体进行主动运输。
主动运输具'O有高度选择性，其选择性表现在三个方面：心核孔复合体的直径大小是可调节的，主动运输的功能直径比被动运输大，为10~2Onm，可调节达26nm;(2)核孔复合体的主动运输是信号识别与载体介导的过程，需消耗能量；＠核孔复合体的主动运输具有双向性，兼有核输入和核输出i(a)转录它既能把DNA复制、RNA转录所需的各种酶及组两种功能。
蛋白、核糖体蛋白和核质蛋白等，经核孔复合体运进细胞核；同时又能把细胞核内装配好的核糖体大小亚基和经转录加工后的RNA通过核孔复合体运到细胞质。
1亲核蛋白的核输入在细胞质中游离核糖体上合成、气；、＄了丐令mRNA
经核孔转运入细胞核发挥作用的蛋白质称为亲核蛋白(karyoph山cprotein)，常见的如核糖体蛋白、组蛋白、DNA聚合酶、
(c)翻译j RNA聚合酶等。
核质蛋白(nucleoplasmin)是一种亲核蛋白，可同组蛋白(d)翻译后加y翁汪碌H2A、H2B结合，协助核小体的装配。
核质蛋白由5个单体组成，分子量为165000，具有头尾两个不同的结构域。
用蛋白＠蛋白质水解酶可把核质蛋白切成头、尾两部分，用放射性核素标记后把带有放射性标记的完整核质蛋白，以及它的头、尾片段分别注射到爪赡卵母细胞的细胞质中，结果发现，完整的核质图8-6核膜的区域化作用蛋白和其尾部片段均可以在核内出现，而头部却仍停留在细胞质中。
用尾部包裹直径为20nm的胶体金颗粒，然后注射到细胞质中，虽然它们的直径已大大超过核孔复合体的有效直径，但电镜下却可看到胶体金颗粒通过核孔进入核内。
在运输过程中核孔复合体的直径从9nm可扩大到26nm，说明核孔复合体中央亲水性通道的大小是可调节的，蛋白质的核输入具有选择性（图8-7)。
胶体金
尾＼、上z”t t·I
头一只仑l一1、-乙
放射性物质放射性物质放射性物质尾部包裹的标记的核质蛋白标记的头部标记的尾部胶体金颗粒..
进入胞核滞留胞质进入胞核
通过核孔进入胞核
184第二篇细胞的结构与功能
通过对亲核蛋白的序列分析，发现这些亲核蛋白一般都有一段特殊的氨基酸信号序列，正是这些信号序列起到｀定向”和“定位”的作用，从而保证蛋白质通过核孔复合体向核内输入，因此，将这一特殊的信号序列命名为核定位序列(nuclear localization sequence, NLS)或核定位信号(nuclear localization signal, NLS)。
具有NLS的蛋白质才能进入核内。
通过大拔的研究发现NLS是含4~8个氨基酸的短肤序列。
不同的亲核蛋白上的NLS不同，但都富含带正电荷的赖氨酸和精氨酸，通常还有脯氨酸。
这些信号序列与指导蛋白质穿膜运输的信号肤不同，NLS可以位千亲核蛋白的任何部位，并且在指导亲核蛋白完成核输入以后不被切除。
这个特点有利于细胞分裂完成后，亲核蛋白在子细胞中能够重新输入细胞核。
通过大屈研究表明，仅有NLS的蛋白质自身不能通过核孔复合体，它必须通过和NLS受体结合才可通过核孔复合体，这种受体称为输入蛋白(importin)。
推测这些输入蛋白在被转运的亲核蛋白与核孔复合体运输装置之间作为一种衔接体蛋白(adaptor prote in)而起作用，将在细胞质中结合的蛋白质经核孔复合体转运到核内。
目前比较确定的输入蛋白受体有核输入受体m核输入受体B和Ra n（一种GTP结合蛋白）等。
在它们的参与下，亲核蛋白的入核转运可分为以下几个步骤（图8-8):CD亲核蛋白通过NLS识别核输人受体a，与核输入受体可B异二聚体结合，形成转运复合物；＠在核输入受体B的介导下，转运复合物与核孔复合体的胞质纤维结合；＠转运复合物在核孔复合体中移动，从胞质面转移到核质面；＠转运复合物在核质面与Ran-GTP结合，导致复合物解离，亲核蛋白释放；＠受体的亚基与结合的Ran GTP返回细胞质，在胞质内Ran-GTP水解形成Ran-GDP并与核输入受体B解离，Ran-GDP返回核内，再转换成Ran-GTP状态。
核基质}-、
核输人受体P
核输入受体r:r
含核定位严勹蛋白。
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…．．一经典实验：核定位信号的发现－－－－－一------－--..-…-·…--------·-·------、、·:月早知识:细胞核作力一个独特的生化区域，需要一种蛋白分配机制来确保核－质间蛋白质的正确分:布，借以维持细胞核的生化特性。
20世纪70年代的研究表明小分子物质可以通过扩散方式迅速通过核膜，而大多数蛋白质则不能。
这提示进入核内的蛋白质很可能被特异性识别，并被选择性地从胞质中转运入核。
早前Gunter Blobel等已发现了由一小段氨基酸组成的信号序列可引导蛋白质定位于内质网。
那么，核内的蛋白质是否存在类似的信号序列来引导其入核转运呢？
1984年，A.
Sm心及其同事对这一问题进行了深入探讨，发现了核定位信号的存在。
实验内容他们选用猴肾病毒(SV40)的T抗原作为研究动物细胞核定位的蛋白模型。
T抗原常分布于被SV40感染的宿主细胞核内。
研究发现在嗤齿类动物及猴子的细胞内，T抗原的Lys-128。
第八章细胞核185
无论是突变为Thr还是Asn，均可阻止T抗原在核内聚集，表明Lys-128应是核定位信号的一部分。
：Smith及其同事用两种方法验证了这一假说。
:首先探讨了去除T抗原的不同区域对其在亚细胞层次上定位的影响。
发现去除T抗原的笫：,1~l26位氨基酸或笫l36~C末端的氨基酸后，它依旧聚集于细胞核；相反，去除笫127-132位氨基酸后，T抗原则滞留于胞质中。
因此，l27~l32位氨基酸序列是T抗原核定位所必需的。
此外，将T抗原的笫l27~132位氨基酸序列与胞质蛋白半乳糖符酶融合或丙酮酸酷酶融合，：均可引起这些胞质蛋白在核内聚集。
因此，T抗原的该段氨基酸序列即是引导蛋白核定位的必要；条件。
:Kalderon D, Robe1is BL, Richardson WD, et al.
A sh01i amino acid sequence able to specify nuclear!location.
Cell,1984,39:499-509.
后续影响
SV40T抗原的核定位信号为其他亲核蛋白相似序列的研究提供了基础。
该信号可引导蛋白！
质的入核转运，确保了细胞核特有的生化特征，使细胞核与细胞质之间从根本上实现了区域化分，隔。
此外，核定位信号的发现对亲核蛋白的入核转运机制的研究亦起着至关重要的作用。
2. RNA及核糖体亚基的核输出核孔复合体除了把亲核蛋白输入核内以外，还要把新形成的核糖体大、小亚基、mRNA和tRNA等输出到细胞质。
用小分子RNA(tRNA或5S rRNA)包裹着直径为20nm的胶体金颗粒，然后注入到蛙的卵母细胞核中，发现它们可以迅速地从细胞核进入细胞质中；如果将它们注入到蛙的卵母细胞质中，则它们会停留在细胞质内。
由此看来，核孔复合体除了有亲核蛋白输入信号的受体外，还有识别RNA分子的受体，这些受体称输出蛋白(export in)。
当核孔复合体存在这些受体时，就能向细胞质中转运RNA或与RNA结合的蛋白质。
真核细胞中的RNA一般要经过转录后加工，修饰为成熟的RNA分子后才能被转运出核。
将包裹了RNA的胶体金颗粒及包裹了入核信号肤的胶体金颗粒分别注射到细胞核及细胞质中，通过观察同一个核孔复合体可发现上述物质的双向运输，即包裹了RNA的胶体金颗粒向细胞质转运；而包裹了入核信号肤的胶体金颗粒则向细胞核转运。
由此证实，核孔复合体对大分子和颗粒物质的运输是双向性的，即将某些物质由细胞质转运入细胞核的同时，也对另一些物质由细胞核向细胞质进行运输。
第二节染色质与染色体
染色质(chromatin)是间期细胞核中由DNA和组蛋白构成的能被碱性染料着色的物质，是遗传信息的载体。
在细胞分裂间期，染色质成细丝状，形态不规则，弥散在细胞核内；当细胞进入分裂期时，染色质高度螺旋、折叠而缩短变租，最终凝集形成条状的染色体(chromosome)，以保证遗传物质DNA能够被准确地分配到两个子代细胞中。
因此，染色质和染色体是细胞核内同一物质在细胞周期不同时相的不同表现形态。
—、染色质的组成成分
染色质和染色体的组成成分主要是DNA和组蛋白，此外还含有非组蛋白及少呈的RNA。
DNA和组蛋白是染色质的稳定成分，两者的比率接近1:1。
非组蛋白的含量变动较大，常随着细胞生理状态的不同而改变。
(-)DNA是遗传信息的载体
DNA分子是由数目巨大的腺嗦呤(A)、鸟嗦呤(G)、胞啥唗(C)和胸腺啥唗(T)四种脱氧核糖核。
186第二篇细胞的结构与功能
昔酸通过3',5'－磷酸二酣键聚合而成的生物大分子。
DNA分子呈双螺旋结构，其两条链的核甘酸序列按碱基互补配对原则排列，即A对T,G对C。
真核细胞中每条未复制的染色体均含有一条线型DNA分子。
一个真核细胞单倍染色体组中所含的全部遗传信息称为一个基因组(genome)。
DNA的主要功能是携带和传递遗传信息，并通过转录形成的RNA来指导蛋白质合成。
真核细胞中染色质DNA序列根据其在基因组中分子组成的差异分为单一序列和重复序列两大类型重复序列又分为中度重复序列和高度重复序列。
单一序列(unique sequence)，又称单拷贝序列(sing le-copy sequence)，在基因组中一般只有单一拷贝或少数几个拷贝。
一般为具有编码功能的基因。
真核生物大多数编码蛋白质（酶）的结构基因属这种形式。
中度重复序列(mod erately repetitive sequen ce)，其重复次数在101-105之间，序列长度由几百到几千个碱基对(bp)不等。
中度重复序列多数是不编码蛋白的序列，构成基因内和基因间的间隔序列，在基因调控中起重要作用，涉及DNA复制、RNA转录及转录后加工等方面。
在中度重复序列中，有一些是有编码功能的基因，如rRNA基因，tRNA基因，组蛋白的基因、核糖体蛋白的基因等。
高度重复序列(high ly repetitive seque nce)，其长度较短，一般为几个至几十个bp，但重复拷贝数超过105，分布在染色体的端粒、着丝粒区。
它们有些散在分布，另一些则串联重复，均不能转录，主要是构成结构基因的间隔，维系染色体结构，还可能与减数分裂中同源染色体联会有关。
一条功能性的染色质DNA分子必须能进行自我复制，得到两个完全相同的DNA分子，并将其平均分配到子细胞中，保证遗传信息的稳定传递。
要达到这个目的，染色质DNA必须包含三类不同的功能序列（图8-9)：复制源序列、着丝粒序列及端粒序列。
心复制源序列(replicat i on origin sequence):它是DNA进行复制的起始点。
对千真核细胞来说，多个复制源序列可被成串激活，该序列处的DNA双链解旋并打开，形成复制叉。
因此，一条DNA分子上可同时在多个复制源序列处形成多个复制叉，使得DNA分子可在不同部位同时进行复制。
根据不同来源的复制源序列分析，发现所有的复制源序列DNA均有一段11-14bp的同源性很高的富含AT的保守序列：200bp-A(T)TITAT(C)A(G)TITA(T)-200bp，同时证明这段序列及其上下游各200bp左右的区域是维持复制源功能所必需的。
＠着丝粒序列(centromere seq uence)：着丝粒序列是真核生物在细胞分裂时，两个姐妹染色单体连接的区域，根据不同来源的着丝粒序列分析，发现其共同特点是两个彼此相邻的核心区，一个是80-90bp的AT区，另一个是含有11个高度保守的碱基序列：－TGArm、CCGAA-，功能是形成着丝粒，在细胞分裂时，两个姐妹染色单体从着丝粒分离，保证均等分配两个子代染色单体。
通过着丝粒序列缺失损伤实验或着丝粒序列一门「l\))飞11~11)。
第八童细胞核187
插入突变实验，发现一旦伤及这两个核心区，着丝粒序列即丧失其功能。
＠端粒序列(telomere sequ e n ce)：它存在于真核生物染色体的末端，在序列组成上十分相似，为一在进化中高度保守的串联重复序列。
双链中一条3'端为富含TG序列，互补链富含CA的序列。
端粒序列在维持DNA分子两末端复制的完整性与染色体的稳定性方面发挥重要作用。
采用分子克隆技术把真核细胞染色体的复制源序列、着丝粒序列、端粒序列分别克隆，并把它们相互拼接在一起构造成人工染色体，用于科学研究。
（二）组蛋白是真核细胞染色质中的基本结构蛋白组蛋白(histon e)是真核细胞染色质的基本结构蛋白质。
组蛋白富含带正电荷的精氨酸和赖氨酸等碱性氨基酸，等电点一般在p H10.0以上，属碱性蛋白质。
用聚丙烯酰胺凝胶电泳可将组蛋白分离成5种，即H l,H2A、H2B、H3、H4（表8-1)。
5种组蛋白在染色质的分布与功能上存在差异，可分为核小体组蛋白和连接组蛋白。
种类赖氨酸／精氨酸残基数分子量存在部位及结构作用HI29021523000存在千连接线上，锁定核小体及参与高一层次的包装H2A l.2212914500存在于核心颗粒，形成核小体H2B2.6612513774存在千核心颗粒，形成核小体1-130.7713515324存在于核心颗粒，形成核小体H40.7910211822存在于核心颗粒，形成核小体核小体组蛋白(nucleosomal his tone)包括H2A、H2B、H3、H4四种，分子量较小，这类组蛋白之间有相互作用形成聚合体的趋势，从而可将DNA卷曲形成核小体。
核小体的组蛋白在进化上高度保守，无种屈及组织特异性，其中H3和H4是已知蛋白质中最为保守的，不同种属间这两种蛋白的一级结构高度相似，例如牛和豌豆的H4组蛋白的102个拭基酸残基中仅有2个不同，海星与小牛胸腺的H4组蛋白仅有一个氨基酸不同，这一特点表明H3和H4的功能几乎涉及它们所有的氨基酸，以致其分子中任何氨基酸的改变都将对细胞产生影响（动画8-2“核小体的形成过程”)。
HI组蛋白由215个氨基酸残基组成，分子伍较大，为连接组蛋白。
H1组蛋白在构成核小体时起连接作用，与染色质的高级结构的构建有关。
Hl组蛋白在进化中不如核小体组蛋白那么保守，有一定的种屈特异性和组织特异性。
在哺乳类细胞中，HI约有六种密切相关的亚型，氨基酸顺序稍有不同。
在成熟的鱼类和鸟类的红细胞中，H I被H5取代。
组蛋白在细胞周期的S期与DNA同时合成。
组蛋白在胞质中合成后即转移到核内，与DNA结合，装配形成核小体。
组蛋白带正电荷与DNA结合可抑制DNA的复制与RNA转录。
但一些组蛋白的修饰可影响染色质的活性，这些修饰包括乙酰化、磷酸化和甲基化。
当组蛋白某些氨基酸乙酰化或磷酸化后，则可改变组蛋白的电荷性质，降低组蛋白与DNA的结合，使DNA解旋从而有利于复制和转录的进行。
而甲基化则可增强组蛋白与DNA的相互作用，降低DNA的转录活性。
（三）非组蛋白能从多方面影响染色质的结构和功能非组蛋白(non扣stone)是指细胞核中除组蛋白以外所有蛋白质的总称，为一类带负电荷的酸性蛋白质，富含天门冬氨酸、谷氨酸等。
非组蛋白数屈远少于组蛋白，但其种类多且功能多样，用双向疑胶电泳可得到500多种不同组分，分子队一殷在15000-100000之间。
包括染色体骨架蛋白、i周节蛋白及参与核酸代谢和染色质化学修饰的相关酶类。
非组蛋白有种属和组织特异性，在整个细胞周期都能合成，其含扯常随细胞的类型及生理病理状态不同而变化，一般功能活跃细胞的染色质中非组蛋白的含址高于不活跃细胞中的染色质。
非组蛋白的组分中含有启动蛋白、DNA聚合酶、引物酶等，它们以复合物形式结合在某段DNA分子上，启动和推进DNA分子的复制。
有些非组蛋白是转录活动的调控因子，与基因的选择性表达有关。
非组蛋白作用于一段特异DNA序列上，能特异地解除组蛋白对DNA的抑制作用，以调控有关基因的转录。
在染色质结构的＂拌环“模型中，组蛋白把DNA双链分子装配成核小体串珠结构，非组蛋白则帮助DNA分子进一步盘曲折叠，DNA拌环停泊在非组蛋白组成的支架上，构建成染色质的高级结构。
二、常染色质与异染色质
根据间期核中染色质螺旋化程度以及功能状态的不同，可分为常染色质(euchromati n)和异染色质(heterochromalin)。
(—)常染色质是处于功能活跃呈伸展状态的染色质纤维常染色质是指间期核中处于伸展状态，螺旋化程度低，用碱性染料染色浅而均匀的染色质。
常染色质大部分位千间期核的中央，一部分介于异染色质之间。
在核仁相随染色质中也有一部分常染色质，往往以拌环的形式伸入核仁内。
在细胞分裂期，常染色质位于染色体的臂。
构成常染色质的DNA主要是单－DNA序列和中度重复DNA序列（如组蛋白基因和核糖体蛋白基因），常染色质具有转录活性，是正常情况下经常处于功能活性状态的染色质，但并非常染色质的所有基因都具有转录活性，处于常染色质状态只是基因转录的必要条件。
（二）异染色质是处千功能惰性呈凝缩状态的染色质纤维异染色质是指间期核中，螺旋化程度高，处千凝缩状态，用碱性染料染色时着色较深的染色质，一般位于核的边缘或围绕在核仁的周围，是转录不活跃或者无转录活性的染色质。
异染色质可分为组成性异染色质(constitutive beterochromalin)和兼性异染色质(facu l tative heterochromatin)两类。
组成性异染色质又称“恒定性异染色质”，是异染色质的主要类型。
在各种类型细胞的细胞周期中（除复制期外）都呈凝缩状态，是由高度重复的DNA序列构成，在分裂中期染色体上常位千染色体的着丝粒区、端粒区、次缢痕等部位；具有显著的遗传惰性，不转录也不编码蛋白质；在复制行为上，较常染色质早聚缩晚复制。
将培养的细胞进行同步化处理，在S期掺入3H胸腺啼唗的实验证明，组成性异染色质多在S期的晚期复制，而常染色质多在S期的早、中期复制。
兼性异染色质是指在生物体的某些细胞类型或一定发育阶段，处于凝缩失活状态，而在其他时期松展为常染色质。
兼性异染色质的总量随不同细胞类型而变化，一殷胚胎细胞含量少，而高度分化的细胞含量较多，这就说明随着细胞分化，较多的基因渐次以聚缩状态关闭。
因此，染色质的聚缩可能是关闭基因活性的一种途径。
例如，人类女性卯母细胞和胚胎发育早期，两条X染色体均为常染色质；至胚胎发育的第l6~18天，体细胞将随机保持一条X染色体有转录活性，呈常染色质状态；而另一条X染色体则失去转录活性，成为异染色质。
在间期核中失活的X染色体呈异固缩状态，形成直径约lµm的浓染小体，紧贴核膜内缘，称为X染色质或X小体。
X染色质检查可用于性别和性染色质异常鉴定。
三、染色质组装形成染色体
20世纪70年代以前，染色质一直被认为是由组蛋白包衷在DNA外，形成类似＂铅笔”状的结构。
1974年经R.
D. Kornberg等入对染色质进行酶切降韶研究及电镜观察后，人们对于染色质的结构才有了进一步的认识。
现已知道，染色质的基本结构单位为核小体，核小体在串联的基础上，发生进一步折叠、压缩形成高级结构，最终组装成染色体。
（一）核小体为染色质的基本结构单位
组成染色质的基本结构单位是核小体(nucleosome)。
每个核小体包括有200个左右hp的DNA、8个组蛋白分子组成的八聚体及一分子组蛋白H1。
八聚体是由四种组蛋白H2人H2B、H3和H4各两个分子组成，两个H3、H4二聚体相互结合形成四聚体，位于核心颗粒中央，两个H2A、H2B二聚体分别位千四聚体两侧。
］46bp的DNA分子在八聚体上缠绕l75圈，形成核小体的核心颗粒。
在两个相。
第八章细胞核189
邻的核小体之间以连接DNA(l i nker DNA)分子相连，典型长度约60bp，其长度变异较大，随细胞类型不同而不同，其七结合一个组蛋白分子Hl，组蛋白Hl锁定核小体DNA的进出端，起稳定核小体的作用。
多个核小体形成一条念珠状的纤维，直径约为10nm（图8－lO)。
连接DNA
核小体
组蛋白与DNA之间的互相作用主要是结构性的，基本不依赖核甘酸的特异序列。
实验表明，核小体具有自装配的性质。
（二）核小体进—步螺旋形成螺线管
由直径10nm的核小体串珠结构进行螺旋盘绕，每6个核小体螺旋一周，形成外径30nm，内径10nm的中空螺线管(solenoid)，组蛋白Hl位于螺线管内部，是螺线管形成和稳定的关键因素。
螺线管为染色质的二级结构（图8-11)。
在电镜下观察发现，大多数染色质以30nm染色质纤维形式存在。
蛋组
Hl组蛋白
核`',小体
（三）螺线管进—步包装成染色体
关于DNA如何组装成染色体，在一级及二级结构上已有直接实验证据，并被大多数科学家认可。
但从30nm的螺线管如何进一步组装成染色体的过程尚存在争议，目前主要有多级螺旋模型(muhi ple coiling mod e l)及骨架－放射环结构模型(secufold-radial loop structure mod e l)得到较为广泛的接受。
1染色体多级螺旋模型在该榄型中，由螺线管进一步螺旋盘绕，形成直径为400nm的圆筒状结构，称为超螺线管(supersolen o id)，这是染色质组装的三级结构。
超螺线管再进一步螺旋、折叠形成染色质的四级结构——染色单体。
根据多级螺旋模型，当DNA分子缠绕在直径10nm的核小体核心颗粒上时，长度被压缩7倍；直径10nm的核小体形成螺线管后，DNA分子长度又被压缩6倍；而当螺线管盘绕形成超螺线管时，DNA分子长度被压缩约为40倍；超螺线管再度折叠、缠绕形成染色单体后，DNA分子长度又将被压缩5倍。
因此，在染色质的组装过程中，DNA分子在经过核小体、螺线管、超螺线管到染色单体四级连续螺旋、折叠后，其长度共压缩了8400倍（图8-12)。
2染色体骨架——放射环结构模型该模型认为螺线管以后的高级结构，是由30nm螺线管纤维折叠成的拌环构成的，螺线管一端与由非组蛋白构成的染色体支架某一点结合，另一端向周围呈环状迂回后又返回到与其相图8-12染色质组装的多级螺旋模型邻近的点，形成一个个拌环围绕在支架的周围。
每个DNA拌环长度约2lµm，包含315个核小体。
每18个拌环呈放射状平面排列，结合在核骨架上形成微带(miniband)，再由微带沿纵轴纵向排列构建成为染色单体（图8-13)。
放射环模型最早是由U.
K. Laemmli等(1977)根据大量的实验结果提出的。
他们用2moVL的NaCl溶液加肝素处理HeLa细胞中期染色体，以去除组蛋白及大部分非组蛋白。
电镜下观察染色体铺展标本，看到由非组蛋白构成的染色体骨架，两条染色单体的骨架相连于着丝粒区。
由骨架的一点伸展出许多直径30nm的染色质纤维构成的侧环。
若用EDTA处理染色体标本后，则可见30nm的纤维解螺旋，形成10nm的纤维。
此外，实验观察发现，两栖类卯母细胞的灯刷染色体和昆虫的多线染色体，都含有一系列的拌环结构域(l oop domain)，提示拌环结构可能是染色体高级结构的普遍特征。
放射环模型较好地解释了电镜下观察到的10nm及30nm纤维产生的结构形态，同时也说明了染色质中DNA-宁非组蛋白的作用。
而且，祥环结构可能是保证DNA分子多点复制特性的高效性和准确性的结构基础；也是TDNA分子中基因活动的区域性和相对独立性的结构基核小体-l, r一、上l,-11广础（动画8-3“核小体浓缩成染色体的过程”)。
四、染色体的形态结构T
螺线管30nm
在细胞有丝分裂中期，因染色质高度凝集成染色上体，此时染色体形态、结构特征明显，可作为染色体一尸T般形态和结构的标准，常用于染色体研究及染色体病的诊断检查。
伸展的拌环＼/I/\／八＼fn vJI^300nm(—)着丝粒将两条姐妹染色单体相连每一中期染色体都是由两条相同的染色单体构成，两条单体之间在着丝粒部位相连。
彼此互称为姐浓缩的拌环宫55％运＇涿·,·709nm妹染色单体(s ister chromatid)。
在中期染色体的两姐妹染色单体连接处，存在一~o~个向内凹陷的、浅染的缢痕，称主缢痕(primary constriction)或初级缢痕。
着丝粒(centromere)位于主缢痕内染色体:==c14fnm两条姐妹染色单体相连处的中心部位。
该结构由高度重复DNA序列的异染色质组成，并将染色单体分为两图8-13染色质组装的放射环模型。
第八章胞核
个臂。
着丝粒可作为一个重要标志在染色体鉴别中起作用，中期染色体可根据着丝粒的位置，分为4种类型（图8-14)。
细姐妹染色单体
短劈
眷丝粒
长停
中若丝粒近中着丝粒近端籽丝粒
染色体染色体染色体~
中着丝粒染色体(metacentric chromosome)：着丝粒位于或靠近染色体中央，如将染色体全长分为8等份，则着丝粒位于染色体纵（长）轴的1/2~5/8之间，将染色体分成大致相等的两臂。
亚中着丝粒染色体(subme tacentric chromosome)：着丝粒位于染色体纵轴的5/8~7/8之间，将染色体分成长短不等的短臂(p)和长臂(q)。
近端着丝粒染色体(acrocentric chromosome)：着丝粒靠近染色体的一端，位于染色体纵轴的7/8~近末端之间，短臂很短。
端着丝粒染色体(telocentric chromosome)：着丝粒位于染色体的一端，形成的染色体只有一个臂。
在人类正常染色体中没有这种端着丝粒染色体，但在肿瘤细胞中可以见到。
（二）着丝粒－动粒复合体介导纺锤丝与染色体的结合动粒(k inetochore)是由多种蛋白质组成的存在于着丝粒两侧的圆盘状结构。
每一中期染色体含有两个动粒，是细胞分裂时纺锤丝微管附着的部位，与细胞分裂过程中染色体的运动密切相关。
在细胞分裂后期，微管牵引着两条染色单体向细胞两极移动，动粒起着核心作用，控制着微管的装配和染色体的移动。
着丝粒－动粒复合体(centromere-kinetochore complex)是由着丝粒与动粒共同组成的一种复合结构，两者的结构成分相互穿插，在功能上紧密联系，共同介导纺锤丝与染色体的结合。
它包括三种结构域：动粒域(ki n e tochore domain)、中心域(ce ntral domain)及位于中心域内表面的配对域(pairin g domain)（图8-15)。
动粒域位千着丝粒的外表面，包括外、中、/,, l I内三层式板状结构的动粒和围绕在动粒外层的60nm；内层电子密度高，厚约15~40nm，与着丝｝纤I l lI粒中心域相联系。
在没有动粒微管存在时，外\\I I l I lI层表面还可见覆盖着一层由动力蛋白构成的纤I I I ll维冠(fibrous corona)，是支配染色体运动和分离I(________I I的重要结构。
动粒域主要含有与动粒结构、功图8-15着丝粒动粒复合体结构示意图能相关的蛋白质，常为进化上高度保守的着丝粒蛋白(centromere protein, CENP)以及一些与染色体运动相关的微管蛋白、钙调蛋白(CaM)、动力蛋白等。
中心域位于动粒域的内侧，是着丝粒区的主体，由富含重复DNA序列的异染色质组成，能抗低渗膨胀和核酸酶消化。
对着丝粒－动粒复合体结构的形成和正常功能活性的维待有重要作用。
配对域在中心域内表面，是有丝分裂中期姐妹染色单体相互作用的位点。
该结构域分布有两类重要蛋白，即内着丝粒蛋白(in ner cen tromere prote in, INCENP)及染色单体连接蛋白(c hromati d lin king proteins, CLIPs)。
在细胞分裂期，这些蛋白与姐妹染色单体的配对、分离有密切关系，伴随着染色单体之间分离的发生，INCENP可迁移到纺锤体赤道区域，而CLIPs则会逐渐消失。
着丝粒动粒复合体的三种结构域在组成及功能上虽有区别，但当细胞进入有丝分裂时，它们彼此间需要相互配合、共同作用，才能确保有丝分裂过程中染色体与纺锤体的整合，为染色体的有序配对及分离提供了结构基础。
（三）次缢痕并非存在所有染色体上有些染色体的长、短臂上可见凹陷缩窄区，称为次缢痕(secondary constriction)，次缢痕为染色体上除主缢痕外的浅染缢缩部位，为某些染色体所特有的形态特征。
次缢痕在染色体上的数目、位置及大小通常较恒定，可作为染色体鉴定的一种常用标记。
（四）随体是位千染色体末端的球状结构人类近端着丝粒染色体短臂的末端，可见球状结构，称为随体(satelli te)。
随体通过柄部凹陷缩他染色体的末端融合，保持染色体的结构完整；＠在细胞的寿命、衰老和死亡以及肿瘤的发生和治疗中起作用。
在正常情况下，染色体末端彼此之间不发生融合，但当染色体发生断裂而端粒丢失后，染色体的断端可以彼此粘连相接，形成异常染色体（动画8-4“端粒及端粒酶＂）。
五、核型与带型
核型(karyotype)是指一个体细胞中的全部染色体，按其大小、形态特征顺序排列所构成的图像。
将待测细胞的核型进行染色体数目、形态特征的分析，称为核型分析(kai"yo ty pe a nalysi s)。
根据染色体的长度和着丝粒的位置，将人类体细胞的46条染色体进行配对，顺序排列编号，其中22对为男女所共有，称为常染色体(au tosomal chromosome)，编为1~22号，并分为A、B、C,D、E、F,G7个组，A组最大，G组最小（表8-2)。
另一对随男女性别而异，称为性染色体(sex chromosome)。
女性为XX染色体，男性为XY染色体。
X染色体较大，为亚中着丝粒染色体，列入C组；Y染色体较小，为近端着丝粒染色体，列入G组。
第八章细胞核193
组号染色体号大小着丝粒位置次缢痕随体组内鉴别程度A l~3最大中(I号、3号）1号常见无可鉴别亚中(2号）
B4~5次大亚中无难鉴别
C6~l2;X中等亚中9号常见无难鉴别(X大小位于7至8号之间）
D13~15中等近端有难鉴别
E16~18小中(16号）16号常见无可鉴别
亚中(17号、18号）
F19~20次小中无难鉴别
G2l~22;Y最小近端(21号、22号）有难鉴别(21号、22号）
(Y)无可鉴别(Y两长臂平行靠拢）
按照国际标准，核型的描述包括两部分内容，第一部分是染色体总数（包括性染色体），第二部分是性染色体组成，两者之间用逗号隔开。
正常女性核型描述为46,XX。
正常男性核型描述为46,XY。
通常采用常规染色和显带染色技术来辨别染色体。
常规染色方法所得到的染色体标本，除着丝粒和次缢痕外，整条染色体着色均匀，因此在核型分析中，除A组和E组外，组内各号染色体均难以准确鉴别。
显带染色则能精确识别每一条染色体。
显带技术将染色体标本经过一定程序处理，并用特定染料染色，使染色体沿其长轴显现出明暗或深浅相间、宽窄不等的横行带纹，构成了每条染色体的带型。
每对同源染色体的带型基本相同且相对稳定，不同对染色体的带型不同，因此通过显带染色体核型分析，除可准确地识别每条染色体外，还能检测各条染色体的微小变化，如缺失、易位等，这大大提高了核型分析的精确度。
_目前常用的染色体显带方法有G带法、Q带法、R带法及高分辨图8-17人类1号染色体显带等方法，这些方法可以恒定的显示入体24条染色体的特异性带的带型示意图型（图8-17)，表明了带型的客观性和应用性，为识别染色体的改变提供技术分析基础，为临床上某些疾病的诊断和病因研究提供了有效的手段。
第三节核仁
核仁是真核细胞间期核中出现的结构，在细胞分裂期表现出周期性的消失和重建。
核仁的形状、大小、数目依生物的种类、细胞的形状和生理状态而异。
每个细胞核一般有1~2个核仁，但也有多个的。
蛋白质合成旺盛、生长活跃的细胞，如分泌细胞、卯母细胞中的核仁较大，其体积可达细胞核的25%；蛋白质合成不活跃的细胞，如精子和肌细胞，休眠的植物细胞其核仁不明显。
核仁主要是rRNA合成、加工和核糖体亚基的装配场所。
—、核仁的主要成分
研究表明核仁含有三种主要成分：蛋白质、RNA和DNA。
但这三种成分的含址依细胞类型和生理状态而异。
从离体核仁的分析得知，核仁的蛋白质占核仁干重的80％左右，包括核糖体蛋白、组蛋白、非组蛋白等多种蛋白质。
核仁中存在许多参与核仁生理功能的酶类，例如碱性磷酸酶、核甘酸酶、ATP酶、RNA聚合酶、RNA酶、DNA酶和DNA聚合酶等。
核仁中的RNA含量大约占核仁干重的10%，变动范围在3%～l3%。
RNA转录及蛋白质合成旺盛的细胞，其核仁中的RNA含量高。
核仁的RNA常与蛋白质结合成核糖核蛋白。
核仁中含有约8%的DNA，主要是存在千核仁染色质(nu cleolar chromatin)中的DNA。
核仁还含有微量脂类。
含水量较核内其他组分少。
二、核仁的结构
光镜下，核仁通常是匀质的球体，具有较强的折光性，容易被某些碱性或酸性染料着色。
电镜下，核仁是裸露无膜的纤维网状结构。
核仁的超微结构包括3个不完全分隔的部分，即纤维中心(fibri llar center,FC)、致密纤维组分(dense fibrill扣component,DFC)、颗粒组分(granular component, GC)（图8-18)。
颗粒组分
纤维中心
·'·...，拿＇，｝曾、，`'图8-18人成纤维细胞核电镜照片A完整的细胞核；B核仁（引自：Albe rts B, Johnson A, Lewis J, el al.
Molecular Biology of theCell.5th ed.
New York:Garland Publishing, Inc.,2007)(—)核仁的纤维中心是分布有rRNA基因的染色质区电镜下核仁结构的纤维中心由直径10nm的纤维组成，位于核仁中央部位的浅染低电子密度区，包埋在颗粒组分的内部，是rRNA基因rDNA的存在部位。
rDNA实际上是从染色体上伸展出的DNA拌环，拌环上的rRNA基因成串排列，通过转录产生rRNA，组织形成核仁，因此称为核仁组织者(nuclear organizer)。
rRNA基因通常分布在几条不同的染色体上，人类细胞的rRNA基因分布千第13、14、15、21和22号5对染色体的次缢痕部位，因此，在人类二倍体的细胞中，就有10条染色体上分布有rRNA基因，他们共同构成的区域称为核仁组织区（图8-l9)，含有核仁组织区的染色体称为核仁组织染色体(nucleolar organizing chromosome)。
（二）核仁的致密纤维组分包含处于不同转录阶段的rRNA分子。
核仁结构的致密纤维组分位千核仁浅染区周阶的高含有rRNA基因的10条间期染色质以拌环形式伸入核仁内核膜图8-19人10条染色体的「DNA拌环伸入核仁组织区示意图电子密度区，染色深，呈环型或半月型分布。
电镜下可见该区域由紧密排列的细纤维丝组成，直径一般为4~1Onm，长度约20~40nm，主要含有正在转录的rRNA分子，核糖体蛋白及某些特异性的RNA结合蛋白，构成核仁的海绵状网架。
用RNA酶及蛋白酶可将该区域的纤维丝消化。
（三）核仁的颗粒组分由正在加工的rRNA及蛋白质构成核仁结构的颗粒组分是电子密度较大的颗粒，直径为15-20nm，密布于纤维骨架之间，或围绕在纤维组分的外侧。
该区域是rRNA基因转录产物进一步加工、成熟的部位。
颗粒组分主要由rRNA和蛋白质组成的核糖核蛋白颗粒，为处于不同加工及成熟阶段的核糖体亚基前体。
上述三种组分存在于核仁基质中。
核仁基质为核仁区一些无定形的蛋白质性液体物质，电子密度低。
因核仁基质与核基质互相连通，所以有人认为核仁基质与核基质是同一物质。
三、核仁的功能
核仁是rRNA合成、加工和装配核糖体亚基的重要场所，除5S rRNA外，真核生物的所有rRNA都在核仁内合成。
在RNA聚合酶等多种酶的参与下，核仁中的rDNA开始转录rRNA，初级产物是纤维状，而后是颗粒状，最后完全成熟形成核糖体亚基，由核仁转运至细胞质。
（一）核仁是rRNA基因转录和加工的场所真核生物中的18S、5.8S和28S rRNA基因组成一个转录单位，在核仁组织区呈串状重复排列。
已知在所有的细胞中均含有多拷贝编码rRNA的基因。
根据对两栖类卵母细胞和其他细胞中具有转录活性的rRNA基因的电镜观察，发现它们都有共同的形态特征，即核仁的核心部分由长的DNA纤维组成，新生的RNA链从DNA长轴两侧垂直伸展出来，而且是从一端到另一端有规律地增长，构成箭头状，似圣诞树(Christmasee)的结构外形（图8tr-号20)。
沿DNA长纤维有一系列重复的箭头状结构单位。
每个结构单位中的DNA纤维是一个rRNA的基因，因而每个箭头状结构代表一个rRNA基因转录单位。
在两个箭头状的结构之间存在着不被转录的间隔DNA。
不同生物的间隔DNA片段长度不同，人的间隔片段长约30OOObp。
放、一.尸~-大
l三_.f`^'I'j＂呱…i心．-•...、，
尽羁间隔序列L一间隔序列_j非编码
间隔序列
在RNA聚合酶I的作用下，rRNA基因进行转录，形成45S rRNA分子。
从45S rRNA剪切为18S、5.8S和28S三种rRNA，是一个多步骤、复杂加工的过程。
通过3H标记尿瞪唗和放线菌素D研究HeLa细胞前1-RNA合成时发现：当HeLa细胞同3H标记尿啼唗共培养25分钟后，被标记的rRNA的沉降系数是45S，加入放线菌素D阻断RNA的合成后，标记的45S rRNA首先转变成32SrRNA，随着培养时间的延长，逐渐出现被标记的28S、18S的rRNA。
根据这一研究结果推测rRNA的加工过程为：45S rRNA裂解为4lS、32S、20S等中间产物。
20S很快裂解为18S rRNA,32S进一步剪切为28S和5.8S rRNA。
虽然所有真核生物的18S、5.8S和28S rRNA基因是相同的，并且在染色体上组成同一个转录单位，但是不同生物中的18S、5.8S和28S rRN A基因的转录起点和间隔区的长短并不完全相同。
真核细胞核糖体中5S rRNA（含有120个核昔酸）基因不定位在核仁组织区，如入类的5S rRNA。
196第二篇细胞的结构与功能
基因定位在1号染色体上，也呈串联重复排列，中间同样有不被转录的间隔区域，5S rRNA是由RNA聚合酶III所转录的，转录后被运至核仁中，参与核糖体大亚基的装配。
（二）核仁是核糖体亚基装配的场所
核糖体大、小亚基的组装是在核仁内进行的。
如图8-21所示，45S rRNA前体转录出来以后，很快与进入核仁的蛋白质结合，组成80S的核糖核蛋白颗粒。
以核糖核蛋白方式进行加工，即一边转录一边进行核糖体亚基的组装。
根据对带有放射性标记的核仁组分的分析，发现大部分核糖体蛋白质参与了45S rRNA的包装，在加工过程中，80S的大核糖核蛋白颗粒逐渐失去一些RNA和蛋白质，然后剪切形成两种大小不同的核糖体亚基。
由28S rRNA、5.8S rRNA、5S rRNA与蛋白质一起装配成核糖体的大亚基，其沉降系数为60S。
18S rRNA与蛋白质共同构成核糖体的小亚基，其沉降系数为40S。
大、小亚基形成后，经过核孔进入细胞质，进一步装配为成熟的核糖体。
严尸夕NA
核糖体蛋白
纬二名2s8S
～．、工亡.L-5S
细胞质委18S
霆＼：心
40S亚基60S亚基
通过放射性脉冲标记和示踪实验表明，在30分钟内，核糖体小亚基在核仁中首先成熟，并很快通过核孔进入细胞质中，而核糖体大亚基的组装约需l小时左右，所以核仁中核糖体的大亚基比小亚基多。
加工下来的蛋白质和小的RNA分子存留在核仁中，可能起着催化核糖体构建的作用。
一般认为，核糖体的成熟作用只发生在其亚基被转移到细胞质以后，这样有利于阻止有功能的核糖体与细胞核内加工不完全的hnRNA分子结合，避免mRNA前体提前在核内进行翻译，这一特点对保证真核细胞的转录、翻译控制在不同时空中进行有重要的意义。
四、核仁周期
核仁随细胞的周期性变化而变化，在细胞分裂前期消失，分裂末期又重新出现。
这种周期性变化与核仁组织区的活动有关e在有丝分裂前期，染色质凝集，伸入到核仁组织区的rDNA拌环缠绕、回缩到相应的染色体次缢痕处，rRNA合成停止，核仁的各种结构成分分散于核基质中，核仁逐渐缩小，最后消失。
所以在分裂中期和后期的细胞中见不到核仁。
当细胞进入分裂末期时，已到达细胞两极的染色体逐渐解旋成染色质，核仁组织区的rDNA拌环呈伸展状态，并开始重新合成rRNA，核仁的纤维组分和颗粒组分开始生成，核仁又重新出现。
在核仁的周期性变化中，rRNA基因的活性表达是核仁重建的必要条件，而原有的核仁组分可能起一定的协助作用（动画8-5“核仁的形成及功能”)。
第四节核基质
1974年初，美国R.
B e rezn e y和D.
S. Coffey等将分离纯化的大鼠肝细胞核用非离子去垢剂、核酸酶消化与高盐缓冲液处理，当核膜、染色质和核仁被抽提后，发现核内仍保留一个以纤维蛋白成分为主的网架结构（图8-22)，将这种网状结构命名为核基质(n uclear matrix)。
因为它的基本形态与细胞质骨架相似，同时与胞质骨架体系存在一定的联系，所以也有人将其称为核骨架(nucle釭ske leton)。
但对核骨架或核基质概念的理解，目前有两种看法：广义的概念是核骨架由核纤层、核孔复合体、残存的核仁和一个不溶的网络状结构（即核基质）组成。
狭义的概念是指核基质，它不包含核膜、核纤层、染色质和核仁等成分，但是这些网络状结构与核纤层及核孔复合体等有结构上的联系，而且在功能上与核仁、染色质结构和功能密切图8-22核基质的透射显微镜图像相关。
小鼠成纤维细胞的核基质，首先用去垢剂、高盐提取，然后用核酸酶和低盐处理去除染色质一、核基质的组成成分与形态结构镶嵌的DNA，可见有残存的纤维状基质构成的核质区和细胞骨架基质构成的胞质区（引自：电镜下观察，核基质是一个以纤维蛋白成分为主Karp G.
Cell and Molecular Biology:Concepts的纤维网架结构，分布在整个细胞核内。
这些网架结and Experiments.2"'1ed.
New York:John Wiley&构是由粗细不均、直径为3~30nm的纤维组成。
纤维Sons, Inc.,1999)单体的直径约3~4nm，较粗的纤维是单体纤维的聚合体。
核基质的主要成分是蛋白质，基含植达90％以上，另有少址的RNA。
RNA含蜇虽少，但对于维持核基质三维网络结构的完整性是必需的。
在制备核基质过程中，用RNase消化处理，制备的核基质上的网状颗粒结构变得稀疏，并发现核基质纤维的三维空间结构有很大的改变。
因此，认为RNA在核基质纤维网络之间可能起着某种连接作用。
由千在核基质纤维上结合有一定数量的RNP颗粒，因此，有人提出核基质的结构组分是以蛋白质为主的RNP复合物。
组成核基质的蛋白质成分较为复杂，它不像细胞质骨架如微管、微丝那样，主要由专一的蛋白质成分组成，而且核基质蛋白在不同类型细胞和不同生理状态的细胞中均有明显差异，同时也与提取核基质成分时采用的方法、步骤与盐溶液的不同有关。
双向电泳显示，核基质蛋白多达200余种，可分为两类：一类是核基质蛋白(nuclear matrix protein, NMP)，分子量在40000~60000之间，其中多数是纤维蛋白，也含有硫蛋白，是各种类型细胞所共有的；另一类是功能性的核基质结合蛋白(nu clear matrix associated protein, NMAP)，与细胞类型、分化程度、生理及病理状态有关。
核基质复杂多样的生物学功能除了靠核基质本身的蛋白质完成外，更重要的是通过多种核基质结合蛋白的共同参与。
二、核基质的功能
近年的研究表明，核基质可能参与DNA复制、基因表达、hnRNA加工、染色体DNA有序包装和构建等生命活动。
(—)核基质参与DNA复制1核基质上描泊DNA复制复合体实验表明DNA拌环与DNA复制有关的酶和因子铀定在核基质上形成DNA复制复合体(DNA replication complex)，进行DNA复制。
实验证明，DNA聚合酶在核基质上可能具有特定的结合位点，DNA聚合酶通过结合千核基质上而被激活。
有人认为从链的起始到链的终止，整个过程在核基质上进行。
核基质可能是DNA复制的空间支架。
在复制时DNA复制起始点结合在核基质上，同时还观察到新合成的DNA会随着复制时间的延长而逐渐从核基质移向DNA环。
所以，DNA复制时，DNA就像从一个固定的复制复合体中释放出来。
2.核基质上结合新合成的DNA Coffey(l980)和Berezney(1981)等分别以体外培养的3T3成纤维细胞、大鼠再生肝细胞为材料，用3H-TdR进行脉冲标记，发现标记后30分钟内，90％的放射性掺入集中在与核基质结合的DNA上。
这表明，新合成的DNA先结合在核基质上。
S. J.
McCready(1980)的实验，以HeLa细胞为材料，也证实新合成的DNA是结合在核基质上的。
他们认为，一个拌环中可能有几个复制起始点。
只有起始点结合到核基质时，DNA合成才能开始。
电镜放射自显影的实验也指出了DNA复制的位点结合于核基质上。
通过研究表明，DNA拌环是通过其特定位点结合在核基质上的。
该特定位点的核昔酸序列被称为核基质结合序列(matrix-attached region, MAR)，该序列富含AT，它通过与核基质相互作用，调节基因的复制与转录等。
3核基质上DNA的复制效率提高最初的DNA复制模式认为，可溶性的DNA聚合酶结合于DNA复制起始点后，沿模板移动合成新DNA。
实际上高度纯化的DNA在离体进行DNA复制时，DNA的复制效率极低且复制错误多，而在含有核基质组分的非洲爪蟾卯母细胞提取物的非细胞系统中进行DNA复制，其DNA复制效率很高，表明核基质可能为DNA精确而高效的复制提供良好的空间支架。
（二）核基质参与基因转录和加工1核基质与基因转录活性密切相关D.
A. Jac k son等(1981)用3H－尿啥唗核昔脉冲标记HeLa细胞，发现95％以上新合成的RNA存在千核基质上，说明RNA是在核基质上进行合成的。
（三）核基质参与染色体构建
染色质组装的放射环模型中，由30nm染色质细丝折叠而成的拌环铀定在核基质上，每18个拌环呈放射状排列结合在核基质上构成微带，再由微带沿着核基质形成的轴心支架构成染色单体。
根据这个模型，说明核基质可能对于间期核内DNA有规律的空间构型起着维系和支架的作用，它们参与DNA超螺旋化的稳定过程。
（四）核基质与细胞分化相关
核基质的发达状况与核内RNA合成能力、细胞分化程度密切相关。
分化程度高的细胞中RNA合成能力强，核基质也很发达。
核基质结构和功能的改变，可导致基因选择性转录活性的变化，引起细胞分化。
与正常细胞相比，肿瘤细胞中核基质的结构及组成存在异常，许多癌基因可结合于核基质上，核基质上也存在某些致癌物作用的位点。
第五节细胞核的功能
细胞核是细胞遗传物质储存、复制、传递及核糖体大小亚基组装的场所，在维持细胞遗传稳定性及细胞的代谢、生长、分化、增殖等生命活动中起着控制中心的作用。
—、遗传信息的贮存和复制
生物物种要得以延续，子代必须从亲代获得所有控制个体发生、发育及各种性状的遗传信息，而遗传信息是通过DNA复制、生殖细胞或体细胞分裂传递给子代或子细胞的。
(-)DNA复制是在多个复制起点上进行的半保留复制真核生物中，染色体为DNA分子的载体，每条染色体为一个DNA分子，每个DNA分子上有多个复制起点。
含有起点的复制单位称为复制子(replicon)。
复制从复制起点开始，双向进行，在起点两侧分别形成一个复制叉(replication fork)（图8-23)。
在进行DNA复制时，多个复制子可同时从起始点进行双向复制，一个复制起点的两个复制叉向两侧推进，最终将与另一起始点的复制叉相连，电镜下观察到的复制子呈一个个气泡状结构（图8-24)。
6..拓扑异构酶
·-~解旋酶
.^、九农心飞少
当亲代DNA分子上的所有复制子都汇合连接成两条连续的子代DNA分子时，复制解旋酶解旋酶得以完成。
复制后的两个DNA分子中的碱基顺序与复制前的DNA分子相同，而且每一个DNA分子都含有一条旧链和一条新合成的链，因此DNA的复制是半保留复制(semiconservative replication)（图8-25)。
图8-24DNA的双向及多起点复制示意图（二）DNA复制为半不连续性复制由千DNA聚合酶催化合成DNA链的方向只能是5'---+3'，使DNA链的3'端加脱氧核背酸，所以新合成的DNA链只能沿5'一3'的方向进行。
而DNA双链的方向一条为5'---+3'，另一条为3'---+5'，彼此反向平行。
在以3'---+5'方向为模板的链模板链图8-25DNA的半保留复制示意图上，子链合成的方向与复制叉推进的方向一后随链致，DNA是沿5'一3'方向连续复制的，速度较冈崎片段快，称为前导链(leading strand)；而以5'一3'链方向为模板合成的3'-+5'方向的互补链，其合成方向与复制叉推进的方向相反，合成过程则需要引物(primer)的存在，即需要一复制叉移动方向个长约lObp的RNA序列以提供DNA聚合酶所需的3'端，而且每一引物只能始动合成一个100-200bp的DNA片段，称为冈崎片图8-26DNA复制的半不连续性示意图段(Okazaki fragment)，因此在5'一3'方向的模板链上，DNA的复制是不连续的。
当一个个冈崎片段合成后，引物被去除，在DNA连接酶(DNA li gase)的作用下，补上一段DNA。
所以，这一条DNA链合成较慢，称为后随链(lagging strand)。
因此，DNA的复制又是半不连续复制(semi－小scontinuous replication)（图8-26)。
（三）端粒酶能够保持DNA复制时染色体末端的完整性端粒是由端粒酶合成的，端粒酶是由RNA和具有反转录酶活性的蛋白质组成的复合结构，其RNA长159bp，含一个CAACCCCAA序列，能为端粒DNA的合成提供模板，合成的方向是5'一3'。
而端粒酶中的蛋白质则为一种反转录酶。
在DNA复制终末时，由千DNA双链中后随链所进行的DNA转录(transcription)是将遗传信息从DNA传递给RNA分子的过程，是细胞合成蛋白质图8-27端粒酶的作用所必需的重要环节。
真核细胞RNA转录及其端粒酶通过其RNA序列识别染色体富含G的末端，并与后的加工、剪接、转运都是在细胞核各组分相之结合。
在端粒酶作用下，延长染色体DNA的3'末端，互配合、共同作用下完成的。
随着端粒酶在染色体末端的移动，3＇末端被进一步延长由RNA聚合酶I转录的rRNA分子，在核仁部位和5S rRNA以及与从胞质中转运入核的核糖体蛋白结合形成核糖核蛋白颗粒，并在核仁内加工、成熟，以核糖体大、小亚基的形式转运出核；由RNA聚合酶II转录的核内异质RNA(heterogeneous nuclem-RNA, hnRNA)，首先在核内进行5'端加帽、3'端加多聚A尾以及剪接等加工过程，然后形成成熟的mRNA，由DNA转录的mRNA前体只有在核内经转录后加工修饰成为成熟的mRNA分子才能被转运出核；5S rRNA和tRNA的转录则均由RNA聚合酶IlI催化，在核内合成（详见第九章）。
第六节细胞核与疾病
细胞核是细胞生命活动的控制枢纽，细胞核的结构和功能受损，将导致严重的后果，常会引起细胞生长、增殖、分化等的异常，从而导致疾病的产生。
—、细胞核结构异常与疾病
细胞核内遗传物质改变将导致遗传病，根据遗传物质改变的不同，可分为染色体病和基因病。
染色体异常可以表现为染色体的数目异常，也可表现为染色体的结构异常。
由染色体数目和结构异常所引起的疾病称染色体病(chromosomal disease)。
常见的染色体病有：21三体综合征、先天性睾丸发育不全综合征等。
由于染色体病往往涉及许多基因，所以常表现为复杂的综合征。
而由基因突变引起的疾病称为基因病，包括单基因病、多基因病。
常见的单基因病有：短指、遗传性舞蹈症、先天性聋哑、白化病、色盲、血友病等。
而少年型糖尿病、哮喘、冠心病、原发性高血压、精神分裂症等则属于多基因病。
还有一些疾病，与细胞核形态结构的改变密切相关。
（一）肿瘤细胞核异常
与正常细胞相比，肿瘤细胞增殖、生长旺盛，代谢活动活跃，其细胞核的形态结构有很多的异常。
在肿瘤细胞中，细胞核通常较大，核质比增高。
核的形状表现为：拉长、边缘呈锯齿状、凹陷、长芽、分叶及弯月形等畸形。
在骨髓瘤细胞中，甚至出现仅细胞核分裂但细胞质不分裂而形成的双核细胞（四倍体）。
肿瘤细胞的核膜增厚且呈不规则状，可出现小泡、小裂状突起。
核孔的数目在肿瘤细胞中往往增加。
肿瘤细胞核仁大而数目较多，常规染色的肿瘤细胞中核仁深染。
这是由于这些核仁的形态变化反映了肿瘤细胞活跃的RNA代谢的变化。
恶性肿瘤细胞的组蛋白磷酸化程度升高，磷酸化可以改变组蛋白中的赖氨酸所带的电荷，降低组蛋白与DNA的结合，从而有利于转录的进行。
肿瘤细胞的染色质沿核的周边分布并呈粗颗粒或团块状，分布不均匀。
当染色质形成染色体时，可出现正常或异常的有丝分裂相。
肿瘤组织的有丝分裂相数目一般是增多的，据此可诊断某些类型的恶性肿瘤。
染色体异常被认为是肿瘤的特征之一，很多的肿瘤细胞都有染色体畸变。
染色体的变化是肿瘤早期诊断的客观指标，在医学上具有一定的意义。
（二）核纤层蛋白异常与早衰
在人类早老征患者的表皮细胞中，电镜观察发现核纤层增厚的现象。
核纤层不仅能稳定核膜结构，而且与异染色质组装、基因的转录以及DNA复制等密切相关。
核纤层主要由两类蛋白组成：A型核纤层蛋白和B型核纤层蛋白。
A型核纤层蛋白主要包括Lamin A和Lamin C,B型核纤层蛋白主要包括Lamin Bl和Lamin B2。
当编码核纤层的基因发生突变，可以直接引起细胞核纤层的损伤，造成细胞衰老，也将引发机体一系列与衰老相关的退行性病变。
Lamin A及其结合蛋白的突变将影响核膜蛋白的定位和功能，或影响基因组的稳定性，导致早老的发生。
人类早老征患者Lamin A合成障碍，有毒性的Lamin A前体的累积，人类正常年老细胞中同样存在Lamin A减少。
二、核转运异常与疾病
雄激素受体(androgen receptor, AR)在男性第二性征的发育及前列腺的生长过程中起着重要的作用，其核定位对个体正常的生理状态非常重要。
在胞质中Import a通过识别AR上的核定位信号(NLS)，并与其结合，然后再与Import[3结合，AR-Import a-Import[3复合体通过核孔复合体进细胞核，然后将AR释放。
AR或AR的NLS位点的突变（如：Lys630、Lys632、Lys633)会严重影响AR与Import a的结合，导致AR不能正常入核。
AR或者AR的NLS位点的突变体造成的AR异常，其亚细胞定位明显与前列腺癌以及雄激素不敏感症相关。
三、端粒异常与疾病
研究发现高血压患者内皮细胞中端粒长度存在异常。
对体外高血压动物模型研究发现，血管平滑肌细胞的端粒消耗加速，由此可能对血管平滑肌细胞增殖与凋亡失衡产生影响。
在非胰岛素依赖性糖尿病人的白细胞中也出现端粒长度缩短的现象，因此有人推测一些与年龄老化相关疾病（如高血压、糖尿病、动脉粥样硬化和恶性肿瘤等）的发生机制可能与年龄增加导致的端粒磨损加速、长度缩短相关，端粒的这些异常增加了疾病等位基因杂合性丢失的机率及染色体基因型的不稳定，使发病风险升高。
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小、结
细胞核是真核细胞内的最大、最重要的结构，是细胞生命活动的控制中心。
间期细胞核主要由核膜、染色质、核仁及核基质（核骨架）构成。
核膜作为界膜将细胞区分为细胞核与细胞质两个彼此独立又相互联系的功能区，从而使基因的转录和翻译过程在时空上分开。
核孔复合体是核－质之间的物质运输和信息交流的通道。
核纤层是附着在内核膜下由核纤层蛋白组成的纤维蛋白网，与核膜及朵色质在结构和功能上有密切的联系。
染色质是由DNA、组蛋白、非组蛋白及少量RNA组成的核酸蛋白质复合结构。
按其螺旋化程度及功能状态的不同分为常染色质和异朵色质两类，异朵色质又分为组成性异染色质和兼性异染色质。
核小体为朵色质的基本结构单位。
核小体进一步螺旋形成30nm朵色质纤维，染色质经过多级折叠、包装后可形成染色体。
在细胞分裂中期染色体形态、结构特征最为明显，具有两条朵色单体，主要结构包括染色体臂、着丝粒与动拉、次缢痕、随体和端粒。
人体染色体有中着丝粒、亚中着丝粒、近瑞着丝拉三种类型。
核仁主要由蛋白质与rRNA组成。
电镜下的核仁结构由纤维中心、致密纤维组分、颗粒成分三个不完全分隔的部分构成。
核仁是一种高度动态的结构，经历着周期性的变化，核仁的形成与核仁组织朵色体上存在的含有rRNA基因的核仁组织区有关。
核仁的主要功能是合成除5S rRNA之外的所有彸勹rRNA及装配核糖体大、小亚基。
核基质为间期核内由非组蛋白组成的纤维网架结构，核基质与DNA复制、基因表达及朵色体构建有着密切的关系。
细胞核是遗传信息的贮存场所，核内进行基因复制、转录和转录出的初级产物的加工等活动，从而控制细胞代谢、生长、繁殖和分化。
细胞核的结构或功能受损，可导致疾病的发生。
（项荣）
第九章细胞内遗传信息的传递及调控
人类对基因的认识和探索经历了近百年的历程，这个历程是从奥地利的一个神父孟德尔“中心法则”的不断补充和完善，丰富了人们对遗传信息传递过程的认识。
遗传信息（即基因信息）传递的结果，是合成在细胞内执行特定功能的蛋白质，该过程受到严密和精确的调控，其中任何环节出现异常均可导致疾病的发生。
第一节基因及其结构
—、基因及其信息流向
(—)基因是DNA分子中含有特定遗传信息的核苦酸序列细胞的生物学性状是由其遗传物质所携带的遗传信息决定的，绝大多数的遗传物质是DNA，少数噬菌体和病毒的遗传物质是RNA。
基因(gene)是细胞内遗传物质的最小功能单位，是负载有特定遗传信息的DNA片段。
在原核细胞中，一个基因就是DNA分子的一个片段；但在真核细胞，一个基因可以是DNA分子的一个片段或是若干片段的组合。
基因能够编码生物活性物质，其产物为各种RNA和蛋白质。
为了区分调控途径中的成员和被调控的基因，目前一般将基因分为结构基因(s tructural gene)和调控基因(regulat01-y gene)。
结构基因是指编码非调控因子的任何蛋白质和RNA的基因，其表达产物如结构蛋白、酶、rRNA和tRNA等；而调控基因则通过编码蛋白质或RNA来调节其他基因的表达。
构成DNA遗传信息的物质基础是DNA序列中的核甘酸排列顺序，不同的生物细胞中DNA所载有的遗传信息大小不一，基因数目不同，所合成的蛋白质种类不同，这也是生物物种丰富多彩的原因。
蛋白质是生命活动的执行者，通过转录和翻译，基因DNA的编码序列决定了蛋白质的一级结构，从而决定蛋白质的功能。
通过DNA的复制，基因所携带的遗传信息代代相传。
基因组(genome)是指细胞或生物体的一套完整的单倍体遗传物质，是所有染色体上全部基因和基因间的DNA的总和，它含有一个生物体进行各种生命活动所需要的全部遗传信息。
原核细胞没有细胞核结构，其基因组以裸露DNA或RNA的形式存在于细胞中，其基因组结构较真核细胞简单。
真第九章细胞内遗传信息的传递及调控核细胞基因组的复杂性和信息榄的庞大程度远远超过原核细胞。
研究表明，由于DNA存在编码区与非编码区，基因组的大小并不一定代表基因组的复杂性。
例如，人类基因组约有3.
Oxl09bp，但只有2万～3万个基因，仅是大肠杆菌(E.
coli)4000个基因的5~7倍；而蛛姬和百合花的DNA数量却是人类基因组的10倍，但这些生物的复杂程度显然比不上人类。
（二）中心法则揭示了基因的信息流向
基因是遗传信息的贮存形式。
在细胞内，遗传信息的流向一般是DNA--+RNA一蛋白质。
首先以DNA作为模板合成RNA分子，接着RNA分子指导特定蛋白质合成，此过程称为基因表达(gene expression)。
基因表达的终产物是蛋白质（也可以是RNA)。
遗传信息从DNA到RNA再到蛋白质的流动，称为分子生物学的中心法则(central dogma)（图9-l)。
中心法则包括：心复制(replication)，即遗传信息可由亲代DNA通过半保留复制传递Dm给子代DNA;＠转录(transcripti on)，即以DNA为模板合成RNA的过程；＠翻译(translation)以RNA(mRNA)为模板指导蛋白质生物合成的过程，即由mRNA的核昔酸序列转变为蛋白质的氨基酸序列。
后来的研究发现了逆转录现象，逆转录酶能催化以RNA为模板合成DNA，从而证明了遗传信息亦可反向传递，即从RNA--+DNA；另外，一些RNA病毒可以RNA为模板复制出新的RNA这些现象都是对中心法则的有益补充。
在遗传信息传递的过程中，RNA分子起很重要的作用。
负责翻译为蛋白质的RNA，像信使那样携带着来自DNA的遗传信息到胞质核糖体指导合成蛋白质，因而称之为信使RNA(messenger RNA, mRNA)。
除mRNA外，核糖体RNA(ribosomal图9-1中心法则示意图RNA,rRNA)和转运RNA(transfer RNA, tRNA)都是基因表达的终产物，它们不能被翻译成蛋白质，但为蛋白质合成所需要。
细胞中还有一些小分子的RNA在遗传信息的表达调控中起重要作用。
二、基因的结构及特点
(—)原核细胞的基因结构较为简单
大多数原核细胞中只有一个DNA分子，即一条染色体。
原核细胞基因组DNA的绝大部分可编码蛋白质，只有小部分不转录，为非编码区。
在原核细胞中，功能相关的结构基因串联排列，受上游共同调控区的控制，同时转录和翻译，最终形成功能相关的几种蛋白质。
如大肠杆菌中与乳糖代谢有关的酶有三种：B－半乳糖昔酶、B－半乳糖昔通透酶和B－半乳糖昔乙酰转移酶，编码这三种酶的结构基因分别为LacZ、LacY和LacA，串联排列于大肠杆菌DNA的某一区段上。
位千结构基因上游的是启动子(promot er)序列，它是RNA聚合酶识别和结合的部位，可以控制在同一条DNA上紧密连接的一个或几个基因的转录。
原核生物的启动子大约有55个碱基对长，其中包含有转录的起始点和RNA聚合酶的识别部位及结合部位。
起始点是DNA模板链上开始进行转录作用的位点，以“+1”标识，在DNA模板上，从起始点开始顺着转录方向的区域称为下游；从起始点逆着转录方向的区域称为上游。
识别部位是RNA聚合酶的G因子识别DNA分子的部位，约有6个碱基对，其中心位千上游－35bp处，所以称为－35区，其共有序列是5'-TTGACA-3'。
结合部位是指在DNA分子上与RNA聚合酶核心酶紧密结合的序列，其长度大约是7个碱基对，其中心位于起始点上游的－lObp处，因此将此部位称为－10区。
多种启动子的－10区具有高度的保守性和一致性，它们有一个共有序列或共同序列，为5'-TATAAT-3'，又称为Pribnow盒(pribnow box)。
在Pr山now盒中的DNA双链容易解开，利于RNA聚合酶的进入而促使转录作用的起始。
原核细胞结构基因序列是连续的（没有内含子成分），在转录后不需要剪切和加工。
206第二篇细胞的结构与功能
（二）真核细胞基因是不连续的断裂基因
与原核细胞相比，真核细胞基因组DNA含量要大得多，如人单倍体基因组DNA含最是大肠杆菌的近700倍。
除了数量多，真核细胞的基因结构也更复杂。
首先，基因序列由编码区(coding region)和非编码区(non-coding region)组成，编码区（编码序列）是不连续的，被非编码区（非编码序列）所隔断，因而真核细胞基因也称为断裂基因(spli t gene)。
其次，在真核基因组中存在许多重复序列，有些碱基序列反复出现可达百万次以上。
此外，真核细胞基因大小相差悬殊，如人血红蛋白B－珠蛋白基因全长约1700bp，而DMD(Duchenne's muscular dystrophy，假肥大型肌营养不良）基因全长可达2300kb。
真核细胞基因结构的复杂性赋予了真核生物更为精细的功能。
1真核细胞基因由多个功能区域组成真核基因一般是由若干内含子和外显子构成的不连续镶嵌结构的基因。
除内含子和外显子之外，完整的基因还包括位千编码区上游的启动子和基因末端的终止子。
(1)外显子和内含子：原核细胞的基因往往是连续的，DNA经转录后即可得到直接编码蛋白质的序列，而真核细胞基因中编码序列常常被非编码序列隔断，转录后需加工切去非编码序列成为成熟的RNA，才能进行蛋白质的合成。
通常人们把基因内部能够被转录，并能指导蛋白质生物合成的编码序列称为外显子(exon)，把在基因内部能够被转录，但不能指导蛋白质生物合成的非编码的序列称为内含子(intron）。
一个断裂基因可由若千个外显子和若干个内含子组成，基因中的外显子与内含子间隔排列，其转录的终产物为mRNA。
在内含子的5'端多以GT开始，3＇端多以AG结束，称GT-AG法则，是普遍存在于真核细胞基因中RNA剪接的识别信号。
在RNA剪接加工后形成的成熟mRNA的5'端和3'端，都各有一段由30到数百个核昔酸组成的非翻译区(untranslated region, UTR)。
(2)启动子：启动子是基因上游的DNA序列，是控制转录的关键部位。
启动子中含有特征性的核心序列，真核生物典型的启动子是由TATA盒及其上游的CAAT盒和（或）GC盒组成。
在转录起始位点上游－25~-35bp区段是由7~10个碱基组成而以TATA为核心的序列，称为TATA盒(TATA box）。
这一部位是RNA聚合酶及其他蛋白质因子的结合位点，与转录起始的准确定位有关。
若TATA盒缺失，转录合成的RNA可有不同的5'端。
位于TATA盒的上游，距转录起始点-70~-80bp区含有CCAAT序列，在－80~-llO bp区含有GGGCGG序列，这两段保守序列分别称CAAT盒(CAAT box)和GC盒(GC box),目前统称为上游启动子序列(upstream promoter sequence, UPS)或上游启动子元件(upstream promoter elemen t, UPE)，它们是许多蛋白质转录因子的结合位点。
CAAT盒和GC盒是基因有效转录所必需的DNA序列，主要控制转录的起始频率，基本不参与起始位点的确定。
(3)终止子：终止子(terminator)是存在千基因末端具有转录终止功能的特定顺序。
转录后形成发夹结构，使RNA聚合酶从模板上脱离，终止转录。
2.基因家族是真核细胞中—组来源相同、功能相关的基因真核细胞基因结构最显著的特征之一是存在许多基因家族(gene family)。
基因家族是真核细胞基因组中来源相同、结构相似、功能相关的一组基因，是由一个祖先基因经重复和变异形成的。
按照在基因组中的分布不同，基因家族可分为二类，一类是基因家族的成员成簇存在，串联排列千特殊的染色体区段上，形成基因簇(gene cluster)，它们常可同时转录，合成功能相关或相同的产物，如组蛋白、rRNA基因家族；另一类是基因家族成员分散存在，广泛地分布于整个染色体，甚至可存在于不同的染色体上，如干扰素、珠蛋白等基因家族。
在基因家族中，有些成员不能产生有功能的基因产物，称为假基因(pseudogene)，它们或是不能转录，或是转录后生成无功能的基因产物。
假基因在核昔酸序列上与有功能的基因相似，它们可能来自同一祖先基因，只是在进化过程中某些成员的核昔酸序列中发生缺失、倒位、点突变而成为无功能,的假基因。
大多数基因家族都有假基因的存在，但数量很少。
第九章细胞内遗传信息的传递及调控207
3真核基因组中含有大量的DNA重复序列在真核细胞基因组中，编码蛋白质的基因一般只有一个或几个拷贝，这称为单一序列(uni q u e sequence)。
除此之外，基因组中还含有大量的功能未知、有多个拷贝的DNA重复序列(repetitive sequence)。
在动物细胞中，多达一半的DNA由DNA重复序列组成。
根据DNA重复程度的不同，将其分为以下两种：(1)中度重复序列：中度重复序列(moderate ly repetitive sequence)由相对较短的序列组成，重复次数在10~1000之间。
一般认为，中度重复序列属非编码序列，散在分布千基因组中，与基因调控有关。
如人类Alu家族(Alu family)是人类基因组中含量最丰富的中度重复序列，占人类基因组的3%~6%，长300bp,Alu家族成员约有30万个，因每个Alu序列中隐含有一个限制性内切酶Alu I的识别序列ACCT而得名。
Al u序列的功能可能与转录调节、hnRNA加工有关。
某些编码功能性RNA和蛋白质的基因在基因组中的重复次数也达几十到几百次，它们串联排列于基因组的一定区域，如rRNA基因和tRNA基因等，从严格意义上讲，它们也属于中度重复序列。
(2)高度重复序列：高度重复序列(highly repetitive sequen ce)由基因组中非常短的序列（一般小于lOObp)组成，其在基因组中的重复次数在几千次以上，一般组成长的串联重复序列，常成簇分布于染色体着丝粒区及染色体的端部，如卫星DNA。
高度重复序列在哺乳动物基因组中的比例一般小于JO%，可能与基因表达调控及染色体结构维持有关，具体功能尚不清楚。
在生物进化过程中，来自自然环境和体内多种因素的影响，可引起DNA结构的改变，也就是基因发生突变。
虽然细胞内具有修复DNA损伤的功能，但并非所有的损伤都能被修复。
一些未能修复的损伤有可能形成可遗传的突变。
如果突变是发生在结构基因中，将使基因编码的蛋白质发生结构改变，失去原有的功能，导致疾病的发生。
基因突变是生物进化和分化的分子基础，也是某些疾病的基础，是生物界普遍存在的现象。
'，··一．一…~-－－－-－－-----------－--－--一--－－…-－…一．经典实验：内含子的发现---~－-－-e---－－邑-邑--……
....－-…－-－－．一…---－－\在分子克隆技术出现之前，人们对真核细胞中mRNA的合成知之甚少，但已知在真核细胞中mRNA的合成过程比在细菌中复杂得多。
真核细胞中mRNA的合成似乎不仅包括转录，还包括对初始转录产物的加工和修饰过程。
当时推测，真核细胞可能首先在细胞核中产生一个较长的mRNA初始转录产物，接着被切割形成较小的mRNA分子，并被输送到细胞质中。
在当时，人们认为这个切割过程包括去除初始转录产物的5'末瑞和3'末端部分的序列。
根据这个观点，mRNA被包含在较长的初始转录产物中，并且编码mRNA的DNA序列应该是没有间断的。
直至RNA剪接的发现，这一对真核细胞mRNA的认识才得以彻底改变。
P.A. Sh缸p和R.
J. Roberts两个研究小组于1977年分别独立地发现了剪接现象。
实验内容
Sh缸p和Roberts两个研究小组都利用腺病毒2来研究人细胞中mRNA的合成过程。
腺病毒2的优点是可以作为一个比宿主细胞更为简单的研究模型。
病毒DNA可直接从病毒颗粒中分离出未，同时，编码病毒结构蛋白的mRNA含量丰富，可直接从感染细胞中纯化得到。
S h扣p把他们的实验重点放在病毒结构多肤hexo n的编码mRNA上。
为了分析hexon mRNA序列在病毒基因组中的位置，他们将纯化的hexon mRNA与腺病毒DNA进行杂交，并利用电镜未观察杂交分子。
结果显示，hexon mRNA的主体序列能够与含有hexon基因的腺病毒DNA形成杂交分子。
出乎意料的是，hexon mRNA的5'末瑞序列不能与编码h exon mRNA主体的DNA序列的邻近序列杂交。
这表明hexon mRNA的5'端可能来源于病毒基因组中其他位置的序列。
通过hexon mRNA与hexon基因上游的DNA片段杂交实验证实了这种可能性。
实验中mRNADNA杂交体形成了一个复杂的环状结构，hexon mRNA的主体与先前证实的hexon DNA序列形成一长的杂交区域，令人惊奇的发现是hexon mRNA的5'末端与hexon DNA上游3个短序列发生了杂交。
在电镜下可以看到3个大的单链DNA环，这些DNA环将3个短序列彼此分隔开，并也将3个短序列与h exon mRNA主体序列分隔开未（图9-2)。
由此可见，h exon mRNA的5'末瑞序列由病毒基因组的3个独立区域转录而来，是从一个长的初始转录产物中被剪接到hexon mRNA的主体上的。
外显子4
A.电镜图片；B根据电镜结果绘制的模式图
发表论文
Berget SM, Moore C, Sharp PA.
Spliced segments at the5'terminu s of adenovirus2late mR-i NA.
Proc Natl Acad Sci. USA,1977,74:3171-3175.!Chow LT, Gelinas RE, Broker TR, et al.
An amazing sequence arrangement at the5'ends of ade-[novirus2messe nger RNA.
Cell,1977,12:1-8.
后续影响
腺病毒mRNA的剪接现象被发现之后，相继进行了一系列关于细胞mRNA前体剪接的类:似实验，结果显示真核基因存在一种此前未曾预料到的结构，即真核基因的编码序列不是连续:的，而是被内含子所间隔。
细胞通过对初级转录产物的剪接去除内含子。
现已清楚，真核细胞l基因组中存在大量的内含子，内含子在进化过程以及基因表达调控过程中的作用一直是生命l科学研究的热点。
剪接现象的发现也推动了对这种以前未曾认识到的RNA加工机制的研究。
;这方面的研究不仅阐明了新的基因表达调控的机制，也揭示了RNA的催化活性，为早期进化是以自我复制的RNA分子为基础的这一假说提供了重要证据。
总之，腺病毒mRNA的剪接现}象的发现对细胞生物学及分子生物学的多个领域产生了重大的影响。
!、、··--·---------------------·------------··..-----·---------------··-···--....._______.__....._------------·---------____._......
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...-/第二节基因转录和转录后加工—、基因转录的一般特点基因转录是遗传信息从DNA流向RNA的过程，即将DNA分子上的核昔酸序列转变为RNA分子上核昔酸序列的过程。
DNA链是基因转录的模板。
在双链DNA中，作为转录模板的链称为模板链(template strand)或反义链(antisense strand)，即与mRNA互补的DNA链；与模板链互补的另一条链称为编码链(coding彸之r Slrand)或有意义链（sense strand)，该链与转录产物的序列相同，只是在转录中将DNA中的T变为第九章细胞内遗传信息的传递及调控209RNA中的U。
模板链并非总在同一单链上，如图9-3所示，在DNA双链的某一区段，以其中一条单链为模板，而在另一区段，以其相对应的互补链为模板。
这种DNA链的选择性转录也称为不对称转录(asymmetric transcription)。
：一一—-－_五一二~:
二结构基因一编码链
转录的本质是一个以DNA双螺旋链中反义链为模板，以四种核昔三磷酸ATP、GTP、CTP、UTP为原料，在RNA聚合酶作用下，遵循碱基互补配对原则合成RNA的过程。
RNA合成的方向是5'一3''生成的RNA链与模板链反向平行，游离的NTP只能连接到RNA链的3'-0H端。
在RNA合成中不需要引物。
在真核细胞中，转录生成的RNA是初级转录产物，必须经过不同方式的加工和修饰才具有生物活性。
二、原核细胞的基因转录
(—)RNA聚合酶和p因子是原核细胞基因转录的主要因子1.
RNA聚合酶原核细胞中只有一种RNA聚合酶，催化转录形成各种RNA分子。
大肠杆菌的RNA聚合酶是由4种不同亚基构成的复合体，记为伍部'6，称为全酶，没有G亚基的复合体称为核心酶。
G亚基的主要功能是识别原核细胞基因上游的启动子，启动基因转录。
核心酶的作用是催化RNA的聚合。
其中B'亚基能与DNA模板结合，B亚基能与核昔三磷酸结合，并在磷酸二酣键形成中起作用。
2. p因子p因子是一种蛋白质。
当转录进行到基因末端时，p因子能识别终止信号并与之结合，使RNA聚合酶不能继续作用而使转录终止。
（二）原核细胞基因转录的基本过程通常被分为三个阶段1.转录起始阶段首先RNA聚合酶的6亚基识别基因上游的启动子，使全酶与启动子结合并形成复合体，这是转录起始的关键，随后DNA双链从局部被打开，以反义链为模板，按照碱基互补配对原则将第一个核昔三磷酸结合到模板的转录起始点上，并与第二个核昔三磷酸形成第一个磷酸二酷键。
通常，当RNA链达8~9个核甘酸后，G亚基便从全酶解离出来，至此完成转录的起始（图9-4)。
RNA聚合酶
6亚基起始位点
2.转录的延长阶段核心酶沿模板链3'一5'方向移动，在滑行中使DNA双链不断解旋，并按模板的碱基序列配对加入相应的核昔三磷酸(ATP、GTP、CTP、UTP)，与DNA分子中双链间碱基配对有所不同的是转录中由新加入的U与模板中的A配对，使RNA链以5'-+3'方向不断延长。
随着RNA链的延长，核心酶前面的DNA链不断解旋，而核心酶后面已完成转录的区段则重新形成双螺旋。
3.转录的终止阶段模板DNA上具有特殊的转录终止序列，即终止位点，当RNA聚合酶移动至终止部位时，转录终止，RNA从DNA模板上脱离。
原核细胞中转录终止有两种形式，一种是p因子依赖性终止，即p因子在转录终止点与RNA聚合酶结合，使RNA链脱离。
另一种是p因子非依赖性终止，由新合成RNA链形成局部发夹结构(hairpin struc ture)，发夹结构形成可能改变了RNA聚合酶的构象，导致了酶模板结合方式的改变，RNA聚合酶则不再向下移动，磷酸二酷键停止形成，RNA从模板脱离。
原核细胞转录形成的mRNA分子一般不需要加工，在合成后即可作为模板参与蛋白质的合成。
而tRNA和rRNA则需要在合成初级转录产物的基础上，进一步剪切修饰才能成为具有生物功能的成熟分子。
例如，rRNA基因的初级转录产物在核酸酶的作用下，剪切成3种rRNA，即5S rRNA,16S rRNA,23S rRNA，三者比例为1:1:1。
三、真核细胞的基因转录和转录后加工
真核细胞基因转录要比原核细胞复杂得多。
真核细胞基因转录形成初级转录产物的基本过程与原核细胞相似，也分为转录的起始、延长和终止。
但所需酶及各种蛋白因子有所不同，最为复杂的是真核细胞中转录形成的RNA前体分子通常需要经过复杂的加工修饰过程才能成为成熟的功能形式。
与原核细胞只有一种RNA聚合酶负责全部的mRNA、rRNA、tRNA合成不同的是，真核细胞中含有多种RNA聚合酶（表9-1)，它们专一性地转录不同基因而生成各不相同的产物。
下面介绍各种RNA的合成和加工。
种类细胞内定位转录的基因RNA聚合酶I核仁5.8S rRNA,18S rRNA牙'!128S rRNA RNA聚合酶II核质所有编码蛋白的基因，snoRNA和某些snRNA RNA聚合酶皿核质tRNA,5SrRNA，某些snRNA和其他小RNA（一）真核细胞mRNA成熟前经历首尾加工和中间剪接1.
mRNA的初级转录本是hnRNA mRNA是RNA中唯一具有编码蛋白质功能的RNA分子，其前体是编码基因在RNA聚合酶II催化下转录形成的。
由于mRNA前体分子的大小各不相同，被称为不均一核RNA(heterogeneous nuclear RNA, hnRNA), hnRNA需经过剪切修饰才能成为成熟的mRNA。
RNA聚合酶II启动转录时，需要一些称为转录因子(transcription factor, TF)的蛋白质参与，才能形成具有活性的转录复合物。
这些参与构成RNA聚合酶II转录起始复合物的转录因子通常称为通用转录因子(ge neral transcription factor)，为RNA聚合酶II启动转录所必需。
通用转录因子有TFIIA、TF II B、TF II D、TF II E、TF II F、TFII H，它们在真核生物进化中高度保守。
在基因转录起始的过程中，RNA聚合酶II的定位因子是TF II D。
TF II D由TATA－结合蛋白(TATA-binding protein,TBP)和11种TBP关联因子(TEP-assoc iated factor)组成。
先由TBP结合到启动子的TATA盒，然后TF II B与TBP结合，TFII B也能与DNA结合。
TF II A虽然不是必需的，但它能稳定已与DNA结合的TF II B-TBP复合体，并且在TBP与不具有特征序列的启动子结合（这种结合较弱）时发挥重要作用。
TF II B-TBP复合体再与由RNA聚合酶II和TF II F组成的复合体结合。
TF II F的作用是通过和RNA聚合酶II一起与TF II B相互作用，降低RNA聚合酶II与DNA的非特异部位的结合，来协助RNA聚合酶Il靶向结合启动子。
最后是转录起始位点TF Il E和TF Il H加入，形成闭合复合体，完成转录起始_TATA盒广复合物的装配。
TFilH具有解旋酶活性，能使转录起始I点附近的DNA双螺旋解开，使闭合复合体成为开放复=「-二）
合体，启动转录（图9-5)。
当合成一段60-70bp的RNA TBP TFII D后，TF Il E和TFil H释放，RNA聚合酶Il进入转录延长I七合一廿恤甘h,．国句，＂止勹心右`l期。
一旦RNA合成结束，转录即终止。
有关真核生物转录终止的机制目前尚不清楚。
2.成熟的mRNA是hnRNA经过戴帽、加尾和剪
接后形成的转录形成的前体RNA需经过加工过程成为成熟的mRNA，才能进入细胞质进行蛋白质合成。
加工过程包括戴帽、加尾和剪接（图9-6)。
TFIIF(l)5'末端加上“帽子”结构－戴帽：戴帽(capping)是指对hnRNA5'端进行化学修饰，即首先在mRNA前体5'端开始的第一个核昔酸上接上一个三磷酸鸟嗦呤，然后在甲基转移酶的作用下，在鸟嗦呤第7位的氮上进行甲基化，形成一个7－甲基鸟嗦呤三磷酸RNA聚合酶II(m7Gppp)的帽子结构，同时在原来第一个核昔酸的2'O上也进行甲基化，因此，一个帽带有二个甲基。
新生的mRNA的长度达25~30bp时，就开始进行戴帽修饰。
mRNA戴帽的作用一是能封闭mRNA5'端，使其不再加接核背酸，同时也防止转运时被核酸酶水解，增强mRNA r_ucTTRRAGTTpp的稳定性；二是帽子结构能被核糖体小亚基识别，有利于mRNA最初翻译的准确性。
(2)3'末端加上“尾”结构－加尾：加尾(ta山ng)是指对mRNA前体3'端的修饰过程，即在腺昔酸聚合酶5的作用下，在3'端加上由200~250个腺背酸组成的多
聚腺昔酸(poly-A)的尾巴。
加尾一方面可使mRNA3'端稳定，防止被核酸酶水解，另一方面有利于mRNA由核
转j;.
到细胞质的转运。
图9-5真核生物转录起始复合物的形成目前发现，决定mRNA前体分子加尾的信号序列存在于mRNA3'端，即在发生多聚腺昔酸化位点的上游l0~30bp处存在一高度保守的6核昔酸序列（在哺乳动物中为AAUAAA)，在多聚腺昔酸化位点的下游常存在富含G和U的序列。
这些序列可被含有腺背酸聚合酶的复合物所识别，进行加尾。
(3)剪接：基因转录过程是以一段连续的DNA序列为模板进行的，在初级转录产物中包含有内含子和外显子序列，在形成成熟mRNA过程中，需将hnRNA中的内含子切除，形成由连续编码序列组成的mRNA模板。
剪接(splicing)即是将RNA前体分子中内含子切除，将外显子拼接的过程。
对真核生物外显子与内含子相邻序列研究发现，初级转录产物中的内含子常以GU开始，以AG结束，被认为是真核生物基因特有的剪接信号，也称剪接点。
几乎所有真核生物基因的内含子均遵循这一GU-AG规则表明这类内含子存在着共同的剪接机制。
完成hnRNA剪接需要有三个必需的序列：5'GU序列，3'AG序列和分支点(branch site)。
分支点位于内含子3'端上游约30个碱基处，为一高度保守的A，在3剪接位点的识别中起重要作用。
点突变研究表明，剪接点GU或AG的突变可以阻止剪接的出现。
例如，人类的B－珠蛋白生成障碍性贫血可能就是由于B－珠蛋白的hnRNA的内含子剪切点外显子内含子外显子内含子外显子顺序发生改变，不能形成成熟的B珠蛋白mRNA，因而不能合成正常的血红蛋白，从而导致疾病。
mRNA前体的剪接是通过剪接体(spliceosome)完成的。
剪接体大小为60S，由数种小分子核糖核蛋白颗粒(small nuclear ribonucleoprolein particle, snRNP)组成。
snRNP由细胞核中存在的一类小核RN A(small nucleru·RNA, snRNA)和一些蛋白质组成，常见的snRNA有U1、U2、U4、us和U6,除U6snRNA由RNA聚合酶皿转录外，其他snRNA均由RNA聚合酶II催化合成。
剪接过程见图9-7，首先Ul snRNP结合到具有5'帽结构的hnRNA内含子5'剪接点，随后U2s nRNP结合到内含子分支点，这一过程需要ATP供能。
接着，U4、us、U6snRNP以复合体的形式与先期已经结合于mRNA前体分子的Ul、U2装配成无活性的剪接体；再通过内部的重排，U1、U4被排出剪接体，从而使无活性的剪接体转变为有活性的剪接体。
此后，发生两步反应，第一步，分支点上的核昔酸A接近5'剪接点，内含子与5'外显子被从此处断开，切断的内含子5'端与核昔酸A共价连接形成套索状(lariat)结构。
第二步，5'5'51'外显子序列勹勹3'1：显子序列寸前体分子mRNAU5U4〉／剪切体的装配3'剪切点步骤l：套索状结构形成并切割5'剪切点2:切割3'切点两端外显子序列连接3,以套装形式切除的内含子序列IJOH-（将在核中被降解）
5'3'成熟的mRNA
第九章细胞内遗传信息的传递及调控213
外显子上的3'-0H端与3'外显子的起始部位结合，并切割3'剪接点，3＇和5'端外显子彼此连接，剪接体各组分和套索状结构脱离，剪接完成。
（二）核仁DNA编码的rRNA分子都来源于一个前体分子的合成后加工真核细胞中的rRNA基因串联排列千特定的核仁染色质区段，为多拷贝基因，人体每个单倍体基因组上包含有200个rRNA基因拷贝，每个基因之间由不转录的间隔DNA分隔，这种间隔长度在不同种属生物间差别较大。
每个基因由3个外显子和2个内含子组成，3个外显子依次为编码18S rRNA、5.8S rRNA、28S rRNA的前体序列，共同组成一个转录单位。
在RNA聚合酶I催化下转录形成原始rRNA前体--45S rRNA，最终剪切为28S、18S和5.8S rRNA（图9-8)。
有关45S rRNA前体的加工过程及其与核糖体大、小亚基形成的关系，已在第八章细胞核中详细叙述。
rRNA前体的另一种加工形式是甲基化，主要发生在核糖的2'－轻基，一般认为，这种化学修饰有利于前体rRNA的有效裂解。
非转录区转录单位
II妇蠲圈，
＇，护夕转录间隔区
转录单位
转录!RNA聚合酶I催化
RNA初级产物45S|18S5.8S28S
RNA加工修饰卜转录间隔区被颐
成熟的rRNA分子仁二二］仁Jc==]
有研究表明，rRNA的剪接不需要任何蛋白质的参与即可发生，进行的是自身剪接。
1982年T.
Cech等发现在四膜虫细胞的rRNA剪接过程中，前体rRNA释放出一种能催化霖核昔酸底物剪接的短链RNA(Ll9RNA)，即为一种具有酶活性的核酶(ribozyme)。
（三）新合成的tRNA只有经过加工修饰后才能成为有活性的分子tRNA是一类小分子撮的RNA分子，真核细胞中有50~60种。
它们能够识别mRNA中的密码子并携带由密码子所指定的氨基酸进行蛋白质的合成。
在真核细胞中含有多个编码tRNA的基因，人体细胞中有1300个拷贝，成簇存在并被间隔区分开，在RNA聚合酶皿的作用下被转录为tRNA前体。
tRNA前体基因转录需要两种转录因子，TF皿B和TF皿C，它们可与tRNA基因转录起始点下游＋10~+60中的两个特殊区段结合形成复合物，该复合物与RNA聚合酶皿结合，启动tRNA基因的转录。
真核生物tRNA前体约为100个核昔酸长度，这种新转录生成的tRNA前体一般无生物活性，需要进行剪接和碱基修饰才能形成成熟的tRNA。
第二篇细胞的结构与功能
转变为假尿密唗核节；＠脱氨基反应，部分腺甘酸脱氨基成为次黄嗦呤核昔酸。
(3)3'末端加上CCA：在核甘酸转移酶的作用下，3＇末端除去个别碱基后，换上tRNA分子统一的CCA-OHc末端，完成tRNA分子中的氨基酸臂结构。
原核生物tRNA成熟的机制与真核生物相同。
（四）5SrRNA由核仁外基因编码5S rRNA是一类特殊的rRNA分子。
与其他类型的rRNA分子不同，5S rRNA是由核仁外的基因编码，5S rDNA为串联排列的多拷贝基因，在RNA聚合酶III的作用下，5S rDNA转录为5S rRNA。
由千在5S rDNA中无内含子存在，所以，由5S rDNA转录形成的5S rRNA无需进一步的剪切加工，即可转运至核仁中，直接参与核糖体大亚基的组装。
第三节蛋白质的生物合成
在遗传信息的传递过程中，DNA将其遗传信息转录给mRNA，这是基因表达的第一步，mRNA再指导蛋白质的合成，这是基因表达的第二步，即翻译(translati o n)。
在翻译过程需要300多种生物大分子的参与，其中包括核糖体、mRNA、tRNA及多种蛋白质因子。
mRNA作为翻译的模板，决定蛋白质中的氨基酸顺序；tRNA作为运输工具，携带氨基酸准确进入指定位置；rRNA与多种蛋白质组成核糖体，作为蛋白质合成的装配机器。
体内的蛋白质处千不断合成与降解的动态平衡。
细胞内的蛋白质不断地被降解和被新合成的蛋白质取代，以维系细胞正常的生命活动。
—、遗传信息翻译的基本原理
(—)mRNA携带指导蛋白质合成的遗传密码
生物体的遗传信息储存于DNA分子四种碱基的排列顺序中，通过转录，这种顺序转移到mRNA分子中。
由千DNA和RNA具有相似的结构特点，因而在转录中可通过碱基互补配对的形式实现信息的传递。
但RNA和蛋白质的结构不同，而且组成蛋白质的氨基酸有20种，组成RNA的碱基只有4种，无法实现相互之间的一一对应。
那么RNA与蛋白质间的信息传递是以什么方式进行的呢？
现在人们认识到，在mRNA链上从5'端到3'端每3个相邻的核背酸可以决定一个特定的氨基酸，这种核甘酸三联体被称为密码子(codon)。
除了5'端和3'端的非翻译区之外，整个mRNA链即是由串联排列的密码子组成，这样，就把mRNA上的碱基排列顺序叫做遗传密码(genetic code)。
在蛋白质合成中，它们决定氨基酸的排列顺序。
核昔酸有4种，每3个为一组，共可组成64种密码子（表9-2)。
第九童细胞内遗传信皂的传递及调控215
G续表
第一碱基第二碱基第三碱基(5'端）u C A G(3'端）
AUU异亮氨酸ACU苏氨酸AAU门冬酰胺AGU丝氨酸u
A AUC异亮氨酸ACC苏氨酸AAC门冬酰胺AGC丝氨酸AUA异亮氨酸ACA苏氨酸AAA赖氨酸AGA精氨酸A AUG甲硫氨酸ACG苏氨酸AAG赖氨酸AGG精氨酸GGUU颌氨酸CCU丙氨酸GAU门冬氨酸GGU甘氨酸u GUC颌氨酸GCC丙氨酸GAC门冬氨酸GGC甘氨酸C GUA颌氨酸GCA丙氨酸GAA谷氨酸GGA甘氨酸A GUG颌氨酸GCG丙氨酸GAG谷氨酸GGG甘氨酸G遗传密码有如下特点：心通用性(universal)：从原核生物到真核生物，几乎所有生物体中的遗传密码都是通用的，就是说，一个特定的碱基序列无论在哪一种生物体中均编码同一种氨基酸。
但也有例外，动物细胞线粒体和植物细胞叶绿体中，蛋白质合成所使用的三联密码子有少数与目前通用密码子有所不同（详见第六章）。
＠简并性(degeneracy)：密码子有64种，其中三个密码子UAA、UAG、UGA为终止密码，不决定氨基酸，其余61个密码子都可以编码氨基酸，而氨基酸只有20种，所以，必然出现多个密码子决定同一氨基酸的情况，这种现象叫做遗传密码的简并性。
如丙氨酸由GCU、GCC、GCA、GCG4种密码子决定，而亮氨酸则由6种密码子决定。
＠连续性(commaless)：在翻译过程中，遗传密码的阅读是连续的，在mRNA上的每个三联体密码子之间没有间隔。
＠方向性（如ect ion):mRNA中每个密码子的阅读方向必须从5'-+3'，因而起始密码子AUG总是位千5'端，终止密码子则位于3'端，翻译过程是从mRNA的5'一3'方向进行。
（二）tRNA既能识别mRNA上的密码子又能携带特定的氨基酸在翻译过程中，mRNA上的碱基序列可以决定蛋白质中的氨基酸序列，但在mRNA碱基与氨基酸之间不具有特异的化学识别作用，两者之间的相互作用是通过另一类核酸分子tRNA实现的。
tRNA既能够识别mRNA上的密码子，又能携带特定的氨基酸，因而被称为蛋白质合成的接合器(adap tor)（图9-9)（动画9-1"tRNA的转录后加工”)。
合成的肤链
酸基酸
\I/动方向
对应氨基酸的密码子
tRNA结构的主要特点是3'端的CCA序列，活化后的氨基酸就是通过CCA序列上的－OH与tRNA结合，然后被带到核糖体上参与蛋白质的合成。
tRNA携带特定氨基酸的过程是通过氨酰－tRNA合成酶催化的两步反应完成的，反应的第一步是氨基酸与ATP在氨酰－tRNA合成酶作用下形成氨酰AMP，完成氨基酸的活化；第二步，活化氨基酸的氨酰基被转移至tRNA分子上形成氨酰－tRNA(aminoacyl-tRNA)并释放AMP，完成氨基酸与tRNA的连接。
tRNA的另一个重要的结构部位是位于反密码环中的一个三联核背酸，在蛋白质合成中能通过碱基互补配对识别mRNA上的密码子，这种存在于tRNA中的三联核昔酸被称为反密码子(anticodon)。
不同的tRNA分子有不同的反密码子。
在翻译过程中，tRNA携带特定的氨基酸，通过反密码子识别mRNA上的密码子，实现遗传信息从mRNA到蛋白质的传递，因此，密码子与反密码子之间的正确识别是遗传信息正确传递的保证。
在生物体中，tRNA的种类要小于编码氨基酸的密码子的种类，要识别这些密码子，必然存在一种反密码子识别多种密码子的现象。
一般来讲，密码子的前两位碱基在和反密码子配对时，遵循正常的碱基互补配对原则，而第三位碱基的配对具有一定的灵活性，即反密码子的第三个碱基(5'碱基）可与密码子第三位上的不同碱基配对，这就是密码子和反密码子配对的摆动性(wobble)。
例如，携带丙氨酸的tRNA反密码子为3'-CGC-5'，它既可以和密码子5'-GCG-3'配对，也可以和5'-GCU-3'配对。
二、蛋白质合成的场所——核糖体
核糖体(ribosome)也称核蛋白体。
核糖体几乎存在千所有的细胞内，即使是最简单的支原体细胞也至少含有上百个核糖体。
此外，在线粒体中也含有核糖体。
核糖体是合成蛋白质的机器，其功能是按照mRNA的指令由氨基酸合成蛋白质。
（一）核糖体是由rRNA和蛋白质组成的大分子复合物生物体内含有两种基本类型的核糖体，一是70S的核糖体，存在于原核细胞；另一类是80S的核糖体，存在于真核细胞。
此外，真核细胞线粒体内的核糖体近于70S。
70S和80S的核糖体均由大小不同的两个亚单位组成，大的称为大亚基，小的称为小亚基。
核糖体大小亚基在细胞内一般以游离状态存在，只有当小亚基与mRNA结合后，大亚基才与小亚基结合，形成完整的核糖体。
分析结果显示：在70S核糖体中，小亚基为30S，由16S rRNA和21种蛋白质组成，大亚基为50S,由23S rRNA、5S rRNA和34种蛋白质组成。
在80S核糖体中，小亚基为40S，由18S rRNA和33种蛋白质组成，大亚基为60S，由28S rRNA、5.8S rRNA和5S rRNA及49种蛋白质组成（表9-3)。
RNA约占核糖体的60%，蛋白质约占40%。
核糖体中的RNA主要构成核糖体的骨架，将蛋白质串联起来，并决定蛋白质的定位。
原核生物真核生物完整核糖体70S80S核糖体大亚基50S60S组成大亚基的rRNA23S，含2900个核昔酸28S，含4700个核昔酸5S，含120个核昔酸5.8S，含160个核昔酸5S，含120个核昔酸组成大亚基的蛋白质34种约49种核糖体小亚基30S40S组成小亚基的rRNA16S，含1540个核昔酸18S，含1900个核昔酸组成小亚基的蛋白质21种约33种电镜下，核糖体呈颗粒状，直径约为15-25nm，图9－l0显示了根据电镜负染色结果所绘制的核糖体立体结构模型。
（二）核糖体是蛋白质合成的场所在原核细胞中，除少数核糖体附着在质膜以外，大部分核糖体则以游离形式存在。
在真核细胞第九章细胞内遗传信息的传递及调控217新生肤链释放部位核糖体大亚基中，很多核糖体附着在内质网膜的外表面，形成糙面内质网，还有一部分核糖体以游离形式分布在细胞质溶胶内。
呈游离状态的核糖体称为游离核糖体，附着在膜上的核糖体称为附着核糖体，两者的结构与功能基本相同，其不同点在于所合成的蛋白质种类不同，如游离核糖体主要合成细胞内的某些基础性蛋白，附着核糖体主要合成细胞的分泌蛋白和膜蛋白。
核糖体上存在多个与蛋白质的多肤链形成密切相关的活性部位（图9-11)，主要有：1.
mRNA结合位点原核生物30S小亚基具有专一性地识别和选择mRNA起始位点的性质。
研究发现，30S小亚基通过其16S rRNA的3'端与mRNAS'端起始密码子上游碱基配对结合。
在原核生物的mRNAS'端起始密码子的上游都有一个SD序列(Shine-Dalgrunosequence)，即5'-AGGAGGU-3'序列，这个富嗦呤区与30S小亚基上16S rRNA3'端的富瞪唗区序列5'-CACCUCCUUA-3'互补。
SD序列可指导mRNA的起始密码子正确定位在30S小亚基的P位，又称为核糖体结合位点(ribosomal binding site, RBS)。
在真核生物中，核糖体上有专一位点或因子识别mRNA的帽子结构，使mRNA与核糖体结合。
5参与蛋白质合成的因子的结合部位如结合起始因子(initi at i on factor, IF汃延长因子(e longation factor, EF)和终止因子或释放因子(release factor, RF)的部位。
三、蛋白质合成的一般过程
蛋白质生物合成可分为五个阶段，即氨基酸的活化、多肤链合成的起始、肤链的延长、肤链的终止和释放、蛋白质合成后的加工修饰。
原核生物与真核生物的蛋白质合成过程中有很多区别，真核生物此过程比较复杂，下面着重介绍原核生物蛋白质合成的过程，并指出真核生物与其不同之处。
\}{ai（一）氨基酸活化是蛋白质生物合成的预备阶段氨基酸在参与合成肤链以前需活化以获得额外的能量。
在氨酰－tRNA合成酶作用下，氨基酸的狻基与tRNA3'末端的CCA-OH缩合成氨酰－tRNA。
该反应是耗能过程，生成的氨酰－tRNA中酷酰键含较高能量，可用千肤键合成。
其总反应式可写为：氨基酸＋tRNA+ATP----*氨酰－tRNA+AMP+PPi氨酰－tRNA合成酶分布在细胞质中，其作用具有高度特异性，它既能识别特异的氨基酸，又能辨认携带该种氨基酸的特异tRNA，这是保证遗传信息准确翻译的关键之一。
（二）起始过程形成起始复合物
起始阶段指核糖体大、小亚基，mRNA和具有启动作用的起始氨酰－tRNA装配为起始复合物的过程。
具有启动作用的氨酰－tRNA在原核细胞是甲酰甲硫氨酰－tRNA(fMet-tRNA仆1e'），在真核细胞是甲硫氨酰－tRNA(Met-tRNAMe,)。
在大肠杆菌中翻译起始复合物形成的过程：心在起始因子－1(IF-1)和(IF-3)作用下，核糖体30S小亚基附着于mRNA起始信号部位(SD序列），形成IF1-IF3-30S亚基－mRNA复合物；＠在起始因子－2作用下，fMet-tRNA仆1e'与mRNA分子中的AUG相结合（密码子与反密码子配对），形成30S前起始复合物，即IF1-IF2-IF3-30S亚基－mRNA-fMet-tRNA几le复合物，此步需要GTP和M忙参与；＠50S亚基与上述的30S前起始复合物结合，同时IF-1、IF-2和IF-3脱落，形成70S起始复合物，即30S亚基－mRNA50S亚基－mRNA-fMet-tRNAfme'复合物。
此时fMet-tRNAf!lc'占据着50S亚基的肤酰位(P位），而A位留空有待千对应mRNA中第二个密码的相应氨酰－tRNA进入，从而进入延长阶段（图9-12)。
30S亚基/二)l~也@
形成的复合物
与mRNA`结合l
+50S亚只
第九章细胞内遗传信息的传递及调控219
与原核细胞相比，真核细胞蛋白质合成起始过程更为复杂。
参与该过程的起始因子被称为eIF(e代表真核细胞）。
某些eIF参与了40S小亚基与mRNA5'端帽子结构的结合。
在起始复合物形成后，40S小亚基在mRNA上扫描直到发现正确的AUG起始密码子，然后5'3'eIF被释放，60S大亚基结合到起始复合物上来，启动蛋白质的合成。
此外，mRNA3'端尾部的poly-A可以促进起始复合物的形成，提高翻译效率。
（三）肤链延长是多因子参与的核糖体循环过程
起始复合物形成后，根据mRNA上密码子序列的指导，各种氨酰－tRNA依次结合到核糖体上使肤链从N端向C端逐渐延长。
由于肤链延长在核糖体上连续循环进行，所以这个过程又称为核糖体循环(ribosome circulali on)，核糖体循环包括进位(registration)、成肤(peptide bond formation)、转位(translocation)三个步骤（图9-13)。
每经过一个循环肤链增加一个氨基酸残基（动画9-2"蛋5'3'白质合成的进位、成肤、转位”)。
1.进位起始复合物形成时，P位已被起始－tRNA占据，而A位是空的。
根据70S起始复合物A位上』肤键形成mRNA密码子，特异的氨酰－tRNA进入A位。
此步骤需GTP、M矿和延长因子EF-Tu与EF-Ts。
EF-Tu和EF-Ts是延长因子EF-T的两个亚基。
EF-Tu与GTP、氨酰tRNA反应生成三元复合物－氨酰－tRNA-EF-Tu-GTP。
5'3'该复合物中tRNA的反密码子与小亚基上mRNA结合后，其中的GTP分解释放Pi,EF-Tu-GDP脱落并与EF-Ts
反应生成GDP和EF-Tu-EF-Ts，后者再与GTP反应，释放出EF-Ts生成EF-Tu-GTP并进入下一次延长反应。
-－转位2成肤在起始复合物形成后，核糖体的P位上已结合了£Me t-tRNA仆1e'，在进位后，P位和A位上各结合了一个氨酰tRNA，两个氨基酸之间在核糖体大亚基转肤酶的作用下，P位上的氨基酸提供a-COOH基，与A位上的氨基酸的a-N比基形成肤键，从而使P位上的氨基5'3'酸连接到A位氨基酸的氨基上，这就是成肤。
成肤后，在A位上形成了一个二肤酰tRNA。
P位上的tRNA随之从核糖体上脱落下来，使P位空出。
图9-13核糖体循环3.转位P位空出后，在延长因子G(EF-G)的作用下，由GTP供能，核糖体沿mRNA5'端向3'端移动一个密码子距离，结果使肤酰tRNA由A位移到P位，空出的A位可接受新的氨酰－tRNA。
此后，肤链上每增加一个氨基酸残基，即重复上述进位、成肤、转位的步骤，直至肤链合成终止。
真核细胞的肤链延长过程与原核细胞大致相同，仅在参与的因子方面有所区别。
如真核细胞的延长因子有3种，分别为eEFl a,eEFl防和eEF2；转位时所需因子为eEF-2。
（四）脉链合成终止过程包括三个步骤在核糖体向mRNA3'端移动中，肤链也逐渐延长，当mRNA的终止信号UAA、UAG、UGA中任一种进入A位时，没有任何tRNA能与之识别，只有释放因子(RF)识别这种信号。
原核细胞的RF有3种，RF-1识别UAA和UAG,RF-2识别UAA和UGA,RF-3结合GTP并促进RF-1、RF-2与核糖体结1.终止密码的辨认当A位上出现终止密码时，RF-I或RF-2识别并结合到A位上。
2肤链和mRNA等释出RF的结合使核糖体上转肤酶构象改变，具有水解酶活性，使P位上tRNA与肤链间酷键水解，肤链脱落。
tRNA、RF、mRNA也随后从核糖体上释出。
核糖体3核糖体大小亚基解聚在IF-3作用下，大小亚基解聚，重新进入新循环。
真核细胞终止过程与原核细胞相似，但其释放因子为eRF l，它可识别3种终止密码子。
在生物细胞内进行蛋白质合成时，每分子mRNA上NH2不只结合一个核糖体，而是同时结合着多个核糖体。
蛋白质开始合成时，第一个核糖体在mRNA的起始部位结器合，引入第一个甲硫氨酸，接着核糖体向mRNA的3'端移动一定距离后，第二个核糖体又在mRNA的起始部位图9-14多聚核糖体与蛋白质合成结合，并向前移动一定的距离，在起始部位又结合第三个核糖体，依次下去直至终止。
这样，多个核糖体结合到一个mRNA分子上，成串排列，形成蛋白质合成的功能单位，称为多聚核糖体(polyribosome)（图9-14)。
两个核糖体之间有一定的长度间隔，每个核糖体都独立完成一条多肤链的合成，所以这种多聚核糖体可以在一条mRNA链上同时合成多条相同的多肤链，这就大大提高了翻译的效率。
四、肤链合成后的加工修饰
从核糖体mRNA链释放的新生多肤链尚不具有生物活性，必需经过化学修饰（如糖基化、甲基化等）和加工处理，使其在一级结构的基础上进一步盘曲、折叠，对千含有多个亚基的蛋白质还需要亚基与亚基间的结合，这样才能形成具有天然构象和生物学活性的功能蛋白。
(—)一级结构的修饰改变了多肤链氨基酸的性质和组成新生多肤链一级结构的修饰常通过化学反应进行，如磷酸化、甲基化、二硫键形成等，这往往能改变多肤链氨基酸的性质和组成，并为空间结构的形成提供基础。
1.肤链氨基端的修饰原核生物中几乎所有蛋白质合成都是从N－甲酰甲硫氨酸开始，真核生物从甲硫氨酸开始，但天然蛋白质大多数不是以甲硫氨酸或甲酰甲硫氨酸为氨基端起始的。
因此，在多肤链合成终止，甚至在肤链合成进行的同时，甲酰基经脱甲酰基酶水解而除去，甲硫氨酸或者氨基端的一些氨基酸残基由氨肤酶水解掉，包括除去信号肤序列。
2.共价修饰许多蛋白质可以进行不同类型化学基团的共价修饰，如磷酸化、糖基化、胫基化、甲基化、乙酰化和二硫键形成等，修饰后可以表现为激活状态，也可表现为失活状态。
磷酸化多发生在多肤链丝氨酸、苏氨酸和酪氨酸残基上，由蛋白激酶催化，磷酸化后蛋白质的活性发生改变，如磷酸化酶经磷酸化后活性增加，而糖原合成酶经磷酸化后活性丧失；质膜蛋白质和许多分泌型蛋白质都具有糖链，这些寡糖链通过糖基化反应结合在丝氨酸或苏氨酸的经基上，如红细胞膜上的ABO血型决定簇；胶原蛋白前体脯氨酸和赖氨酸残基胫基化形成经脯氨酸和胫赖氨酸，对成熟胶原的链间共价交联是必需的；mRNA上没有胱氨酸的密码子，多肤链中的二硫键，是在肤链合成后，通过两个半胱氨酸的琉基氧化形成的，二硫键的形成对维持蛋白质的活性和结构是必需的。
3多肤链的水解修饰有些活性蛋白往往是由其无活性的前体蛋白水解而得来的，如大多数的蛋白酶原水解后转变为蛋白酶。
一般真核细胞中一个基因对应一个mRNA，一个mRNA对应一条多彷，：，肤链，但少数情况下一种mRNA翻译后的多肤链经水解后产生几种不同的蛋白质或多肤，如哺乳动物的鸦片样促黑皮质激素原(proopio-melano-cortin, POMC)初翻译产物为265个氨基酸，在垂体前叶细胞中，POMC初切割成为N－端片段和C－端片段的B－促脂解激素(13-LT, lipotropin)，然后N－端片段又被切割成较小的N－端片段和39肤的促肾上腺皮质激素(ACTH)，而在脑下垂体中叶细胞中，B-促脂解激素再次被切割产生B－内啡肤(!3-endorphin); ACTH也被切割产生13肤的促黑激素(a-melanotropin)。
（二）高级结构的修饰包括亚基聚合、多肤折叠和辅基连接有许多蛋白质是由两个以上亚基构成，并需要各亚基肤链通过非共价键聚合成多聚体才能表现出完整的生物活性，如由两条a链、两条B链所组成的入血红蛋白、细胞膜上的镶嵌蛋白和穿膜蛋白等。
新生肤链必须逐步折叠成天然空间构象才能成为有活性的功能蛋白。
一般认为，蛋白质一级结构是其空间结构形成的基础，同时也需要其他的酶、蛋白质辅助才能完成折叠过程。
分子伴侣(molecular chaperone)是一类能识别肤链的非天然结构、并能促进各功能域和整体蛋白质的正确折叠的酶或蛋白分子，它能介导其他蛋白质正确装配成有功能活性的空间结构，而本身并不参与最终装配产物的组成。
目前认为“分子伴侣＂蛋白有两类：O蛋白因子，如热休克蛋白(heat shock protein, HSP)、伴侣素(chaperonin)，它们可以和部分折叠或没有折叠的蛋白质分子结合，稳定它们的构象，使其免遭其他酶的水解或促进蛋白质折叠成正确的空间结构；＠酶，如蛋白质二硫键异构酶(protei n disulfide isomerase, POI)，可以识别和水解非正确配对的二硫键；肤－脯氨酸顺反异构酶(peptide prolyl cis-trans i somerase, PPI)能促进多肤链中肤酰－脯氨酸肤链的顺反异构体之间的转换。
有些蛋白，特别是结合蛋白和带辅基的酶，合成后都需要结合相应辅基，才能成为天然功能蛋白质。
五、蛋白质的降解
细胞内蛋白质处千不断合成与降解的动态平衡。
细胞内的蛋白质不断地被降解和被新合成的蛋白质取代。
蛋白的降解在细胞的生理活动中发挥着不可替代的作用，包括处理损伤或错误折叠的蛋白翻译后修饰的蛋白及功能发挥后蛋白质的清除等。
细胞内蛋白质在一系列蛋白酶的作用下水解成多肤，再在肤酶作用下降解成游离氨基酸，又再被重利用合成新的蛋白质。
如果蛋白质的降解速率和位点出现异常，就会影响细胞的多种功能，如细胞分裂、信号传递等，从而导致疾病的发生。
胞内蛋白质的降解主要通过两个途径，即泛素－蛋白酶体途径(ubiquitin proteasome system)和溶酶体途径。
(1)蛋白质通过泛素－蛋白酶体途径被降解：泛素－蛋白酶体途径是细胞内蛋白质选择性降解的重要途径。
细胞中新合成的蛋白质中有超过30％需要通过泛素介导而被降解以保证蛋白质的质址。
泛素是在1975年从小牛的胰脏中分离得到的1种含有76个氨基酸的小肤，随后被发现存在于大掀不同的组织和有机体（但至今未在细菌中发现）中，因此命名为泛素(ubiqu山n)。
泛素可以与待降解的蛋白质共价结合，而且一种蛋白质可以和多个泛素分子结合。
后来将这种现象称为多泛素化(poly咖quitination)，蛋白质的多泛素化是启动蛋白质降解的信号。
在细胞内存在3种与泛素有关的重要的酶：泛素激活酶(E l汃泛素结合酶(E2汃泛素蛋白连接酶(E3)。
El激活泛素分子，此过程需要ATP供能；泛素分子被激活后被运送到E2上，E2负责将泛素绑在被降解的蛋白质上；E3能识别被降解的蛋白质；最后，E3释放出被泛素标记的蛋白质。
如此循环反复，在结合了一定数量（一般认为至少5个）的泛素分子后，被降解蛋白质就被运送到细胞内的一种被称为＂垃圾处理厂＂的蛋白酶体(pro teasome)结构中进行降解（图9-15)。
蛋白酶体是一个26S蛋白复合体，主要存在于细胞核和细胞质中，负责依赖泛素的蛋白质降解途径，降解异常蛋白和短寿命蛋白。
蛋白酶体本身不具备选择蛋白质的能力，只有被泛索分子标记而且被E3识别的蛋白质才能在蛋白酶体中进行降解。
(2)蛋白质在溶酶体通过ATP非依赖途径被降解：与蛋白质在蛋白酶体通过ATP依赖途径被降解的途径不同，溶酶体是真核细胞的消化器官，内含多种酸性水解酶，可以直接分解蛋白质分子。
蛋。
222第二篇细胞的结构与功能
第一步第二步
蛋白底物
砌四@@~@b
泛素@@@
多三三步
硐砌b n'b尸'>』\`也;*子
多肤
＠泛素活化酶＠泛素结合酶＠泛素－蛋白连接酶26S蛋白酶体白质通过此途径降解，是不需要ATP提供能量的。
蛋白物质经自噬形成自噬体，或内吞作用进入细胞后，通过溶酶体消化，分解为小分子氨基酸。
溶酶体降解蛋白质是一条非特异性的蛋白质降解系统，真核细胞内的膜蛋白、长寿蛋白和一部分短寿命蛋白都是在溶酶体中降解的。
蛋白质在溶酶体的酸性环境中被相应的酶降解，然后通过溶酶体膜的载体蛋白运送至胞液，为合成新的蛋白质提供原料（动画9-3”原核生物肤链合成终止过程”)。
第四节基因表达的调控
遗传信息（基因信息）由DNA转录为RNA、再由RNA翻译为蛋白质，通常称为基因的表达。
基因表达的实质是通过基因的转录和翻译，产生具有特异生物学功能的蛋白质分子，赋予细胞或个体一定的功能或形态表型。
基因的表达受到严密和精确的调控，以适应环境、维持生长和发育的需要。
遗传信息传递过程中任何环节的改变均会导致基因表达的变化，基因表达的涸控可发生在遗传信息传递的各个阶段。
基因表达的调控一般表现为正性调控(pos山ve regulation)和负性调控(negative regulation)，前者使基因表达量增加，后者则是使基因表达量减少。
在介绍基因的表达调控之前，首先了解一下基因表达的特点。
一、基因表达的一般特点
同一个体所有细胞都具有相同的基因组，携带个体生存、发育、活动和繁殖所需要的全部遗传信息。
但生物基因组的遗传信息（基因）不是同时全部都表达出来，即使是极其简单的生物（如最简单的病毒），其基因组所含的全部基因也不是以同样的强度同时表达。
（一）基因表达具有时间性和空间性
·1'`基因表达具有严格的时间和空间特异性，这是由基因的启动子等调控序列与调节蛋白相互作用第九章细胞内遗传信息的传递及调控223决定的。
例如，病原体侵入宿主后呈现一定的感染阶段，随感染阶段的发展、生长环境的变化，有些基因开启，有些基因关闭。
按照功能需要，某一特定基因表达严格按照一定的时间顺序发生，这称为基因表达的时间特异性(temporal specifi city)。
多细胞生物从受精卵到组织、器官形成的各个不同发育阶段，都会有不同的基因严格按照自己特定的时间顺序开启或关闭，表现为分化、发育阶段一致的时间性，也称为阶段特异性(stage specifi city)。
在个体某一发育、生长阶段，同一基因产物在不同的组织器官中表达多少是不一样的。
一种基因产物在个体的不同组织或器官中表达，即在个体的不同空间出现，这就是基因表达的空间特异性(spa tial specificity)。
不同组织细胞中不仅表达的基因数量不相同，而且基因表达的强度和种类也各不相同，这就是基因表达的组织特异性(tissue specific ity)。
例如肝细胞中涉及编码鸟氨酸循环酶类的基因表达水平高于其他组织细胞，合成的某些酶（如精氨酸酶）为肝脏所特有。
（二）基因表达有组成性表达和可诱导／阻遏表达两种方式改变基因表达的情况以适应环境，在原核生物、单细胞生物中尤其显得突出和重要，因为这些细胞的生存环境经常会有剧烈的变化。
例如，周厮有充足的葡萄糖，细菌就可以利用葡萄糖作为能源和碳源，不必更多去合成利用其他糖类的酶类；当外界没有葡萄糖时，细菌就要适应环境中存在的其他糖类（如乳糖、半乳糖、阿拉伯糖等），开放能利用这些糖的酶类基因，以满足生长的需要。
即使是内环境保持稳定的高等哺乳类动物，也经常要变动基因的表达来适应环境。
例如，与适宜温度下生活相比较，在冷或热环境下适应生活的动物，其肝脏合成的蛋白质图谱就有明显的不同；长期摄取不同的食物，体内合成代谢酶类的情况也会有所不同。
二、原核基因的表达调控
相对千真核细胞，原核细胞的基因表达调控机制比较简单，研究得较为深入。
转录调控是原核生物基因表达调控的关键步骤。
原核生物大多数基因表达调控是通过操纵子机制实现的。
操纵子(operon)由结构基因和表达调控元件组成，是原核细胞中最常见的表达调控单位。
操纵子机制在原核基因表达调控中具有普遍意义。
首饭衬？
东回原核基因表达调控最典型的代表是大肠杆菌(E.
coil)乳糖操纵子(lac operon)调控模式。
在此，以乳糖操纵子为例说明原核基因的表达调控机制（动画9-4"乳糖操纵子阻遏蛋白的负性调节”)。
大肠杆菌乳糖代谢相关基因组成乳糖操纵子。
大肠杆菌的乳糖操纵子含LacZ、LacY和LacA三个结构基因，分别编码B－半乳糖昔酶(r3-galactos idase)、p－半乳糖昔通透酶(permease）和B－半乳糖昔乙酰转移酶(tran sace tylase)，此外还有一个操纵序列0lac、一个启动序列plac及一个调节基因Lael（图916)。
Lael编码一种阻遏蛋白(repressor)，后者与Ohc序列结合，使操纵子受阻遏而处于关闭状态。
在启动子P/，IC上游还有一个分解（代谢）物激活蛋白(catabolite activator protein, CAP)的结合位点，其主要作用是增强乳糖操纵子的转录活性。
由P如序列、0如序列和CAP结合位点共同构成乳糖操纵子的调控区，三个酶的编码基因都由同一调控区调节，实现基因产物的协调表达。
224第二篇细胞的结构与功能
调节基因启动序列DNA各1LacZILac Y|LacA l
操纵序列！
o－半乳糖昔酶基因\胪－半乳糖背乙
庐－半乳糖昔酰转移酶基因
通透酶基因
大肠杆菌在没有乳糖的环境中生存时，乳糖操纵子处于阻遏状态。
Laci在其自身的启动子控制下，表达产生阻遏蛋白，阻遏蛋白与操纵序列0lac结合，阻碍了RNA聚合酶与启动子plac的结合，阻止了基因的转录启动。
当有乳糖存在时，乳糖受B－半乳糖甘酶的催化转变为半乳糖，半乳糖与阻遏蛋白结合，使其构象改变，失去与Olac的亲和力，与Olac解离，基因转录开放。
该机制很好地解释了单纯乳糖存在时，细菌是如何利用乳糖作碳源的。
然而细菌生长环境是复杂的，例如有葡萄糖或葡萄糖／乳糖共同存在时，细菌首先利用葡萄糖才是最节能的。
这时，葡萄糖的存在使细菌内的cAMP浓度降低，阻碍cAMP与CAP结合，抑制乳糖操纵子转录（因为只有与cAMP结合的CAP才能结合到PI《,c上游的CAP结合位点），使细菌只能利用葡萄糖（动画9-5“低糖时，乳糖操纵子正、负性调节的协同作用＂；动画9-6“高糖时，乳糖操纵子正、负性调节的协同作用”)。
三、真核基因的表达调控
真核细胞的基因表达调控要比原核细胞复杂得多。
由于核膜的存在，真核细胞基因的转录与蛋白质的翻译分别在细胞内不同的区域进行。
真核细胞基因表达调控可以在转录水平、RNA加工水平、RNA转运水平、mRNA降解水平、翻译水平和蛋白质活性水平上进行（图9-17)。
对大多数基因来说，转录水平是最重要的控制点。
此外，在某些细胞中DNA水平的变化如染色质上基因拷贝数的变化、DNA重排、DNA甲基化等也会影响基因的表达，这将在第十五章细胞分化中介绍。
三[蛋
运转控调
DNA----.-----转录.~mRNA m RN l2
转录水平RNA加工的调控调控
质白
（一）转录水平调控是真核细胞基因表达的主要控制点转录水平调控主要是对基因表达转录起始的调节。
真核基因具有复杂的调控区，它包括启动子区和其他能调节基因表达的转录因子和基因调节蛋白结合位点。
影响基因表达的各种因子通过与DNA调控区的结合而增强或抑制基因的表达。
图9-18显示了真核细胞基因表达调控区的一般结构。
真核细胞中存在多种基因表达调节蛋白，它们能促进或抑制基因的转录，有些基因表达调节蛋白是特异性的DNA结合蛋白，它们能够和靶基因相邻的DNA序列结合；还有一些基因表达调节蛋白虽然不能直接与DNA结合，但它们可通过与其他基因表达调节蛋白的相互作用调控基因转录。
通常将基因表达调节蛋白称做反式作用因子(trans-acting factor)，将它们所识别的DNA序列叫做顺式作用元件o;~(cis-acting element)。
具体地讲，顺式作用元件是对基因表达有调节活性的DNA序列，其活性只影响第九章细胞内遗传信息的传递及调控225与其自身同处在一个DNA分子上的基因，这种DNA序列一般不编码蛋白质，多位千基因旁侧或内含子中。
基因表达的调节是通过反式作用因子与顺式作用元件相互作用而实现的。
基因表达调节蛋白
调控序列1间隔DNA序列1
X基因的调控区
1.顺式作用元件是能够调控基因表达的特殊DNA序列根据顺式作用元件在基因组中的位置、转录激活作用的性质及发挥作用的方式，可将真核基因的顺式作用元件分为启动子、增强子(enhancer)和沉默子(silencer)。
启动子是决定细胞基因转录起始、能被RNA聚合酶所识别并结合的特异性DNA序列，它是基因准确和有效地进行转录所必需的结构（详见本章第一节）。
增强子是一种能增强真核细胞某些启动子功能的调节序列，不具有启动子的功能，但能增强或提高启动子的活性。
增强子在DNA双链中没有5'与3'固定的方向性，作用不受序列方向性的限制。
增强子在所调控基因的上游或下游均可发挥作用，但大多位千上游；下游内含子中，乃至下游最后一个外显子以外的序列也可含有增强子。
增强子在距离启动子相对较远（距启动子数kb至数十kb)时也能发挥作用。
增强子一般有组织或细胞特异性，但对启动子的影响无严格的专一性。
基因重组实验证明，同一增强子可影响不同类型的启动子，真核生物增强子也可影响原核生物的启动子（图9-19)。
在顺式作用元件中还存在一种与增强子作用相反的沉默子。
沉默子是基因表达的负性调控元件。
当特异蛋白因子与其结合时，对基因转录起阻遏作用。
沉默子最早在酵母中发现，后来在T淋巴细胞的T抗原受体基因的转录和重排中也证实了这种负调控顺式元件的存在。
目前对这种在基因转录降低或关闭中起作用的序列研究还不多，但从已有的例子来看，沉默子的作用可不受序列方向的影响，能远距离发挥作用，并可对异源基因的表达起作用。
2.反式作用因子通过顺式作用元件调控基因的表达真核基因表达的调节蛋白又称转录调节因子或转录因子。
绝大多数真核转录调节因子由它的编码基因表达后，通过与特异的顺式作用元件的识别、结合（即DNA－蛋白质相互作用）反式激活另一基因的表达。
RNA聚合酶和转录因子就是反式作用因子。
能直接结合DNA序列的反式作用因子是少数，但不同的反式作用因子之间可以相互作用，因而目前认为多数转录因子是通过蛋白质－蛋白质间作用与DNA序列联系并影响转录效率的，转录因子之间或转录因子与DNA的结合都会引起DNA构象的变化，从而调节转录。
作为蛋白质的转录因子从功能上分析其结构，可包含有不同区域：心DNA结合域(DNA binding domain)：多由60~l00个氨基酸残基构成的几个亚区组成。
其他一些不与DNA直接结合的转录因子没有DNA结合域，但能通过转录激活域直接或间接作用千转录复合体而影响转录效率。
＠转录激活域(activating domain)：常由30~100个氨基酸残基组成，该结构域包含富含酸性氨基酸、富含谷氨酰胺、富含脯氨酸等不同种类。
＠连接区：即连接上两个结构域的部分。
与DNA结合的转录因子大多以二聚体形式起作用，其DNA结合域常见有以下几种：心锌指结构(zinc finger)，是最常见的DNA结合域，它由约23个氨基酸残基组成，其中的半胱氨酸和组氨酸通过配位键与锌原子结合这样形成一个以锌原子为中心的”指“状结构，称为锌指结构。
锌指结构的N-ot})J)J~/`:1I//、二～\图9-19增强子作用模式示意图没有增强子存在时，基因转录维持在较低的基础水平(A)；当有增强子存在时，可以使转录水平升高。
增强子可以紧邻启动子上游(B)；也可以位于转录起始位点的上游或下游几kb处(C和D)；与转录方向相反的增强子也可刺激转录(E)末端形成B－片层，C－末端形成Cl'.－螺旋，Cl'.－螺旋能够与DNA大沟相结合（图9-20)。
一个转录因子中常常含有多个串联重复的锌指结构，如与GC盒结合的转录因子SP1中就含有3个重复的锌指结构，这些锌指结构中的3个Cl'.－螺旋恰好等于DNA大沟的一圈。
＠螺旋－转角－螺旋(helix-turn-helix, HTH),如图9-21A所示，这类结构域通常由3个Cl'.－螺旋结构组成，其中一个螺旋与DNA大沟结合，另两个螺旋则位于其上面起稳固作用。
例如，参与大肠杆菌乳糖操纵子调控的CAP蛋白以及真核细胞中的同源异形结构域(homeodomain)蛋白中就含有HTH结构域。
＠螺旋－环－螺旋(helix-loop-helix,HLH)，这类结构至少有两个Cl'.－螺旋，螺旋间由短肤段形成的环连接，两个具有HLH结构的转录因子以二聚体形式相连，两个较长的Cl'.－螺旋刚好能够嵌入DNA的大沟（图9-21B)。
例如，参与肌细胞生成的转录因子MyoD蛋白就含有HLH结构域。
＠亮氨酸拉链(l eucine zipper)，该结构的特点是蛋白质分子的肤链上每隔6个氨基酸就有一个亮氨酸残基，结果导致这些亮氨酸残基都在Cl'.－螺旋的同一个方向出现，两个这样的Cl'.－螺旋肤链单体就能通过亮氨酸残基以疏水键结合形成二聚体。
该二聚体另一端的·o肤段形成“Y”形的结构（富含碱性氨基酸残基）与DNA大沟结合（图9-21C)。
在肝、小肠上皮、脂肪细胞和某些神经细胞中有称为C/EBP(CCAAT/enhancer-binding protein)家族成员的一类蛋白质能够与CAAT盒结合，其特征就是能形成具有亮氨酸拉链的二聚体结构。
A．螺旋转角－螺旋
B．螺旋环－螺旋c．亮氨酸拉链
亮氨酸拉链
总之，反式作用因子能够通过识别启动子、启动子附近和增强子等顺式作用元件中的特异靶序列并与之结合（即蛋白质－DNA相互作用），以及通过蛋白质－蛋白质的相互作用，最终影响RNA聚合酶活性，从而对基因表达发挥正调控或负调控作用。
通常把发挥正调控作用的反式作用因子称为转录激活蛋白(acti valor)。
3真核细胞的阻遏蛋白真核细胞中除存在发挥正性调控作用的转录激活蛋白之外，还有一类阻遏蛋白(repressor，也称抑制子）也参与了真核细胞基因表达的负性调控。
与原核细胞中起同样作用的分子一样，真核阻遏蛋白通过与特定的DNA序列结合而抑制转录。
其中，某些阻遏蛋白通过干扰其他转录因子与DNA的结合来发挥抑制作用，例如，在转录起始位点附近结合的阻遏蛋白可以阻止RNA聚合酶或通用转录因子与启动子的相互作用；另一些阻遏蛋白则通过与转录激活蛋白竞争结合DNA分子中的调控序列发挥作用，这些阻遏蛋白含有和激活蛋白相同的DNA结合域，但是阻遏蛋白没有转录激活域，无法激活转录。
这类阻遏蛋白抑制基因转录的实质是：通过阻止激活蛋白与启动子或增强子的结合，抑制转录。
另一类阻遏蛋白，称为活性阻遏蛋白(active repressor)，与那些仅仅干扰激活蛋白结合的阻遏蛋白不同，它们虽然也有DNA结合域，但主要靠功能结构域通过蛋白质－蛋白质的相互作用来抑制转录，例如果蝇的Kruppel基因，其表达的蛋白质即为活性阻遏蛋白。
灼uppel蛋白中除了含有一个能够与DNA结合的锌指结构域之外，还存在一个独立的抑制结构域，灼uppel蛋白与DNA结合后，依赖其抑制结构域与特定的转录激活蛋白、中介蛋白或通用转录因子相互作用而抑制转录。
阻遏蛋白对基因转录的调控作用扩展了人们对真核细胞基因表达调控机制的认识。
阻遏蛋白一个重要的功能可能是抑制组织特异性基因在不适当细胞中的表达。
例如，免疫球蛋白基因的增强子中含有阻遏蛋白的结合位点，该位点与阻遏蛋白的结合有助于抑制非淋巴细胞中免疫球蛋白的表达，确保免疫球蛋白的组织特异性表达。
4.染色质通过结构重塑调控基因的转录染色质是高度有序的紧密结构，限制了转录因子对DNA的接近和结合，控制着真核细胞基因的转录。
基因表达激活首先需要将致密压缩的染色质／核小体舒展开来，该过程涉及具有酶活性的功能蛋白复合体参与，通过调整核小体结构，中和组蛋白碱性氨基酸残基上的正电荷来减弱组蛋白与DNA（携负电荷）间的结合，从而降低相邻核小体间的聚集，增加转录因子的进入，最终促进基因转录。
这种染色质结构的动态变化过程通常称为染色质重塑(chro matin remolding)。
染色质重塑是基因表达调控的主要方式之一。
目前认为引起染色质重塑的方式主要有以下两种（图9-22):
特定组蛋白的乙酰化结合通用转录因子
图9-22真核细胞中基因活化蛋白通过影响局部染色质的结构而激活转录显示了通过组蛋白共价化学修饰和染色质重塑复合体两种方式引起局部染色质结构改变(1)依赖ATP的物理性修饰：即以ATP水解释放的能矗，使组蛋白和DNA的构象发生局部改变。
该过程主要通过依赖ATP的染色质重塑复合体或染色质重建子(remodeler)来完成，这些复合体是一种以ATP酶为催化中心的多种蛋白亚基复合体，如SWI/SNF复合体，能够被DNA结合的激动子(activator，也称基因活化蛋白）或抑制子(repressor)招募至启动子部位，借ATP水解的能址移动核小体的位置使DNA序列暴露或被掩盖，而参与基因表达调控。
彸“I(2）组蛋白共价化学修饰：最初，染色质上的组蛋白被认为仅仅是维系染色质或染色体结构的组第九章细胞内遗传信息的传递及调控229成成分，现在入们认识到，组蛋白的结构是动态变化的，这种变化影响了染色质结构的构型，从而调节基因的表达。
组蛋白结构的改变源于组蛋白中被修饰的氨基酸。
核小体的核心组蛋白(H2A、H2B、H3和H4)是一类小分子量的强碱性蛋白，它们均由球状结构域（外周被146bp大小DNA包绕）和从核小体表面伸出的位千蛋白N－端的”组蛋白尾巴”组成。
近些年研究表明，组蛋白特别是H3和H4尾部的氨基酸残基能够被化学修饰，包括组蛋白的乙酰化(acetylation)、甲基化(methylation)、磷酸化(phosphorylation)、泛素化(ubiquitination)、sumo化(sumoylation)、多聚ADP核糖基化[poly(ADP-ribosyl)ati on]等。
组蛋白中被修饰氨基酸的种类、位置和修饰类型以及各种修饰在时间、空间上的组合与生物学功能的关系被称为组蛋白密码(histone code)，它决定了染色质转录活跃或沉默的状态。
图9-23描述了组蛋白修饰的一般概念和常见标记。
磷酸化噜户P户孽母
呐OT;:;岛TCGtAP陆OLAT沪酗~PATGGVtPH~l35aa
乙酰化
押户PP P
甲基化SCRCKCCKGLCKCCAKRHRKVLRDNIQGITKPAlRRLAR十组蛋白H4|102aa（精氨酸）I J581216211笚（活化甲嘉矗酸）)cRG~GGtRAKAKSRSSRAGLQFPVGRVHRLLRKGNY仁五正｀｀129..
甲基化（阻遏的赖氨酸）户梪
令泛素化PEPA~APAPK胪沪KAVTKAQKKDSKKRKRSRKESYSV仁亘画~125aa
A.组蛋白核心八聚体被DNA盘绕，N－端无结构的组蛋白尾部从八个组蛋白组成的球状结构域上伸出；B.组蛋白尾部氨基酸残基的修饰位点，组蛋白N－端的尾部痰括了已知共价修饰位点的大部分，修饰也可发生在球状结构域，一般地，活化标签包括乙酰化，精氨酸甲基化，以及一些赖氨酸甲基化，如H3K4和H3K36；球状区域的H3K79具有抑制沉默的功能；抑制标签包括H3K9、H3K27和H4K20组蛋白修饰导致基因转录或沉默的机制与其引起的染色质重塑密切相关。
组蛋白N－端尾部的氨基酸修饰直接影响了核小体的结构，进而影响到转录起始复合体是否易于同启动子部位的DNA结合。
在此以组蛋白常见的修饰方式一一组蛋白乙酰化为例，说明组蛋白修饰影响基因转录的机制。
组蛋白乙酰化多发生于H3和H4氨基酸的赖氨酸残基。
在组蛋白乙酰基转移酶(histone acetyltransferase,HAT，也称乙酰化酶）作用下，于组蛋白N－端尾部的赖氨酸加上乙酰基，称为组蛋白乙酰化。
组蛋白N端的赖氨酸残基乙酰化会移去正电荷，降低组蛋白和DNA之间的亲和力，使得RNA聚合酶和通用转录因子容易进入启动子区域（图9-22)。
因此，在大多数情况下，组蛋白乙酰化有利于基因转录。
低乙酰化的组蛋白通常位千非转录活性的常染色质区域或异染色质区域。
一些组蛋白可以快速地乙酰化，然后又去乙酰化，使得组蛋白结合基因的表达受到精确地调控。
组蛋白的去乙酰化由组蛋白去乙酰化酶(histone deacetylase, HDAC)催化完成，组蛋白去乙酰化则抑制转录。
其具体机制是：基因激活因子结合于特定上游激活序列(UAS)并招募组蛋白乙酰化酶，催化附近的组蛋白乙酰化，促进基因激活；而结合于上游抑制序列(URS)的转录抑制因子则招募组蛋白去乙酰化酶，催化附近的组蛋白去乙酰化，抑制转录。
5. DNA甲基化修饰程度影响基因表达水平真核DNA分子中的胞啼唗碱基约有5％被甲基化修饰为5－甲基胞啥唗。
胞啥唗碱基的甲基化修饰常发生在基因上游调控序列的CpG（岛）富含区。
处于活性染色质区、呈现转录活性状态的基因的CpG序列一般总是低甲基化的；而不表达或处千低表达水平的基因的CpG序列则总是高甲基化的。
实际上，DNA胞啼唗的甲基化与去甲基化修饰是一个动态的过程，在真核基因的表达调控中发挥着重要作用。
DNA甲基转移酶(DNA methyltransferase, DNMT)催化甲基与胞啼唗的共价结合，而去甲基化酶(demethylase)则负责去除5－甲基胞瞪唗上的甲基。
6非编码RNA能够调节基因转录近年来的研究显示，除了转录调节蛋白以外，一些非编码RNA分子，如miRNA等小RNA和长链非编码能调控基因的转录。
相对千长链非编码RNA，人们对小RNA(miRNA)的作用机制有较多的认识。
在第二章中已经介绍过miRNA在发挥RNA干扰（降解mRNA)中的作用机制（图2-12)，在此简述miRNA在调节基因转录中的作用。
在miRNA发挥转录抑制作用时，-m IRNA miRNA与另一种蛋白质复合体RITS(R~A-induced transcriptional silencing)复合体结合，解离后的一条miRNA链将RITS复合体引导至同源基因处（很可能是通过碱基配对结合千同RNA聚合酶II结合的mRNA上），然后，RITS复合体通过募集组蛋白甲基转移酶，使组蛋白H3的赖氨酸－9发生甲基化，靶基因的mRNA结合导致异染色质形成，最终抑制基因的转录（图924)。
（二）RNA加工水平调控的主要途径是剪接以外显子和内含子为单元的基因结构形式是真核细胞基因结构的特点，人类的大多数基因中都含有内含子。
多数真核细胞的mRNA前体分子经剪接去除内含子后仅形成一种成熟的mRNA，并经过翻抑制基因的转录译生成一条相应的多肤链，这种RNA剪接方式称为常规剪接(constitutive splicin g)。
但许多高等真核细图9-24miRNA调节基因的转录胞的mRNA前体不止含有一个内含子，在特定条件下，剪接发生在两个内含子之间，即某个内含子的5'端与另一个内含子的3'端进行剪接时，就会删除这两个内含子及其中间的全部外显子或内含子，这称为RNA可变剪接(alternative splicing)（详见第十五章，图15-14)。
由此，一个基因的mRNA前体经过可变剪接可以产生多种不同的蛋白质，或形成一组相似的蛋白质家族。
mRNA前体的剪接由被称为剪接体的核酸－蛋白质复合物完成，该复合物主要包括snRNA及富含丝氨酸和精氨酸的相关蛋白。
剪接首先是剪接体识别mRNA前体剪接位点，剪接位点的选择受许多顺式作用元件和反式作用因子的调控。
反式作用因子可以通过识别正性或负性的顺式作用元件对不同的剪接位点进行选择。
此外，剪接体中的剪接因子也参与了对选择性剪接的调控。
（三）真核细胞基因表达的翻译水平调控与起始因子磷酸化密切相关真核细胞翻译水平调节点主要在翻译起始阶段和延长阶段，尤其是起始阶段。
如起始因子活性的调节、Met-tRNA"'•'与核糖体小亚基结合的调节、mRNA与小亚基结合的调节等。
其中通过磷酸化作用改变起始因子活性这一点备受关注。
蛋白质合成速率的快速变化很大程度上取决千起始水平，通过磷酸化调节起始因子活性对起始阶段有重要的控制作用。
如e1F-2a亚单位的磷酸化可以阻碍elF的正常运行，从而抑制蛋白质合成的起始。
elF-2a亚单位的磷酸化由特异蛋白激酶催化。
在病毒感染的细胞中，细胞抗病毒机制之一即是通过双链RNA(double-stranded RNA, dsRNA)激活一种蛋白激酶，使eIF-2a磷酸化，从而抑制蛋白质合成的起始。
此外，mRNA的5'UTR（非翻译区）与3'UTR在翻译过程中能够相互依赖、协同作用提高翻译效率。
一些蛋白质能够识别mRNA的3'UTR，通过干扰3'poly-A尾与5'端帽的联络而减少翻译的起动。
第九章细胞内遗传信息的传递及调控231
第五节基因的信息传递与医学
遗传信息传递过程中任何环节出现异常均会导致基因表达的异常，引起疾病的发生。
转录因子突变和基因修饰改变都可在不同层面影响基因的正常表达，从而引发疾病；蛋白质降解异常与肿瘤、神经退行性疾病、心血管疾病、代谢性疾病的发生发展密切相关；利用原核生物和真核生物蛋白质合成的体系差异，医学上设计出对病原微生物有特效，而对人体没有损害的药物，例如抗生素和干扰素等。
—、基因表达调控异常与疾病
基因表达调控是高度有序的多级调控过程，在基因表达的过程中任何环节出现错误都可能影响基因的正常表达，从而引发疾病。
转录因子突变与疾病的发生密切相关。
转录因子在真核细胞基因表达调控中起重要作用，其本身结构与功能的改变，将引起细胞或个体功能有较大缺陷。
研究表明，至少有30多种疾病与转录因子有关。
例如，转录因子TBX5显性突变可引起心手综合征(Holt Oram syndrome, HOS)，表现为大拇指异常、心脏的房间隔缺损、室间隔缺损及复合畸形；转录因子PAX3显性突变会产生Wa缸denburg综合征I型(WSl)，引起宽鼻梁、眼内毗侧移、着色异常如眼睫毛和头发变白、虹膜异色并有耳蜗性失聪等临床表现；转录因子NKX2-l突变后，表现出中枢神经、甲状腺及肺功能等多方面的复杂症状，如小头畸形、基底神经节畸形、肌张力减退、共济失调、手足徐动症、发育迟缓和肺功能紊乱等；锌指类转录因子GATA3突变后的临床表现为血内甲状旁腺素水平降低、感觉神经性耳聋和肾脏发育不良。
二、蛋白质降解异常与疾病
蛋白质是执行生命活动的基本分子，细胞中的蛋白质不断地处于合成、降解的代谢更新过程中。
在正常代谢条件下，蛋白质的合成和降解有精确的调节而处于动态平衡。
内源性的蛋白质都有一定寿命，最终都会被降解。
如果蛋白质的降解出现异常，就会影响细胞的多种功能，从而引起疾病的发生。
在此以肿瘤和神经退行性疾病为例，说明蛋白质与疾病的关系。
蛋白质降解异常与肿瘤：在后续章节中我们将学到泛素介导的蛋白质降解途径在细胞周期、DNA修复、细胞凋亡中起重要作用，当泛素介导的蛋白质降解途径出现异常时，则有可能导致肿瘤的发生。
例如，细胞周期的正常进行需要细胞周期蛋白和其他蛋白质的降解，细胞周期蛋白Cyclin A稳定存在千S期和G2期，细胞通过M期需要Cyclin A的降解，若Cyclin A不被降解则会引起细胞周期停止在M期的中期，从而导致染色体的不正常分离，诱发肿瘤形成。
p53基因是细胞生长周期中的负调节因子，参与细胞周期的调控、DNA修复、细胞分化、细胞凋亡等重要的生物学功能，其表达水平和活性受到严格的控制，如果p53蛋白降解异常，则会发生肿瘤。
研究表明，10％的肿瘤中负责降解p53的泛素连接酶Mdm2的表达异常升高。
有研究指出，抑制26S蛋白酶体的活性，可以选择性抑制肿瘤细胞的增殖。
蛋白质降解异常与神经退行性疾病：大多数神经退行性疾病与细胞内或细胞外错误折叠蛋白不能被有效降解和清除有关。
例如，老年性痴呆症(Alzheimer disease, AD)的主要病理改变是神经元细胞内神经原纤维缠结(NFT)的形成及细胞外B－淀粉样蛋白老年斑(SP)的沉积。
泛素－蛋白酶体系统能及时降解错误折叠和修饰的蛋白，使细胞尤其是神经细胞内的蛋白质处于稳定状态，其功能障碍将导致细胞内异常蛋白的聚积和毒性代谢产物AB无法及时清除，导致NFT和SP。
随着缠结和斑块的不断聚集又会抑制蛋白酶体的降解活性，由此恶性循环，不断促进AD的发生发展。
蛋白传染因子导致的疾病，如人的纹状体脊髓变性病，以及由含异常扩展多聚谷胺酰胺片段蛋白聚集引起的疾病，如亨廷顿(huntington)舞蹈病，都发现与泛素蛋白酶体途径介导的蛋白降解异常有关。
因此，泛素－蛋白江qi酶体在神经退行性疾病中的作用越来越受到关注。
三、基于原核生物和真核生物蛋白质合成体系差异的药物研制蛋白质生物合成在细胞生命过程中具有重要作用，影响蛋白质生物合成的物质非常多，它们可以作用千RNA转录水平，对蛋白质的生物合成起间接作用。
原核生物和真核生物翻译过程相似但也有差别，这种差别在医学上有重要的价值，利用原核生物和真核生物蛋白质合成的体系差异，设计出对病原微生物有特效，而对人体没有损害的药物。
这类药物主要以抗生素为代表。
抗生素(ant灿otics)是一类微生物来源的能够杀灭或抑制细菌的药物，它们通过直接千扰原核生物的蛋白质合成而起到杀灭或抑制作用，但并不影响（或较少影响）真核生物的蛋白质合成。
抗生素可作用于蛋白质合成的多个环节，包括抑制起始因子，延长因子及核糖体的作用等。
例如：链霉素和卡那霉素通过与原核生物核糖体小亚基结合，使其构象改变，引起读码错误，使细菌蛋白质没有活性，从而起到抑菌作用；氯霉素能与原核生物核糖体大亚基结合从而阻断翻译延长过程，包括与核糖体上的A位紧密结合，而阻碍氨酰tRNA进入A位，以及抑制转肤酶活性，使肤链延伸受到影响等；四环素和土霉素则通过阻止氨酰－tRNA在A位置上的联结，从而阻止肤链延伸和细菌蛋白质合成。
嗦呤霉素(puromycin)的结构与酪氨酰－tRNA相似，因而它可作氨酰tRNA的类似物，在翻译过程中取代一些氨酰－tRNA进入核糖体的A位，当延长中的肤转入此异常A位时，容易脱落，以肤基嗦呤霉素的形式从核糖体上早期解离，而终止肤链合成。
由于嗦呤霉素对原核和真核生物的翻译过程均有干扰作用，故难于用做抗菌药物，仅作为抗肿瘤药物使用。
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WatsonJD基因的分子生物学6版杨焕明，等译北京：科学出版社，2009基因是DNA分子中含有特定遗传信息的核符酸序列。
基因是遗传信息的贮藏形式，遗传信息的流向一般是DNA一RNA一蛋白质，这称为分子生物学的中心法则。
真核生物基因一般是由若干内含子和外显子构成的不连续镶嵌结构的基因。
除内含子和外显子之外，完整的基因还包括位于编码区上游的启动子和基因末端的终止子。
真核细胞基因组最显著的特征之一是存在许多功能未知、有多个拷贝的DNA重复序列。
基因转录是遗传信息从DNA流向RNA的过程，其本质是一个以DNA双螺旋链中反义链为模板，以四种核菩三磷酸ATP、GTP、CTP、UTP为原料，在RNA聚合酶作用下，遵循碱基互补配对原则合成RNA的过程。
真核细胞基因转录形成初级转录产物的基本过程与原核细胞相似，也分为转录的起始、延长和终止，但所需酶及各种蛋白因子有所不同，真核细胞中转录形成的RNA前体分子通常需要经过复杂的加工修饰过程才能成为成熟的功能形式。
真核细胞中含有多种RNA聚合酶，其中RNA聚合酶II负责mRNA的转录。
mRNA的初级转录本是hnRNA。
转录形成的前体RNA需经过加工过程成为成熟的mRNA，才能进入细胞质进行蛋白质合成。
mRNA加工过程包括5'末端加上“帽子”结构、3'末端加上“尾”结构和剪接。
剪接是将RNA前体分子中内含子切除，将外显子拼接的过程。
在RNA聚合酶I催化下转录形成原始rRNA前体--45S rRNA，最终被剪切为28S、18S和5.8S rRNA。
在真核细胞中含有多个编码tRNA的基因，在RNA聚合酶ill的作用下被转录为tRNA前体，这种新转录生成的tRNA前体需要进行剪接和碱基修饰才能形成成熟的tRNA。
翻译是mRNA指导蛋白质合成的过程。
在翻译过程中mRNA作为翻译的模板，决定蛋白质中的氨基酸顺序；tRNA作为运输工具，携带氨基酸准确进入指定位置；rRNA与多种蛋白质组成核糖体，作为蛋白质合成的装配机器。
在mRNA链上3个相邻的碱基可以决定一个特定的氨基酸，这种核苍酸三联体被称为密码子，mRNA上的碱基排列顺序叫做遗传密码。
蛋白质生物合成可分为五个阶段：氨第九章细胞内遗传信息的传递及调控233基酸的活化、多肤链合成的起始、肤链的延长、肤链的终止和释放、蛋白质合成后的加工修饰。
从核糖体mRNA链释放的新生多肤链尚不具有生物活性，必须经过化学修饰和加工处理，才能形成具有天然构象和生物学活性的功能蛋白。
体内的蛋白质处于不断合成与降解的动态平衡。
胞内蛋白质的降解主要通过泛素－蛋白酶体途径和溶酶体途径。
基因的表达受到严密和精确的调控。
原核细胞大多数基因表达调控是通过操纵子机制实现的。
操纵子由结构基因和表达调控元件组成，是原核细胞中最常见的表达调控单位。
真核细胞基因表达调控可以发生在在转录水平、RNA加工水平、RNA转运水平、mRNA降解水平、翻译水平和蛋白质活性水平。
转录水平调控是真核细胞基因表达的主要控制点。
通常将真核细胞的基因表达调节蛋白称做反式作用因子，将它们所识别的DNA序列叫做顺式作用元件。
真核基因的顺式作用元件包括启动子、增强子和沉默子。
反式作用因子通过顺式作用元件调控基因的表达。
作为蛋白质的转录因子，其结构中一般包含DNA结合域和转录激活域。
螺旋－转角－螺旋、锌指结构、亮氨酸拉链是常见的DNA结合域。
真核细胞中除存在发挥正性调控作用的转录激活蛋白之外，还有一类阻遏蛋白，它通过与特定的DNA序列结合参与真核细胞基因表达的负性调控。
染色质结构的动态变化过程通常称为染色质重塑，它是基因表达调控的主要方式之一。
除了转录调节蛋白以外，一些非编码RNA分子也能调节基因的转录。
在真核细胞中，一个基因的mRNA前体经过可变剪接可产生多种不同的蛋白质，这是RNA加工水平的调控方式。
真核细胞基因表达的翻译水平调控与起始因子磷酸化密切相关。
基因信息传递过程中任何环节出现异常均会导致基因表达的异常，引起疾病的发生。
（杨霞）
第三篇细胞的社会性
第十章细胞连接与细胞黏附
在胚胎发育过程中，细胞通过分裂、分化，然后迁移到达预定区；同一组织内的细胞间直接形成一些连接结构让细胞连在一起成为整体，以便协同发挥功能；不同组织间，通过细胞识别、黏着然后形成连接机制，从而进一步形成各种器官乃至系统，最终形成完整的有机体。
人体的形态建成既是细胞分裂、分化的结果，也是细胞通过表面分子相互识别、黏着以及形成特殊细胞连接的结果。
细胞之间、细胞与细胞外基质之间通过细胞表面特殊的黏附分子彼此识别和黏着；通过相邻细胞表面形成特殊连接装置以加强彼此间的机械联系和保障功能的协调。
细胞之间、细胞与细胞外基质之间的相互作用是组织形成、定位、生存及稳态维持的重要保证，而细胞连接(cell junction)与细胞黏附(cell adhes ion)是细胞间发生关联的结构基础和基本方式。
细胞连接与细胞黏附体现细胞的社会性。
第一节细胞连接
人和多细胞动物体内除结缔组织和血液外，各种组织的细胞之间按一定排列方式，在相邻细胞表面一些特殊的蛋白质形成一些特殊结构把细胞连接在一起，以加强细胞间的机械联系和维持组织结构的完整性、协调性，有一些细胞通过细胞膜上的特殊蛋白与细胞外基质结合在一起，这种细胞表面与其他细胞或细胞外基质结合的特化区称为细胞连接。
细胞连接是维系细胞间相对稳定的特化连接结构，也是相邻细胞之间协同作用的重要结构基础。
细胞连接有多种类型，根据其结构和功能特点可分为三大类，即封闭连接(occlu ding junction)、描定连接(anchoring junc tion)和通讯连接(comm uni cating junction)（表10-1，图10-1)。
—、紧密连接
1.紧密连接的概念入和脊椎动物体内的封闭连接只有一种，称为紧密连接(tight junction)。
广泛分布于各种上皮细胞，如消化道上皮、膀胱上皮、睾丸曲细精管生精上皮的支持细胞基部和腺体的上皮细胞管腔面的顶端侧面区域；此外，脑毛细血管内皮细胞之间也存在紧密连接结构。
透射电镜显示，在紧密连接处，两个相邻细胞质膜以断续的点状结构连在一起，点状接触部位细胞间隙消失，非第十章细胞连接与细胞黏附237细胞与细胞连接细胞与细胞外基质连接接接连带连密着粒隙紧黏桥间细胞连接细胞黏附图10-1细胞连接、细胞黏附和细胞外基质点状接触处尚有10~15nm的细胞间隙。
冰冻断裂复型技术显示，紧密连接区域是一种＂焊接线”样的带状网络（图10-2A)。
焊接线又称峙线，扫描电镜显示，两个相邻细胞膜上的暗线由成串排列的特殊穿膜蛋白质颗粒构成（图10-2B)，这种在相邻细胞膜上形成的特征性结构称为封闭索(seali ng s trand)，封闭索相互交错成网状，呈带状环绕每个上皮细胞的顶部，将相邻细胞紧密连接在一起，封闭细胞间隙（图10-3A)。
E面质膜侧面峙线(P面）
蛋白质颗粒条索
紧密连接［
微绒毛肠腔
图10-2小肠上皮细胞紧密连接电镜照片A冰冻断裂复型电镜照片，示细胞微绒毛和细胞紧密连接区；B扫描电镜照片，示蛋白质颗粒条索238第三篇细胞的社会性图10-3紧密连接模式图A相邻质膜上蛋白颗粒连成的封闭索；B紧密连接中的两种穿膜蛋白2参与紧密连接的分子现已证明有40余种蛋白质参与了紧密连接的形成与功能。
这些蛋白质主要是穿膜蛋白和胞质外周蛋白(cytoplsmic peripheral protein)。
从紧密连接皓线中至少确定了两类穿膜蛋白：一类称为闭合蛋白(occl ucl in)，是一种表观分子量为65kD的4次穿膜蛋白；另一类称为密封蛋白(clauclin)，也是一种4次穿膜的蛋白，表观分子量较小，为20-27kD的（至少24种此类蛋白得以鉴定），是形成崝线的主要成分。
两类穿膜蛋白的C末端和N末端均伸向细胞质，C末端具有能与其他紧密连接蛋白结合的区域，通过与其他紧密连接蛋白的相互作用，参与紧密连接的形成（图103B)。
胞质外周蛋白有多种，包括PDZ蛋白、zo家族、PATJ、PAR-3和PAR-6等，它们帮助穿膜蛋白与细胞骨架相连，还能将蛋白激酶、磷酸酶、小GTP酶和转录因子等调节蛋白聚集到紧密连接处发生作用。
近年来发现，密封蛋白claudin-1和闭合蛋白还是丙型肝炎病毒(hepatitis C viru, HCV)入侵细胞所必需的受体，提示紧密连接很可能和HCV入侵细胞的过程有关。
3紧密连接的主要功能紧密连接有以下两个功能。
(1)封闭上皮细胞的间隙，形成一道与外界隔离的封闭带，保证组织内环境的稳定。
防止细胞外物质无选择地通过细胞间隙进入组织，或组织中的物质回流入腔中。
如小肠上皮细胞的紧密连接结构，对腔内大部分物质起着阻隔作用。
脑毛细血管内皮以及睾丸支持细胞之间的紧密连接构成了血脑屏障(blood-brain barrier)和血睾屏障(blood-testis banie1)，保护这些重要器官和组织免受异物侵害。
(2)形成上皮细胞质膜蛋白与膜脂分子侧向扩散的屏障，从而维持上皮细胞的极性。
如小肠上皮细胞游离面质膜上含有大量吸收葡萄糖分子的协同运输载体，完成Na十驱动的葡萄糖同向转运；而基底面含有执行被动运输的葡萄糖转运载体，将葡萄糖转运到细胞外液，从而完成葡萄糖的吸收和转运功能。
正是由于紧密连接限制了膜蛋白和膜脂分子的流动性，从而保证了小肠上皮细胞物质运转的方向性。
紧密连接还具有将上皮细胞联合成整体的机械连接作用。
4.紧密连接与医学有人发现在活动期的炎症性肠病，紧密连接的完整性被破坏，Z0-1和闭锁蛋白以及闭合蛋白－1和2的表达均降低。
低糖皮质激素治疗多发性硬化症，主要是通过保持闭合蛋臼l、5以及闭锁蛋白的表达水平，维待紧密连接的完整性，增强血脑屏障的功能来实现的。
二、描定连接
铀定连接是一类由细胞骨架纤维参与、存在于细胞间或细胞与细胞外基质之间的连接结构。
其主要作用是形成能够抵抗机械张力的牢固黏合。
铀定连接广泛分布千动物各种组织中，在上皮、心肌和子宫颈等需要承受机械力的组织中分布尤为丰富。
其重要功能是参与组织器官形态和功能的维待细胞的迁移运动以及发育和分化等多种过程。
彸，t，，根据参与连接的细胞骨架纤维类型不同，铀定连接可分为两大类：一类是肌动蛋白丝参与的铀定连接，称为黏着连接(adhe1ing junc tion),黏着连接又可分为两类：细胞与细胞之间的黏着连接称为黏着带(adhesion belt);细胞与细胞外基质间的黏着连接称为黏着斑(focal ad h esion)。
另一类是中间纤维参与的错定连接，称为桥粒连接(desmosome junction)，桥粒连接也分为两类：细胞与细胞之间的连接称为桥粒(desmosome)；细胞与细胞外基质间的连接称为半桥粒(hemidesmosome)。
铀定连接主要由两类蛋白构成：一类是细胞内铺定蛋白(intracellulru·ancho1细胞外基质protein)，这类蛋白在细胞质面一端与特定图10-4描定连接的两类蛋白示意图的细胞骨架成分（肌动蛋白丝或中间纤维）相连，另一端与穿膜黏着蛋白连接；第二类蛋白统称穿膜黏着蛋白(transmembrane adhesion protein)，是一类细胞黏附分子，其胞内部分与胞内铀定蛋白相连，胞外部分与相邻细胞特异的穿膜黏着蛋白或细胞外基质蛋白相连（图10-4)（动画10-1“微丝及中间纤维参与铀定连接”)。
(—)黏着连接是由肌动蛋白丝参与的描定连接
1.黏着带
(1)黏着带的概念及分子组成特点：位于上皮细胞紧密连接的下方，是相邻细胞之间形成的一个连续的带状结构（图10-5A)。
透射电镜显示，在黏着带处相邻细胞质膜之间的间隙约15-30nm，间隙两侧的质膜通过伸出的穿膜黏着蛋白相互黏合（图l0-5B)。
参与形成黏着带的穿膜黏着蛋白称为钙黏着蛋白(cad h erin)，是一类C砍依赖性细胞黏附分子（有关钙黏着蛋白特点与功能见本章第二节）。
钙黏着蛋白在质膜中形成同源二聚体，相邻细胞的钙黏着蛋白胞外结构形成胞间横桥相连，其胞内区域通过铀定蛋白与肌动蛋白丝相连；从而使细胞间的连接与胞内的微丝束网络连接在一起，细胞间牵拉的张力通过微丝束网络得以缓解。
胞内铀定蛋白包括a、B、-y联蛋白(catenin汃黏着斑蛋白(vinculin汃斑珠蛋白(plakoglobin）和a-辅肌动蛋白(a-actin i n)等，形成复杂的多分子复合体，起铀定肌动蛋白丝的作用。
微绒毛内的肌动蛋白纤维
微绒毛
细胞l细胞2
紧密连接
肌动蛋白
纤维束
相邻上皮细
胞的质膜
肌动蛋白纤维钙黏着蛋白二聚体铀定蛋白
A.黏若带示意图；B黏着带的组成结构模式图
胞』[内白
240第三篇细胞的社会性
(2)黏着带的功能：少黏着带在维持细胞形态和组织器官完整性方面具有重要作用，特别是为上皮细胞和心肌细胞提供了抵抗机械张力的牢固黏合。
＠发育中影响形态发生。
由于微丝束具有收缩功能，在动物胚胎发育过程中黏着带可以使上皮细胞内陷形成管状或泡状原基，从而对形态发生起重要作用。
2.黏着斑
(1)黏着斑的概念及结构特点：位千上皮细胞基底部，是细胞通过局部黏附与细胞外基质之间形成的黏着连接。
参与黏着斑连接的穿膜黏着蛋白是整联蛋白(integrin)（大多数为a5阳），其胞外区与细胞外基质（主要是纤连蛋白与胶原）成分相连，胞内部分通过铀定蛋白与肌动蛋白丝相连，从而介导细胞与细胞外基质的黏着（图10-6)。
黏着斑部位的铀定蛋白有：踝蛋白(talin)、a－辅肌动蛋白、细丝蛋白(filamin)和纽蛋白等。
由于整联蛋白是纤连蛋白的受体，因此，细胞通过整联蛋白与细胞外基质之间的连接是受体与配体之间的识别和结合（有关整联蛋白的特点与功能见本章第二节）。
黏着斑＼
激酶信号传导
桩蛋白＼至细胞核
a－辅肌动蛋白
(2)黏着斑的相关生物学功能：心参与肌细胞与肌健的连接。
黏着斑在肌细胞与肌腮（主要是胶原）形成的连接中很常见。
＠体外培养细胞常通过黏着斑贴附在培养基质上，它的形成与解离对于细胞的铺展和迁移具重要意义。
＠黏着斑还参与细胞信号转导，整联蛋白的胞内部分与蛋白激酶，如黏着斑激酶(FAK)结合，当整联蛋白与胞外配体结合后可以激活这些激酶，引起连锁反应，促进与细胞生长和增殖相关基因的转录。
（二）桥粒连接是由中间纤维参与的描定连接桥粒连接广泛分布于承受机械力的组织中，如皮肤、心肌、食管、膀胱、子宫和阴道等处的上皮细胞之间，为其提供机械支持力，维持组织完整性。
根据其分布位置不同，可以分为桥粒和半桥粒两种。
1.桥粒
(I)桥粒的概念及结构特点：位于上皮细胞黏着带的下方，是相邻细胞间的一种斑点状的描定连接结构，结构中含有桥粒斑(desmosomal plaque)。
电镜下，桥粒连接处相邻细胞质膜之间的间隙约20~0.30nm，质膜的胞质侧各有一致密的胞质斑(cytoplasmic plaque)，称为桥粒斑。
其直径约05µm，是由多种第十章细胞连接与细胞黏附241胞内铀定蛋白包括桥粒斑珠蛋白和桥粒斑蛋白(desmoplaki n)构成的复合物，是中间纤维附着的部位，许多成束的中间纤维伸向桥粒斑，被更细的纤维系牢在胞质斑上，然后折返形成拌状结构。
在不同类型细胞中附着的中间纤维也不同，如上皮细胞中主要是角蛋白丝(keratin filaments)，心肌细胞中则为结蛋白丝(desmin filame nts)。
桥粒质膜处的穿膜黏着蛋白为桥粒黏蛋白(desmoglein)和桥粒胶蛋白(desmocol lin)，均属于钙黏着蛋白家族。
其胞内部分与桥粒斑相连，胞外部分与相邻细胞的穿膜黏着蛋白相连，通过依赖C汒的黏附机制将两个相邻细胞连接在一起（图10-7)。
相邻细胞中的中间纤维通过桥粒斑和穿膜黏着蛋白构成了贯穿整个组织的整体网架，增强了细胞抵抗外界压力与张力的机械强度。
桥粒黏蛋白
(2)桥粒的功能及稳定性：桥粒是一种坚韧、牢固的细胞连接结构，对上皮细胞结构的维持非常重要。
胰蛋白酶、胶原酶、透明质酸酶和Ca正鳌合剂（如乙二胺四乙酸）等均能够破坏桥粒结构。
(3)桥粒与医学：一些皮肤病与桥粒结构的破坏有关。
临床上一种自身免疫性疾病一天庖疮(pemphigus)，就是由千患者体内产生了抗桥粒穿膜黏着蛋白抗体，破坏了桥粒结构，导致上皮细胞桥粒连接丧失，组织液通过细胞间隙进入表皮，引起严重的皮肤水疤病，如不及时治疗，严重者可危及生命。
良性家族性天疤疮(H叫ey-Hailey病）跟桥粒斑组分的细胞内化、分子被破坏及桥粒数量减少密切相关。
2.半桥粒
(1)半桥粒的概念及结构特点：半桥粒是上皮细胞基底面与基膜之间的连接结构，因其结构仅为桥粒的一半而得名。
形态上与桥粒类似，但功能与化学组成不同。
半桥粒的胞质斑是由一种称为网蛋白(plectin)的胞内铀定蛋白组成，可与细胞内的中间纤维相连。
半桥粒部位的穿膜黏着蛋白一种是整联蛋白（心阴），另一种是穿膜蛋白BP180，通过一种特殊的层粘连蛋白（描定纤维）与基膜相连，从而将细胞与基膜牢固地柳在一起。
这些整联蛋白也从细胞外基质向胞内传导信号，影响着上皮细胞的形状和活性（图10-8)。
(2)半桥粒的功能：半桥粒主要功能是把上皮细胞与其下方的基膜连接在一起，防止机械力造成的上皮与其下方的组织剥离。
(3)半桥粒与医学．一种自身免疫性疾病一一大泡性类天疤疮(bullous pemphigoid)，由千患者体内产生的抗体破坏了半桥粒结构，导致表皮基底层细胞脱离基膜，组织液渗入表皮下空间，引起严重的表皮下水泡。
层粘连蛋白和整联蛋白心或阳基因的突变均可引起大瘛性表皮松解症(epidermo lysis bullosa)，其症状与大泡性类天庖疮相似。
242第三篇细胞的社会性
细胞质
胶原纤维
6、歹A0.3µm B V11型胶原纤维
A.半桥粒结构照片；B半桥粒结构模式图
三、通讯连接
生物体大多数组织相邻细胞膜上存在特殊的连接方式，以实现细胞间电信号和化学信号的通讯联系，从而完成群体细胞间的合作和协涸，这种连接形式称为通讯连接。
通讯连接除了具有机械的细胞连接作用外，还可在细胞间形成代谢偶联或电偶联。
在动物组织细胞间通讯主要由间隙连接(gap junct i on)介导。
存在于神经元之间或神经元与效应细胞之间的化学突触(chemi cal synapse)也属于通讯连接。
(—)间隙连接是动物组织中普遍存在的一种细胞连接方式1间隙连接的结构特点相邻细胞间的连接子(connexon)相对接形成微小的通道，使细胞相连接起来的方式。
除骨骼肌细胞及血细胞外，几乎所有的动物组织细胞都利用间隙连接来进行通讯联系。
透射电镜显示，间隙连接部位相邻细胞膜之间有2~3nm的缝隙，因而间隙连接也称缝隙连接。
间隙连接的基本结构单位是连接子(connexon)。
每个连接子长7.5nm，外径6nm，由6个相同或相似的穿膜连接蛋白－~连接子蛋白(connexin, Cx)环绕而成，中央形成15~2nm的亲水性通道。
相邻质膜上的两个连接子相对接而连在一起，通过中央通道使相邻细胞质连通。
冷冻蚀刻技术显示，许多心间隙连接单位往往集结在一起呈斑块状，不同细胞、不同区域内单位面积内的数显不等，可含有几个噱到数百个连接子（图10-9)。
通过密度梯度离心技术可将质膜上的间隙连接区域的膜片分离出来。
（动画10-2"间隙连接”)
目前已经从不同动物或不同组织中分离出20余种不同的连接子蛋白，它们属于同一类蛋白家族，尽管不同的连接子蛋白相对分子扯差异较大，但都具有4个保守的a－螺旋穿膜区。
一个连接子可以由相同的连接子蛋白构成同源连接子，也可以由不同的连接子蛋白构成异源连接子。
由不同连接子蛋白所构成的连接子，在通透性、导电率和可调性方面是不同的，它们的分布具有组织细胞特异性。
如心肌细胞的连接子蛋白是Cx43，心脏电传导系统细胞的连接子蛋白是Cx40，当这两种连接子蛋白形成间隙连接时，连接子之间便没有通透功能，从而保证了心脏器官不同类型细胞功能的相对独立。
2间隙连接的生物学功能
(I)加强相邻细胞的机械连接：间隙连接中相邻细胞膜内连接子颗粒的相互融合，加强了相邻细胞的机械连接。
间隙连接的更重要的功能是介导细胞间通讯，细胞通讯(cell communication)是指一个细胞的信息通过化学递质或电信号传递给另一个细胞，协调相邻细胞间的功能活动。
间隙连接的通讯方式有两种，即代谢耦联(metabol ic coupling)和电耦联(electric coupling)。
第十章细胞连接与细胞黏附243
相邻细胞的质膜
大的间隙连接2-4nm
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D图10-9间隙连接的结构A质膜横切面显示间隙连接；B质膜冷冻蚀刻显示间隙连接成片分布区域；C间隙连接三维结构示意图；D连接子蛋白与连接子(2)代谢耦联：是指小分子质扯（小于lkD)代谢物和信号分子，在相邻细胞间通过间隙连接的传递。
在相邻细胞间，通过连接子形成的亲水性通道，允许如无机离子、单糖、氨基酸、核甘酸、维生素、cAMP和IP3等小分子物质从一个细胞迅速进入另一个细胞，从而使细胞可以共享这些重要的物质，协调细胞群体的功能活动，这种功能在胚胎发育早期特别重要。
在血液循环建立以前，同一发育区的细胞通过代谢耦联使物质平均分配，以控制细胞的分化。
当细胞分化时，细胞与其周即组织解耦联，但每个细胞群中的细胞仍相互耦联，以保持发育行为一致。
间隙连接的通透性是可调节的。
在实验条件下，降低细胞pH，或升高钙离子浓度均可降低间隙连接的通透性。
当细胞受损时，大扯钙离子进入，导致间隙连接关闭，以免正常细胞受到伤害。
间隙连接的通透性还受胞外化学信号的调节，有助于细胞间的代谢耦联。
如胰高血糖素作用千肝细胞时，使肝细胞内cAMP浓度增高，cAMP激活了依赖于cAMP的蛋白激酶，蛋白激酶又使间隙连接蛋白磷酸化，导致其构象发生改变，从而使间隙连接通透性增加，使cAMP可以迅速从一个细胞扩散到周围的肝细胞，最终使肝细胞共同对胰高血糖素的刺激作出应答反应。
(3)电耦联：也称离子耦联(ionic coupling)，其连接子是一种离子通道，带电的离子能通过间隙连接到达相邻细胞，使电信号从一个细胞传递到另一个细胞。
在兴奋性组织的细胞之间，广泛存在电耦联现象。
如电耦联使心肌细胞同步收缩和舒张，若这种连接破坏，电耦联消失，则心脏停止跳动；成年动物大多数平滑肌细胞仅有少数平滑肌受神经支配，其兴奋传导主要靠间隙连接，小肠平滑肌细胞通过电耦联，使收缩和蠕动同步化。
3间隙连接与医学胚胎发育中细胞间的偶联提供信号物质的通路，从而为某一特定细胞提供它的＂位匠信息”，并根据其位置影响其分化。
肿瘤细胞之间间隙的连接明显减少或消失，间隙连接类似＂肿瘤抑制因子”。
（二）突触也是—种细胞通讯连接方式神经元之间或神经元与效应细胞（如肌细胞）之间通过突触(synapse)完成神经冲动的传递。
突触可分为电突触(elec tron i c synapse)和化学突触两种基本类型。
电突触是指细胞间形成间隙连接，电冲动可直接通过间隙连接从突触前向突触后传导（图10-10)，速度快而准确。
而化学突触的突触前和突触后细胞膜之间存在20nm宽的间隙，使电信号不能通过，因此信号传递时，要经过将电信号转变为化学信号，再将化学信号转变为电信号的过程。
化学突触信号传递时，神经冲动传递到轴突末端，引起神经递质小泡释放神经递质，然后神经递质作用千突触后细胞，引起新的神经冲动。
这种信号传递速度不及电突触。
电突触对千某些无脊椎动物和鱼类快速准确地逃避反射具有十分重要的意图A电突触结构示意图；B电突触的间隙连接示意义。
第二节细胞黏附
在动物个体发育过程中，无论是受精、还是胚泡植入、形态发生、组织器官的形成以及成体结构与功能的维持，都离不开细胞的识别与黏附。
在胚胎发育过程中，具有相同表面特性的细胞通过特异性识别并黏附在一起形成内、中外三个不同的胚层；同样通过细胞的识别与黏附使具有相同表面特性的细胞聚集在一起形成组织和器官。
通常将这种在细胞识别的基础上，同类细胞发生聚集形成细胞团或组织的过程称为细胞黏附(cell adhesion)。
细胞黏附通过细胞表面特定的细胞黏附分子(cell adhesion molecule, CAM)介导细胞与细胞之间、细胞与细胞外基质之间的彼此黏着。
黏附分子的类型：目前已发现的细胞黏附分子达百余种，根据其分子结构与功能特性，可分为四大类：钙黏着蛋白(cadherin)，选择素(selectin)，免疫球蛋白超家族(Ig-superfamily, IgSF)和整联蛋白家族(integrin family)。
细胞黏附分子多数需要依赖千二价阳离子C芷或M忙才起作用，这些分子介导的细胞识别与黏附还能在细胞骨架的参与下，形成桥粒、半桥粒、黏着带以及黏着斑等铀定连接结构（表10-2)。
黏附分子类型主要成员Ca2+/Mg2+在胞内相连的参与的细依赖性细胞骨架成分胞连接钙黏着蛋白E,N,P－钙黏着蛋白+肌动蛋白丝黏着带桥粒－钙黏着蛋白+中间纤维桥粒免疫球蛋白超家族神经细胞黏附分子白细胞整联蛋白a l132+肌动蛋白丝整联蛋白20多种类型+肌动蛋白丝黏着斑质膜蛋白聚糖多配体蛋白聚糖肌动蛋白丝黏附分子的结构特点：细胞黏附分子均为穿膜糖蛋白，由三部分组成：心胞外区，较长，肤链的N端部分带有糖链，是与配体识别的部位；＠穿膜区，多为一次穿膜的a－螺旋；＠胞质区，肤链的C端部分，一般较小，可与质膜下的细胞骨架成分或与胞内的信号转导蛋白结合。
细胞黏附分子介导细胞识别与黏附的方式（图10-11)：心同亲型结合(homophilic binding), A B C即相邻细胞表面的同种黏附分子间的相互识别与黏附，如钙黏着蛋白主要以这种方式介导细图10-11细胞间黏附的三种方式胞黏附；＠异亲型结合(heterophilic bi nding)，即结合A同亲型结合；B异亲型结合；C.连接分子依赖性两相邻细胞表面的不同种黏附分子间的相互识别与黏附，如选择素和整联蛋白主要以这种方式介导细胞黏附；＠连接分子依赖性结合(linker-dependent binding)，即相邻细胞黏附分子通过连接分子中介才能相互识别与黏着。
一、钙黏着蛋白家族
钙黏着蛋白是一类依赖于Ca正的同亲型细胞黏附分子，在胚胎发育中的细胞识别、迁移和组织分化以及成体组织器官的构成中起重要作用。
钙黏着蛋白是一个很大的糖蛋白家族，不同类型的细胞以及发育不同阶段，细胞表面的钙黏着蛋白的种类和数扯均有所不同。
目前已在人类中发现了约200种钙黏着蛋白成员，不同的钙黏着蛋白都有其特定的组织分布，常根据其最初发现的组织类型命名，如上皮组织中的钙黏着蛋白称E－钙黏着蛋白(epithelial cadherin, E-cadherin)；神经组织中的钙黏着蛋白称N－钙黏着蛋白(neural cadherin, N-cadherin)；胎盘、乳腺和表皮中的钙黏着蛋白称P－钙黏着蛋白(placental cadhe1in, P-cadheri n)；血管内皮细胞中的钙黏着蛋白称VE－钙黏着蛋白(vascular endothelial cadherin, VE-cadherin)（表10-3)。
上述几种最常见的钙黏着蛋白称为典型钙黏着蛋白(classica l cadherin)，具有细胞黏着和信号转导功能，其胞内或胞外结构域在序列组成上高度相似。
此外还有一些非典型钙黏着蛋白，在结构序列组成上差异较大，主要功能是介导细胞黏着，如桥粒中的钙黏着蛋白分子结构特点钙黏着蛋白分子典型结构为单次穿膜糖蛋白，由700~750个氨基酸残基组成，在质膜中常以同源二聚体的形式存在，依靠Ca2•与相邻的细胞的钙黏着蛋白分子结合。
钙黏着蛋白分子胞外区约由110个氨基酸残基组成，常折叠成5个重复结构域，C汒结合在重复结构域之间，可将胞外区锁定在一起形成棒状结构，赋予钙黏着蛋白刚性和强度。
Ca2＋结合越多，钙黏着蛋白刚性越强。
如果去除Ca2+，胞外区就变得松软塌落，不能相互黏附（图10-12)，故在细胞培养时常用阳离子鳌合剂EDTA破坏Ca2＋或M忙依赖性细胞黏附。
钙黏着蛋白的胞内部分是高度保守的区域，可以通过胞内衔接蛋白即联蛋白(a.-catenin或[3-catenin)与肌动蛋白丝连接；钙黏着蛋白胞内部分还与胞内信号蛋白([3-catenin或p120-cat eni n)相连，介导信号向细胞内传导，以调整细胞的功能活动。
246第三筒细胞的社会性
钙黏着蛋白广＿^^
重复子
细胞1
质膜
细胞质钙黏着蛋白同源二聚体
钙黏着蛋白同源二聚体
图10-12钙黏着蛋白的结构与功能A一个经典钙黏着蛋白；B一个钙黏着蛋白重复子的三维结构；C.
Ca2•对钙黏着蛋白的影响(1)介导细胞与细胞之间的同亲性细胞黏附：在胚胎和成入组织中，同类细胞需要具备自我标识与彼此黏附的特性，这一特性主要是由钙黏着蛋白分子在特定组织上的选择性表达所决定的。
如E－钙黏着蛋白就是保持上皮细胞相互黏合的主要细胞黏附分子，如果将编码E－钙黏着蛋白的DNA转染至不表达钙黏着蛋白也无黏附作用的一种成纤维细胞(L cell)，可使这种成纤维细胞之间发生Ca2＋依赖性的同亲性细胞黏附，表现出上皮细胞样的聚集，并且膜蛋白出现极性分布。
用抗E－钙黏着蛋白抗体可以抑制这种黏附。
(2)在个体发育过程中影响细胞的分化，参与组织器官的形成：在个体发育过程中，细胞通过调控钙黏着蛋白表达的种类与数量而决定胚胎细胞间的相互作用（黏附、分离、迁移、再黏附），影响细胞的分化，参与组织器官的形成。
如E－钙黏着蛋白在胚胎发育进入8细胞卵裂时期就开始表达，使松散的分裂球细胞紧密黏附；在外胚层发育形成神经管时，神经管细胞停止表达E－钙黏着蛋白，转而表达N－钙黏着蛋白；而当神经崝细胞从神经管迁移出来时，神经峭细胞则很少表达N－钙黏着蛋白，转而主要表达钙黏着蛋白－7；当神经皓细胞迁移至神经节并分化成神经元时，又重新表达N－钙黏着蛋白。
近年来在神经系统发现一个独特的钙黏着蛋白家族，称为原钙黏着蛋白(protocadherin)，它们携带介导突触连接分子的密码，对千神经元识别靶细胞并建立起正确的突触联系起重要的作用。
上皮细胞转型为间质细胞或间质细胞转型为上皮细胞是一个受控的可逆过程，称之为上皮－间质转换(epithelial-mesenchymal transition, EMT)，是细胞转分化的一种方式。
其分子机制是E－钙黏着蛋白的表达与否。
细胞表达E－钙黏着蛋白后，分散的间质细胞会聚集在一起形成上皮组织；不表达E－钙黏着蛋白的上皮细胞则从上皮组织迁移出来形成游离的间质细胞。
E－钙黏着蛋白的表达受到启动子区甲基化的影响，又受多种转录调控因子如Snail, Sl ug、Twist等的负调控起抑制作用。
这种上皮－间质转型(EMT)在胚胎发育、器官的细胞更新和再生，以及某些多能干细胞的分化等过程均发挥重要的生理作用。
(3)参与细胞之间稳定的特化连接结构：参与铀定连接。
在黏着连接中，钙黏着蛋白胞内区通过细胞内铀定蛋白a和B联蛋白(catenin)与肌动蛋白丝相第十章细胞连接与细胞黏附247连，形成细胞之间牢固连接的黏着带（图10-13)；在桥粒结构中，钙黏着蛋白家族的桥粒黏蛋白和桥粒胶蛋白的胞内区钙黏着蛋白同源二聚体通过胞质斑与中间纤维相连形成牢固的连接结构。
另外，一I l些钙黏着蛋白在铀定连接中起向细胞内传递信号的作用。
如VE－钙黏着蛋白不仅参与内皮细胞间的黏附，还作为血管内皮生长因子的辅助受体，参与维持内皮细胞存活信号的传递。
3.钙黏着蛋白与疾病(I)钙黏着蛋白功能的丧失在恶性肿瘤的扩散中起重要作用。
缺失E－钙黏着蛋白可导致上皮性肿瘤的发生。
在上皮癌的研究中，很多种癌组织细胞表面的E－钙黏着蛋白减少或消失，导致癌细胞容易从肿瘤组织中脱落，成为癌细细胞质胞侵袭与转移的前提。
因而有人将E－钙黏着蛋白视为细胞转移抑制分子，表达E－钙黏着蛋白越多，细胞转移越少，因此，人为升高恶性肿瘤细胞中钙黏着蛋白的表达时，其在动物体内的生长能力降低。
(2)钙黏着蛋白的表达与器官纤维化有关。
钙黏着蛋白的表达与EMT相关，而医学上脏器纤维化病变也与EMT有关，例如与肾纤维化病变直接相关的肾间质成纤维细胞绝图10-13钙黏着蛋白通过附着蛋白与大多数由上皮细胞经EMT而来。
微丝结合选择素是一类依赖千Ca正的异亲型细胞黏附分子，它们能特异性地识别并结合其他细胞表面寡糖链中的特定糖基，主要介导白细胞与血管内皮细胞或血小板的识别和黏附，在炎症反应和免疫反应中起重要作用。
选择素家族包括三种成员：L－选择素(leukocyte selectin)最早在淋巴细胞上作为归巢受体被发现，后来发现在各种白细胞上都表达；P－选择素(platelet selectin)主要位千血小板和内皮细胞上；E选择素(endothelial selecti n)表达千活化的内皮细胞上。
1.选择素的分子结构特点选择素是单次穿膜糖蛋白，其胞外区由三大结构域组成：即N－末端的C型凝集素(C lectin)样结构域、表皮生长因子(epithelial growth factor, EGF)样结构域以及与补体调节蛋白(complement control protein module, CCP)同源的结构域。
其中N－末端凝集素结构域是识别特异糖基，参与细胞之间选择性黏附的活性部位。
所有选择素均可识别和结合一类特定的糖基（图10-14), Ca“参与该识别黏附过程。
EGF样和CCP结构域具有加强分子间黏附以及参与补体系统调节等作用。
选择素分子的胞内区可通过铀定蛋白与细胞内微丝结合。
2选择素的功能主要功能是参与白细胞与血管内皮细胞或血小板的识别与黏着，帮助白细胞从血液进入炎症部位。
在炎症发生部位，血管内皮表达E－选择素，与白细胞和血小板上的寡糖链识别，由千选择素与白细胞表面的特异寡糖链亲和力较小，加上血流速度的影响，白细胞在炎症部位的血管中黏附—分离，再黏附一冉分离，呈现滚动方式运动，随后激活了自身整联蛋白，由后者介导白细胞与血管内皮细胞较紧密地结合在一起，并使白细胞经内皮细胞间隙迁移至组织（图10-15)。
白细胞以这种机制富集到炎症发生的部位。
248第三篇细胞的社会性
凝集素样结构域Q EGF样结构域补体调节蛋白结构域乙_---------:---------夕夕_--夕---------:A示3种选择素的结构；B这3种选择素都能够识别糖蛋白寡糖链末端的糖基配体并与之结合；C示糖基配体的详细结构基底膜三、免疫球蛋白超家族免疫球蛋白超家族(immunoglobi n-superfamily, lg弱黏附强黏附SF)是一类分子结构中含有类似免疫球蛋白结构域、及滚动及迁移启不依赖Ca2＋的细胞黏附分子。
这类分子的胞外区由（选择素依赖）（整联蛋白依赖）白细胞一个或多个免疫球蛋白(lg)样结构域组成。
每一个lg结构域都是由90~110个氨基酸残基形成的紧密内皮细胞折叠结构，其间有二硫键相连接。
lg-SF成员复杂，其中有的介导同亲型细胞黏着，如各种神经细胞黏附分组织子(neu ral cell adhesion molecule, N-CAM或NCAM)及图10-15选择素及整联蛋白介导白细胞迁移血小板－内皮细胞黏附分子(PE-CAM或PECAM)；有第十章细胞连接与细胞黏附249的介导异亲型细胞黏着，如细胞间黏附分子(I-CAM或ICAM)及血管细胞黏附分子(V-CAM或VCAM)等。
大多数lg-SF黏附分子介导淋巴细胞和免疫应答所需要的细胞（巨噬细胞、其他淋巴细胞和靶细胞）之间的特异的相互作用。
但一些lg-SF成员，如N-CAM介导非免疫细胞的黏着。
1. lg-SF黏附分子的功能
(1)一些lg-SF成员通过同亲型细胞黏着机制参与神经细胞黏附。
表达于神经细胞的lg-SF黏附分子成员，由单一基因编码，mRNA的选择性剪接及糖基化的不同形成了20余种不同的N-CAM，其配体也为N-CAM。
分析发现，所有N-CAM的胞外区都有5个免疫球蛋白样的结构域，它们通过同亲型黏着机制与相邻细胞同类分子结合黏附在一起，与神经系统的发育、轴突的生长和再生以及突触的形成密切相关（图10-16)。
N-CAM的基因缺陷可引起智力发育迟缓和其他神经系统病变。
除了神经组织外，N-CAM也可在肌肉和胰腺等其他组织中表达。
NH2NH2NH2NH2细胞1
免疫球蛋白样结构域
i--------11[型纤连蛋白结构域
细胞2
图10-16神经细胞黏附分子的结构A.4种神经细胞黏附分子免疫球蛋白结构域，每个结构域在环末端形成二硫键；B同亲型黏着(4)一些lg-SF成员参与血小板和内皮的识别与黏附。
PE-CAM主要表达千血小板和内皮细胞，既可以同亲型黏着方式又可以异亲型黏着方式与其他黏附分子结合，在血管内皮细胞的紧密黏附中起主要作用。
250第三篇细胞的社会性
2. lg-SF黏附分子与医学
四、整联蛋白家族
整联蛋白(integrin)是一类普遍存在千脊椎动物细胞表面，依赖于Ca2＋或M忙的异亲型细胞黏附分子，介导细胞与细胞外基质之间以及细胞和细胞之间的相互识别和黏附，具有联系细胞外部作用因素与细胞内部结构（细胞骨架）的功能。
经典实验：整联蛋白的发现研究背景细胞与细胞外基质黏附作用的分子基础一直受到细胞生物学家的关庄。
20世纪70年代末到80年代初，包括R.0.
Hynes实验室在内的一些研究工作发现，在细胞骨架的应力纤维(stress fiber)与细胞外基质中的纤连蛋白之间存在一种物理性的连接，并发现有多个细胞骨架蛋白（包括纽蛋白和踝蛋白）参与其中，但是连接细胞与细胞外基质的关键性穿膜蛋白尚不清楚。
A. F.
Horwitz和C.
Buck等人利用自制的抗体筛选出参与细胞和细胞外基质黏附的候选穿膜蛋白一140kD大小的穿膜糖蛋白复合体。
免疫荧光和免疫电镜栓剧发现这些糖蛋白定位于细胞与细胞外基质的黏附部位。
另有研究表明140kD糖蛋白复合体与纤连蛋白结合，参与细胞黏附。
这些结果提示，这个140kD的糖蛋白复合体很可能是介导细胞与细胞外基质黏附的关键性穿膜蛋白。
但该糖蛋白复合体的编码基因及其蛋白结构特征均不清楚。
Hyn es实验室人员利用抗体杂交技术，筛选到了这种糖蛋白复合体的编码基因，并对其进行了进一步的鉴定。
实验内容
他们应用可以在大肠杆菌中转录和翻译真核细胞cDNA插入片段的入噬菌体表达载体，利用鸡胚成纤维细胞的mRNA构建出cDNA文库。
这个cDNA文库包含约100000个独立的cDNA插入片段，可以充分代表在鸡胚成纤维细胞内表达的所有mRNA。
然后，利用140kD糖蛋白复合体的抗体去筛选这个文库，荻得了若干携带特定cDNA插入片段的噬菌体重组体。
抗体杂交反应显示，这些克隆（噬茼体重组体）所表达的蛋白可以与140kD糖蛋白复合体的抗体结合。
接下来的问题是确定噬菌体重组体中的cDNA是否确实编码了140kD糖蛋白复合体中的某种蛋白成分。
他们利用筛选出的噬菌体克隆来表达蛋白，并将表达后的蛋白注射给免子，进行免疫，使之产生特异性的抗体。
免疫印迹实验显示，该抗体可以识别筛选到的噬菌体重组体中的cDNA所编码的蛋白，并能识别鸡胚成纤维细胞上140kD糖蛋白复合体中的某种蛋白；此外，利用该抗体对细胞进行免疫荧光栓测发现，阳性染色部位均位于应力纤维与细胞外基质相连的部位，这与用原来的140kD糖蛋白复合体的抗体进行朵色的结果相似。
因此，免疫印迹和免疫荧光的结果都说明，筛选得到的cDNA克隆编码了140kD糖蛋白复合物中的某种蛋白。
第十章细胞连接与细胞黏附251
接着，他们对该段cDNA进行测序，并由此推断其编码的氨基酸序列，发现该段cDNA编码了一个由803个氨基酸组成的蛋白质。
此蛋白包含一个位于氨基端的信号序列，以及一个位于狻基端的由23个疏水氨基酸构成的跨膜a－螺旋。
对氨基酸序列的进一步分析显示，该蛋白可能存在一个短的胞内结构域和一个长的含有多个糖基化位点的胞外结构域，这些都符合推测的穿膜糖蛋白的结构。
发表论文Tamkun JW., DeSimon e DW, Fonda D, et al.
Stmcture of inte护·in, a glycoprotein involved in the lransmembrane linkage hehveen fibroneclin and actin.
Cell,1986,46:271-282.
后续影响
Hynes和他的同事由此得出结论，即克隆得到了一种将细胞外基质的纤连蛋白同细胞骨架连接在一起的穿膜蛋白的编码基因。
他们将这种蛋白命名为整联蛋白(i n tegri n)，“以表明它能够作为一种与细胞膜整合的复合体，参与细胞外基质和细胞骨架间的穿膜联系”。
对整联蛋白基因的克隆推动了对构成细胞连接的分子基础的认识。
在黏着斑处，整联蛋白将细胞外基质和肌动蛋白丝连接起来。
此外，整联蛋白还介导了上皮细胞通过半桥粒与细胞外基质的黏附（整联蛋白在半桥杠处将细胞外基质与细胞的中间纤维连接起来）。
因此，正如Hynes和他的同事所展示的，整联蛋白在细胞－细胞外基质的黏附过程中发挥着广泛的作用。
后续研究表明，整联蛋白也在细胞的信号转导过程中发挥重要作用，通过将细胞外的信号传递至细胞内，来调控细胞的运动、增殖和存活等。
因此，整联蛋白的发现不但拓展了人们对细胞～细胞外基质黏附的认识，也提出了一种崭新的细胞行为的调控机制。
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.-·一．一一．一．．．一一一·•·一．．．．一．．．一．．．．．．．一．．．．一一．一一．．＿__..__＿．一一一一一1.整联蛋白的分子特点由a和B两个亚基组成的异二聚体，两亚基均为穿膜蛋白。
目前至少已鉴定出人有24种不同的a亚基和9种不同的B亚基，它们相互组合成不同的整联蛋白，可与不同的与细胞外基质成分结合配体结合。
整联蛋白a和B业基均由胞外区、跨膜区和胞内区三个部分组成。
由a和B亚基胞外区组成的球状头部区是整联蛋白分子与配体结合部位；胞内区很p亚基短，只含有30~50个氨基酸，可通过胞内的一些连接蛋白（踝蛋白、a－辅肌动蛋白、细丝蛋白、纽蛋白等）与细胞内的肌动蛋白丝等细胞骨架成分相互作用（图富含半胱氨酸10-17)。
整联蛋白的胞外区可以通过自身结构域与纤的结构域连蛋白、层粘连蛋白、胶原等含有Arg-Gly-Asp(RGD)三肤序列的细胞外基质成分结合（表10-4)，从而介导细胞与细胞外基质的黏着。
典型结构有黏着斑和半桥粒。
从表10-4可以看出，不同细胞表达的整联蛋白在组成上不尽相同；此外，不仅同一种整联蛋白可以与一种以上的不同配体相结合；而且，同一种配体也可以与多种不同的整联蛋白相结合。
2整联蛋白的功能
(l)整联蛋白介导细胞与细胞外基质间的连接或相互作用：整联蛋白介导细胞与细胞外基质的铀定连10nm接。
由bl亚基组成的整联蛋白为细胞外基质蛋白的图10-17整联蛋白的结构受体，其胞外区具有与大多数细胞外基质蛋白，如蛋白聚糖、纤连蛋白、层粘连蛋白等含有RGD三肤序列结合的位点，因此可以使细胞黏着于细胞外基质上。
一般来说，整联蛋白与其配体结合的亲和性不很高，而在细胞表面的数量较多，这种低亲和性有利于细胞调节其与细胞外基质成分结合的牢固程度与可逆性结合，细胞可通过膜上这类受体(b l亚基）与细胞外基质成分黏附、分离、再黏附、再分离，从而进行迁移。
(2)整联蛋白也介导细胞间相互作用：在一些细胞表面有与整联蛋白结合的特异性配体（如Ig超家族成员），可以介导细胞间的反应。
如由b2亚基组成的整联蛋白能使白细胞在感染部位的血管内皮细胞上黏附，白细胞由此得以迁移出血管进入炎症部位。
b3亚基组成的整联蛋白见千血小板和其他类型的细胞，可以介导血小板的黏附，参与凝血过程。
(3)整联蛋白在信号传递中发挥重要作用：整联蛋白与其配体结合后聚集成簇，不但借以形成稳定、牢固的结合，并可启动信号转导，调节细胞的行为，如细胞的迁移、增殖、分化、存活和凋亡等基本生命活动。
整联蛋白参与的信号传递方向有”由内向外”(insid e out)及“由外向内”(outside in)两种形式（图10-18)。
细胞外基质成分（整联蛋白的配体）
贮信号分子
气4'气卢活勹，广三飞白
信号分子受体
胞外信号内传胞内细胞外传
整联蛋白与细胞外整联蛋白在细
基质分离胞膜上分散开
黏着斑组装黏着斑去组装（整联蛋白簇集）
第十章细胞连接与细胞黏附253
研究发现整联蛋白往往以无活性的形式存在千细胞表面，当细胞内事件启动胞内信号传递后，激活整联蛋白，使其胞内结构域发生构型改变，继而诱导胞外结构域发生构型变化，从而增强整联蛋白与其他胞外配体的结合能力，最后介导细胞黏着。
这种由细胞内信号的启动，通过改变细胞本身的功能状态，将胞内信号由整联蛋白胞内区传递到细胞外，促进整联蛋白与配体结合的方式称为”由内向外＂的信号转导。
一些蛋白，如肌动蛋白结合蛋白和黏着斑激酶(focal adhesion kinase, FAK)等胞内蛋白，能直接与整联蛋白胞内区结合，通过磷酸化或去磷酸化作用调节整联蛋白的活性，影响其功能。”
由内向外”的信号转导主要控制细胞黏附力，对千血小板和白细胞介导的黏附反应是非常重要的。
整联蛋白还可作为受体介导信号从细胞外环境向细胞内的转导，这种方式称为”由外向内＂的信号转导。
例如，细胞在体外培养时，大多数正常细胞必需贴附在细胞外基质上才能生长，如果细胞不能贴附在细胞外基质上就会停止分裂直至死亡，这种现象叫做铀定依赖性生长。
其原因是因为它们的整联蛋白不能与细胞外基质配体相互作用，致使无法向细胞内传递存活信号。
现在知道，这种整联蛋白介导的”由外向内”的信号转导通路依赖细胞内酪氨酸激酶一FAK。
整联蛋A白与配体结合可使整联蛋白发生簇集，导致FAK自主磷酸化而与Src激酶结合，FAK/Src复合体使多个下游分子磷酸化，血小板活化FAK-MAPK和FAK-PI3K等通路，直血小板凝集接或间接传递信号，调控细胞增殖、黏附整联蛋白纤维蛋白原与｛申展、迁移等多种细胞功能。
3整联蛋白与医学血小板凝聚与血小板黏着血栓形成：整联蛋白胞外区可以通过自身结构域识别含有RGD的三肤序列的配体，体外实验证实，含有RGD序列的入工合成肤可以竞争性阻断细胞与纤连蛋白的结合，使培养的细胞不能贴壁生长。
据估计大约半数的整联蛋白含有结合RGD的结合成的构域。
RGD序列的发现开辟了以受体－配RGD短肤体相互作用为基础的新的治疗疾病的手段。
血栓的形成是造成心脏病发作的病因之一。
血凝块的形成始千血小板的凝聚，由血小板特异的整联蛋白a IIb因与血浆中含有RGD序列的纤维蛋白原结合，图10-19血小板整联蛋白与纤维蛋白原结合介导血小板相介导了血小板的凝聚（图10-19)。
动物实互黏附验表明，含有RGD序列的入工合成肤可以A血小板整联蛋白活化后与纤维蛋白原结合形成血凝块；B用合成的RGD短肤抑制血小板凝聚竞争性地阻止血小板整联蛋白与血浆中纤维蛋白原结合，从而预防血凝块的形成。
这一发现使人们设计出一种新的非肤类抗凝血药物（如Aggrastat)，它们类似千RGD结构，但只与血小板整联蛋白结合。
此外，一种直接抗整联蛋白的特异性抗体（称为ReoPro)，能阻止接受血管外科手术患者的血凝块形成。
整联蛋白有望成为疾病治疗的靶点。
目前已有三个以整联蛋白a IIb阳为靶点的治疗不稳定心绞痛的药物已经进入市场。
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[I]周柔丽细胞社会性I/周柔丽医学细胞生物学2版北京：北京大学出版社，2006:572-601多细胞生物相邻细胞之间或细胞与细胞外基质之间在质膜上存在的蛋白质连接结构称为细胞连接。
细胞连接可分为封闭连接、描定连接和通讯连接三种类型C其中以紧密连接为代表的封闭连接通过相邻质膜上的穿膜蛋白将细胞紧密连接在一起，封闭上皮细胞间隙，阻止细胞外物质通过细胞间隙进入组织，同时还隔离了膜蛋白和膜脂分子的侧向扩散，维持上皮细胞的极性；描定连接分为两大类：一类与肌动蛋白丝相关联的黏着连接，在相邻细胞之间形成黏着带，在细胞与细胞外基质间形成黏着斑；另一类由中间纤维参与的连接，在相邻细胞之间形成桥拉，细胞与细胞外基质间形成半桥粒。
它们把相邻细胞或细胞与细胞外基质连接在一起，形成抵抗机械张力的牢固连接，并在组织器官的形成和细胞的迁移等过程中发挥重要作用；通讯连接在相邻细胞膜上存在特殊的结构或通道，以实现细胞间电信号和化学信号的通讯联系，从而完成群体细胞间的合作和协调。
其中间隙连接在细胞之间的代谢耦联和信号传递过程中起重要作用，在电兴奋性细胞之间还可以通过化学突触传递冲动信号。
位于细胞表面的黏附分子介导细胞之间或细胞与细胞外基质之间的黏着。
黏附分子主要有四大类：钙黏着蛋白、选择素、免疫球蛋白超家族及整联蛋白家族。
钙黏着蛋白是一类依赖于Ca"的同亲型细胞黏附分子，对胚胎发育中的细胞识别、迁移和组织分化以及组织器官的构筑起重要作用；选择素是一类依赖于Ca2＋的异亲型细胞黏附分子，它们能特异识别其他细胞表面寡糖链中的特定糖基，主要参与白细胞与血管内皮细胞或血小板的识别和暂时性黏附，帮助白细胞、血小板从血及进入炎症部位；免疫球蛋白超家族是分子结构中含有类似免疫球蛋白结构域、不依赖Ca2＋的细胞黏附分子，大多介导淋巴细胞和免疫应答所需要的细胞之间的黏看，而N-CAM和NCAM-Ll则介导非免疫细胞的黏着，在神经系统发育中有重要作用；整联蛋白普遍存在于脊椎动物细胞表面，依赖于Ca”或Mg2+的异亲型细胞黏附分子，它介导细胞与细胞外基质之间或细胞与细胞直1司的相互识别和黏着，同时整联蛋白还具有信号双向转导作用，调节细胞的运动、增殖、生长、生存、凋亡等重要生命活动。
（王向东）
第十一章细胞微环境及其与细胞的相互作用
在人体或哺乳动物组织中，细胞的存在和活动都与其所处的周围环境有关，这种环境被称为细胞的微环境(cell microenviroment)。
包括细胞外基质在内的细胞微环境与细胞一起，共同组成机体的组织。
1978年，R.
Schofield提出了“微环境”(microenvironment或niche)假说，用来描述支持干细胞生长的生理性微环境。
随着研究的深化，细胞微环境的概念也得到拓展和完善。
可以认为，细胞微环境是由相邻细胞和非细胞成分共同构成的局部“区室”，它参与其细胞所在组织结构有序性和稳定性的维持，也参与其细胞本身功能活动的调控。
细胞微环境总是处于一种动态的平衡状态，谓之微环境稳态(microenviromental homeostasis)。
细胞微环境的稳态是保持细胞正常生命活动（如增殖、分化）的基础。
微环境成分的异常变化，与许多病理过程有关，如肿瘤的发生发展、组织器官的纤维化以及组织创伤修复等。
因此，在医学上细胞微环境与细胞同样具有重要意义。
近年来，对于细胞微环境的研究备受关注，已经成为细胞生物学及医学领域的研究热点和前沿。
第一节细胞微环境的组成
在哺乳动物和人体组织中，任何一个细胞都不是孤立存在的，细胞与细胞微环境相互作用并发挥功能。
细胞微环境主要由不同类型的细胞成分、细胞外基质、细胞外调节分子和液体物质组成。
细胞微环境中的各种成分不仅对细胞起支持、保护、连结和营养作用，而且与细胞的增殖、分化、黏着与迁移、代谢等基本生命活动密切相关。
细胞与这些相邻结构和成分之间的信息沟通失衡，在疾病发生过程中起重要作用。
—、微环境的细胞成分
细胞生存的微环境中的细胞成分在不同类型的细胞中有所不同。
在干细胞微环境中主要是干细胞龛(stem cell niche)（支持细胞，support cells)（详见第十七章）。
有些组织中的未分化前体细胞（如干细胞），其相邻的微小血管也是细胞微环境的主要组分之一。
在肿瘤细胞微环境中存在大谥的间质细胞(mesenchymal cell)，包括炎性细胞、内皮细胞、脂肪细胞、肿瘤相关成纤维细胞等。
间质细胞与肿瘤细胞相互作用，在促进肿瘤细胞生长、转移的同时，也为肿瘤细胞逃避机体免疫系统的攻击提供了必要的条件。
部分间质细胞的功能出现异常后可以促进肿瘤的转移和定植，部分可起到抗原呈递作用，该过程需要间质细胞分泌的多种细胞因子参与。
二、细胞外基质
细胞外基质(extracellular matrix, ECM)是细胞微环境的核心组分，也是目前研究较清楚的细胞微环境成分。
细胞外基质由细胞合成并分泌到细胞外空间，是一个由许多大分子，主要是一些蛋白和多糖或蛋白聚糖构成的精密有序的三维网状结构。
ECM的存在形式有二类：一是存在千细胞之间称之释放，作用于内皮细胞或微环境中的其他细胞。
邮，1"．回为间质性基质二是存在于内皮细胞和上皮细胞的基底部，称基膜或基底膜（动画11-1“细胞外基；嘎三：三三三产三三三勹：三艺三三勹代谢、识别、黏着、迁移等基本生命活动密切相关。
首先，ECM中的生物大分子所构成的三维网状结构，为细胞和组织提供结构支持。
其次，ECM还可以通过黏附受体进行信号传导，并可以结合、储存、释放生长因子和其他生物活性分子。
例如，在血管组织，ECM不仅仅作为结构物质支持血管的形成，也是血管生成促进因子和抑制因子的储存场所。
ECM中的生物活性分子在蛋白酶的作用下激活或细胞外基质的结构和功能异常，与许多病理过程有关，如组织器官纤维化、肿瘤恶变浸润以及组细胞微环境中的因子，除了有生物化学的多样性和特异性之外，还具有生物物理学的多样性，包细胞外基质是目前了解较清楚的细胞微环境的重要组成成分。
构成细胞外基质的大分子种类繁多，大致可分为三类心糖胺聚糖与蛋白聚糖；＠胶原和弹性蛋白＠非胶原糖蛋白纤连蛋白和层粘；：，、一织创伤修复等。
三、细胞外调节因子
信号分子和细胞因子是细胞微环境中重要的细胞外调节分子。
信号分子是指生物体内的某些化学分子与相应的细胞受体相结合，在细胞间和细胞内传递信息，如激素、神经递质、生长因子等。
根据信号分子的溶解性可分为亲水性和亲脂性两类。
细胞因子是一类特殊的信号分子，是由免疫细胞（如单核、巨噬细胞、T细胞、B细胞、NK细胞等）和某些非免疫细胞（内皮细胞、表皮细胞、成纤维细胞等）分泌的一类具有广泛生物学活性的小分子蛋白质，它们通过与相应的受体结合而发挥对细胞行为（如免疫反应、血管生成、损伤修复等）的调节作用。
在肿瘤微环境中，细胞因子与其相应配体特异性结合后可导致肿瘤的发生、发展及转移。
括分子结构的力学特性，微环境剪切流(sh ear flow)等。
第二节细胞外基质的主要组成成分
连蛋白（图11-1)。
纤连蛋白层粘连蛋白
......
.`L/广蛋白聚糖
第十一章细胞微环境及其与细胞的相互作用257
细胞外基质从结构表现形式上看，主要由凝胶样基质和纤维网架构成。
糖胺聚糖与蛋白聚糖构成凝胶样基质，纤维网架由起结构作用的胶原和弹性蛋白，以及起黏着作用的纤连蛋白和层粘连蛋白构成。
在动物组织中，细胞外基质的含量因组织种类不同而异，上皮组织、肌组织及脑与脊髓中的细胞外基质含批较少，而结缔组织中细胞外基质含量最大。
细胞外基质的组分及组装形式由所产生的细胞决定，并与组织的特殊功能需要相适应。
例如，角膜的细胞外基质为透明柔软的片层，肌腿则坚韧如绳索。
细胞外基质不仅静态地发挥支持、连接、保水、保护等物理作用，而且动态地对细胞行为产生全方位的影响。
一、糖胺聚糖与蛋白聚糖
糖胺聚糖(glycosaminoglycan,GAG)与蛋白聚糖(proteoglycan, PG)是一些高分子址的含糖化合物，它们构成细胞外高度亲水性的凝胶，赋予组织具有良好的弹性和抗压性。
（一）糖胺聚糖是由重复的二糖单位构成的直链多糖糖胺聚糖是由重复的二糖单位构成的直链多糖，过去称为黏多糖(mucopolysaccharide)。
其二糖单位之一是氨基已糖(N－乙酰氨基葡萄糖或N－乙酰氨基半乳糖），故又称氨基聚糖；二糖单位中另一个糖残基多为糖醒酸（葡萄糖醋酸或艾杜糖醒酸）。
因糖残基上通常带有硫酸基团或狻基，因此糖胺聚糖带有大量负电荷（图11-2)。
重复二糖
艾杜糖醋酸k°N－乙酰半乳糖胺－4－硫酸图11-2硫酸皮肤素GAG链的二糖重复序列根据糖残基的性质、连接方式、硫酸化数量和存在的部位，糖胺聚糖可分为六种：心透明质酸(hyaluromc acid,HA)；＠硫酸软骨素(chon如｀oiti n sulfate,CS)；＠硫酸皮肤素(dermatan sulfate, DS)；＠硫酸乙酰肝素(hepru-an sulfate, HS)；＠肝素(hepru·in)；＠硫酸角质素(keratan sulfate, KS)。
其结构、特性及分布见表11-1。
糖胺聚糖重复二糖单位组织分布
透明质酸D－葡萄糖酸酸，N－乙酰氨基葡萄糖结缔组织、皮肤、软骨、滑液、玻璃体硫酸软骨素D－葡萄糖酸酸，N－乙酰氨基半乳糖软骨、角膜、骨、皮肤、动脉硫酸皮肤素L－葡萄糖酸酸或艾杜糖醋酸．，N－乙酰氨基半乳糖皮肤、血管、心瓣膜、韧带硫酸乙酰肝素D－葡萄糖醋酸或艾杜糖醋酸.,N－乙酰氨基葡萄糖肺、动脉、细胞表面肝索D－葡萄糖酸酸或艾杜糖醋酸．，N－乙酰氨基葡萄糖肺、肝、皮肤、肥大细胞硫酸角质素D－半乳糖，N－乙酰氨基葡萄糖软骨、角膜、椎间盘注：·艾杜糖醋酸是由差向异构酶催化糖链中的D－葡萄糖酘酸进行差向异构化而生成的透明质酸(HA)是糖胺聚糖中结构最简单的一种，整个分子全部由葡萄糖醋酸和N－乙酰氨基葡萄糖二糖单位重复排列构成，不发生硫酸化。
二糖单位有5000~25000个不等。
由千透明质酸分子表面糖酸酸的狻基带有大屈的负电荷，其相斥作用使整个分子伸展膨胀占据很大的空间；其表面的大批亲水基团，可结合大拢水分子，使基质等渗性水肿，因而即使浓度很低，也能形成黏稠的胶体。
如果没有约束，一个透明质酸分子可以占据1000倍于其自身分子的空间。
当处千有限空间时可产生膨胀压，赋予组织具有良好的弹性和抗压性C透明质酸是一种重要的糖胺聚糖，在胚胎发育早期和组织创伤修复时，细胞大品分泌透明质酸，促进细胞迁移和增殖。
任务完成后，可被透明质酸酶(hyaluronidase)降解。
（二）蛋臼聚糖是由糖胺聚糖和核心蛋白共价结合形成的高分子量复合物1.蛋白聚糖的分子结构蛋白聚糖是由糖胺聚糖（除透明质酸外）与核心蛋白(core protein)共价结合形成的高分子温复合物，是一种含糖量极高的糖蛋白（含糖量可达分子总重址的90%~95%）。
核心蛋白为单链多肤，一条核心蛋白分子上可以连接1~100条以上相同或者不同的糖胺聚糖（糖链较短，一般在300个糖基以下），形成蛋白聚糖单体。
若干个蛋白聚糖单体通过连接蛋白(link er protein)以非共价键与透明质酸结合形成蛋白聚糖多聚体。
软骨中的蛋白聚糖复合体是巳知的最巨大分子之一，它的糖胺聚糖为硫酸软骨素和硫酸角质素，每个复合体相对分子量高达数百万，长达几个微米。
这些蛋白聚糖赋予软骨凝胶样特性和抗变形能力（图11-3)。
lµm蛋白聚糖聚合体
图11-3细胞外基质中的蛋臼聚糖A细胞外基质中蛋白聚糖多聚体；B软骨中的蛋白聚糖电镜照片2蛋白聚糖的合成与装配蛋白聚糖的核心蛋白肤链在糙面内质网核糖体上合成，多糖侧链装配到核心蛋白上是在高尔基复合体中进行的。
在装配时，首先是一个专一的连接四糖：木糖－半乳糖半乳糖－葡萄糖醋酸(Xyl-Gal-Gal-GlcUA)与核心蛋白的丝氨酸残基共价结合，在丝氨酸所处的肤链部位具有专一的构象，可被识别。
然后在糖基转移酶(glycosyltransferases)的作用下，一个个糖基依次添加上去，形成了糖胺聚糖糖链（图11-4)。
蛋白聚糖的一个显著特点是其多态性，可以含有不同氨基酸序列的核心蛋白，以及长度和成分不同的多糖链。
每种蛋白聚糖都有其特有的结构，其功能由各自的核心蛋白和糖胺聚糖所决定（表112)。
酸氨丝
连接四糖GAG
专一的连接匹糖首先与核心蛋白的丝氨酸共价连接，GAG链的其余部分主要由重复的二糖单位组成蛋白聚糖并不都是细胞外基质成分，有的也是质膜的整合成分，如成纤维细胞和上皮细胞表面的黏结蛋白聚糖(syndecan)，其核心蛋白以穿膜糖蛋白的方式嵌入质膜的脂双分子层中，胞外区连有硫酸软骨素和硫酸类肝素GAG糖链，可以与细胞外基质的胶原、纤连蛋白以及信号分子结合，胞内区肤段可与膜下细胞骨架及细胞皮层内的信号蛋白分子相互作用，既可介导细胞与细胞外基质结合，又可使细胞内外信息相通（图11-5)。
（三）糖胺聚糖与蛋白聚糖的功能糖胺聚糖和蛋白聚糖普遍存在于动物体内各种组织中，在结缔组织中含量最高。
其功能主要有以下几个方面：1.使组织具有弹性和抗压性糖胺聚糖和蛋白聚糖构成了细胞外高度水合的凝胶状基质，使组织具有渗透压和膨胀压，有抗张、反弹、抗机械压力的缓冲作用。
在维待组织的形态，防止机械损伤中起重要作用。
软骨中的蛋白聚糖巨大复合体，赋予软骨具有良好的弹性和抗压性。
第三篇细胞的社会性
硫酸乙酰肝索\细胞外基质结合区
细胞外
细胞质
图11-5黏结蛋臼娶糖－4的结构示意图各种黏结蛋白聚糖的细胞外区不同，但穿膜区和细胞内区均相同。
细胞内区除和肌动蛋白丝相连外，尚可结合调节分子，在信号转导过程中发挥作用2.对物质转运有选择渗透性由于糖基的高度亲水性和负电性，使糖链挺直交错，构成高度水化孔胶样物，孔的大小和电荷密度可调节对分子及细胞的通透性，具有分子筛的作用。
水、离子和各种营养性小分子、代谢物、激素、维生素和细胞因子等可选择性渗透。
肾小球基膜中的硫酸软骨素蛋白聚糖对于原尿的生成即具有筛滤作用。
3角膜中蛋白聚糖具有透光性角膜中主要含硫酸软骨素和硫酸角质素，由于高度硫酸化，使基质脱水变得致密，阻止血管的形成，使角膜柔软并具有透光性，同时角质化具有保护作用。
4糖胺聚糖有抗凝血作用肝素蛋白聚糖可与某些凝血因子结合而具有抗凝血作用，肝素蛋白聚糖常以单体形式存在，由靠近血管的肥大细胞分泌产生，并贮存千肥大细胞的颗粒中，当受到刺激时释放入血液，与抗凝血酶相结合，抑制凝血因子的作用，具有抗凝血功能。
5细胞表面的蛋白聚糖有传递信息作用在成纤维细胞和表皮细胞质膜内的黏结蛋白聚糖(syndecan-1)其胞外区硫酸乙酰肝素蛋白聚糖可与多种细胞外基质蛋白、生长因子等信号分子结合，将细胞外信号传递到细胞内引起细胞内生物学效应。
6.糖胺聚糖和蛋白聚糖与组织老化有关糖胺聚糖和蛋白聚糖的种类和数楹随年龄而变动，与发育过程中组织的功能相适应。
如在胚胎发育早期，透明质酸生成特别旺盛，它促进细胞增殖、迁移，并起阻止细胞分化作用。
透明质酸和硫酸软骨素具有很好的保水性，3个月胎儿的皮肤中，透明质酸和硫酸软骨素的含批是成人的20倍，随着年龄的增长，含垃逐渐减少，它们的一部分逐渐被硫酸皮肤素取代。
关节软骨中的蛋白聚糖随年龄增长而减少，同时硫酸软骨索逐渐被硫酸角质素取代。
随着个体的老化，蛋白聚糖中糖链比重下降，导致组织的保水性及弹性减弱，糖胺聚糖和蛋白聚糖变化与老化过程有关。
糖胺聚糖的众多阴离子可结合Ca2+，在组织的钙化，尤其是骨盐的沉积中起重要作用。
（四）糖胺聚糖和蛋白聚糖与疾病
糖胺聚糖和蛋白聚糖的合成与代谢异常与许多疾病有关。
蛋白聚糖的降解可在一系列细胞外酶或溶酶体中细胞内酶的催化下进行。
由于基因突变引起先天性缺乏降解糖胺聚糖的酶（如糖昔酶或硫酸酷酶）可导致糖胺聚糖或蛋白聚糖及其降解中间产物在体内一定部位堆积，造成黏多糖累积病(mucopolysaccharidoses)，如Hun ler综合征。
第十一章细胞微环境及其与细胞的相互作用261
动脉粥样硬化患者血管内皮细胞表面硫酸乙酰肝素和硫酸软骨素含蜇下降，硫酸皮肤素蛋白聚糖含量升高，使其易与低密度脂蛋白结合，导致脂类沉积。
糖胺聚糖的变化和蛋白聚糖分子的异常表达对肿瘤的发生、发展及转移有着重要意义。
在一些肿瘤组织中，如间质瘤、乳腺癌、神经胶质瘤细胞合成分泌透明质酸和硫酸软骨素增多，透明质酸形成的含水凝胶有利千细胞的增殖和迁移，并抑制细胞分化；硫酸软骨素可促进乳腺癌、艾氏腹水癌的生长。
在人肝癌、小鼠骨髓瘤、自发性乳腺癌中，均有硫酸乙酰肝素硫酸化程度降低现象，为肿瘤细胞的增殖、脱落、侵袭、转移提供了条件。
二、胶原与弹性蛋白
(—)胶原是细胞外基质中的骨架结构
胶原(collagen)是动物体内高度特化的纤维蛋白家族，是人体内含量最丰富的蛋白质，约占人体蛋白质总量的25％以上。
它遍布千体内各种器官和组织，在结缔组织中特别丰富，是细胞外基质的框架结构。
胶原可由成纤维细胞、软骨细胞、成骨细胞以及某些上皮细胞合成并分泌到细胞外。
1.胶原的分子结构典型的胶原分子呈纤维状，是由3条a多肤链盘绕而成的3股螺旋结构，长300nm，直径1.5nm，称为原胶原(tropocollagen)。
每条a肤链的氨基酸组成和排列独特，含有丰富的甘氨酸(Gly)和脯氨酸(Pro)，其中甘氨酸含量占1/3，脯氨酸及胫脯氨酸(Hypro)约占1/4。
a肤链中的氨基酸组成规律的Gly-X-Y三肤重复顺序(X和Y可以是任何一种氨基酸），但X常为Pro,Y常为Hypro或胫赖氨酸(Hylys)。
由于三肤重复顺序中甘氨酸的分子量最小，使肤链卷曲成规律的a－螺旋结构，而肤链的轻基化和糖基化使肤链互相交联，形成稳定的3a－螺旋结构。
2.胶原的类型a链是原胶原的基本亚单位，目前已发现人基因组中有42个编码a链的基因，每种a链由一种基因编码，各种基因产物以不同的方式组合成不同类型的胶原。
每型胶原由3条相同或不同的Q链构成，例如I型胶原是异源三聚体，由2条a1(I)和1条a2(I)构成；而1I型胶和皿型原是同源三聚体，分别由3条0'.1(JI)和3条0'.1(ill)链组成。
理论上42种Q链可以组合成数千种类型的胶原分子，但目前发现的胶原类型只有27种。
其基因突变往往导致3股螺旋形成障碍。
胶原在体内分布有一定的组织特异性，几种常见的胶原及其组织分布见表11-3。
注．分子式一栏中罗马数字代表胶原类型，a1,a2,m分别代表肤链类型，中括号外的数字代表肤链数目3胶原的合成装配与降解与大多数分泌蛋白的合成、修饰类似，胶原的合成与组装始于内质网，在高尔基复合体中进行修饰最后在细胞外组装成胶原纤维。
262第三篇细胞的社会性
前u链I
比N心～千～更~COOH胶原纤维
严－母－l0~300
原胶原分子
nm
___前胶原横纹(67nm)胶原原纤维图11-6胶原纤维形成过程中在细胞内和细胞外的变化示意图1合成前Cl.－链；2脯氨酸和赖氨酸进行胫基化；3胫赖氨酸糖基化；4三条前a－链的自我组装；5前胶原三股螺旋的形成；6分泌；7切除前肤；8组装成原纤维；9胶原原纤维聚集成胶原W型胶原与I、lI、皿型胶原不同，在Q链中不含规则的三肤重复顺序(Gly-X-Y)，因此不形成g螺旋结构；分泌到细胞外基质的前胶原分子的前肤不被切除；在装配成高级结构时，二个前胶原分子的狻基端头对头相接形成二聚体，几个二聚体再相互交联成网络，构成基膜的骨架结构。
N型胶原与层粘连蛋白、硫酸乙酰肝素蛋白聚糖等组装成基膜。
第十—章细胞微环境及其与细胞的相互作用263
(3)胶原的降解：一般情况下胶原更新转换率较慢，如骨胶原分子的半衰期可达10年。
但在创伤修复或炎症反应初期，胶原转换率加快，并伴有胶原类型的转变。
胶原分子可被胶原酶((,ullagenase)降解，胶原酶的活化与抑制对千调节胶原的转换率具有重要作用。
创伤组织、癌变组织中胶原酶活性显著增高；一些酶类如蛋白酶、纤溶酶等可以活化胶原酶；结缔组织可以合成胶原酶抑制剂；激素可调节胶原酶的合成和降解，如糖皮质激素可以诱导胶原酶的合成，雌二醇和孕酮抑制子宫胶原的降解。
4.胶原的功能
(1)胶原在不同组织中行使不同的功能：哺乳动物皮肤中的胶原编织成网，分布千皮下结缔组织中，具有抗衡来自不同方向的张力的作用。
肌胞起着连接肌肉和骨的作用，在肌腮中的胶原纤维沿着肌腮的长轴平行排列，与承受拉力的方向一致，使肌腿具有很强的韧性，能够承受巨大的拉力。
在骨、角膜和横脯肌腿中，胶原纤维形成胶合板样多片层结构，角膜形成有序的胶合板样多片层结构使角膜既透明又具有一定强度。
皿型胶原形成微细的纤维网包绕在腺泡、骨骼肌和平滑肌细胞周围。
N型胶原以三维网络形式构成各种上皮细胞基膜的网架结构。
胶原通过与细胞外基质中各种成分结合，将细胞外基质组织起来，与细胞表面受体结合，连成组织和器官。
(2)胶原与细胞的增殖和分化有关：胶原有刺激上皮细胞增殖的作用，人体内的细胞绝大多数属于贴附依赖性细胞，即只有在一定的细胞外基质上贴附铺展，才能使细胞增殖周期运行。
胶原是细胞贴附的重要基质成分。
胶原还起着诱导细胞分化的作用。
如干细胞有多向分化潜能，在W型胶原和层粘连蛋白上分化为呈片层极性排列的上皮细胞；在I型胶原和纤连蛋白上分化为结缔组织的成纤维细胞；在II型胶原及软骨粘连蛋白上则分化为软骨细胞。
(3)哺乳动物在发育的不同阶段表达不同类型的胶原：在胎儿皮肤中含有大量的皿型胶原，随着发育的进程，旧型胶原逐渐被I型胶原取代。
正常人皮肤中以1型胶原为主。
皮肤在损伤后的修复阶段，皿型胶原含量显著增高。
成熟的组织胶原较稳定，半衰期很长，如骨板中胶原分子的半衰期可长达10年。
在创伤修复或炎症反应初期，胶原表达呈现胚胎期特点，胶原分子间缺乏交联，随着年龄增长，分子交联增多，胶原纤维结构逐渐变得紧密，从而导致皮肤、血管及组织变得僵硬，是衰老的重要特征。
5.胶原与疾病胶原与多种疾病或病理过程有关。
由于胶原的含量、结构、类型或代谢异常而导致的疾病称为胶原病(collagen disease)。
如胶原表达过度或分布和比例异常，可造成肝、肺、皮肤病理性纤维化。
恶性肿瘤细胞的侵润及转移，与他们能够分泌产生针对W胶原的专一性水解酶密切相关；基因突变引起胶原分子结构改变，导致遗传性胶原病等。
(1)维生素C缺乏导致维生素C缺乏症：在胶原合成过程中，前a链的轻基化是肤链间互相交联形成稳定的3a－螺旋结构的必需条件，该过程需脯氨酰3轻化酶和脯氨酰4胫化酶的催化，二者均以维生素C为辅助因子。
当人体内维生素C缺乏时，可导致胶原前a链的胫基化反应不能充分进行，不能形成稳定的3股螺旋结构，随即在细胞内被降解；而原先存在于基质及血管中的正常胶原逐渐丧失，结果导致组织中胶原的缺乏，引起血管、肌腿、皮肤等脆性增加，皮下牙跟易出血及牙齿松动等症状，称为维生素C缺乏症。
(2)遗传性胶原病：胶原在体内分布广泛，基因突变引起胶原分子的表达或胶原装配异常将导致遗传性胶原病。
如，成骨发育不全(Osteogenesis i mpe1fecta)综合征，由于编码I型胶原m(I)或气(I)的基因突变，使I型胶原合成障碍，导致骨骼发育不良，畸形，四肢短小，骨质疏松易骨折，重者早年天折；II型胶原基因突变可引起软骨异常，导致关节畸形、身材矮小；爱－唐综合征(Ehlers-Danlos syndrome)是一种胶原基因突变引起的遗传性疾病，由于缺乏一种切除前肤的酶，导致前胶原不能正常组装为高度有序的纤维，造成骨骼和肌腿缺乏刚性，关节活动过度，皮肤、肌胞、血管变脆症状。
(3)免疫性胶原病：胶原可引起免疫性疾病。
天然或变性的胶原分子，均可引起免疫反应。
正常情况下，人体对自身胶原结构组织具有免疫耐受性，如果机体丧失对自身胶原结构的免疫耐受，即可产生自身免疫性胶原组织损伤，导致类风湿性关节炎及慢性肾炎等。
免疫复合物在胶原组织中沉积，可引起炎症反应。
（二）弹性蛋白是构成细胞外基质中弹性纤维网络的主要成分入体一些器官组织在执行生理功能过程中，既需要强度也需要弹性，在受到外力牵拉后可迅速恢复原状，如皮肤、血管和肺组织等，由弹性蛋白形成的弹性纤维网络就赋予组织这种特性。
弹性蛋白(elas tin)是弹性纤维的主要成分，是高度疏水的非糖基化纤维蛋白，约含750个氨基酸残基。
它弹性纤维的氨基酸组成像胶原一样富含甘氨酸和脯氨酸，但很少胫化，不含轻赖氨酸，无糖基化修饰。
由千肤链中不含胶原特有的三肤(Gly-X-Y)重复序列，故不形成规则的三股螺旋，而呈无规则的卷曲。
弹性蛋白的肤链是由两种类型短肤交替排列构成，一种是疏水性短肤，赋予分子以弹性；另一种短肤为富含丙氨酸和赖氨酸残基的釭单个弹性蛋白分子螺旋短肤，负责在相邻分子间形成交联。
每种短肤各由．勿一个外显子编码。
弹性蛋白在细胞中合成后，随即以可溶性前体——..原弹性蛋白(tropoelasti n)的形式分泌到细胞外，通过赖图11-7弹性蛋白网络的伸展和回缩氨酸残基之间相互交联装配成弹性纤维网。
由于弹性蛋白的无规则卷曲及高度交联，使弹性纤维网可以像橡皮条一样的伸长与回缩（图11-7)，其伸展能力比同样截面的橡皮条至少高5倍。
弹性纤维与胶原纤维相互交织，分别赋予组织弹性和抗张性。
弹性蛋白的降解主要由弹性蛋白酶(elastase)催化。
弹性纤维(elastic fiber)并非单纯由弹性蛋白构成，在弹性蛋白的表面还包绕着一层由糖蛋白构成的微原纤维(microfibril)。
微原纤维直径约为10nm，是由一些不同的糖蛋白构成，其中一种较大的糖蛋白是原纤维蛋白(fibrillin)，是保持弹性纤维完整性必需的成分。
它的基因发生突变可导致一种称为马方综合征(Marfan syndrome)的遗传性疾病。
病变累及富含弹性纤维的组织，患者可出现骨骼及关节畸形，身材异常瘦长，严重者容易发生主动脉破裂。
弹性蛋白是动脉中含量最高的细胞外基质蛋白质，可占主动脉干重的50%。
弹性蛋白基因的突变可导致动脉壁平滑肌细胞过度增殖而引起动脉狭窄。
弹性蛋白与无弹性的胶原互相交织，可维待皮肤的韧性，并可防止组织和皮肤过度伸展和撕裂。
随着年龄的增长，胶原的交联度越来越大，韧性越来越低，皮肤等组织中弹性蛋白生成减少，降解增强，结果是老年人的骨和关节灵活度下降，皮肤弹性降低起皱。
三、细胞外基质中的非胶原糖蛋白
在细胞外基质中除了胶原和弹性蛋白两类主要的纤维蛋白外，还含有另一类重要的蛋白成分一非胶原糖蛋白。
目前已经在细胞外基质中发现数十种，它们都是多功能大分子，在结构上往往具有多个结构域，可与多种细胞及细胞外基质成分结合，是细胞外基质的组织者，对细胞的存活、增殖、分化、黏着、迁移等有着直接的影响。
目前对其结构与功能了解最多的是纤连蛋白和层粘连蛋白两种。
(—)纤连蛋白广泛存在于动物组织中
纤连蛋白(fibronectin,FN)是细胞外基质中发现最早的非胶原糖蛋白，广泛存在于人和动物组织中，是一类含糖的高分子量非胶原糖蛋白，含糖4.5%~9.5%，其糖含量因组织不同和分化状态不同而有差异。
纤连蛋白有两种存在形式：一种是可溶性的纤连蛋白，主要存在于血浆及各种体液中，由，。
1,肝实质细胞分泌产生，少部分产生于血管内皮细胞，称为血浆纤连蛋白(plasma fibronectin)；另一种是第十一章细胞微环境及其与细胞的相互作用265不溶性的纤连蛋白，主要存在于细胞外基质（包括某些基膜）及细胞表面，主要由间质细胞分泌产生，称之为细胞纤连蛋白。
1纤连蛋臼的分子结构各种纤连蛋白均由相似的亚单位（分子量为220~250kD)组成。
血浆纤连蛋白是由两条相似的肤链形成的二聚体(dime1)，两条肤链在C端借二硫键交联形成V字形。
细胞纤连蛋白为由二聚体交联后形成的多聚体。
目前在人体中已鉴定的纤连蛋白亚单位就有20种以上，它们是由同一基因编码的产物，转录后由于拼接上的不同而形成多种异型分子，具有不同的生物学功能。
不同组织来源的纤连蛋白亚单位在结构上稍有区别，每条肤链约含2450个左右氨基酸残基，构成线性排列的5~6个杆状的功能区，各功能区之间的短肤连接部位可折屈，并对蛋白酶敏感（图11-8)，因此可以通过胰蛋白酶的水解作用分离这些功能区之间的短肤，来研究各功能区的功能。
研究证实，分离下来的不同的杆状功能区上含有不同的大分子结合位点，可分别与不同的生物大分子或细胞表面受体结合，如可与I、II、W型胶原、肝素、凝血因子、纤维蛋白(fibrin)，以及细胞表面受体如整联蛋白等结合。
细胞硫
酸乙
酰纤维蛋白硫酸乙酰肝素和胶原纤维蛋白结合域肝素结合域结合域纤维蛋白结合域结合域结合域研究表明，纤连蛋白肤链中的某些特殊的短肤序列，如Arg-Gly-Asp(RGD)三肤是细胞表面各种纤连蛋白受体识别并结合的最小结构单位。
如果该结构区发生突变或缺失，则会导致纤连蛋白与细胞的黏附活性显著下降。
一些含有RGD序列的短肤，可与纤连蛋白竞争结合细胞膜上的纤连蛋白受体，因此，这种短肤序列具有抑制细胞同纤连蛋白结合的作用。
但RGD序列并不是纤连蛋白所独有的，许多细胞外基质蛋白都含有这种序列。
此序列可被细胞表面受体中的整联蛋白所识别。
因此，所谓的RGD序列，是指存在于纤连蛋白和某些细胞外基质蛋白肤链中的“精氨酸(R)－甘氨酸(G)－天冬氨酸(D)“三肤序列。
可被细胞表面一些整联蛋白所识别，并与之结合。
纤连蛋白的细胞表面受体是整联蛋白家族成员，是一种高分子量的穿膜糖蛋白，由a、B两种亚基（多肤链）组成的异源二聚体，其性质决定了细胞能结合的黏附分子的类型，介导与其他细胞表面或细胞外基质间的黏合（见第十章第二节，图10-17)。
2.纤连蛋白的功能纤连蛋白与细胞的形状、黏着、迁移、增殖、分化以及创伤修复、肿瘤转移等均有密切关系。
(1)介导细胞与细胞外基质间的黏着：纤连蛋白分子的多结构域以及其排列的特点，使得它可以同时与细胞外基质中多种生物大分子结合并介导细胞与细胞外基质、细胞之间的相互黏着。
通过黏着斑的作用，调节细胞的形状和细胞骨架的装配，促进细胞的铺展，加速细胞的增殖与分化。
266第三篇细胞的社会性
(2)纤连蛋白与细胞的迁移：细胞的迁移依赖于细胞的黏附与去黏附以及细胞骨架的组装与去组装。
在黏着斑处纤连蛋白受体通过纤连蛋白介导细胞与胞外基质黏附。
细胞通过黏着斑的形成与解离，影响细胞骨架的组装与去组装，促进细胞的迁移运动。
在胚胎发育早期，细胞分泌大量的纤连蛋白促进细胞迁移，例如在神经管形成时，神经唷细胞从神经管的背侧迁移到胚胎特定区域，分化成神经节、色素细胞等不同类型的细胞。
如果注射纤连蛋白受体的抗体或含RGD序列的短肤，就阻断了细胞的迁移。
(3)纤连蛋白在组织创伤修复中的作用：血浆中的纤连蛋白能促进血液凝固和创伤面的修复。
在组织创伤修复过程中，血浆纤连蛋白能与血浆纤维蛋白结合，在伤口处吸引成纤维细胞、平滑肌细胞和内皮细胞向伤口迁移，形成肉芽组织，然后形成瘢痕，同时还可以刺激上皮细胞增生，使创面修复。
3.纤连蛋臼与疾病血浆纤连蛋白在促进血液凝固和创伤修复中起重要作用，由于血浆纤连蛋白主要来自肝实质细胞，少量来自血管内皮细胞，当肝坏死、严重肝炎、肝硬化、弥漫性肝癌时，血浆纤连蛋白显著降低。
纤连蛋白与肾小球肾炎发生有关。
在肾小球基膜中含有大量纤连蛋白，DNA、金黄色葡萄球菌、链球菌、胶原、纤维蛋白的降解产物可以直接或以免疫复合物的形式与纤连蛋白结合而沉积在肾小球基膜上，引起肾小球肾炎。
血浆中纤连蛋白可与上述降解产物和免疫复合物结合，被肝Kupffer细胞和脾巨噬细胞表面受体识别而被清除，对肾脏起保护作用。
在创伤愈合过程中，组织局部的纤连蛋白过度表达，可导致瘢痕过度形成。
由千恶性肿瘤细胞表面的纤连蛋白受体异常，细胞黏着能力下降，使细胞容易分散和转移。
（二）层粘连蛋白是基膜的主要成分层粘连蛋白(Laminin, LN)是胚胎发育过程中出现最早的细胞外基质成分，同时也是基膜的主要结构组分之一。
层粘连蛋白是黏合糖蛋白，含糖量可达15%-28%。
在成体，它存在千上皮下和内皮下紧靠细胞基底部，还存在于肌细胞和脂肪细胞周围。
在不同种属及组织中先后发现了多种层粘连蛋白异型分子，它们结构复杂，功能多样，除了构成基膜的片层网状结构外，还与细胞的分化、黏附、迁移和增殖有关。
1.层粘连蛋白的分子结构层粘连蛋白是一种高分子量糖蛋白，分子量为820-850kD,70nm长。
层粘连蛋白是由a、B、丫三条不同的多肤链组成的异三聚体。
三聚体分子由一条重链(a链）和二条轻链(B、'Y链）借二硫键交联而成，外形呈不对称十字形构型，有三条短臂和一条长臂。
三条短臂各由三条肤链的N端序列构成。
每一短臂上都有相间排列的两个或三个球形结构域和短杆区；层粘连蛋白十字形结构的长臂杆状区域由3条肤链的近C端序列共同构成。
其中a链C端肤链序列高度卷曲形成一个较大的球状结构，此为肝素结合的部位（图11-9)。
层粘连蛋白分子中存在的多个不同的结构域，可与W型胶原、硫酸乙酰肝素、肝素、脑甘脂和神经节昔脂等细胞外基质组分结合，还可通过自身的RGD三肤序列与细胞膜上的整联蛋白结合。
现已证明层粘连蛋白分子中至少有8个与细胞结合的位点，可以分别与上皮细胞、内皮细胞、某些成纤维细胞、神经元、神经鞘细胞以及肿瘤细胞等结合。
在层粘连蛋白分子上还发现了能与化脓性链球菌等原核细胞结合的部位。
层粘连蛋白主要由附着在基膜上的上皮细胞和内皮细胞以及被基膜包绕的肌细胞等分泌产生。
层粘连蛋白是一个大的蛋白质家族，已鉴定出5种a链(a1-a5),4种B链((31～队）和3种丫链（丫l~'Y3)。
目前发现有15种层粘连蛋白异形分子(laminin1-laminin15)，每种分子分布有组织特异性，在不同的组织类型和不同的发育阶段，有不同分子结构的层粘连蛋白表达。
如lami ni n8存在于血fi~o·,1管内皮和肌细胞的基膜中，在胚胎组织中尤为丰富。
第十—章细胞微环境及其与细胞的相互作用267
结合硫酸脂／＼—丫
结合W型胶原
－螺旋卷曲螺旋诏
L~]j结合神经突
结＾整联蛋白［
口和肝素100nm（大的球状区）
医11-9层粘连蛋白的分子结构
A.层粘连蛋白的分子结构模式图；B电镜照片
2层粘连蛋白的功能层粘连蛋白是基膜的主要组分，在基膜的基本框架的构建和组装中起了关键作用。
层粘连蛋白分子上也有被上皮细胞、内皮细胞、神经细胞、肌细胞以及多种肿瘤细胞表面层粘连蛋白受体识别与结合的RGD三肤序列，使细胞黏附固定在基膜上，促进细胞的生长并使细胞铺展而保持一定的形态。
层粘连蛋白通过与细胞间的相互作用，可直接或间接控制细胞的活动，如细胞的黏附、迁移、分化、增殖或凋亡以及基因表达。
层粘连蛋白在早期胚胎中对于保持细胞间的黏附、细胞的极性及细胞的分化具有重要意义。
层粘连蛋白还有助于神经元在体外存活，并可在缺乏神经生长因子的情况下，促进中枢及外周神经元轴突的生长。
3.层粘连蛋白与疾病层粘连蛋白在体内的合成与降解异常与许多疾病有关，如糖尿病具有广泛的基膜改变，糖尿病性肾病的肾小球基膜中层粘连蛋白的含量明显降低，血清和尿中出现层粘连蛋白和W型胶原的降解产物。
一些疾病与层粘连蛋白的自身免疫反应有关，如由链球菌感染所致的肾小球肾炎患者血中出现抗层粘连蛋白的抗体，从而引起自身免疫反应，使肾小球基膜受损；在扩张性心肌病与心肌炎患者血清中也检测到抗层粘连蛋白的抗体。
层粘连蛋白还具有促进肿瘤细胞生长和转移的作用。
四、细胞外基质的特化结构一基膜
基膜(basal lamina或basement membrane)也称基底膜，是细胞外基质的特化结构形式，存在于多种组织之中。
它是细胞外基质特化而成的一种柔软、坚韧的网膜结构，厚约40-120nm，以不同的形式存在千不同的组织结构之中。
在各种上皮及内皮组织，基膜位千细胞基底部，是细胞基部的支撑垫。
在肌肉、脂肪等组织，基膜包绕在细胞周围，将细胞与结缔组织隔离。
在肾小球中，基膜介于两层细胞（内皮细胞和足细胞）之间，是滤过膜的主要结构。
在胚胎发育过程中，基膜为细胞的分离和分化提供支架；在成年时参与细胞的增殖、分化、迁移和组织损伤修复等过程。
基膜是机体抵抗肿瘤细268第三篇细胞的社会性胞转移和侵袭的第一道防线。
（一）基膜的组成成分构成基膜的绝大多数细胞外基质组分是由坐落在基膜上的上皮细胞和下方的结缔组织细胞合成并分泌的。
不同组织器官的基膜，甚至同一基膜的不同区域，其组成成分也有所不同。
但各种基膜都含有W型胶原、层粘连蛋白、巢蛋白及渗滤素四种蛋白成分（图11-10)。
巢蛋白
三三
亡蛋白
N型胶原
整联蛋白
1. N型胶原W型胶原是构成基膜的主要结构成分之一，是构成基膜的框架结构。
W型胶原分子长400nm，被非螺旋片段隔断20多处，为W型胶原分子提供了可折屈的部位。
各W型胶原分子通过C端球状头部之间的非共价键相互作用，以及N端非球状尾部之间的共价交联，形成了构成基膜基本框架的二维网络结构。
2层粘连蛋白是基膜中的主要蛋白质成分，由mB、1三条肤链构成非对称型十字结构。
蛋白之间通过长臂和短臂的臂端相连，自我装配成二维纤维网络结构，并进而通过巢蛋白与N型胶原二维网络相连接。
细胞质膜中的整联蛋白为其受体。
由千层粘连蛋白具有多个不同的功能结构域，既能与W型胶原结合，也能与细胞表面受体结合，从而将细胞与基膜紧密结合在一起。
（二）基膜的生物学功能
基膜不仅对上皮组织起结构支撑作用，而且在上皮组织和结缔组织之间起结构连接作用，同时还具有调节分子通透性以及作为细胞运动的选择性通透屏障。
如在表皮细胞层下的基膜可阻止结缔组织中的成纤维细胞进入表皮，而允许参与免疫作用的白细胞（巨噬细胞、淋巴细胞）穿过基膜进入表第十—章细胞微环境及其与细胞的相互作用269皮内；基膜对分子的通透具有高度选择性，如肾小球基膜在原尿形成过程中可以阻挡血液中细胞及蛋白质的透过，起选择性筛滤作用。
此外，细胞的形态、细胞的极性、细胞代谢、质膜上蛋白质的分布、细胞存活、细胞增殖、分化、细胞迁移等许多生命活动现象，均与基膜有着非常密切的关系。
第三节细胞微环境与细胞间的相互作用
机体的组织是由细胞与细胞微环境成分相互作用共同组成的，两者之间有着十分密切的关系，两者相互依存，相互影响，共同决定着组织的结构与功能。
细胞微环境与细胞间的相互作用主要是细胞外基质与细胞间的相互作用、细胞与细胞间的相互作用。
—、细胞外基质与细胞间的相互作用
一方面细胞通过控制基质成分的合成和降解决定细胞外基质的组成，另一方面细胞外基质对细胞的各种生命活动有着重要的影响。
(—)细胞外基质对细胞生物学行为的影响
细胞外基质除了与细胞一起构建组织，具有支持、连接细胞和保护作用外，还对细胞的结构与功能有着重要的影响。
只有在细胞外基质存在的条件下，组织中的细胞才能维持正常形态和行使各种生物学功能。
1细胞外基质影响细胞的形态结构细胞的形态往往与其特定的生存环境密切相关。
同一种细胞在不同环境中具有不同的形态。
体外实验表明，几乎所有组织的细胞在脱离了组织，处于单个游离悬浮状态时均会呈圆球状。
同一种细胞在不同的细胞外基质上黏附和铺展时，可表现出不同的形态。
如上皮细胞只有黏附在基膜上才能显示其极性，并通过细胞连接成为柱状上皮；成纤维细胞在天然的细胞外基质中呈扁平多突状，而在I型胶原凝胶中则呈梭形。
细胞外基质对细胞形态的决定作用主要是通过与细胞表面受体的结合，影响细胞骨架成分呈不同方式的组装和排列来实现的。
2.细胞外基质影响细胞的生存与死亡人体内大多数类型的细胞需要黏附在一定的细胞外基质上才能存活，细胞外基质对细胞的生存与死亡起着非常重要的作用。
例如，上皮细胞和内皮细胞一旦脱离了细胞外基质就会发生凋亡。
这种细胞失去基质缺少黏附就会走向凋亡的现象称为失巢凋亡(ano如s)。
这主要是由于细胞脱离细胞外基质后，细胞骨架松散而致线粒体释放细胞色素c，从而活化caspase凋亡途径而导致细胞凋亡。
当细胞通过整联蛋白黏附于细胞外基质上，可启动细胞存活相关的信号转导途径，维持细胞的存活。
3.细胞外基质调节细胞的增殖体外培养细胞实验证实，大多数细胞只有在一定的细胞外基质上黏附并铺展，才能使细胞增殖周期运行，这种现象称为贴壁依赖性生长(anchorage dependent growt h)。
细胞的这种特性是由千细胞黏附在基质上时，可通过整联蛋白介导传递多种生存和增殖信号到细胞内，最终影响细胞增殖相关基因的表达。
整联蛋白调节细胞增殖主要通过MAPK途径来实现。
MAPK信号通路是真核细胞调节细胞增殖和凋亡的关键通路。
肿瘤细胞的增殖丧失了贴壁依赖性，可以在悬浮状态下增殖。
4细胞外基质参与细胞的分化调控细胞外基质其多种组分可通过与细胞表面受体特异性结合，从而触发细胞内信号传递的某些连锁反应，影响核基因的表达，调控细胞的分化。
实验表明，特定的细胞外基质可使某些类型的细胞撤离细胞周期而进入细胞分化状态，如内皮细胞在胶原基质上培养时进行增殖，而在层粘连蛋白基质上则停止增殖进行分化，形成毛细血管样结构；乳腺上皮细胞在Matri gel上培养时，不但具有腺管样形态，而且分泌酪蛋白等乳汁成分。
酪蛋白基因的表达，是由于层粘连蛋白与细胞表面的贮B1整联蛋白作用后，活化了一定的信号转导系统而启动的。
5细胞外基质影响细胞的迁移无论在个体发育过程还是在成体组织再生以及创伤修复过程中都伴随着十分活跃的细胞迁移运动。
在细胞迁移过程中，细胞发生黏附与去黏附、细胞骨架组装与去组装等，都离不开细胞外基质的影响。
细胞通过基膜迁移时，需要基质成分的局部降解，胶原酶等基质金属蛋白酶在这一过程中通过分解局部的基质成分，开辟道路促进细胞的迁移。
蛋白酶抑制剂可阻止细胞的迁移。
这种情况可发生在白细胞穿过血管基膜迁移至炎症或创伤部位，也可发生在肿瘤细胞浸润和转移过程。
（二）细胞对细胞外基质的影响
1细胞外基质是由其所在组织细胞分泌的各种组织的细胞外基质的成分、含量和存在形式不同，都是由该组织的细胞（包括实质细胞和间质细胞）合成和分泌的。
同一个体的不同组织，在不同的发育阶段，所产生的细胞外基质也有所不同。
例如，胚胎结缔组织的细胞外基质主要产生皿型胶原、透明质酸和弹性蛋白；而成年结缔组织中成纤维细胞产生的细胞外基质以I型胶原、纤连蛋白等为主要成分。
细胞外基质的成分随组织的类型和功能状态的不同也有差异，如软骨组织中由成软骨细胞分泌的细胞外基质主要有1I型胶原和蛋白聚糖等。
2.细胞外基质成分的降解是在细胞的控制下进行的细胞外基质成分的降解也是由细胞分泌的蛋白水解酶催化的。
细胞外基质成分在细胞分泌的基质金属蛋白酶(matrix metalloproteinase, MMP,迄今已鉴定了20多种MMP)和丝氨酸蛋白酶家族联合作用下被降解。
基质金属蛋白酶家族是一类Zn2＋和Ca2＋依赖的蛋白酶，有多种类型，如胶原酶、明胶酶、基质溶解素、弹性蛋白酶等。
其中胶原酶具有高度特异性，可以切割蛋白质上某些特异性位点，这种局部降解方式既可以保持基质结构的完整性，又可为细胞迁移开辟道路。
细胞还可分泌基质金属蛋白酶和丝氨酸蛋白酶的抑制剂控制蛋白酶的作用程度和范围。
细胞对细胞外基质成分降解的控制和调节对创伤修复、组织重构以及细胞的迁移都有重要作用。
二、细胞与细胞间的相互作用
在细胞微环境中，除细胞与胞外基质之间的相互作用外，细胞与细胞之间相互作用(cell-cell in即action)对多细胞生物个体的发育和分化，以及维持细胞的正常生命活动起到至关重要的作用。
前者如细胞分化过程中的胚胎诱导和千细胞的稳态维持，后者如脑组织中的神经元活动。
局部微环境中细胞间相互作用的机制主要是：O相邻细胞分泌的旁分泌因子(paracri n e factor)对细胞的作用。
＠细胞膜并置在一起的近分泌相互作用(juxtacrine interaction)。
＠相邻细胞分泌的外泌体对细胞的调控。
有时，细胞还接受来自远距离的经血液运输的激素调控（详见第十二章）。
第四节细胞微环境异常与疾病
在正常生理条件下，细胞微环境依赖其中的各种组成成分共同作用的相对平衡，而维持在一种稳定状态（即稳态）。
然而，当受到其他组织或来源因素特别是病理因素（如激素、生长因子、免疫因子、化学物质、生物致病因子及免疫细胞等）的影响时，细胞微环境的稳态将被打破。
如果微环境中的各种成分被打破后不能重新建立新的平衡，也即微环境失衡，将导致细胞行为（如增殖、分化、衰老和死亡等）发生改变，进而导致疾病。
微环境异常引起疾病发生的典型例子是肿瘤的发生发展和器官的纤维化。
一、细胞微环境异常与肿瘤的发生发展
除基因突变等基因组不稳定性之外，肿瘤的发生发展与肿瘤细胞生存的微环境密切相关。
肿瘤微环境中的细胞和基质成分的异常也是肿瘤发生的重要因素。
图11-11显示了肿瘤细胞赖以生存的复杂的微环境系统：心成纤维细胞是肿瘤微环境中主要的基质细胞。
肿瘤邻近的成纤维细胞活化，成份，为肿瘤相关成纤维细胞（tumor-associated fibroblast)，它是实体肿瘤（如乳腺癌、大肠癌、胰腺癌）中最第十一章细胞微环境及其与细胞的相互作用271丰富的细胞成分，可产生大址的生长因子和细胞因子影响肿瘤细胞的行为，也是蛋白水解酶的主要来源，后者通过降解细胞外基质直接影响肿瘤迁移。
＠肿瘤微环境中存在大量的巨噬细胞，它被肿瘤细胞吸引到其周围，成为肿瘤相关巨噬细胞(tumor-associated macrophage)。
与正常巨噬细胞相比，肿瘤相关巨噬细胞产生细胞因子和组织蛋白酶等的能力更强，对促进基质降解、肿瘤周围血管形成和肿瘤细胞侵袭周围组织起重要作用。
＠肿瘤微环境影响T淋巴细胞的功能，导致T细胞免疫功能下降。
近年研究发现，微环境促使肿瘤细胞的PD-LI(programmed death-ligand1)表达上调，PD-LI与活化的T细胞表面的PD-I(programmed cell death protein1，一种重要的免疫抑制分子）结合后，抑制T细胞的活化和增殖，诱导T细胞凋亡，进而使肿瘤细胞逃逸机体的免疫监视。
＠在原发性肿瘤细胞的周围还包含有许多间质细胞，如骨髓来源的间充质干细胞，它们在促进肿瘤细胞迁移和抑制T细胞免疫中起重要作用。
＠肿瘤微环境中的细胞外基质成分和特性与正常组织明显不同。
研究表明，不同的ECM组分可以不同程度地影响肿瘤细胞的增殖和迁移能力。
癌细胞中性粒细胞
成纤维细胞
细胞外基质
血管
二、细胞微环境异常与器官纤维化
纤维化(fibrosis)是间质纤维结缔组织对受损实质细胞的修复失衡或反应过度的结果，几乎可累及人体各大组织和器官。
虽然其在各个系统、器官的发病机制不同、临床表现迥异，但均有类似的病理改变特征：组织或器官纤维组织增生，胶原纤维明显增加，包括细胞外基质成分及量的改变，持续的发展将导致正常器官结构破坏和功能减退，乃至衰竭，严重威胁人类健康和生命。
细胞微环境成分的变化与组织器官纤维化有非常密切的关系。
多种细胞因子、生长因子参与组织器官的纤维化，形成致纤维化的信号转导通路。
转化生长因子~(transforming驴owth factor-~, TGFB)在体内促进细胞外基质成分合成中起着重要作用，同时也被认为是介导纤维增生性疾病的关键因子。
TGF-~的各种生物学功能对机体具有积极的意义，它可以保护机体免受外部环境产生的各种危害。
然而，在一些情况下，TGF-~的应答反应是失败的，因而有时是有害的。
TGF-~对机体组织产生的损伤反应主要归因千它的自分泌环路机制能够使组织修复过程变成一种慢性的、进行性的过程，因而最终导致组织器官（如肝、肺、肾等器官）发生纤维化、硬化、结构破坏、功能丧失。
推荐读物
[I J成军现代细胞外基质分子生物学2版北京：科学出版社，2012[2]Turley SJ, Cremasco V.
Immunological hallm扣·ks of stromal cells in the tumour microenvironment.
Nat Rev lmmunol,2015,15:669-682.
272第三篇细胞的社会性
小结
在人体或哺乳动物组织中，细胞的存在和活动都与其所处的周围环境有关，这种环境被称力细胞的微环境。
细胞微环境是由相邻细胞和非细胞成分（细胞外基质、细胞外调节分子和液体物质）共同构成的局部“区室”，其在组织结构的有序性和稳定性维持及其细胞本身功能活动的调控中起重要作用。
细胞微环境的稳态是保持细胞正常生命活动（如增殖、分化）的基础。
细胞外基质是细胞微环境的核心组分，也是目前研究较清楚的细胞微环境成分。
细胞外基质是由细胞分泌到细胞外空间，由蛋白和多糖构成的精密有序的网络结构。
主要组分为糖胺聚糖与蛋白聚糖、胶原和弹性蛋白以及非胶原糖蛋白：纤连蛋白和层粘连蛋白。
细胞外基质不仅对组织细胞起支持、保护、营养作用，而且还与细胞的增殖、分化、代谢、识别、黏着、迁移等基本生命活动密切相关。
糖胺聚糖是由重复二糖单位构成的直链多糖，可与核心蛋白共价结合形成高分子复合物—-—蛋白聚糖，其分子表面带有大量的负电荷，可结合大量水分子，构成了细胞外高度水合的凝胶状基质，赋子组织良好的弹性和抗压性。
胶原是动物体内高度特化的纤维蛋白家族，胶原分子是由3条a多肤链盘绕成的三股螺旋结构，其合成与组装始于内质网，并在高尔基复合体中进行修饰，最后在细胞外组装成胶原纤维。
胶原使肌胧具有很强的韧性，N型胶原装配成的片层网架形成了基膜的主要结构。
弹性蛋白在基质中形成了交联网络，增强了基质的弹性和韧性。
纤连蛋白广泛分布于结缔组织中，而层粘连蛋白主要存在于基膜中，它们是细胞外基质中的非胶原糖蛋白，其分子肤链中包含多个功能结合区，可同基质中其他大分子或细胞表面受体结合，从而使细胞与细胞、细胞与外基质相互黏着。
整联蛋白是细胞表面的细胞外基质受体，纤连蛋白和某些细胞外基质蛋白肤链中的RGD序列可被整联蛋白识别，并与之结合，起连接和信号传递作用。
纤连蛋白和层粘连蛋白是细胞外基质的组织者，对细胞的存活、形态、黏看、铺展、迁移、增殖、分化有直接影响。
细胞外基质对细胞的形态和生命活动具有全方位的调控作用。
在正常生理条件下，细胞微环境中的各种组分共同作用使微环境保持在一种稳定的状态。
在某些来源因素特别是病理因素作用下，细胞微环境的稳态将被打破，引起细胞的生物学行为改变。
微环境成分的异常变化与许多病理过程有关，如肿瘤的发生发展和器官的纤维化。
（高志芹）
第十二章细胞间信息传递
为了形成多细胞的生物个体，细胞之间必须进行信息传递，就像人类如果要形成复杂的社会团体彼此之间必须进行交流一样。
多细胞生物个体中的细胞每时每刻都在接受和处理来自细胞内、外的各种信息。
这些信息的传递和整合不仅影响细胞本身的活动，而且还能使单个细胞在代谢、运动、增殖和分化等行为上与细胞群体及机体的整体活动保持协调一致。
因此弄清楚这些高度进化的细胞之间信息传递的方式、途径及机制十分重要。
细胞间的信息传递主要由细胞外信号分子介导，其中一些细胞外信号分子向远处的细胞传递信息，而另一些分子仅传递信息给邻近的细胞。
细胞外信号分子通过与细胞膜上或胞内的受体特异性结合，将信号转换后传给相应的胞内系统，使细胞对外界信号做出适当的反应，这一过程称为信号转导(signal transduction)。
多细胞生物体中的大多数细胞既能发出信息也能接收信息。
根据传递和接收信息的不同，在细胞内发生效应的分子可以是基因调控蛋白、离子通道及代谢通路的组分等。
目前已经证实，细胞内存在多种信号转导方式及途径，而且彼此间可交叉调控，构成复杂的信号网络(sign al i ng ne twork)。
阐明细胞间信息传递的机制不仅能加深对细胞生命活动本质的认识，也有助千人们对疾病发生、药物和毒物的作用等机制的研究。
第一节细胞间信息传递的方式和途径
多细胞生物个体是一个复杂而有序的细胞社会，这种社会性的维持不仅依赖于细胞的物质代谢和能掀代谢，还有赖于细胞间的信息传递，使各个细胞能以不同的方式协调和整合自身的行为（诸如细胞生长、分裂、死亡及分化等各项生理功能），从而服从千多细胞生物体的整体利益。
细胞间信息传递即细胞通讯(cell communication)，是指一个细胞发出信息，通过介质传递至另一个细胞产生特定反应的过程。
细胞间的信息传递对千多细胞生物个体的生长发育、组织器官的形成及维持，以及各种生理活动之间的协调至关重要。
一、细胞间信息传递的方式
细胞间信息传递的方式主要有细胞间隙连接(gap」unction汃细胞膜表面分子接触通讯(contact signaling by plasma membrane bound molecules)和不直接接触细胞间的化学通讯(chemical signaling)三大类。
1细胞间隙连接是细胞间直接进行信息传递的一种方式两个相邻的细胞间存在着由蛋白质构成的特殊结构——连接子(connexon)，其两端分别嵌入两个相邻的细胞，形成一个亲水性孔道（详见第十章）。
这种孔道允许两个细胞间自由交换分子质量小千1500Da的无机离子和水溶性分子（如cAMP和Ca2+，而不是蛋白质和核酸等大分子物质）。
因此，缝隙连接可以使相邻的两个细胞之间直接进行双向信息交流，而不必通过细胞膜这道屏障，是细胞间所有信息传递方式中最亲密的信息传递方式。
这种直接进行信息传递方式的生物学意义在千相邻细胞可共享一些具有特殊功能的小分子物质，因此可以快速、可逆地促进相邻细胞对外界信号做出协同反应（图12-l A)。
2细胞膜表面分子接触通讯是细胞间直接进行信息传递的另一种方式每个细胞都有许多蛋白质或糖蛋白分子分布于细胞膜的外表面，这些分子皆可作为细胞的触角，与相邻细胞膜表面的分子相互识别并相互作用，以达到功能上的相互协调，这种细胞间信息传递的方式称为膜表面分子接触通讯或接触依赖性信息传递(contact-dependent signaling)，也称近分泌相互作用(juxtacrine interaction)。
274第三篇细胞的社会性
这种信息传递方式需要细胞膜与细胞膜的直接接触。
例如细胞黏附分子之间的相互作用就是通过膜表面分子接触通讯来完成的，细胞表面的整合蛋白、钙黏蛋白和免疫球蛋白超家族等分子通过其蛋白质或糖链部分与另一细胞的同类或不同类分子相互识别并结合，使得两个细胞黏附在一起（图121B)。
这种接触依赖性的信息传递在多细胞生物个体的发育和免疫反应中尤其重要。
3.化学通讯是细胞间间接进行信息传递的方式在细胞之间进行信息传递的过程中细胞除了可识别相邻细胞外，还可识别周围环境中存在的各种信号，主要为物理信号、化学信号和生物学信号三大类。
在这些信号中，研究较多的是化学信号。
通过化学信号为介质来介导的信息传递称为化学通讯（图12-lC)。
化学通讯不需要细胞之间的直接接触，属于间接的细胞通讯方式，这是多细胞生物最普遍、最重要的细胞通讯方式。
主要的化学通讯包括：心旁分泌(paracrine fac t or)，旁分泌因子作为细胞外（液）的局部介质通过局部扩散到达靶细胞。
＠内分泌(endocri ne)，是由激素介导的细胞间进行长距离信息传递的方式，激素须经过远距离的血液运输后才能到达靶细胞。
此外，神经元之间或神经元与靶细胞之间的化学突触(c h em i cal synapse)和自分泌(autocri ne，细胞分泌的信号分子作用于细胞本身）也是化学通讯的常见方式。
自分泌信号常见于病理条件下，例如，肿瘤细胞经常使用自分泌途径促进自身的存活与增殖。
4．外泌体(exosome)是一种介导细胞间信息传递的新载体外泌体是直径在30-l OOnm的膜性小泡，由肥大细胞、树突细胞、B淋巴细胞、神经元、脂肪细胞、内皮细胞及上皮细胞等多种类型细胞分泌，广泛存在千血液、羊水、尿液、癌性积液、脑脊液、乳汁、唾液、淋巴液及胆汁等多种体液中。
外泌体中含有蛋白质、脂类和核酸（例如功能性的mRNAs和microRNAs)，作为介导细胞间信息传递的新载体，越来越受到重视。
外泌体介导细胞间信息传递的方式主要有3种：心外泌体通过膜表面信号分子的直接作用激活靶细胞内的信号通路；＠外泌体通过生物活性成分的胞外释放完成细胞间信息交流；＠外泌体通过膜融合完成基因水平的细胞间信息交流（图12-lD)。
外泌体膜可以与靶细胞膜直接融合，非选择性的释放其所含的蛋白质、mRNA及microRNA，进而靶向调节靶细胞的基因表达。
外泌体的这种信息传递方式使人们首次认识到基于基因水平的细胞间信息交流，是细胞通讯领域的重大发现。
外泌体的发现使得细胞间的信息传递更加精细和全面，它的发现揭示了存在于机体自身的RNA细胞间的转移途径。
间隙连接
小分子细胞膜表面的信号分子
分泌信号分子的细胞
细胞
旁分泌I.`.\
©:/.•'/'·内分泌
图12-1细胞间信息传递的方式A细胞间隙连接通讯；B细胞膜表面分子接触通讯；C.化学通讯；D外泌体通讯由间隙连接介导的细胞通讯的传递途径比较简单，信息分子通过双向扩散即可完成传递过程。
而其他信息传递方式包括细胞膜表面分子接触通讯、细胞间化学通讯和外泌体等介导的信息传递过程或信息传递的路线图则较复杂。
执行细胞间信息传递的信号分子，如旁分泌因子、激素和神经递质等均须与细胞表面或细胞内部的受体结合，并引起下游胞内信号分子的级联反应，才能实现对细胞的调节，该过程即信号转导，其中整个信息传递过程的路径谓之信号转导通路(signaling pathway)。
信号转导是细胞间信息传递的主要途径。
第二节细胞的信号转导及其关键分子一、细胞外信号细胞所接受的信号包括物理信号、化学信号及生物信号，其中最重要的是由细胞分泌的、能够调节机体功能的一大类生物活性物质，它们是细胞间通讯的信号，被称为“第一信使”。
这类信号分子主要是蛋白质、肤类、氨基酸及其衍生物，也包括类固醇激素和一氧化氮等。
第一信使分子的一级结构或空间构象中携带着某些信息，当它们与位于细胞膜上或细胞质内特定的受体结合后，后者可将接收到的信息转导给细胞质或细胞核中的功能反应体系，从而启动细胞产生效应。
化学信号分子大部分是水溶性的，不能通过细胞膜，少数是脂溶性的，可以直接穿过胞膜到达细胞内。
根据胞外信号的特点及作用方式，化学信号分子可分为激素、神经递质和局部化学介质三种类型。
激素由内分泌细胞合成，经血液或淋巴循环到达机体各部位的靶细胞。
这类信号分子的作用特点是距离远、范围大、持续时间较长。
胰岛素、甲状腺素和肾上腺素是它们的代表。
神经递质由神经元的突触前膜终端释放，作用于突触后膜上的特殊受体。
这类信号分子如乙酰胆碱、去甲肾上腺素等，具有作用时间和作用距离短等特点。
局部化学介质是由某些细胞产生并分泌的一大类生物活性物质，包括生长因子、前列腺素和一氧化氮(NO)等。
它们不进入血液，而是通过细胞外液的介导，作用于附近的靶细胞（同种细胞或异种细胞）。
一些细胞外信息物质影响细胞内代谢的可能途径见表12-1。
信息物质受体引起细胞内的变化神经递质乙酰胆碱、谷氨酸、氨基丁酸膜受体引起离子通道开闭生长因子类胰岛素生长因子－l、表皮生长因子、血膜受体引起酶蛋白和功能蛋白的磷酸化和脱小板衍生生长因子磷酸化，改变细胞的代谢和基因表达激素蛋白质、多肤及氨基酸衍生类激素膜受体同上类固醇激素、甲状腺素胞内受体调节转录维生素维生素A、维生素D胞内受体调节转录根据与受体结合后细胞所产生的效应的不同，也可将胞外信号分子分为激动剂和拈抗剂两大类。
激动剂是指与受体结合后能使细胞产生效应的物质。
与受体结合的部位与内源性配体相同，产生的细胞效应与内源性配体相当或更强者称为I型激动剂；与受体结合的部位不同千内源性配体，本身不能使细胞产生效应，但可增强内源性配体对细胞的作用者为lI型激动剂。
桔抗剂是指与受体结合后不产生细胞效应，但可阻碍激动剂对细胞作用的物质。
1型拈抗剂结合于受体的部位与内源性配体相同，可阻断或减弱内源性配体对细胞的效应；而JI型桔抗剂结合于受体的部位与内源性配体不同，能阻断或减弱内源性配体对细胞的作用。
276第三篇细胞的社会性
二、受体
受体(recep tor)是一类存在于胞膜或胞内的特殊蛋白质，能特异性识别并结合胞外信号分子，进而激活胞内一系列生物化学反应，使细胞对外界刺激产生相应的效应。
与受体结合的生物活性物质统称为配体(ligand)，包括激素、神经递质、生长因子、某些药物和毒物等。
受体在信号转导系统中的作用非常关键，它通过识别和结合配体，触发整个信号转导过程。
(—)受体包括膜受体和胞内受体
膜受体主要为银嵌在胞膜上的糖蛋白，由与配体相互作用的细胞外域、将受体固定在细胞膜上的穿膜域和起传递信号作用的胞内域三部分构成，其配体是一些亲水的、不能直接穿过细胞膜脂质双分子层的肤类激素、生长因子和递质等。
胞内受体为DNA结合蛋白，可与来自胞外的亲脂性小分子笛类激素等结合，作为转录因子与DNA顺式作用元件结合，调节基因的表达。
1.膜受体包括离子通道型受体、G蛋白耦联受体和酶联受体图12-2N型乙酰胆碱受体(nAChR)的结构模式图A乙酰胆碱受体a l亚单位跨膜示意图；B乙酰胆碱受体顶面观；C.乙酰胆碱受体结构膜式图II型及皿型受体超家族：此两类受体与I型受体的不同之处在于，组成受体的亚基均有6个穿膜区域，其中有两个穿膜区的氨基酸组成具有高度同源性；受体与配体的结合部位在细胞膜（穿膜部位），而不是在胞外。
常见的II型受体有光受体、嗅神经受体，而肌浆网膜上的Ca2＋通道则属皿型受体。
离子通道型受体因在结构上既可与细胞外信号分子结合，同时又是离子通道，因此具有受体与离子通道耦联的特点，所以当离子通道型受体与配体结合后，其离子通道可在极短的时间（数毫秒）内迅速打开，离子可通过胞膜流入或流出细胞，在胞内产生离子流和电效应，导致膜电位的变化。
离子通道型受体介导的信号转导反应是一种快速的反应，为神经系统和其他电激发细胞如肌细胞所特有，主要在神经系统的突触反应中起控制作用。
(2)G蛋白耦联受体通过间接调节G蛋白的活性进行信号转导：G蛋白耦联受体(G protein coupled receptor, GPCR)是膜受体中最大的家族，分布广泛、类型多样，几乎遍布所有细胞。
M－乙酰胆碱受体、视紫红质(rhodopsin)受体、Q2和B肾上腺素受体等均属此类。
G蛋白耦联受体介导的信号转导过程较慢，但敏感、灵活，而且类型多样。
G蛋白耦联受体成员均为一条多肤链构成的糖蛋白，由400~500个氨基酸残基组成，分为胞外、胞膜及胞内三个区。
N末端位于胞外区，带有多个糖基化位点；胞膜结构区由7个穿膜的疏水的Q－螺旋结构组成，其氨基酸组成高度保守，各穿膜螺旋结构之间有环状结构形成，共有6个（胞外、胞内各三个）；C末端位于胞内区（图12-3)。
穿膜区的仪－螺旋结构片段是受体与配体结合的部位，位千胞质内的、跨膜第五及第六区间的细胞内环则是能被G蛋白识别的区域；当受体被激活时，这一区域将与G蛋白结合，进而使G蛋白激活。
如这一部位的氨基酸组成改变或数目减少，受体将不能与G蛋白耦联。
C末端的丝氨酸、苏氨酸为磷酸化部位，在蛋白激酶的作用下，可结合磷酸基团。
coo一皿气
G蛋白耦联区
(3)酪氨酸蛋白激酶型受体是一类本身具有酪氨酸激酶活性的受体：许多膜受体具有酶活性，其中对酪氨酸蛋白激酶型受体的研究最为清楚。
酪氨酸蛋白激酶型受体(ty ro si n e-specific protein kinase receptor, TPKR)为一条多肤链构成的穿膜糖蛋白，N端位于胞外区，是配体结合部位。
胞外区由500-850个氨基酸组成，较其他受体大，不同的TPKR胞外区氨基酸种类差别较大。
C端位千胞质内，含酪氨酸激酶功能区，该区在氨基酸组成上高度保守，包括结合ATP与结合底物两个区域，穿膜区由一个高度疏水的a－螺旋构成，由22~26个氨基酸组成（图12-4)。
当配体与受体结合后，受体的胞外结构域构象改变，引起其胞内结构域构象发生变化，使受体C端酪氨酸残基被迅速磷酸化，激活受体的激酶，在空间结构上形成一个或数个SH2结合位点(SH2binding site)，通过这些位点，受体可与具有SH2结构域(Src同源序列2结构域的简称）的蛋白质结合并使之激活，激活的蛋白质进一步催化细胞内的生化反应，由此完成信号从胞外向胞内的传递。
由于酪氨酸蛋白激酶型受体的配体主要为一些生长因子和分化因子，如表皮生长因子(epidermal growth factor, EGF)、血小板源生长因子(platelet-derived growth factor, PDGF)和胰岛素(insu lin)等，因此这类受体介导的信号转导途径在参与细胞生长和分化的调控中起着重要的作用。
不过，它们引起细胞产生效应的过程较缓慢，一般需数分钟。
2.胞内受体根据其在细胞中的分布情况分为胞质受体和核受体胞内受体通常为400~1000个氨基酸组成的单体蛋白，其N末端的氨基酸序
列高度可变，长度不一，具有转录激活作用；其C端由200多个氨基酸组成，是配体结合的区域，对受
催化域立体的二聚化及转录激活也有重要作用，其DNA结合区域由66~68个氨基酸残基组成，富含半胱氨
酸残基，因有两个锌指结构，故可与DNA结合。
配体结合区与DNA结合区之间为饺链区，这一序列
名较短，其功能尚未完全明确。
胞内受体的配体多为<PI3激酶Nek“转换盟'l脂溶性小分子肖体类激素，以类固醇激素类较为常<Ras-GAP l见，此外还包括甲状腺素类激素、维生素D等，这催化域些分子可直接以简单扩散的方式或借助于某些载<g RiD?
SHP21体蛋白穿过靶细胞膜，与位千胞质或胞核内的胞内YI受体结合。
不同的胞内受体在细胞中的分布情况可不同，如糖皮质激素和盐皮质激素的受体位于胞质中，称为胞质受体；而维生素队及维甲酸受体则图12-4酪氨酸激酶活性区示意图存在于胞核，称为核受体；还有一些受体可同时存在千胞质及胞核中，如雌激素受体、雄激素受体等。
胞内受体是基因转录调节蛋白，在与配体结合后，其分子构象发生改变，进入功能活化状态，其DNA结合区与DNA分子上的激素调节元件(hormoneregulatory element, HRE)相结合，通过稳定或干扰转录因子对DNA序列的结合，选择性地促进或抑制基因转录。
由胞内受体介导的信号转导反应过程很长，细胞产生效应一般需经历数小时至数天。
（二）受体能特异性识别和结合配体受体能特异性识别和结合相应的配体，在与配体结合后，可将其相互作用的信号向其他信号分子传递，使细胞产生生物学效应。
受体与配体的结合具有下列几个特点：1.受体能选择性地与特定配体结合受体分子的立体构型是决定这一特点的关键，受体可通过与配体分子中反应基团的定位和空间结构互补，准确识别配体并与其特异地结合。
一个配体可以与几种受体结合。
2.配体具备强的亲和力受体与配体的结合力极强，极低浓度的配体与受体结合后，即可产生显著的生物学效应。
对不同的受体和配体而言，亲和力的大小差别很大。
3.受体－配体结合后显示可饱和性随着配体浓度的升高，受体被配体完全结合后，就不再结合其他配体。
这是细胞控制其对胞外信号反应程度的一种方式。
受体的数量相对恒定及受体对配体的较高亲和力是受体饱和性产生的基础。
虽然不同的受体或同一种受体在不同类型细胞中的数量差异较大，但某一特定的受体在特定细胞中的数量，却相对恒定。
4.受体－配体的结合具有可逆性受体与配体的结合与解离处于可逆的动态平衡中。
受体与配体以氢键、离子键和范德华键等非共价键结合，在细胞发生效应后，两者解离，配体被灭活，受体可再次被利用。
第十二章细胞间信息传递279
5受体与配体的结合可通过磷酸化和去磷酸化进行调节受体与配体的结合可受多种因素的影响，主要涉及受体的数目及受体与配体的亲和力，常见的调节机制为受体的磷酸化与去磷酸化，如EGF受体酪氨酸残基的磷酸化，可促进其与EGF的结合。
而类固醇类激素受体在磷酸化后，与配体的结合能力却明显减弱。
三、细胞内信使
细胞内信使是指受体被激活后在细胞内产生的、能介导信号转导的活性物质，又称为第二信使(seco nd messenger)。
已经发现的细胞内信使有许多种，其中最重要的有：cAMP、cGMP、二酷酰甘油（如cylglycerol, DAG)、三磷酸肌醇(inositol trisphosphate, IP3)和钙离子等。
(—)cAMP信使体系是最重要的胞内信使
环磷酸腺昔(cycli c AMP, cAMP)是最重要的胞内信使，它是细胞膜的腺甘酸环化酶(adenylate cyclase,AC)在G蛋白激活下，催化ATP脱去一个焦磷酸后的产物。
cAMP可被特异的环核昔酸磷酸二酷酶迅速水解为5'-AMP，失去信号功能。
AC磷酸二酷酶
cAMP的主要作用是激活cAMP依赖性蛋白激酶A(cAM P-dependent protein kinase A, PKA)，进而使下游信号蛋白丝氨酸／苏氨酸残基的磷酸化被激活或钝化（图12-5)。
cAMP的作用还涉及对离子通道通透性的调节。
AC是一种由1100个氨基酸组成的、分子扯为150kD的糖蛋白，由2个大的疏水蛋白质}x-核膜细胞效应催心单位i区域(Ml,M2)及2个胞质区域(Cl、C2)组成，每一疏水区域均跨膜6次，而胞质区域是ATP结合及具酶活性的部位，其氨基酸组成高度保守（图12-6)。
AC的主要功能是催化ATP生成cAMP，这一过程不仅需经G蛋白激活，还需Mg2•, Mn2＋的存在。
而当AC与Gs或Gi分离后，其酶的活性依然保留。
PKA是一种能被cAMP活化的蛋白激酶，是有催化亚基(C亚基）和调节亚基(R亚基）两部分组成的C2R2四聚体，分子械为160kD。
存在千胞核中的cAMP反应元件结合蛋白(cAMP response element binding protein, CREE)是能被PKA磷酸化的重要蛋白，当PKA被cAMP激活后，其游离的C亚基可从胞质进入胞核，通过使CREB丝氨酸残基磷酸化而激活它，进而参与基因的转录调节。
PKA对底物的特异性要求较低，催化的底物蛋白因细胞类型的不同而异，这导致了cAMP的生物学效应也不相同。
如cAMP浓度上升可使成纤维细胞和造血细胞的增殖停止，却使上皮细胞和内皮细胞增殖加速。
细胞外
细胞质
（二）cGMP信使体系是—种广泛存在千动物细胞中的胞内信使环磷酸鸟甘(cycli c GMP,cGMP)是一种广泛存在于动物细胞中的胞内信使，是由鸟昔酸环化酶(guanylate cyclase, GC)催化并水解GTP后形成。
cGMP可被细胞中的磷酸二酷酶(phosphodiesterase, PDE)水解，因此细胞中cGMP的含量高低受GC与PDE的双重调节。
GC磷酸二酷酶GTPM?
\、eGMP／力2＋5'-f+MP ppi H20,,.--Ca或MgGC在细胞中有两种存在形式，即膜结合型GC和胞质可溶型GC，前者主要结合千胞膜上，也可分布千核膜、内质网、高尔基复合体和线粒体等膜性结构中；而可溶型GC大部分游离在胞质中。
膜结合型的GC是一种单次穿膜蛋白，在结构上类似于酪氨酸激酶受体，胞外结构域是受体部分，膜内为鸟昔酸环化酶催化域。
当胞外受体与配体（主要为神经肤类物质）结合后，胞内的酶催化活性即被激活，催化GTP转化成cGMP。
在细胞中，cGMP形成后可通过激活cGMP依赖性蛋白激酶G(cGMP dependent protein kinase G, PKG)，使相应的蛋白质磷酸化，引起细胞效应。
PKG是一个二聚体，在结构上由具有催化活性的亚基和具有结合cGMP活性的调节亚基组成。
PKG催化的底物蛋白主要涉及组蛋白、磷酸化酶激酶、糖原合成酶及丙酮酸激酶等。
PKG还可通过其磷酸转移酶作用，使自身磷酸化，进而通过抑制方式来调节其自身活性。
在脊椎动物的视杆细胞中，cGMP可直接作用于Na十离子通道，在有光信号存在的情况下，使Na十离子通道关闭，引起胞内超极化，神经递质释放减少，产生视觉反应。
因此，cGMP在光信号的转导中起着重要作用。
cGMP在细胞中的含量较低，仅为cAMP的1/l0~l/lOO，而cGMP在浓度与作用上呈现出与cAMP相括抗的特点，如cAMP浓度升高，细胞内特异性蛋白质合成的进程加快，细胞分化受到促进；而cGMP浓度升高则可加速细胞DNA复制，进而促彷少化进细胞的分裂（图12-7)。
第十二章细胞间信息传递281
第一信使
膜结合的鸟昔酸'GTP Ca2一——胞内Ca2＋库环化酶i钙调节蛋白NO合酶（三）二酷酰甘油／三磷酸肌醇信使体系启动细胞内的生理和生化反应细胞外的某些信号分子与其相应的受体结合后，通过膜上特定的G蛋白激活磷脂酶C(phospholipase C, PLC)，催化胞膜脂质内层的4,5－二磷酸酣酰肌醇(p hosphatid ylin osital-4,5bi phosphate, PIP2)水解，产生三磷酸肌醇(IP3)和二酷酰甘油(DAG)两种胞内信使。
IP3是一种水溶性分子，在其产生后即可从胞膜扩散至胞质中，与内质网膜上的受体结合，使膜上的Ca2＋离子通道开放，Ca2+从内质网释放入胞质，启动细胞内Ca2＋信号系统，使细胞产生相应的反应；脂溶性的DAG生成后仍留于胞膜上，在有Ca2+、磷脂酰丝氨酸存在的情况下，激活蛋白激酶C(protein kinase C, PKC), PKC以磷酸化的方式对多种胞内蛋白质进行修饰，由此启动细胞的一系列生理和生化反应（图12-8)。
282第三篇细胞的社会性
（四）钙离子／钙调蛋白信使体系参与细胞收缩、运动、分泌和分裂等重要生命活动在细胞收缩、运动、分泌和分裂等重要活动中，均需要钙离子的参与及调节。
钙离子的信使作用是通过其浓度的升高或降低乘实现的。
细胞内游离钙离子的浓度是10-8~10-7moVL，比胞外钙离子浓度低104~10环音；当细胞受到特异性信号刺激后，细胞内钙库（内质网）的钙通道或质膜上的钙通道开放，致使胞内钙离子的浓度在瞬间快速升高，可达10-6moVL，由此产生的钙信号使细胞内某些酶的活性和蛋白质功能发生改变，进而产生细胞效应。
不同的细胞钙信号产生的途径存在差异，神经细胞中，胞膜钙通道开放是产生Ca2+信号的主要途径；而在肌细胞中，C汒信号则依赖于钙库钙通道及胞膜钙通道同时开放。
同其他胞内信使一样，钙离子需要与其靶蛋白或靶酶结合才能传递信息，产生细胞效应。
细胞中有多种能够与钙离子结合的、功能复杂的蛋白质，钙询蛋白(calmodulin, CaM)是其中最主要的一种。
CaM广泛分布于真核细胞中，由一条多肤链组成，分子量为16.7kD，呈哑铃形构象，每一个分子的CaM可以结合4个钙离子，当细胞中钙离子浓度超过10-6moVL时，无活性的CaM即可与钙离子结合，使其构象发生改变而被活化，由此激活靶蛋白或靶酶（图12-9)。
CaM本身还可通过激活细胞膜上的Ca2＋泵，调节细胞内的Ca2＋浓度。
Ca2＋也可直接对离子通道进行调节，如活化多种组织细胞胞膜的K十离子通道，致使K勹顺着电化学梯度扩散到细胞外，胞膜处于超极化状态。
一些非专一性的阳离子通道，在受到Ca2＋的活化后，对Na+,K+的通透性增加。
..无活性的酶；化的酶X
H钙调蛋白Ca2+－钙调蛋白复合体A B Ca2+－钙调蛋白复合体A.
Ca“钙调蛋白复合体；B.
Ca2+－钙调蛋白复合体活化酶四、信号转导过程中的分子开关生物体在细胞信号转导过程中，除受体和第二信使分子以外，还有两类在进化上保守的胞内蛋白其功能作用依赖于胞外信号的刺激，这两类蛋白在引发信号转导级联反应中起“分子开关”的作用其中一类是蛋白激酶和蛋白磷酸酶，另一类是GTP结合蛋白。
(—)蛋白激酶催化蛋白质发生磷酸化
蛋白激酶为一类磷酸转移酶，其作用是将ATP的磷酸基转移到底物特定氨基酸残基上。
在细胞的信号转导过程中，蛋白激酶将其底物磷酸化，是胞外信号引起细胞效应的一个重要的环节，如前面提到的PKA、PKC、PKG等。
根据其作用底物的氨基酸残基特异性，可将信号转导过程中的蛋白激酶分为两类，即酪氨酸蛋白激酶和丝氨酸／苏氨酸蛋白激酶。
1.酪氨酸激酶可催化底物蛋白酪氨酸残基磷酸化酪氨酸蛋白激酶(tyrosine protein kinase, TPK)是一类激活后可催化底物蛋白酪氨酸残基磷酸化的激酶，为蛋白激酶家族中最重要的成员之一，对细胞生长、增殖和分化等过程起重要的调节作用。
这类激酶包括两大类，即前述的位于细胞膜上的受体型TPK和位千胞质中的非受体型TPK。
受体型TPK是酪氨酸激酶家族中目前了解最多的一种类型，其共同的特点是胞内域有一个或几个专一的酪氨酸残基，当与配体结合后，其胞内域可发t`生自身磷酸化，活化的受体型TPK进一步作用于ras蛋白、腺昔酸环化酶和多种磷脂酶等底物。
非受体型TPK有9个亚族，JAK(Janus kinase, JAK)是其中一个主要的TPK亚族，这些成员在结构上均含有特殊的保守性结构域，例如SH2和SH3同源域等，这些结构域可在信号转导中起重要作用。
非受体型TPK常与一些非催化型的受体耦联，如干扰素、生长激素、白介素和集落刺激因子等胞外信号分子的受体及部分黏附分子的受体。
转录因子STAT(signal transducers and activation of transcription)家族是JAK激酶作用的主要下游蛋白质分子，其C端含有一个高度保守的SH2结构域，是与JAK作用的区域，激活的两个STAT蛋白质分子通过一个磷酸化的酪氨酸残基与另一个STAT分子的SH2结构域相互作用，形成稳定的STAT异源复合体，进而与DNA结合，调节基因的表达（详见后述的图1214)。
-----------------------------－－－－－-－----－经典实验：Src蛋白酪氨酸激酶活性的发现--－一--－-－－－－－－－－-－－－－－－－－－－－－－－－劳斯肉瘤病毒(Rous s扣coma virus, RSV)是笫一个被分离的能引起动物肿瘤的病毒。
研究人员在RSV的基因组中发现了一个在RSV诱导肿瘤发生过程中起关键性作用的癌基因，即s rc基因(sarcoma的缩写）。
更为重要的是，在各种脊椎动物（包括人类）的正常基因组中也发现了与病毒src基因同原的基因。
1977年，R.
Erikson和他的同事利用抗血清，通过免疫沉淀方法分离得到了Src蛋白。
随后又发现，Src的免疫沉淀物在ATP存在时可导致免疫球蛋白分子的磷酸化。
因此，推测Src可能是一种蛋白激酶，但Src作为蛋白激酶的本质并不清楚。
T. Hunter和B.
M. Sefton对Src可以磷酸化底物蛋白中的哪种氨基酸残基（是酪氨酸残基还是丝／苏氨酸残基）进行了研究。
他们的实验表明，Src具有蛋白酪氨酸激酶的功能。
实验内容
Hunter和Sefton将底物蛋白质（免疫球蛋白分子）与Src免疫沉淀物及32p标记的ATP共同孵育。
这样一来，底物蛋白质中被Src磷酸化的氨基酸残基即具有了放射性标记。
然后，他们分离底物蛋白质并将其水解为单个氨基酸，进一步通过电泳、层析的方法分离磷酸化的酪氨酸、丝氨酸及苏氨酸。
发现所梒测到的具有放射性的氨基酸是酪氨酸，这表明Src能特异性地磷酸化底物蛋白质中的酪氨酸残基。
进一步实验显示，正常细胞的Src蛋白和病毒Src蛋白均具有酪氨酸激酶的活性。
另外，Hunter和Sefton通过体外实验也证实细胞总蛋白中磷酸化酪氨酸的存在。
正常细胞中，磷酸化的酪氨酸仅占整个细胞中磷酸化氨基酸的0.03%（其余是磷酸化的丝氨酸和苏氨酸），这也正是其过去不易被检测到的原因。
而在受RSV感染的细胞中，磷酸化酪氨酸的含量却升高了十倍之多，表明蛋白酪氨酸激酶活性的增加可诱导细胞的非正常增殖。
发表论文
Hunter T, Sefton BM.
Transforming gene product of Rous Sarcoma Virus phosphorylates tyrosine.
Proc.
Natl.
Acad.
Sci. USA,1980,77:1311-1315.
后续影响
沁蛋白酪氨酸激酶的发现不仅确定了一种新的蛋白质酪氨酸激酶，而且发现酪氨酸激酶的活性与细胞增殖调控密切相关。
继Hunter和Sefton的研究之后又有一系列类似的发现：许多其他的肿瘤病毒蛋白也具有蛋白质酪氨酸激酶的功能，从而总结出蛋白质酪氨酸的磷酸化与癌细胞的非正常增殖之间的联系。
后续的研究发现，EGF受体也是一种蛋白质酪氨酸激酶，这直接证明了蛋白质酪氨酸的磷酸化在正常细胞增殖调控中的作用。
自此，受体型和非受体型蛋白质酪氨酸激酶的不断发现，促进了对细胞信号转导通路机制的认识。
到目前为止，由原癌基因编码的蛋白质酪氨酸激酶已为癌细胞特异性药物的开发提供了替在的靶标。
284第三篇细胞的社会性
2.丝氨酸／苏氨酸激酶催化底物蛋白质丝氨酸／苏氨酸残基磷酸化丝氨酸／苏氨酸激酶(serine/threonine kinase, STK)的主要作用是通过变构而激活蛋白质，催化底物蛋白质丝氨酸／苏氨酸残基磷酸化，PKA、PKC、PKG、钙调蛋白依赖性蛋白激酶(CaMK)和丝裂原活化蛋白激酶(MAPK)等均属此类。
此外，还包括许多其他种类，如Raf-1是已知的能够激活MAPKK的细胞激酶之一，在细胞对刺激产生增殖反应的ras信号转导通路中起关键作用。
蛋白激酶催化蛋白磷酸化的过程是可逆的，磷酸化的蛋白质在磷酸酶的作用下可以发生去磷酸化，蛋白激酶与磷酸酶的相对活性决定了蛋白质上磷酸基团的数量。
（二）蛋白磷酸酶催化蛋白质发生去磷酸化蛋白磷酸酶(protein phosphatase)是具有催化已经磷酸化的蛋白质分子发生去磷酸化反应的一类酶分子，即通过水解磷酸单酣将底物分子中的磷酸基团除去，生成磷酸根离子和自由的轻基。
真核生物具有多个蛋白磷酸酶家族，其可以将磷酸基团从氨基酸侧链去除，根据脱磷酸化的氨基酸残基的不同，蛋白磷酸酶分成蛋白酪氨酸磷酸酶和丝氨酸／苏氨酸磷酸酶。
蛋白磷酸酶与蛋白激酶相对应存在，共同构成磷酸化和去磷酸化这一重要的蛋白质活性开关系统。
（三）GTP结合蛋白通过自身构象的变化激活效应蛋白GTP结合蛋白(GTP binding pro t ei n)简称G蛋白，是指在信号转导过程中，与受体耦联的并能与鸟昔酸结合的一类蛋白质，位于细胞膜胞质面，为可溶性的膜外周蛋白，由a、B和丫三种蛋白亚基组成。
G蛋白的主要功能是通过其自身构象的变化激活效应蛋白(effector protein)，进而实现信号从胞外向胞内的传递。
每一个G蛋白都与一个特殊的受体和一个具有特殊结构的下游靶蛋白有特定的结合关系。
G蛋白a亚基上存在GDP或GTP结合位点，有GTP酶活性，能促进与其结合的GTP分解为GDP。
在静息状态下，a亚基与B、1亚基形成三聚体形式后与GDP结合。
此时G蛋白与受体分离，无活性，当配体与相应的受体结合后，受体分子的构象改变，与G蛋白a亚基结合的位点暴露，导致受体胞内部分与G蛋白a亚基接触并相互作用，a亚基构象改变，与GDP的亲和力减弱，与GTP的亲和力增强，进而与GTP结合，G蛋白被激活，进入功能状态并解体为与GTP结合的a亚基和B、丫二聚体两个部分，这两个分子沿着细胞膜自由扩散，直接与位千细胞膜下游的效应蛋白作用并使其激活，完成将信号从胞外传递到胞内的过程。
当配体与受体结合解除后，G蛋白a亚基分解其结合的GTP，生成GDP，其构象改变，与GDP的亲和力增加并与之结合，a亚基与效应蛋白分离，重新与B、1亚基构成三聚体，G蛋白回复到静息状态（图12-10)。
G蛋白下游效应蛋白通常是离子通道或与膜结合的酶，通常为腺昔酸环化酶(adenyla te cyclase, AC)、磷脂酶C(phospho lipase C, PLC)等，不同的效应蛋白受不同类型的G蛋白的影响。
在哺乳动物中已发现20多种不同类型的G蛋白，根据其在功能上对效应蛋白的作用不同，可分为激动型G蛋白(Gs家族）、抑制型G蛋白(Gi家族）和磷脂酶C型G蛋白(Gp)家族等类型，其生物学特性见表12-2。
G蛋白种类ex亚基耦联受体对效应蛋白的作用
Gs a8B－肾上腺素，降钙素及相关受体，胰高血糖素受体，组胺激活腺背酸环化酶H2受体，ACTH受体，LH受体，噤呤2受体激活Ca“通道抑制N旷通道Gi Ci.; Cl.2－肾上腺素，血管紧张素，生长激素抑制受体，嗦呤1受抑制腺昔酸环化酶体，DA2受体Gp a p a,－肾上腺素，促甲肾上腺素，a凝血酶受体，加压索受激活磷脂酶C体，缓激肤受体，代谢型谷氨酸受体1信号转导分子的激活机制具有类同性蛋白质的磷酸化和去磷酸化是绝大多数信号分子激活具有可逆性的共同机制，如Fos的激活需要其丝氨酸和苏氨酸的磷酸化；JAK的激活需要其酪氨酸的磷酸化，在信息传递过程完成后即可发生去磷酸化。
2.信号转导过程为级联式反应信号转导过程中的各个反应相互衔接，形成一个级联反应过程。
细胞外信号从膜受体到胞内的信号转导和基因调节过程中，经历多次的信号转换后信号得以强化，＿肾上腺素10一6mol/L放大使少数细胞外的微弱信号分子足以激起一个较显著/[\的反应。
许多胞内信号分子自身就是蛋白激酶，而它公心上AC本身又可被上游的蛋白激酶磷酸化而激活，由此引起放大上/了勹、;\、细胞内一系列蛋白质的磷酸化，产生级联效应cAMP(IO--,;mol/L)(cascade effec ts)。
例如，在cAMP为第二信使的信号i i i i i转导过程中，一个信号分子可与多个受体结合，活化0@@@＠〉蛋白激酶产生的cAMP激活其依赖性蛋白激酶，进而使下游信放大上//7}\`\\`
号蛋白磷酸化被激活，如此，胞外信号分子所产生的信号便由此被逐渐放大，在短时间内引起细胞效应。
..~000酶在肾上腺素引起的细胞效应中，血中低浓度的肾上腺放大//；勹\;~素(10-10moVL)在引起肝细胞内cAMP浓度升高后，产物cAMP激活PKA,PKA可进一步激活磷酸化酶的激酶，图12-11信号转导的级联效应最后可引起磷酸化酶的活化，由它分解糖原，产生的葡萄糖进入血液后，导致血糖的升高，而在上述过程中，信号被放大了108倍（图12-11)。
3.信号转导途径具有通用性与特异性信号转导途径的通用性是指同一条信号转导途径可在细胞的多种功能效应中发挥作用。
如cAMP途径不仅可介导胞外信号对细胞生长和分化产生效应，也可在物质代谢的调节和神经递质的释放等方面起作用，使得信号转导途径呈现出保守和经济的特点，这是生物进化的结果。
信号转导需要对细胞功能进行精细地调节，所以信号转导途径必须具有特异性，其产生的基础首先是受体的特异性，如生长因子受体的TPK活性，能在生长因子刺激细胞增殖的过程中起独特的作用。
此外，与信号转导相关的蛋白质，如G蛋白家族及各种类型的PKC、TPK，它们在结构及分布等方面的多样性，以及它们作用发生的时间，对千信号转导途径的特异性形成均具有一定的影响。
4.胞内信号转导途径相互交叉由于参与信号转导的分子大多数具有复杂的异构体和同工酶，它们对上游的激活条件要求不同，而对其下游底物分子的识别也有差别，使得各条信号转导途径之间相互交叉继而相互影响，形成复杂的信号网络，共同协调机体的生命活动，具体包括以下两种情况：(1)一条信号转导途径的成员可激活或抑制另一条信号转导途径：如促甲肾上腺素与其受体结合后，不仅可以通过钙离子－二酷酰甘油／三磷酸肌醇信使体系激活PKC，而且还可以因Ca2＋浓度的升高，激活腺昔酸环化酶，促进cAMP的生成，进而使PK.A激活。
(2)不同的信号转导途径可通过同一种效应蛋白或同一基因调控区，彼此协调地发挥作用，从而使细胞对信号进行更精确的相互制约和调控：如G蛋白耦联受体可以激活PLC-IP3/DAG信号通路，一些酶耦联受体也可以激活这条通路，只是他们所激活的PLC是不同的亚型；而cAMP蛋白激酶途径与钙离子－二醋酰甘油／三磷酸肌醇信使体系均能使胞内的转录因子CREB磷酸化，通过活化的CREB与DNA序列的结合，影响多种基因的转录。
第三节细胞的主要信号转导通路—、G蛋白耦联受体介导的信号转导通路G蛋白耦联受体(GPCR)是细胞膜受体中的最大家族，所有真核细胞均使用G蛋白耦联受体，其不仅介导大多数来自环境信号的刺激，也可介导细胞之间的信号传递，包括激素、神经递质和局部化学介质。
人类的视觉、嗅觉和味觉（酸味除外）均依赖千G蛋白耦联受体介导的信号转导通路。
人体中存在700多种G蛋白耦联受体。
作用千G蛋白耦联受体的信号分子在结构和功能上多种多样，而且相同的信号分子能激活许多不同种类的G蛋白耦联受体，这些受体通常表达千不同类型的细胞中，与细胞的功能相关。
信号分子（配体）与G蛋白耦联受体结合后，激活G蛋白，启动不同的信号转导通路，产生各种生物学效应。
G蛋白的下游效应蛋白比较复杂，主要是离子通道或与膜结合的酶包括腺昔酸环化酶、磷脂酶C、磷脂酶A2及磷酸二酣酶。
一般认为以离子通道为效应蛋白的配体－受体作用(G蛋白效应）快速而短暂，而以酶分子为效应蛋白的配体－受体作用(G蛋白效应）缓慢而持久。
(-)G蛋白耦联受体介导腺苦酸环化酶信号通路在腺昔酸环化酶信号通路中，信号分子与G蛋白受体结合后，Ga亚基的首要效应是腺昔酸环化酶(adenylate cyclase, AC)，通过腺昔酸环化酶活性的变化，调节靶细胞内第二信使cAMP的水平，进而影响信号通路的下游事件。
AC可以催化ATP分解形成cAMP,cAMP的主要作用是激活cAMP依赖性蛋白激酶A(PKA)，进而使下游靶蛋白磷酸化，从而调节细胞的新陈代谢。
信号分子通常是激素，如胰高血糖素、肾上腺素及去甲肾上腺素等。
以肾上腺素为例介绍G蛋白耦联受体介导的腺昔酸环化酶信号通路。
肾上腺素的主要功能是调节糖代谢，促进肝糖原和肌糖原的分解，增加血糖和血中乳酸含量。
肾上腺素由肾上腺分泌后通过血液到达肝细胞，与肝细胞膜表面的肾上腺素受体结合，肾上腺素受体分为a及p两个类型。
肾上腺素对a及B两型受体均起作用。
受体与肾上腺素结合后，促进耦联三联体G蛋白构象改变，形成具有活性的GTP-Gsa，而GTP-Gsa激活腺昔酸环化酶，催化ATP环化形成cAMP（在细胞内浓度可达到10-6moVL)，激活cAMP依赖性蛋白激酶A启动下游信号通路。
在肾上腺素介导的信号转导通路中，虽然肾上腺素的浓度极低(10-10贫心l乙10-8moVL)，却能产生SmmoVL的葡萄糖，激素的信号被逐级放大约300万倍，即肾上腺素与受体结合后可以在极短的时间内使磷酸化酶的活性达到最大值。
依赖cAMP的蛋白激酶A在不同的组织中作用的底物不同，cAMP通过活化或抑制不同的酶系统，使细胞对外界不同的信号产生不同的反应。
例如，在肝脏和肌肉组织中，肾上腺素通过对这两种细胞中合成和降解糖原的酶的询控来调控糖代谢过程；而在脂肪细胞中，肾上腺素通过激活PK.A促进磷脂酶的磷酸化，磷酸化的磷脂酶可水解甘油三酷，产生甘油和游离的脂肪酸分子，脂肪酸释放到血液中，被其他组织摄取，为其提供能量。
（二）G蛋白耦联受体介导磷脂酰肌醇信号转导通路磷脂酰肌醇信号通路中细胞外的信号分子与细胞表面G蛋白耦联型受体结合，通过膜上特定的G蛋白激活磷脂酶C(phospholipase C, PLC)，使细胞膜上的4,5－二磷脂酰肌醇(PIP2)水解成1,4,5－三磷酸肌醇(IP3)和二酰基甘油(DAG)两个重要的细胞内第二信使，细胞外信号转换为细胞内信号，IP3扩散入细胞质中，DAG仍继续留在细胞膜中，这一信号系统又称为“双信使系统”(double messenger system)。
1. IP3动员细胞内质网中Ca2•的释放，使胞内Ca2＋浓度升高I凡是一种水溶性分子，产生后即可从细胞膜扩散至细胞质，与内质网膜上的受体结合，致使内质网膜上的Ca2•通道开放，Ca2＋从内质网释放入细胞质，启动细胞内Ca“信号系统，引发多种细胞反应。
细胞内大部分Ca"储存在线粒体和内质网腔及其他细胞小毅中，细胞质中Ca2＋浓度通常在极低水平(-10-7moVL)，细胞质中Ca2+浓度的轻微升高即能诱导多种细胞反应，因此细胞内Ca2＋的水平是经过精确调控的。
当细胞外液中缺乏Ca”时，肝脏及脂肪等组织细胞表面的受体与相关激素结合后通过IP3诱导细胞质中Ca2＋水平升高。
细胞质中低浓度的Ca2＋能够提高通道受体与IP3之间的结合力，从而增强IP3门控的C汒通道的开放，导致储备的Ca2十进一步释放；然而，细胞质中如果存在高浓度的Ca2+，通道受体与IP3之间的结合力却降低，进而抑制职诱导的细胞内储备Ca2＋的释放。
在有些细胞中，细胞外信号分子与受体结合后，激活受体，经IP3途径使得细胞质中游离的Ca2＋水平升高，直接活化一些转录因子。
其中的机制为Ca2+与CaM形成复合物既能通过激活蛋白酶使得一些转录因子磷酸化，也能激活一些磷酸酶使另外一些转录因子的磷酸基团解离，从而改变这些转录因子的活性，进而调控基因的转录。
（三）G蛋白耦联受体调控离子通道
许多神经递质受体如谷氨酸和5－轻色胺受体是配体门控离子通道，但也有一些神经递质受体是G蛋白耦联受体。
其中一些受体的效应蛋白是N旷或k十通道，当神经递质与这些受体结合后引起相关离子通道的开启或关闭，导致细胞膜电位的改变。
鼻腔中的嗅神经受体、眼睛中的光感受器也属于G蛋白耦联受体，它们是通过激活细胞内第二信使间接调节离子通道的活性。
细胞内的信号转导通路对细胞有两种效应：心短期效应：几秒到几分钟，对千已经存在的酶或蛋白质的活性进行调节，从而引起细胞代谢或功能的改变，大多数G蛋白耦联受体介导的信号通路属于这一类心长期效应：数小时到数分钟，有一些G蛋白耦联受体主要通过激活或抑制基因转录引起细胞增殖或向不同类型的细胞进行分化，这类受体介导的信号通路具有长期效应。
288第三篇细胞的社会性
细胞外配体与G蛋白耦联受体结合后，激活G蛋白及其下游的效应蛋白如腺背酸环化酶和磷脂酶C等，进而调节酶（或蛋白）的活性或基因的转录，实现信号的转导过程（图12-12)。
G蛋白》磷脂酶C
钙调
二、具有酶活性受体介导的信号转导通路
像G蛋白耦联受体(GPCR)一样，具有酶活性的受体也是跨膜蛋白，具有与配体结合的胞外结构域，但与GPCR不同的是，酶活性受体通常是单次跨膜，其胞内部分具有酶的催化活性。
这类受体主要包括酪氨酸蛋白激酶受体、丝氨酸／苏氨酸蛋白激酶受体、鸟昔酸环化酶受体和酪氨酸磷酸酶受体等。
(-)Ras蛋白是酪氨酸蛋臼激酶受体介导的信号通路中的关键组分大多数酪氨酸蛋白激酶受体(TPKR)以单体形式存在千细胞膜上，当配体与TPKR结合后，能导致受体二聚体化，从而激活TPKR的酪氨酸激酶活性，使受体胞内段的酪氨酸残基发生磷酸化。
磷酸化的酪氨酸残基可以与含有SH2结构域的蛋白质分子结合，启动下游信号转导。
其中一种蛋白是生长因子受体结合蛋白2(growt h factor receptor-bound protein2, GRB2)，其能耦联活化的受体和其他信号蛋白，参与诸如Ras-MAPK信号通路中；另一种蛋白是GPCR信号通路中的PLC，其下游的信号均与GPCR-PLC通路完全一致。
在真核细胞中，Ras蛋白是TPKR介导的信号通路中的一种关键组分。
Ras蛋白是一种GTP结合蛋白，具有GTPase活性，Ras-GTP是其活化形式而Ras-GDP是其失活形式。
（二）P13K-Akt信号通路是酪氨酸蛋白激酶受体介导的经典信号通路在TPKR介导的信号通路中，与TPKR受体结合的另一个重要分子是磷脂酰肌醇－3－激酶(PI3K)。
PI3K是一种细胞膜结合酶，其不仅具有丝氨酸／苏氨酸激酶活性，还具有磷脂酰肌醇激酶活性，能使细胞膜上的磷脂酰肌醇发生磷酸化，磷酸化的磷脂酰肌醇是许多蛋白激酶的描定位点，可活化下游的蛋白激酶，启动下游的信号通路。
其中一条最典型的下游信号通路是PI3K-Akt信号通路。
活化的Akt能磷酸化多种靶蛋白，从而对细胞产生广泛的影响，如细胞存活、细胞代谢和细胞骨架的调控等。
在PI3K-Akt信号通路中，当PI3K被TPKR激活后能够磷酸化PI-4,5-P2生成PI-3,4,5-P3,PI-3,4,。
第十二章细胞间信息传递289
5-P3能够招募具有PH结构域的PDKl（磷脂酰肌醇依赖性激酶l)和Akt转位到细胞膜上。
随后PDKl磷酸化Akt活性位点上的苏氨酸，胞质内的mTOR磷酸化Akt上的丝氨酸位点，使Akt完全活化，活化的Akt从细胞膜中解离进入细胞质和细胞核，进一步调控下游靶蛋白，产生生物学效应。
综上所述，TPKR信号通路的下游信号通路根据招募的蛋白的不同至少包括3条重要的衍生信号通路：TPKR-PLC、TPKR-Ras-MAPK和TPKR-PBK-Akt信号通路，这些通路之间都存在相互交叉的联系，形成复杂的信号网络。
（三）TGF-~受体信号通路通过Smad将细胞外信号转导到细胞核内转化生长因子－[3(transforming growthfactor-[3, TGF-[3)家族是一类在结构上相似的分泌型多肤生长因子，有近30种成员，包括TGF-[3、BMP(bo ne morphogenetic protein)、ac tivin等多个亚家族。
TGF-[3家族分子在合成后被分泌到细胞外，其活性形式大多为二聚体。
TGF-[3受体的胞内段均含有丝氨酸／苏氨酸酶结构域，根据分子量大小可分为RI、RII和Rlll受体3类。
其中Rlll受体负责结合和富集成熟的TGF-[3,RI和RII受体为二聚体化的跨膜蛋白，直接参与信号转导。
每种TGF书信号分子与相应的RII结合后，RII进一步招募RI受体并与之结合，形成四聚体，从而将激酶结构域靠近，R II受体磷酸化RI受体胞内段的丝氨酸／苏氨酸残基，激活RI受体。
活化的RI受体直接结合并磷酸化下游的基因调节蛋白Smad家族（图12-13)。
TGF-J3配体分子
骂骂
靶基因转录
Smad分子作为细胞内信号分子，将细胞外的TGF书信号转导到细胞核内。
根据功能不同，细胞内的Smad分子分为三类，即受体激活型Smad(R-Smad，包括Smadl/2/3/5/8汃通用型Smad(Smad4)和抑制型Smad(Smad6/7)。
TGF-(3与细胞表面的受体结合，使受体活化，活化的受体进一步磷酸化细胞内的R-Smad分子。
磷酸化的R-Smad分子在细胞质内与Smad4组成复合体，转运到细胞核，发挥转录因子的作用，调控下游靶基因的表达。
Smad分子由MHl和MH2两个结构域以及连接它们的饺链区组成，MHl结构域具有DNA结合能力，MH2结构域可与多种其他转录因子相互作用。
由于细胞的290第三篇细胞的社会性生理状态和分化情况不同，在不同的细胞中相同的TGF-13信号可以引起截然相反的调节作用。
TGFB还可以激活包括MAPK信号通路在内的其他信号通路，共同调节细胞的生命活动。
TGF书信号通路在控制细胞生长、增殖、分化以及个体与器官发育过程中起着重要作用。
三、酶连接受体介导的信号转导通路
与具有酶活性的受体一样，酶连接受体也是跨膜蛋白，但通常是单次跨膜，它们本身不具有酶的催化活性，而是直接与酶相关联。
细胞因子受体即属千此类受体。
细胞因子受体介导的信号转导通路在机体的许多生理反应中发挥着重要的调控作用。
细胞因子是由细胞分泌并作用于其他细胞的一类小分子蛋白，能调控细胞的增殖及分化等行为，包括白介素(interleukin, IL)、干扰素(interferon, IFN)和促红细胞生成素(erythropoietin, Epo)等。
细胞因子受体的胞内段与细胞质酪氨酸激酶(Janus kinase, JAK)稳定结合，JAK家族包括4个家族成员JAKl、JAK2、JAK3和Tyk2。
JAK能磷酸化并活化STAT(signal transducers and activation of transcri pti on)基因调控蛋白。
STAT家族包含7个成员，存在千细胞质中，并且仅在被激活时才会迁移入细胞核，进一步调控下游基因表达（图12-14)。
细胞因子
质膜
靶基因转录
四、蛋白质水解相关的信号转导通路
除了前面提到的信号转导通路外，生物个体内还存在一系列可控性的蛋白水解相关信号通路，一类为泛素化降解介导的信号通路如Wnt、Hedgehog和NF-KB等信号通路，另一类是蛋白切割(cleavage)介导的信号通路如Notc h等信号通路。
(—)泛素化降解介导Wnt、Hedgehog和NF-KB等信号湮路
1. Wnt信号通路中(3-catenin扮演转录激活因子和膜骨架连接蛋白的双重角色Wnt信号通路在个体的发育过程中发挥重要作用，但Wnt信号通路的过度活化或失活均会导致疾病或肿瘤的发生。
Wnt信号通路有两种细胞表面受体蛋白：(DFrizzled(Fz)：含有7次跨膜a螺旋，能直接与Wnt结合；＠共受体LRP：以Wnt信号依赖的方式与Fz受体结合。
当没有Wnt信号时，细胞膜上的f3-catenin发挥连接蛋白的作用，细胞质中的f3-catenin结合由支架蛋白Axin介导的包含APC等蛋白的降解复合物。
静息状态下，复合物中的两个激酶CKl和GSK3能磷酸化f3-caten in。
随后f3-calenin中被磷酸化的一些基团招募泛素化连接酶TrCP，泛素化的Bcatenin最终被26S蛋白酶体降解。
细胞质内仅有低水平的f3-caten in，无法进入细胞核激活下游基因。
当细胞外存在高水平的Wnt信号时，Wnt与细胞膜表面受体Fz和LRP结合，磷酸化LRP受体的胞质结构域。
复合物中的支架蛋白沁m结合到LRP磷酸化的胞质结构域，同时释放出CK l和GSK3,导致f3-ca tenin无法被GSK3和CKl磷酸化。
因此，f3-catenin不会被泛素化降解，在胞质中维持稳定。
在这个过程中，还需要Di shevelled(Dsh)蛋白结合到Frizzled受体的胞内结构域以帮助游离的Bcate nin维持稳定。
游离的f3-catenin进入细胞核，结合转录因子TCF并作为共激活子诱导下游靶基因的表达（图12-15)。
质膜
辛心
2. Hedgehog信号通路通过Ci/Gli转录因子将信号转入细胞核Hedgehog信号通路在胚胎发育过程中的异常可导致严重的发育异常或畸形，而且Hedgehog信号通路的异常激活与多种肿瘤的发生相关。
Hedgehog(Hh)为分泌型蛋白，作用范围一般为l~20个细胞，扩散距离越远，浓度越低。
不同浓度的Hh信号对靶细胞的效应不同，其产生受时间和空间的严格调控。
Hh信号分子有两种膜受体：Smoothened(Smo)和Pa tched(Ptc)。
Smo是7次跨膜蛋白，Ptc是12次跨膜蛋白。
在Hh信号不存在时，Ptc主要富集千细胞膜上，将Smo限制在细胞内膜泡中。
Hh信号通路胞内蛋白复合物包含Fused(Fu)、Costal-2(Cos2)和Cubitis internptus(Ci)蛋白，该复合物在细胞内主要结合在微管上。
复合物中的转录因子C!（脊椎动物中对应的同源基因为Gli)能被3种蛋白激酶磷酸化，磷酸化的Ci在泛素化连接酶和蛋白酶体作用下水解为Ci75片段，C订5进入细胞核抑制下游靶基因的表达。
当Hh信号与细胞膜上的Ptc受体结合后，Ptc的活性被抑制并诱发内吞被溶酶体消化，从而解除了Ptc对Smo的限制作用，使Smo通过膜泡融合移位至质膜上并被CKl和PKA两种激酶磷酸化。
Fu和Cos2的磷酸化水平上升导致Fu/Cos2/Ci复合物从微管上解离下来。
Cos2携带Fu结合到Smo的C端，Ci形成稳定形式并进入细胞核内与转录激活子CREB结合蛋白(CBP)结合，促进靶基因的表达。
3. IK Bex泛素化降解激活NF-KB信号通路核因子心(nucle狙·factor-kappa B, NF-KB)是哺乳动物免疫系统的主要转录调控因子，能促进中性粒细胞迁移到炎症组织，也能在细菌刺激下诱导iNOS（一氧化氮合酶）的表达，以及产生一些抗凋亡蛋白抵抗细胞死亡。
NF-KB信号通路的受体主要包括TNF ex受体、Toll样受体和IL-1受体。
组成NF-KB异二聚体的p50和p65两个亚基通过其N端的同源区形成二聚体并与DNA结合。
在细胞没有应急或感染的静息状态下，NF-KB和其抑制子I KB(inh加tors of of NF-KB)ex结合处于失活状态。
单分子IKB ex结合到p50和p65异二聚体的N端同源区，核定位序列被隐藏。
细胞在感染源或炎症细胞因子的短时间刺激下，胞内异三聚体复合物IKB激酶中的IKK B亚基激活并被磷酸化。
活化的IKK l3亚基进一步磷酸化lKBcx N端的丝氨酸残基，E3泛素化连接酶结合到这些磷酸丝氨酸位点对IKBQ'.进行多泛素化修饰并诱导其被蛋白酶体降解。
IKBa降解后，NF-KB的抑制被解除，其上的核定位序列暴露，引导NF-KB进入细胞核激活靶基因的转录（图12-16)。
炎症刺激信号
质膜
i』卢气尸
靶基因转录
（二）通过蛋白切割(cleavage)激活Notch信号通路
在Notch信号通路中，受体是Notch，与其对应的配体是Delta，两者皆是位千细胞膜表面的单次跨膜蛋白。
一个细胞上的D e lta与邻近细胞上的Notc h受体结合，Notch被激活，其胞外部分首先被MMP家族蛋白ADAMlO切割，释放Notch受体的胞外段。
随后'Y-secretase四蛋白复合体中的nicastrin亚基结合到Notch被切割后的残余部分，复合体中的蛋白酶Presenilin1催化膜内切割并释放Notch胞质片段。
Notc h胞质片段进入细胞核与转录因子相互作用影响基因表达（图12-17)。
信号产生细胞
詈酐酐酐酐酐贸酐詈利你詈酐忻沛酐酐酐酐翟酐酐必胧斟比拟心拟媒心五、细胞内受体介导的信号转导通路细胞内受体的配体大多为脂溶性小分子，它们可以透过细胞膜，进入细胞与细胞内受体结合而传递信号。
(—)笛体类激素通过细胞内核受体介导基因表达调控如前面所述，核受体的配体主要是类固醇激素、甲状腺激素、视黄酸及维生素队等脂溶性小分子肖体类激素。
这些小分子进入细胞内，与其特异性的核受体结合改变其构象从而激活受体。
被激活的受体与DNA上的受体结合元件结合，影响基因转录，从而调节生物体内平衡。
肖体类激素诱导的基因活化分为两个阶段：心直接活化少数特殊基因转录的初级反应阶段，发生迅速；＠初级反应的基因产物再活化其他基因产生延迟的次级反应，对初级反应起放大作用。
（二）NO以自由基的形式(NO·）介导细胞独特的信号通路1998年，美国科学家Robert F.
Furchgott、Louis J.
Ignan·o和Ferid Murad因发现NO(ni tric oxide, NO)在心血管系统中起信号分子作用而获得诺贝尔生理学或医学奖。
NO以自由基的形式(NO·）介导细胞独特的信号通路。
NO可以快速地通过细胞膜，实现细胞与细胞间的弥散，使血管平滑肌舒张或作为神经递质传递信号。
NO的半衰期很短，在细胞外极不稳定，只能在组织中局部扩散，它的生成需要一氧化氮合成酶的催化。
一氧化氮合酶(nitric oxide synthase, NOS)催化L－精氨酸和氧分子，分解合成瓜氨酸和NO。
NO的主要受体是可溶性的鸟昔酸环化酶，NO与鸟昔酸环化酶血红素基团中铁可逆性结合，引发其构象改变从而激活鸟节酸环化酶，生成cGMP，而cGMP通过cGMP依赖的蛋白激酶G的活化从而使血管舒张。
在运动过程中，刺激骨骼肌收缩的Ca2＋反复释放，Ca2＋与CaM结合，并激活NOS生成NO,NO弥散出骨骼肌，进入围绕血管壁的平滑肌细胞，再通过激活GC生成cGMP使血管舒张。
硝酸甘油可以治疗心绞痛的原因就在千它可以在体内转化为NO，从而使血管舒张，减轻心脏负荷和心肌的缺氧量。
第四节细胞信号转导通路的整合与调控
细胞内信号转导过程是由前后相连的生物化学反应组成的，前一个反应的产物可作为下一个反应的底物或者发动者，通过一系列蛋白质与蛋白质的相互作用，信息可从胞内一个信号分子传递到另一个信号分子，每一个信号分子都能够激起下一个信号分子的产生，直至产生代谢酶被激活、基因表达被启动和细胞骨架产生变化等细胞生理效应。
细胞的信号转导是多通路、多环节、多层次和高度复杂的可控过程。
生理情况下，细胞对所接受信号做出适当的应答取决于细胞对所接收的多种信号的整合及对信号有效性的调控。
—、不同信号通路的整合
细胞内各种不同的信号通路提供了信号途径本身的线性特征，然而这些不同的信号通路之间决不可能是彼此孤立的，细胞需要对多种信号途径进行整合和精确调控，形成复杂的信号网络系统，最后做出正确的应答。
人们将各个信号通路之间的交互关系称为“交叉对话”(cross-talk)。
不同上游信号共用下游同一底物的行为称为“收敛"(convergence)，而同一上游信号作用于不同的下游底物则被称为“发散”(divergence)。
交叉对话、收敛和发散等现象的存在保证了细胞具有一定的自我修复和补偿能力。
细胞信号系统的网络化相互作用是细胞生命活动的重大特征，也是细胞生命活动的基本保障之一。
以蛋白激酶为例，通过蛋白激酶的网络整合信息调控复杂的细胞行为是不同信号通路之间实现“交叉对话”的一种重要方式。
事实上，细胞信号网络的复杂性远比我们了解的多得多。
随着对信号转导通路”交叉对话”的研究和信号转导机制的深入认识，将会对多基因的表达调控、个体发育及疾病的产生和控制产生十分重要的影响。
二、信号通路的调控
细胞对外界信号做出适度反应既涉及信号的有效刺激和启动，也依赖于信号通路本身的询节。
还有另一个重要的机制，即信号的及时解除和细胞反应的终止。
事实上，信号的解除和终止与信号的刺激和启动对于确保细胞对信号的适度反应来说同等重要。
在信号浓度过高或细胞长时间暴露千某一种信号的刺激下，细胞会以不同的机制使受体脱敏，这种现象又称之为适应(adaptati on)。
这是细胞解除和终止信号的重要方式。
细胞以其对信号敏感性的校正能力来适应刺激强度或刺激时间的变化，细胞对于信号分子的脱敏机制有如下5种方式。
1细胞通过受体没收(receptor sequestration)减少细胞表面可利用的受体数量细胞通过配体依赖性的受体介导的内吞作用(receptor-mediated endocytosis)减少细胞表面可利用的受体数量，以网格蛋白／衔接蛋白包被膜泡的形式摄入细胞，内吞泡脱包被形成无包被的早期胞内体。
之后随着pH发生改变，受体－配体复合物在晚期胞内体解离，受体返回质膜再利用而配体进入溶酶体降解。
这是细胞对多种肤类或其他激素的受体发生脱敏反应的一种基本途径。
有时即使受体未与配体结合，细胞也会通过批量膜流(bulk membrane flow)将细胞表面受体以较低的速率内化(internalization)，然后循环再利用，从而减少细胞表面的受体数蜇。
2细胞表面受体下调(receptor down-regulation)导致细胞对信号敏感性下降通过受体介导的内吞作用，受体－配体复合物转移至胞内溶酶体消化降解而不再重新利用，细胞通过表面自由受彸？
a;』体数量减少和配体的清除导致细胞对信号敏感性下降。
第十二章细胞间信息传递295
3受体失活(receptor inactivation)是细胞使受体快速脱敏的方式G蛋白耦联受体激酶使与配体结合的受体磷酸化，通过与胞质抑制蛋白(3-arrestin的结合，阻断与G蛋白的耦联作用，这是一种快速使受体脱敏的机制。
4.信号蛋白失活(inactivation of signaling protein)无法诱导正常的细胞反应细胞对信号分子脱敏是通过细胞内信号蛋白本身发生改变，从而使信号级联反应受阻，不能诱导正常的细胞反应。
5细胞通过产生抑制性蛋白(inh心tory protein)降低或阻断信号转导途径配体与受体结合，激活受体后，在信号转导途径的下游（如对基因表达的调控）产生抑制性蛋白形成负反馈环，降低或阻断信号的转导。
第五节细胞间信息传递障碍与疾病
信息传递在细胞的正常功能与代谢中起着极其重要的作用，从受体接受信号至细胞对信号做出反应过程中的任何环节发生异常均可导致疾病的发生。
阐明细胞信号转导机制对于认识生命活动的本质具有重要的理论意义，同时也为医学的发展带来新的机遇和挑战。
细胞信号转导机制的研究在医学发展中的意义主要体现在两个方面：首先是对疾病发病机制的深入认识；其次可为疾病的诊断和治疗提供新的靶位。
—、受体异常与疾病
这是一类因受体的数量或结构和功能异常引起的疾病，根据病因不同，可分为三类：1.因受体基因突变，致使受体缺乏或结构异常引起遗传性或原发性受体疾病如非胰岛素依赖性糖尿病即是一种常见的遗传性受体疾病。
遗传因素导致胰岛素受体数量减少或功能异常，使细胞对胰岛素的敏感性降低，耐受力增强，由胰岛素激发的细胞内信号转导过程不能正常进行，细胞糖代谢出现障碍，最终导致糖尿病。
2机体自身产生受体的抗体可导致自身免疫性受体疾病在某些情况下，机体自身可产生受体的抗体，这些抗体与受体结合后，可封闭受体的作用，使受体功能发生改变，由此引起自身免疫性受体疾病。
如重症肌无力患者体内存在抗乙酰胆碱受体的抗体，当其与乙酰胆碱受体结合后，降低了受体与乙酰胆碱的结合能力，同时促使受体发生分解，细胞表面受体的数最明显减少，与该受体相关的信号转导过程不能正常进行，继而出现相关疾病。
3.机体自身代谢紊乱引发继发性受体疾病这是一类因机体自身代谢紊乱，引起受体异常后产生的疾病。
如肥胖可降低胰岛素受体的功能，引发糖尿病；心功能不全可使心肌细胞的受体数量减少。
二、G蛋白与疾病
G蛋白的a亚基上含有细菌毒素糖基化修饰位点，细菌毒素能使这些位点糖基化，引起a亚基的GTP酶活性失活或与受体结合的能力降低，导致某些疾病的发生。
由霍乱弧菌所致的腹泻即与G蛋白的异常密切相关。
霍乱弧菌在肠道产生的霍乱毒素由A、B两个亚基组成，A亚基具有ADP核酸转移酶的活性，当霍乱毒素与肠上皮细胞表面受体结合后，A亚基穿过胞膜、插入胞内，催化NAD+中的ADP转移至Gs的a亚基上，使其在与GTP结合后，丧失GTP酶活性，不能水解GTP为GDP，使G蛋白的a亚基与陌复合物保持激活状态，致使靶蛋白AC持续活化，细胞中cAMP合成显著增加，促使c1-与HC03-不断进入肠腔，细胞内外渗透压失去平衡，水大量溢入肠腔，导致急性腹泻和脱水，如不采取紧急措施补充水和电解质，就会导致死亡。
尸｝i}在B淋巴细胞和T淋巴细胞中有许多种类的酪氨酸激酶，它们在传递淋巴细胞特异性信号、调节机体免疫反应中起着重要的作用。
这些激酶组成及数量上的变化可使淋巴细胞功能出现异常，导致免疫不全症的发生。
临床上常见的X染色体关联免疫不全症的病因即与B淋巴细胞酪氨酸激酶的异常相关。
这种患者的B淋巴细胞中含有一种称为Brnton的酪氨酸激酶(Bruton tyrosine kinase, BTK)，因其基因的转录受阻或氨基酸被置换，发生先天性数量减少或组成异常，从而使幼稚的B淋巴细胞不能分化成为产生免疫球蛋白的浆细胞而致病。
类似的情况也存在于T淋巴细胞中，一种非受体型酪氨酸激酶的变异可导致另一种免疫不全症的发生。
另外，蛋白激酶的异常还与肿瘤的发生相关。
某些肿瘤促进剂，如佛波酣作用千细胞时，因其分子结构与DAG相似但难于降解，故易在细胞内蓄积且取代DAG与PKC结合，引起PKC长期和不可逆地激活，从而刺激细胞持续增殖，最终产生肿瘤。
四、信号转导与药物研发
研究细胞信号转导在疾病发生过程中的重要作用可为药物的筛选和开发提供新的靶位，由此产生了信号转导药物这一概念。
信号转导分子的激动剂和抑制剂是信号转导药物研究的基础，尤其是各种蛋白激酶的抑制剂已被广泛用作母体药物进行抗肿瘤新药的研究中。
一种信号转导药物是否可用千疾病的临床治疗且具有较少的副作用主要取决于两方面：首先为它所作用的信号转导通路在体内是否广泛存在，如果该通路广泛存在于各种细胞内，则其副作用很难控制；其次是药物自身的选择性，对信号转导分子的选择性越高，副作用越小。
目前，已有一些信号转导药物用于临床，尤其是肿瘤治疗领域。
例如表皮生长因子受体(EGFR)酪氨酸激酶选择性抑制剂吉非替尼、埃克替尼及奥斯替尼等已用千肺癌患者的个体化治疗。
[I]刘佳．Medical Cell Biology北京：人民卫生出版社，2017[2]周天华细胞信号转导II左彶，刘艳平细胞生物学3版北京：人民卫生出版社，2015无论是单细胞生物，还是多细胞生物个体，其细胞每时每刻都在与周围的环境（包括其他细胞）发生着各种各样的联系，进行着丰富多彩的交流和协调，以保持生物体与周围世界及生物体本身的平衡与统一。
细胞对胞内和胞外各种信号的传递和整合在生命过程中具有重要的作用。
细胞之间联系的信号有许多种。
由细胞分泌的、能够调节机体功能的化学信号分子，通过与细胞膜上或胞内的受体特异性结合，将信号转换后传给相应的胞内系统，使细胞对外界信号做出适当反应的过程称为信号转导。
细胞内存在多种信号转导方式及途径，而且彼此间可交叉调控，构成复杂的信号网络。
细胞间信息传递的方式主要有细胞间隙连接、细胞膜表面分子接触通讯和化学通讯（旁分必、内分必、自分泌、突触信息传递）三大类。
外泌体的发现使得细胞间的信息传递更加精细和全面，它的发现揭示了存在于机体自身的RNA细胞间的转移方式。
细胞间信息传递的途径即信号转导。
细胞所接受的信号很多，包括物理信号、化学信号和生物学信号，其中最重要的是由细胞分泌的、能够调节机体功能的一大类生物活性物质，它们是细胞间通讯的信号，被称为第一信使。
它们携带着@b特定的信息，与细胞膜上或胞质内相应的受体结合，受体可将接收到的信息转导给细胞质或细胞核中的功能反应体系，启动细胞产生效应。
与受体结合后能使细胞产生效应的物质为激动剂；与受体结合后不产生细胞效应，但可阻碍激动剂对细胞作用的分子为桔抗剂。
存在于细胞膜或胞内、能特异性识别并结合胞外信号分子、进而激活胞内一系列生物化学反应、使细胞对外界刺激产生相应效应的一类特殊蛋白质，称为受体。
与受体结合的生物活性物质统称为配体。
受体在信号转导系统中的作用非常关键，它通过识别和结合配体，触发整个信号转导过程。
受体分为膜受体和胞内受体。
膜受体由三部分构成：细胞外域（与配体相互作用）、穿膜域（将受体固定在细胞膜上）和胞内域（传递信号），其配体是一些亲水的、不能直接穿过细胞膜脂质双分子层的肤类激素、生长因子和递质等。
膜受体可分为离子通道型受体、G蛋白耦联受体和酶联受体三种类型。
胞内受体为DNA结合蛋白，其配体为脂溶性小分子笝体类激素，这些分子可直接以简单扩散的方式或借助于某些载体蛋白穿过靶细胞膜，与位于胞质或胞核内的胞内受体结合，作为转录因子与DNA顺式作用元件结合，调节基因的表达。
受体能特异性识别和结合相应的配体，使其相互作用的信号向其他信号分子传导，产生细胞生物学效应。
受体与配体的结合具有高度的选择性、极强的亲和力、饱和性、可逆性、磷酸化和去磷酸化调节等几个特点。
受体被激活后在细胞内产生的、能介导信号转导的活性物质，称为细胞内信使，又称笫二信使。
已知的细胞内信使有许多种，其中最重要的有：cAMP、cGMP、二醋酰甘油、三磷酸肌醇和钙离子等。
生物体在细胞信号转导过程中，除受体和笫二信使分子以外，还有两类在进化上保守的胞内蛋白，这两类蛋白在引发信号转导级联反应中起“分子开关”的作用。
其中一类是蛋白激酶和蛋白磷酸酶，另一类是GTP结合蛋白。
蛋白酪氨酸激酶力可催化底物蛋白酪氨酸残基磷酸化的激酶，是蛋白激酶家族中最重要的成员之一，对细胞生长、增殖和分化等过程起重要的调节作用，包括位于细胞膜上的受体型PTK和位于胞质中非受体型PTK两大类。
丝氨酸／苏氨酸激酶的主要作用是通过变构而激活蛋白质，催化底物蛋白丝氨酸／苏氨酸残基磷酸化，包括PKA、PKC、PKG、钙调蛋白依赖性蛋白激酶和丝裂原激活蛋白激酶。
蛋白磷酸酶是具有催化已经磷酸化的蛋白质分子发生去磷酸化反应的一类酶分子。
蛋白磷酸酶与蛋白激酶相对应存在，共同构成磷酸化和去磷酸化这一重要的蛋白质活性开关系统。
GTP结合蛋白简称G蛋白，是指在信号转导过程中，与受体耦联的并能与乌菩酸结合的一类蛋白质，通过自身构象的变化激活效应蛋白，不同的效应蛋白受不同类型的G蛋白的影响。
G蛋白耦联受体介导的信号通路主要包括腺符酸环化酶、磷脂酰肌醇等信号通路；具有酶活性受体介导的信号通路主要包括TPKR-Ras-MAPK、PI3K-Akt及TGF-13受体等信号通路；细胞因子受体介导的信号转导通路属于酶连接受体介导的信号通路；蛋白质水解相关的信号通路包括泛素化降解介导的Wnt、Hedgehog和NF-KB信号通路及通过蛋白切割激活的Notch信号通路；细胞内受体介导的信号通路包括苗体类激素和NO介导的信号通路。
信号转导过程具有信号转导分子激活机制的类同性、过程的级联式反应、途径的通用性与特异性及信号转导途径之间相互交又等特点。
细胞内信号转导过程是由前后相连的生物化学反应组成的，即前一个反应的产物可作为下一个反应的底物或者发动者，通过一系列蛋白质与蛋白质的相互作用，信息可从胞内一个信号分子传递到另一个信号分子，每一个信号分子都能够激起下一个信号分子的产生，直至产生代谢酶被激活、基因表达被启动和细胞骨架产生变化等细胞生理效应。
细胞的信号转导是多通路、多环节、多层次和高度复杂的可控过程。
生理情况下，细胞对所接受信号做出适当的应答取决于细胞对所接收的多种信号的整合及对信号有效性的调控。
298第三篇细胞的社会性
信号转导在细胞的正常功能与代谢中起着极其重要的作用，从受体接受信号至细胞对信号作出反应过程中的任何环节发生异常均可导致疾病的发生。
表现有受体异常性疾病（如遗传性或原发性受体疾病、自身性免疫受体疾病和继发性受体疾病）、G蛋白和蛋白激酶功能障碍性疾病等。
细胞信号转导机制的研究在医学发展中的意义主要体现在两个方面：首先是对疾病发病机制的深入认识；其次可为疾病的诊断和治疗提供新的靶位。
（刘佳）
第四篇细胞的基本生命活动
第十三章细胞分裂与细胞周期
细胞分裂(cell division)是细胞生命活动的重要特征之一，指一个亲代细胞形成两个子代细胞的过程。
通过细胞分裂，亲代细胞的遗传物质和某些细胞组分可以相对均等地分配到两个子代细胞中，这有效地保证了生物遗传的稳定性。
细胞分裂与新个体的发生，以及与个体器官组织的维待和更新密切相关。
在单细胞生物（如细菌、酵母等）中，细胞分裂是其个体繁衍的重要方式，在高等生物中，经过多次细胞分裂生成成熟的性细胞，这些性细胞之间的有性生殖导致受精卵产生，新的生命个体由此出现。
细胞分裂构成了多细胞生物个体生长的基础，从受精开始到个体成熟的整个发育进程中，细胞需经历多次分裂，最终形成机体的器官和组织中数量庞大的细胞群体，如仅成入肝脏就含有2.5x10”个细胞。
细胞分裂在维持和更新个体正常组织中也具有重要的作用，在成体动物的皮肤、骨髓、肠上皮等器官组织中存在一些具有潜在分裂能力的原始细胞，如表皮基底层和毛毅中的干细胞、骨髓造血干细胞和肠上皮千细胞等，通过这些细胞的分裂可以适时地生成大量的新的分化成熟细胞，以替代因生理性衰老而死亡的细胞，这样，既使组织器官的细胞组成得到自我更新，也使细胞的数量保持恒定，维持了器官组织的正常功能。
此外，在机体创伤后的组织修复和再生等活动中都存在大量的细胞分裂现象。
细胞分裂的过程总是呈周期性进行：亲代分裂产生子代细胞；子代细胞经历一系列规律的细胞内生物化学变化，包括遗传物质的复制和特定蛋白质的合成等准备过程，并伴有细胞形态学的改变；然后子代细胞的分裂过程开始。
通常将细胞从上次分裂结束到下次分裂结束所经历的规律性变化过程称为一个细胞周期(cell cycle)。
大多数的细胞周期都包括数个协调的过程：细胞生长、DNA复制、倍增的染色体分配到子细胞中及细胞分裂。
在细菌，细胞生长和DNA复制发生在细胞周期的多数时间内，倍增的DNA和质膜一起分配到子细胞中。
在真核细胞，细胞周期比较复杂，包含4个分离的时相期。
虽然细胞生长通常是一个连续的过程，但DNA合成仅仅发生在细胞周期的一个时相中，然后，复制的染色体通过一个连续的过程在细胞分裂前被分配到子细胞核中。
细胞周期的各步骤进程的调控机制在进化中是保守的，该调控机制不仅可以精细地协调细胞周期中不同的事件，而且还可将调控细胞增殖的细胞外信号与细胞周期联系起来，使整个细胞周期呈现出高度的时空有序性和协同性。
如果由于细胞某些自身的或环境的因素影响，细胞周期正常的调控体系作用受到阻碍，细胞周期进程将可能出现异常，细胞增殖失控，导致肿瘤等疾病发生。
第一节细胞分裂
细胞分裂的方式主要包括有丝分裂、减数分裂及无丝分裂三种，不同分裂方式在分裂过程和子代细胞的遗传特性等方面各具特点。
—、有丝分裂
有丝分裂(mitosis)也称间接分裂(indirect division)，是高等真核生物的体细胞分裂的主要方式。
有丝分裂是细胞分裂的一系列事件连续发生和发展的过程。
有丝分裂持续时间约0.5~2小时，是一个连续的动态变化过程，包括细胞核分裂和胞质分裂，也是形态学变化最为丰富的时期。
根据分裂细胞的形态和结构的变化，以细胞核分裂为坐标，即从细胞分裂开始到细胞核分裂的过程，通常人为地将有丝分裂划分为五个时期：CD前期；＠前中期；＠中期；＠后期；＠末期。
此外，胞质分裂期则可从有丝分裂的后期启动，延续至末期。
通过核分裂及胞质分裂两个过程，借助于细胞骨架的重排，有丝分裂的细胞实现了染色体及胞质在子代细胞中的均等分配。
染色质凝集、纺锤体及收缩环的形成是有丝分裂活动中的三个重要的特征，也是生物长期进化的结果。
蛋白质磷酸化与去磷酸化是有丝分裂中染色质凝集与去凝集、核膜解聚与重建等变化产生的分子基础（图13-1)（动画13-1“细胞分裂的动态过程及调控机制”)。
前期前中期中期
后期末期胞质分离
（一）分裂前期核内染色质开始凝集
前期(prophase)细胞变化的主要特征为：染色质凝集、分裂极确定、纺锤体形成、核仁缩小解体。
1染色质凝集成染色体伴随核仁缩小、消失，间期核松散染色质纤维螺旋化并发生折叠，导致染色质纤维凝集变粗变短是细胞进入有丝分裂前期的标志。
在染色质凝集过程中，因染色质上的核仁组织中心组装到了所属染色体中，导致rRNA合成停止，核仁开始逐渐分解，并最终消失。
2分裂极确立和纺锤体的形成随着染色质的凝集，原来分布于细胞同一侧并巳经完成复制的两个中心体(cenu·osome)开始沿核膜外围分别向细胞的两极移动，它们最后到达的位置将决定细胞分裂极。
中心体是与染色体分离相关的细胞器，每一中心体由一对中心粒(cenb.iole)及周围无定型基质所构成，这些无定型基质中包含微管蛋白、微管结合蛋白、马达蛋白以及一些与细胞周期调控有关的蛋白质。
中心体是细胞的微管组织中心之一，其周围放射状分布着大噩微管，这些微管与中心体一起被合称为星体(as te1)，星体周围微管在细胞分裂中发挥重要的动力学作用，可分为三类：心极微管：极微管为两个星体之间在赤道附近重叠的微管，重叠区微管在动力蛋白的作用下相互滑动，促成星体向两级移动；＠动粒微管：动粒微管从中心体发生，另一端与染色体动粒结合，其主要作用是通过动粒微管缩短而将染色单体拉向两极；＠星体微管：星体微管位于星体周圃，游离端伸向胞质。
经细胞分裂间期已复制后的中心体完全分裂为两个，形成两个星体，星体中的马达蛋白以星体微管作为轨道，利用ATP水解提供的能址沿微管移动，牵引两个子中心体彼此分离，移向细胞的两极，最终两个星体以各自的中心体为两极形成纺锤体。
纺锤体(spindle)是在分裂期出现的特化的亚细胞结构，是一种临时性的梭形细胞骨架结构，由星体微管、极微管和动粒微管纵向排列组成，由中心体作302第四筒细胞的基本生命活动为两极，因状如纺锤而得名（图13-2)。
（二）分裂前中期细胞核膜崩解着丝粒中心粒前中期(prometaphase)细胞变化的主要特征为：核膜崩解、完成纺锤体的装配、染色体列队。
1.核纤层降解、促发核膜崩解在前期末，因核纤层蛋白多肤链的多个位点发生磷酸化，致使核纤层降解，随后核膜破裂，形成动粒微管许多断片及小泡，分散于胞质中，在核膜重建图13-2纺锤体结构示意图时，上述小泡将成为新核膜的组分。
2纺锤体”捕捉＂染色体、完成纺锤体装配，形成有丝分裂器在前期，两个星体向两极移动，形成分裂极。
在驱动蛋白以及其他微管结合蛋白的协助下，由星体发出的极微管、其游离端在赤道面处相互交叠或相互搭桥，形成纺锤体的基本架构；而星体微管与细胞质中的细胞骨架相结合，发挥稳定星体位置的作用；动粒微管与染色体主隘痕部位的着丝粒－动粒复合体结合，捕捉染色体。
纺锤体（包括星体和三种星体周围微管）及与之结合的染色体共同构成有丝分裂器(mitotic apparatus)。
3染色体列队前中期，纺锤体两极距离较短，赤道面直径较大，与同一条染色体相连的两极动粒微管并不等长，随着动粒微管的不断聚合与解聚，这种牵引作用造成染色体在震荡中向细胞中央赤道面移动。
（三）分裂中期染色体排列在细胞中央的赤道面
中期(metaphase)的主要特点是由千同一条染色体相连的两极动粒微管等长而达到力量平衡，导致所有染色体排列在细胞中央的赤道面上。
此期染色体在形态上比其他任何时期都短粗，同时两条姐妹染色单体的臂较易分离，故特别适合千进行染色体数目、结构等细胞遗传学的研究。
（四）分裂后期细胞姐妹染色单体分离后期(anaphase)细胞变化的主要特征是染色体两姐妹染色单体分离并移向细胞的两极。
姐妹染色单体分离的原因主要与染色体着丝粒分裂有关；姐妹染色单体原先在着丝粒处依靠粘连蛋白相连，后期粘连蛋白复合体被蛋白酶剪切而崩解，粘合力减小、消失，导致两侧动粒微管对染色单体的拉力与黏连蛋白粘合力的平衡打破，两边的拉力占上风，千是姐妹染色单体分开，而分离后的姐妹染色单体各自成为一个独立的染色体，即子代染色体。
分离后形成的子代染色体以基本相同的速度向两极移动。
这种移动是由纺锤体的不同微管参与的两种机制共同作用下实现的。
由此可将后期分为后期A和后期B。
后期A主要由动粒微管变化介导的。
动粒微管解聚而缩短，促发子代染色体向两极移动。
后期B主要由极微管变化介导的。
在后期A的基础上，极微管聚合而伸长，通过重叠部分微管的长度的增长及彼此间的滑动，同时伴随星体微管向外的作用力，共同促成纺锤体逐步拉长，进一步促进子代染色体移向两极（图13-3)。
（五）分裂末期细胞实现核分裂
末期(telophase)细胞主要的特点是子代细胞的核重建。
随着后期末染色体移动到两极，染色体被平均分配的完成，发生了和分裂前期相反的染色体解聚的过程。
两套子代染色体分别到达纺锤体两极，动粒微管消失，核膜重新形成，染色体去浓缩恢复间期染色质形态，核仁重新出现。
至此，两个子代细胞的核形成，核分裂完成。
（六）依靠收缩环实现胞质分裂胞质分裂(cytokinesis)是指母细胞胞体一分为二的过程。
一些多核细胞（如破骨细胞、骨骼肌细胞和肝细胞）只发生核分裂而无胞质分裂，因而成为多核细胞。
但是在典型的有丝分裂中，胞质分裂伴随每次核分裂发生。
胞质分裂通常开始于有丝分裂后期，完成于末期。
1收缩环实现胞质分裂当细胞分裂进入后期末或末期初，在中部质膜的下方，出现了由大量肌动图13-3有丝分裂的后期后期A中动粒微管正端的微管蛋白发生去组装，其长度不断地缩短，由此带动染色体的动粒向两极移动；后期B中，通过极微管长度的增长、彼此间的滑动及星体微管向外的作用力，细胞两极间的距离增大，促使染色体发生极向运动蛋白和肌球蛋白聚集形成的环状结构，即收缩环(contractile ri ng)。
此时胞质中的纺锤体也逐渐解体，残存的微管及一些痰泡也聚集于子代细胞核之间的细胞中部，所形成的环形致密层称为中体（图13-4)。
由收缩环中肌动蛋白、肌球蛋白装配而成的微丝束，通过相互滑动使收缩环不断缢缩，直径减小，与其相连的细胞膜逐渐内陷，形成分裂沟，细胞表面出现皱皱褶；随着分裂沟不断加深，细胞逐步凹陷，当分裂沟深至中央时，一方面细胞在此发生断裂，由收缩环完成胞质分裂，另一方面通过细胞内小泡融合插入收缩环邻近的细胞膜，用于补充细胞膜，保证新分裂形成的细胞与亲代细胞具有相似的表面积。
图13-4收缩环A肌动蛋白和肌球蛋白纤维形成收缩环，引起胞质分裂，生成两个子细胞；B扫描电镜显示分裂中的蛙卵细胞一些多核细胞（如破骨细胞、骨骼肌细胞和肝细胞）只发生核分裂而无胞质分裂。
现已知道，分裂沟发生的时间及部位与纺锤体的位置密切相关，纺锤体的位置决定着两个子代细胞的大小，当纺锤体处于细胞中央时，细胞对称分裂，产生的两个子代细胞大小均等，成分相同。
相反，不在细胞中央的纺锤体将导致细胞不均等分裂，所产生的子代细胞在大小与成分上均有差异。
2.细胞器的非绝对均等分配每个子细胞必须得到母细胞中基本的细胞成分，包括各种膜性细胞器。
当细胞进入有丝分裂后期，细胞器的数目或体积都大致扩增一倍，如线粒体通常其数量可在每个细胞周期中简单加倍、内质网和高尔基复合体则体积加大等，在胞质分裂阶段，各种细胞器较为均匀，但非数佩绝对均等地分配到子细胞。
二、减数分裂
减数分裂(meiosis)是生殖细胞形成过程中的特殊有丝分裂。
减数分裂的主要特征是DNA只复制一次，而细胞连续分裂两次，产生四个子代细胞，每个子代细胞中染色体数目比亲代细胞减少一半，',III.ot;成为仅具单倍体遗传物质的配子细胞。
由于减数分裂只发生于生殖细胞的成熟阶段，因此又称为（性）成熟分裂。
经过减数分裂，有性生殖生物配子中的染色体数目由2n变为n。
受精后，配子融合形成的受精卵中染色体数又恢复为2n，由此保证了有性生殖遗传中染色体数目上的恒定。
另一方面，减数分裂过程中可通过非同源染色体的自由组合，以及同源染色体的交换、重组，使生殖细胞遗传基础多样化，生物后代变异增大，对环境的适应力增强。
所以，减数分裂不仅对于维持生物世代间遗传的稳定性具有重要的意义，同时也构成了生物变异及进化的基础。
减数分裂的两次分裂分别称为第一次减数分裂(meosi s I，也称减数分裂I)及第二次减数分裂(meos is II，也称减数分裂II)。
第一次减数分裂完成同源染色体分离，实现染色体数目减半及遗传物质的交换；第二次减数分裂与有丝分裂相似，实现姐妹染色单体分开。
经过两次分裂形成4个单倍体子代细胞（图13-5)。
细线期
前期1I中期1I后期11
单倍体配子减数分裂II
（－）第一次减数分裂进程中细胞内发生复杂的生化和形态变化``第一次减数分裂可进一步分为前期1、中期I、后期I和末期I。
1前期1减数分裂的特殊过程主要发生千前期1。
其主要事件为同源染色体配对、交换与重组，随后随机分离进入两个子代细胞。
通常将前期1人为划分为5个时期：细线期、偶线期、粗线期、双线期、终变期。
(1)细线期(leptote n e s tage)：此期细胞中，核及核仁的体积均增大，在分裂间期已经完成复制的染色质开始凝集，每一染色体均具有两条染色单体，但在光镜下仍呈单条细线状，染色单体的臂未完全分离，这可能因为染色体上某些DNA片段的复制尚未完成。
细线状染色体通过其端粒附着千核膜上，在局部出现成串的、大小不一的珠状结构，称为染色粒。
(2)偶线期(zygotene s tage)：染色质进一步凝集，分别来自父母的、形态及大小相同的同源染色体(homologous chromosome)相互靠近、配对，称为联会(syn apsis)。
染色体配对从端粒处开始，同源染色体间出现若干不同部位的接触点，随后这种结合沿其长轴迅速扩展，直至同源染色体侧面紧密联第十三章细胞分裂与细胞周期会。
同源染色体完全配对后形成的复合结构即为二价体(bivalent)，因其共有四条染色单体，又被称为四分体(tetrad)。
在联会的同源染色体之间，沿纵轴方向形成了一种特殊的结构，称联会复合体(synaptonemal complex,SC)，在电镜下它包括三个平行的部分：侧生成分宽约20~40nm，位千复合体两侧，电子密度较高，其外侧为同源染色体DNA。
两侧生成分之间电子密度较低的区域为中间区，宽约100nm，其中央为电子密集的中央成分，宽约30nm。
侧生成分与中央成分之间存在横向排列的纤维，三者大致呈直角相连，每个横向纤维之间距离约20~30nm，因而使联会复合体像一条“拉链”将同源染色体连接在一起（图13-6)。
联会复合体主要由蛋白质、RNA及少量DNA组成。
联会复合体是同源染色体配对过程中细胞临时生成的特殊结构，对千同源染色体配对、交换与分离均发挥重要作用。
联会复合体的形成中还可能有DNA的参与，偶线期细胞中存在0.3％的DNA合成，称为Z-DNA，如抑制其合成，联会复合体的组装将受到阻止。
联会复合体的形成对于稳定二价体中同源染色体紧侧生成分密的配对有重要意义。
在联会起始阶段，当染色质凝集程度较低时，同源染色体之间主要通过其特定位点上碱基间的互补进行接触。
当联会复合体随着染色质进一步的凝集逐渐形成，其组成中加入了某些单链DNA序列以及蛋白质序列识别分子，由此构成一个有组织的网络，从而促使了同源染色体之间的配对进一步发展，直至完成。
(3)租线期(pachytene stage)：粗线期持续时间较长，可达几天甚至几月。
通过联会紧密结合在一起的两图13-6联会复合体的结构条同源染色体，进一步地凝集而缩短、变租，同源染色体联会复合体在结构上由三个平行的部分组间出现染色体段的交换及重组，因此，该期又称为重组成，即位于两侧的电子密度较高的侧生成期。
联会复合体中央出现一些椭圆形或球形、富含蛋白分，以及两侧生成分之间的中央成分质及酶的棒状结构，称为重组结(recombination nodule),多个重组结相间地分布千联会复合体上，将同源非姐妹染色单体的DNA相对区域结合在一起，发生活跃的DNA片段交换事件，导致基因重组。
在粗线期，除合成减数分裂期特有的组蛋白外，同时合成少部分DNA，称为P-DNA，主要编码与DNA剪切和修复相关的酶，在重组过程中发挥DNA修复等作用。
(4)双线期(di plotene stage)：双线期持续时间长短变化较大，一般持续时间较长。
例如，两栖类卵母细胞的双线期可持续近一年。
作为临时性亚细胞结构的联会复合体在双线期发生去组装，逐渐趋千消失，紧密配对的同源染色体相互分离。
同源染色体的大部分片段分开，但仍在非姐妹染色单体之间的某些部位上，残留一些接触点，称为交叉(chiasma)（图13-7)。
交叉被认为是粗线期同源染色体交换的形态学证据。
同源染色体的交叉部位和数萤与物种、细胞类型、染色体长度等有关，一般每个染色体至少有一个交叉；染色体较长，交叉也较多。
人类平均每对染色体的交叉数为2~3个。
随着双线期的进行，交叉点逐渐移向染色体两端，数目也由此减少，这种现象称为交叉端化(chiasma terminali za tion)。
(5)终变期(diakinesis stage)：同源染色体进一步凝集，核仁消失，交叉端化继续进行。
终变期末，同源染色体仅在其端部靠交叉结合在一起，同源染色体重组完成。
核膜逐渐解体，纺锤体装配完成，在其作用下染色体开始移向细胞中部的赤道面上。
终变期结束标志着前期I完成。
2中期I以端化的交叉连接在一起的同源染色体即四分体，向细胞中部汇集，最终排列于细胞的赤道面上，通过动粒微管分别与细胞不同极相连，每个二价体的两个动粒分别位于赤道面的两侧，各自面向相对两极，而一侧纺锤体动粒微管只连接于同侧的动粒上，由此决定二价体中每条染色306第四篇细胞的基本生命活动3.后期I由千每个同源染色体的两条姐妹染色单体共有一个着丝粒和动粒，受纺锤体微管的牵拉作用，同源染色体彼此分离，而姐妹染色单体并不分开，包含两条姐妹染色单体的同源染色体开始分别移向细胞的两极，结果导致每极的染色体数为细胞原有染色体数的一半，所以，后期1是减数分裂中染色体减半的关键时期。
同时，同源染色体向两极的移动是随机的，因此，非同源染色体之间以自由组合的方式进入两极，有利于生物变异与进化。
4.末期1细胞在末期I存在两种类型的变化：O类似有丝分裂末期，在到达细胞两极的染色体去凝集，逐渐成为细丝状的染色质纤维，核仁和核膜重新出现，胞质分裂后，两个子代细胞形成。
＠某些生物在末期1，细胞中的染色图13-7同源染色体交叉、重组体不发生去凝集，而依然保持凝集状态，直至胞质分裂形成两个子细胞。
（二）第一次减数分裂后出现短暂的间期与有丝分裂间期相比，减数分裂间期通常持续时间较短，不发生DNA合成，无染色体复制，甚至某些生物没有间期，第一次减数分裂结束后，直接进入第二次减数分裂。
（三）第二次减数分裂与有丝分裂过程相似第二次减数分裂过程与有丝分裂基本相同，可分为前期II、中期II、后期II、末期II、胞质分裂等5个时期。
1前期II末期1松散的染色体重新凝聚，核仁消失，核膜崩解，纺锤体再次形成，染色体逐渐向细胞中央的赤道面移动。
在第二次减数分裂结束时，一个亲代细胞共形成4个子代细胞，各子代细胞中染色体数目与分裂前相比，均减少了一半，子代细胞间在染色体组成及组合上也存在差异，这些变化主要在第一次减数分裂中完成。
与有丝分裂相比，同源染色体的配对是减数分裂的显著特征。
配对导致母方染色体上某一片段与同源的父方染色单体相应的片段发生互换。
在染色体交叉互换过程中，母方的染色单体和同源的父方的染色单体上DNA的双螺旋结构都是打开的，这有利千在两条非姊妹染色单体间进行某一片段的相互交换，这一过程就是遗传重组。
这种同源非姊妹染色单体间的交叉互换增加了后代细胞中的基因类型。
在减数分裂过程中，性染色体也要配对。
雌性哺乳动物有两条X染色体，它们能够像其他同源染色体那样配对。
但是雄性个体有一条X染色体和一条Y染色体，它们不是同源染色体。
有证据表明，在减数分裂前期I也能发生X染色体与Y染色体同源区域的配对及交叉互换，因为在X染色体和Y染色体的末端存在一个小的区域，两者的这个区域是具有同源性的。
这种配对、交叉保证X和Y染色体可以连接在纺锤体上，便千染色体分离，结果只产生两种类型的精子，即含有X染色体的精子和含有Y染色体的精子。
第十三章细胞分裂与细胞周期
减数分裂与有丝分裂之间的联系和区别小结如下（表13-1)。
有丝分裂减数分裂
发生范围体细胞生殖细胞
分裂次数2
分裂过程
前期无染色体的配对、交换、重组有染色体的配对、交换、重组（前期I)中期二分体排列于赤道面上，动粒微管与染四分体排列于赤道面上，动粒微管只与染色体的色体的两个动粒相连一个动粒相连（中期I)后期染色单体移向细胞两极同源染色体分别移向细胞两极（后期I)末期染色体数目不变染色体数目减半（末期I)分裂结果子代细胞染色体数目与分裂前相同，子子代细胞染色体数目比分裂前少一半，子代细胞代细胞遗传物质与亲代细胞相同遗传物质与亲代细胞及子代细胞之间均不相同分裂持续时间一般为1~2小时较长，可为数月、数年、数十年无丝分裂(amitosis)又称为直接分裂(direct division)，是最早发现的一种细胞分裂方式。
无丝分裂过程中，间期细胞核经复制后直接分裂成大小基本相等的两部分，期间不形成染色体和纺锤体，核膜也不消失，由亲代细胞直接断裂形成子代细胞，因此，两个子代细胞所获得的遗传物质和其他胞质成分并不一定是均等的，无丝分裂中细胞维持其遗传稳定性的机制目前仍不清楚。
无丝分裂是低等生物细胞增殖的主要方式，但也存在千高等生物的组织细胞，例如动物的上皮组织、疏松结缔组织、肌组织及肝脏等细胞。
另外，创伤、癌变及衰老的细胞中也能进行无丝分裂，无丝分裂具有能量消耗少、分裂迅速、分裂中细胞仍可执行其功能等特点，其快速性与便捷性有利千细胞应激并适应外界环境变化。
第二节细胞周期及其调控
通过细胞周期，实现细胞生长、细胞分裂前DNA复制以及细胞分裂。
细胞周期的演进具有高度精确性，包括细胞周期事件发生的严格时序性、遗传物质复制的精确性以及分配的均等性等。
细胞周期的规律性是由一套复杂的调控系统决定的，各种环境因素均可影响该系统的功能。
—、细胞周期的概念,
地球上所有生物，从单细胞到哺乳动物，均是通过重复的细胞生长和分裂而维持生存和保待物种延续的。
一个细胞经过一系列生化事件，复制其组分，然后一分为二，形成两个子细胞，这种周而复始的循环连续过程，即为细胞周期(cell cycle)。
通常，我们将从一次细胞分裂结束开始，经过物质准备，到下一次细胞分裂结束为止，称为一个细胞周期。
细胞周期具有高度精确的特性，首先必须实现细胞分裂前遗传物质的精确复制，进而通过细胞分裂确保子细胞遗传物质的精确分配。
细胞周期可分为有丝分裂期(mitosis)和分裂间期(interphase)两个基本的部分。
其中，有丝分裂期又称为M期，而分裂间期则分为G1期、S期和G2期。
绝大多数真核细胞，细胞周期严格按照“间期(G,-S-G2)-M－间期”的规律连续循环。
细胞分裂期(M期）与DNA复制合成时期(S期）是整个细胞周期的两大关键环节，G1和也期最主要的任务就是通过合成大量特定蛋白质，储存能量及其他物质，细胞体积增大，促进细胞生长，分别为DNA复制和细胞分裂做好准备（图13-8)。
同种细胞之间，细胞周期长短基本相同，但在机体的不同发育阶段和不同种类的细胞中细胞周期心（（1}308第四篇细胞的基本生命活动持续分裂的细胞持续时间差别很大，例如芽殖酵母的细表皮细胞、肠道上皮细胞胞周期仅90分钟，受精卵早期的细胞周期可能短千30分钟。
M期持续时间DNA复制很短，而间期占据了细胞周期的95%s以上的时间。
就高等生物而言，细胞周期的长短主要取决于GI期长短，而S期、也期与M期时间总体恒定。
典型的快速增殖的人体细胞的细胞周期时暂不分裂肝细胞的细胞间大约24小时，其中G I期约11小时，S期约8小时，化期4小时，M期1小不再分裂的细胞时，因此，间期中的GI期，是影响细胞神经元、心肌细胞周期时间的关键（表13-2)。
G I期的时图13-8细胞周期示意图间长度与G I期细胞中的某些特殊的mRNA及蛋白质的积累相关。
此外，激震生长因子等环境因素也能影响细胞周期长短，如环境温度高千39°C或低千36°C，细胞周期各时相的时间将随之按比例地变化。
细胞类型Tc T G1飞T G2+M
人结肠上皮细胞25.09.014.02.0直肠上皮细胞48.033.010.05.0胃上皮细胞24.09.012.03.0骨髓细胞18.02.012.04.0大鼠十二指肠隐窝细胞10.42.27.01.2内釉质上皮细胞27.316.08.03.3淋巴细胞12.03.08.0l.0肝细胞47.528.016.03.5精原细胞60.018.024.515.5+2.0小鼠小肠隐窝上皮细胞13.
I4.66.9l.0+0.7十二指肠上皮细胞10.3I.37.51.5结肠上皮细胞19.09.08.02.0皮肤上皮细胞101.087.011.822.18乳腺上皮细胞64.037.721.73+1.6注：飞为细胞周期；Tc,、Ts、TG2•'1分别为G,、S期、G2/M期的时间依据细胞增殖及细胞周期特性，可将多细胞生物中的细胞群体分为三类：CD周期细胞(cycling cell)：这类细胞持续分裂、增殖，细胞周期持续循环，如上皮组织的基底层细胞。
＠终末分化细胞：一类分化程度高的细胞，待其分化成熟，将不再分裂，细胞周期因此终止，包括神经元、大掀横纹肌细胞、红细胞等。
＠G。
期细胞，又称静止细胞(qui escen t cell)：这类细胞暂时性终止细胞周期，停止细胞分裂，但是一旦需要，乌期细胞可快速返回正常细胞周期，实施分裂增殖，如在一般情况下，处于不分裂的静息”休眠”状态的皮肤成纤维细胞和肝实质细胞，在需要替换损伤或死亡的细胞时可迅速出现分裂增殖。
第十三章细胞分裂与细胞周期309
二、细胞周期各期的主要特征
(-)G1期是DNA复制的准备期
GI期细胞围绕两大主要活动：心细胞生长；＠为细胞进入S期做准备。
GI期细胞的主要特征为细胞体积增大，细胞体积与质量都比上一次分裂结束时约增加一倍，同时呈现极为活跃的物质代谢特点。
1.大量RNA和蛋白质合成合成S期DNA复制起始与延伸所需的酶类，如DNA聚合酶，也包括G期向S期转换过程中起重要作用的一些蛋白质，如：触发蛋白、钙调蛋白、细胞周期蛋白、抑素等。
2.蛋白质磷酸化细胞中发生了多种蛋白质的磷酸化，如组蛋白、非组蛋白及某些蛋白激酶的磷酸化。
促进GI晚期染色体结构发生改变，有利千S期DNA合成。
3细胞膜物质转运加强细胞对氨基酸、核昔酸、葡萄糖等小分子营养物质摄入量增加，保证了G期中进行的大量生化合成有充足的原料。
此外，细胞对一些可能参与GI期向S期转变的调控物质的转运也增加，cAMP含量在GI早期增加迅速，K＋可因Na+-K飞TP酶活性在GI期发生短暂的升高而大量流入细胞。
GI期是经典细胞周期进入增殖分裂期循环中的第一期，在推动整个细胞周期演进中发挥重要的始发作用。
G期起始依赖于细胞外生长和分裂的信号刺激，如相关生长因子，随着GI期演进，当物质合成与准备足够充足，将通过GI晚期阶段的一个特定时相位点，这个位点在酵母中称为起始点(st釭ter)，在哺乳动物细胞称为限制点(restriction point, R点）。
GI期细胞一旦通过此点，将启动细胞G I期向S期演进。
GI细胞如果通过此限制点，将不受生长因子控制，即使在缺少生长因子的条件下，细胞仍然会进入S期，进而完成后续细胞分裂增殖。
（二）S期中完成DNA复制S期是细胞周期进程中非常重要的一个阶段，此期细胞主要的特征是DNA复制，合成组蛋白及非组蛋白等染色质蛋白，新合成DNA到染色质结构的组装。
细胞由GI期进入S期时，DNA合成所需的酶类，如DNA聚合酶、DNA连接酶、胸腺I密唗核昔激酶、核昔酸还原酶等含量或活性显著增高。
DNA复制遵循严格的时间顺序。
通常，早复制的多为GC含量较高的DNA序列，而晚复制的DNA序列AT含量较高。
常染色质的复制在先，异染色质复制在后，如女性失活的X染色体最后复制。
S期是组蛋白合成的主要时期，进入S期后，组蛋白mRNA水平可增加50倍，新合成的组蛋白迅速进入胞核，与已复制的DNA结合，组装成核小体，进而形成具有两条单体的染色体。
组蛋白的合成与DNA复制是同步进行、相互依存的。
伴随着DNA的复制，胞质中组蛋白mRNA大量增加，当DNA复制在S期末完成，组蛋白mRNA也在短时间发生大佩的降解。
如果S期DNA复制被胫基脉、阿糖胞昔等物质抑制，细胞中组蛋白mRNA的水平也将发生并行性降低，组蛋白合成由此停止。
反之，用环己亚胺、嗦呤霉素、吐根碱等抑制S期组蛋白质的合成，DNA的合成速率会迅速降低，进而在数秒钟内停止。
S期组蛋白合成后进一步发生磷酸化、乙酰化、甲基化等修饰，有助于基因转录和染色质凝集。
中心粒的复制开始于GI期，完成于S期。
首先是相互垂直的一对中心粒彼此发生分离，然后各自在其垂直方向形成一个子中心粒，所形成的两对中心粒将作为微管组织中心，随着细胞周期进程的延续，在纺锤体微管、星体微管等的形成中发挥作用。
（三）G2期是细胞分裂的准备期G2期细胞主要特点是为进入M期做准备，主要大量合成一些与M期结构和功能相关的蛋白质，如合成M期组装纺锤体必需的微管蛋白；对核膜破裂、染色体凝集有重要作用的细胞周期调控因子，310第四篇细胞的基本生命活动如成熟促进因子等。
在化期，S期已复制的中心粒此时体积逐渐增大，开始分离并移向细胞两极。
（四）M期中细胞进行分裂M期是细胞分裂期，细胞通过分裂将染色体遗传物质平均分配到两个子细胞，细胞在M期有丰富而显著的形态学变化规律与特点，包括染色体凝集后姐妹染色单体分离、核膜崩解与重建、纺锤体形成与消失，收缩环出现与胞质分裂等。
三、细胞周期的调控
细胞周期的演进具有高度精确性，包括细胞周期事件发生的严格时序性、遗传物质复制的精确性以及分配的均等性等。
细胞周期调控是一个精细复杂的过程，依赖于复杂的细胞周期调节蛋白网络，即细胞周期调控系统。
细胞周期调控系统的基本构成在从酵母到人类的所有真核细胞中高度保守，其本质为一系列生化反应的有序发生。
细胞周期调控系统发挥强大可靠的分子开关作用，特定的生化反应能够在特定的细胞周期起始时被激活，随即在该细胞周期事件结束时被灭活，从而使各细胞周期能够在正确的时间，以正确的顺序，程序性开始和结束。
同时，细胞周期调控系统能够对细胞内外信号产生应答，细胞外蛋白质或生长因子作用于细胞周期调控系统，可实现其对细胞周期的多因子、多层次调控。
（一）细胞周期蛋白与细胞周期蛋白依赖激酶构成细胞周期涸控系统的核心细胞周期蛋白(cyclin)为全酶调节亚基，细胞周期蛋白依赖性激酶(cyclin-dependent kinase, Cdk)为催化亚基，不同cyclin选择性结合特定Cdk，两者结合后Cdk呈现激酶活性，不同的Cdk进而通过磷酸化一系列特定的底物，实现不同细胞周期进程及转换（动画13-2"Cyclin与CDK是细胞周期向前行进的动因“)。
1细胞周期蛋白cycli n是真核细胞中的一类蛋白质，它们能随细胞周期进程周期性地出现（合成）及消失（降解）。
cyclin通过选择性与Cdk结合，形成复合物，通过介导Cdk激活过程而参与细胞周期的调控。
真核生物的细胞周期蛋白是一些功能相似的同源蛋白，种类多达数十种，酵母中有Cln l-3、Clbl6心g等，而哺乳动物的周期蛋白则包括cyclin A-H及cyclin T等九大类，而每大类则可包含多种蛋白，如存在三种具有组织及细胞特异性的cyclinD，即cyclin D1-3。
依据出现及发挥作用的细胞周期阶段，可以将细胞周期蛋白分为4类：心GI期细胞周期蛋白：cyclin D;(2)G/S期细胞周期蛋白：cyclin E;@S期细胞周期蛋白：cycli n A;@M期细胞周期蛋白：cyclin B。
不同的cycli n在分子结构上存在共同的特点，即均含有一段氨基酸组成保守的细胞周期蛋白框（图13-9)。
该保守序列含约100个氨基酸残基，可介导cycli n与Cdk结合而形成复合物，参与细胞周期的调控。
在S期及M期cycl i n分子中还存在一段被称为破坏框的特殊序列，由9个氨基酸残基构成，位千蛋白质分子的近N端，可通过多聚泛素化～蛋白酶体途径介导cyclin A、B的快速降解。
GI期周期蛋白虽然分子结构虽不具破坏框，但也可通过其C端的一段PEST序列的介导，发生降解。
2细胞周期蛋白依赖性激酶Cdk为一类必须与细胞周期蛋白结合后才具有激酶活性的蛋白激酶，通过磷酸化多种细胞周期相关蛋白，可在细胞周期调控中发挥关键核心作用。
现已被鉴定的Cdk为Cdk1-8。
在不同的Cdk分子结构中，均存在一段相似的激酶结构域，其中有一小段序列具高保守性，是介导激酶与周期蛋白结合的区域。
在细胞周期的各阶段，不同的Cdk通过结合特定的周期蛋白，使相应一系列的蛋白质磷酸化，由此引发或控制细胞周期的一些主要事件。
因细胞周期进程中cyclin可不断地被合成与降解，Cdk对蛋白质磷酸化的作用也因此呈现出周期第十三章细胞分裂与细胞周期311G翡］S期Q期M期图13-9细胞周期蛋白框(A)和Cyclin周期性变化(B)性的变化（表13-3)。
表13-3细胞周期中—些主要的Cdk与cyclin的结合关系及作用特点以Cdk为核心的细胞周期调控系统是细胞周期事件发生时序性和协调性的根本保证，因此Cdk的活性调节就是细胞周期调控的关键环节。
为保证其精准性，细胞从多个层面正、反调控Cdk激酶活性，其中发挥主导作用的调控方式主要为：心Cd k与特定cycli n结合；(2)Cdk多重磷酸化／去磷酸化修饰；＠Cdk与Cdk抑制因子(CKI)结合。
(1)Cdk与周期蛋白结合是Cdk活化的基本条件：Cdk激活必须首先与细胞周期蛋白结合。
周期蛋白与Cd k结合可通过改变Cd k空间构象，暴露出Cd k与底物结合的激酶催化活性位点，从而部分激活Cd k活性。
在裂殖酵母中，处于非磷酸化状态的无活性Cdk分子中含有一个弯曲的环状区域，称为T环，该结构将Cd k的催化活性部位入口封闭，阻止了蛋白底物与催化活性部位结合。
当非磷酸化312第四篮细胞的基本生命活动图13-10Cdk与cycl in结合无活性的Cd k分子中含有一弯曲的T环结构，将C dk的袋状催化活性部位入口封闭，阻止了蛋白底物对活性位点的附着；Cdk与cyclin结合使T环结构移位、缩回，Cdk底物附着位点由此转向其袋状催化活性部位分布，Cdk具有了部分活性；Cdk完全激活还需要T环上的特定位点发生磷酸化的Cdk与cyclin结合后，cyclin与T环彼此间发生强烈的相互作用，引起T环结构位移，催化活性部位入口打开，活性位点暴露（图13-10)。
哺乳动物的C KI可被分为CIP/KIP及INK4两大家族，属CIP/KIP家族成员的CKI有p21e,pl/IVaf1、图13-11多重磷酸化对Cdk1活性的影响Cdk l的三个氨基酸残基位点Thr16l(TJ61)、Tyr15和Thrl4的磷酸化状态与其活性密切相关。
Thrl6I位于T环上，在其磷酸化后，cyclin-Cdk－复合物与底物的结合能力明显增强；Tyrl5、Thr14存在于Cdk l与ATP结合的区域，其磷酸化发生于Thr161之前；当Thr161被磷酸化后，Tyrl5、Thrl4再发生去磷酸化，第十三章细胞分裂与细胞周期313p27凡pl、p57Kip等，而INK4家族成员则包括pl61NK4、plS INK4、p]8I N K4等。
CIP/KIP家族p27Kipl，主要通过与cycl inB-Cdk2复合物结合，改变活性位点空间位置，从而抑制Cdk2活性。
INK4两大家族则能通过特异性结合Cd k4和Cdk6，降低与底物结合的亲和力。
（二）cyclin-Cdk复合体对细胞周期的核心洞控
cycl in-Cdk复合物是细胞周期调控体系的核心，直接掌控细胞周期各时相的有序运转。
作为驱动力，cycl in的周期性的表达及降解，将直接引发cycl in-Cdk复合物周期性的表达及降解，导致不同Cdk分子激酶活性在特定时相的顺序激活，由于不同Cdk激酶控制下的底物不同，而不同系列磷酸化修饰的底物将作为最终执行者，引发细胞周期进程中特定细胞事件的出现，并促成了GI期向S期、G2期向M期、中期向后期等关键过程不可逆的转换，1.
Cyclin D-Cdk4/6、Cyclin E-Cdk2复合物顺序启动G1/S期转化G I期细胞在外界生长因子等促有丝分裂原刺激下，G期细胞cyclin D表达增强，cyclin D-Cdk4/6复合物促进细胞生长，当cyclin D-Cdk4/6积累到一定程度时，活化的Cdk4/6通过磷酸化Rb蛋白，使其失活，释放与Rb蛋白结合而被抑制的转录因子E2F,E2F恢复活性，从而启动S期相关基因转录，随着在G,晚期(G l/S期）cycli n E表达的上升，cycl in E-Cdk2复合体逐渐增多，活化的Cdk2则进一步激活E2F（正反馈）以及其他一些转录因子，与DNA复制相关基因的表达启动，从而使细胞跨过GI期限制点，产生DNA合成所需的酶与蛋白质，为细胞进入S期做准备（图13-12)。
正反馈
活化的Rb蛋白活化的E2F蛋白
CyclinE.-DNA合成
Ill\\\一S期基因转录一-CyclinA
失活的E2F蛋
^＾失活的Rb蛋白..5
cyclinA-Cdk2复合物利用其激酶活性可使与DNA复制起始相关的预复制复合体的某些位点发生磷酸化，预复制复合体由此被激活，DNA合成开始启动。
此外，cyclinA-Cdk2复合物还可通过磷酸化作用，激活预复制复合体中的某些DNA解旋酶的功能，通过解离DNA双链，促进与DNA合成相关\,」1a,314第四篇细胞的基本生命活动解旋酶\.,.t;;,\o'o ORC磷酸化｛P,勹铭新的DNA复制起始点识别复合物结合到DNA复制起始点的酶，如DNA聚合酶等与单链DNA结合，启动DNA复制（图13-l3)。
(2)cyclin A-Cdk2复合物保障DNA只能复制一次：在DNA复制启动后，在cyclinA-Cdk2复合物作用下，Cdc6从ORC上解离，引起预复制复合体去组装，这种机制确保在原复制起始点上DNA将不能再次进行复制。
cyclinA-Cdk2复合物还可进一步对组成预复制复合体的蛋白质进行磷酸化，导致其降解或向核外转运，阻止了预复制复合体在其他复制起始点的重新聚合装配，使DNA复制不会再启动。
cyclinA-Cdk2复合物通过上述机制，保证了S期细胞DNA只能复制一次，cyclinA-Cdk2复合物的这一作用能继续维持到化及M期，因此直至有丝分裂后期染色单体彼此未发生分离前，DNA均无法再进行复制（动画13-3“细胞分裂与细胞周期中DNA只复制一次的分子机制”)。
3. cyclinB-Cdk1启动G2/M期转换G2晚期形成的cyclinB-Cdk1复合物在促进化期向M期转换的过程中起着关键作用，该复合物又被称为成熟促进因子(maturat ion promoting factor, MPF)，意为能促进M期启动的调控因子。
MPF最早发现千20世纪70年代由R.
T. Johnson和P.
N. Rao所进行的细胞融合实验中。
他们用人工方法诱导体外培养的M期及间期HeLa细胞发生融合，结果发现无论融合的间期细胞处于细胞周期何种阶段，其核中染色质均会出现早熟凝集(premature chromosome condensation, PCC)，并都能向M期转换。
此研究提示，在M期细胞中可能分布有能促进染色质凝集及有丝分裂发生的因子。
Y. Mas u]等(1971)将经孕酮处理的成熟非洲爪赡卵细胞胞质显微注射到未成熟的、处千立期的爪蟾卵母细胞中，后者可被诱导向M期转化，进而成熟。
据此他们认为，在成熟卵细胞胞质中必定存在一种能促进G2期卵母细胞进入M期，发育成熟的物质，并将其命名为MPF。
由于MPF在细胞中稳定性较差，在它被发现后的许多年间，人们一直致力于其纯化及鉴定工作。
现已证实，从酵母到哺乳动物的细胞中均有MPF的分布，柱层析结果表明，MPF是由32000和45000两种蛋白质亚基组成的异二聚体，前者为细胞周期蛋白依赖激酶Cdk1，后者即为cyclinB。
在也晚期，MPF活性发生显著的升高，此时cyclinB的表达达到峰值，Cdk1与其结合后，Cdk1活性由此被激活。
MPF活性增高，促进了伍期向M期的转换。
4. M期中cyclinB-Cdk1复合物的作用M期细胞在形态结构上所发生的变化以及中期向后期、M期向下一个GI期的转换均与MPF相关。
(1)MPF促进染色体凝集：在细胞分裂的早、中期，MPF可通过磷酸化组蛋白H1上与有丝分裂彸，1，有关的特殊位点诱导染色质凝集启动有丝分裂。
MPF也可直接作用于染色体疑集蛋白，散在的DNA分子结合于磷酸化的凝集蛋白上后，沿其表面发生缠绕、聚集，介导了染色体形成超螺旋化结构，进而发生凝集。
(2)MPF促进核膜崩解：核纤层蛋白(lamin)也是MPF的催化底物之一，lamin经MPF作用后，其特定的丝氨酸残基可发生高度磷酸化，由此引起核纤层纤维结构解体，核膜破裂成小泡。
(3)MPF促进纺锤体的形成：MPF可对多种微管结合蛋白进行磷酸化，进而调控细胞周期中微管的动态变化，使微管发生重排，促进纺锤体的形成。
(4)MPF促进姐妹染色单体的分离：中期姐妹染色单体在着丝粒部位依靠粘连蛋白复合体（主要由Seel和Smc组成）相连，粘连蛋白被分离酶(sep釭ase)分解而导致染色单体粘合力下降或消失，是姐妹染色单体分离的首要机制。
在有丝分裂后期前，由于分离酶与分离酶抑制蛋白(securin)结合，分离酶呈现无活性状态，保障姐妹染色单体相连；在中期较晚阶段，作为泛素连接酶之一的后期促进因子(anaphase-promoting complex, APC)可在MPF作用下开始发生磷酸化，进而与Cdc20结合而被激活，随后将引起分离酶抑制蛋白发生多聚泛素化反应，最终被降解，分离酶由此被释放、活化，在其作用下，姐妹染色单体之间的凝集力丧失而丝粒发生分离，在纺锤体微管的牵引下，分别移向两极，细胞进入后期阶段（图13-14)。
M期CDK磷酸化APC CDC20结合APC扁无活性的分离酶分离酶抑制蛋白－矗生一』一：云；素化途径颐,有活性的分离酶-.
有丝分裂中期粘连蛋白复合体分离酶分解粘连蛋白复合体有丝分裂后期在有丝分裂中期末，后期促进因子(APC)被MPF磷酸化后激活，致使securin蛋白经多聚泛素化反应被降解，分离酶(separase)被释放、活化，进而降解See l蛋白，粘连蛋白复合体解体，姐妹染(5)MPF失活促进有丝分裂末期进程：随着有丝分裂后期进程，cycl i nB经多聚泛素化途径被降解，MPF解聚而失活，促使细胞转向末期，此时细胞中因失去了MPF的活性作用，磷酸化的组蛋白、核纤层蛋白等可在磷酸酶作用下发生去磷酸化，染色体重新开始凝集、核膜也再次组装，子代细胞核逐渐形成。
MPF激酶活性降低，也促进了胞质分裂发生。
随着后期MPF的失活，磷酸酶使肌球蛋白去磷酸化而活性恢复，肌球蛋白与肌动蛋白相互作用使收缩环不断缢缩直至细胞质发生分裂。
,,--------------------------------------------------------------经典实验：MPF的发现·----------------------------------------------------…·--、、20世纪60年代进行的核移植与细胞融合实验揭示，若将细胞核转移至处于有丝分裂不同阶段的细胞中，该细胞核会逐渐适应宿主细胞的行为，这说明细胞核的有丝分裂活性是由细胞质调节的。
然而，虽然当时已经推测细胞中存在着能调节细胞核有丝分裂活性的胞质因子，但并没有办法用直接的实验加以证实。
直到20世纪70年代，Y.
Masu]与C.
L M扣·kert通过研究非洲爪蛛卵母细胞减数分裂时胞质因子对细胞核行为的调节作用，才确认了这类胞质因子的存在。
前有实验已经表明，爪蟾卵母细胞的减数分裂阻带在G2期（即笫一次减数分裂的分裂前期），用激素孕酮处理此期的爪瞻卵母细胞，可触发减数分裂的恢复，此过程相当于体细胞从G2期向M期转换。
随后，卵母细胞继续发育并阻带在笫二次减数分裂中期直至受精。
于是Masui与Markert猜测，孕酮和受精在减数分裂过程中的效应均是因为细胞质发生了文化，这些,胞质的变化调节了细胞核的活性。
实验中，他们通过将激素刺激后的卵母细胞的细胞质转移;到未经刺激的卵母细胞中，直接证实了这个假说。
实验证明，经激素处理后卵母细胞中的一种,胞质因子可诱导卵母细胞减数分裂的初始，Masu]与Markert将其命名力成熟促进因子(MPF)。
实验内容
由于爪蟾卵母细胞体积大并且在经过玻璃微量吸管注射后依然能够存活，因此是测验胞:质因子活性独特的、良好的实验体系。
Masui和Marke1t实验的基本步骤是：从经孕酮处理恢复!减数分裂的供体卵母细胞中移出胞质，将其分为不同的份量后分别注入未处理过的受体卵毋,细胞中，以促使其恢复减数分裂。
实验得到的关键结果是：供体卵母细胞经孕酮处理6小时或}更长时间后，移出的胞质庄入受体卵毋细胞中能诱导后者减数分裂恢复；而从未经孕酮处理的;对照组卵母细胞中移出的胞质，则对受体卵母细胞没有影响。
由此可见，经孕酮处理的卵母细!胞中含有一种胞质因子，能诱导未经孕酮处理的受体卵毋细胞恢复减数分裂。
;对照实验，特别是证明了将孕酮直接注入受体卵母细胞中不能诱导减数分裂的实验，排除;了孕酮本身是供体胞质中的减数分裂诱导因子的可能性。
孕酮只在细胞外起作用，说明孕酮:作用于细胞表面受体，进而激活了胞质内的一种特殊因子。
由D.
Smith和R Ecker独立进行的:类似实验也得出了相同的结论。
}有趣的是，在这个实验中孕酮对卵母细胞的作用方式与对其他大多数细胞的作用方式截;然不同。
对于大多数细胞，孕酮是透过细胞膜并与胞内受体结合；但在卵母细胞中，孕酮很明I显是通过作用于细胞表面未激活一种存在于卵叶细胞胞质内的特殊因子的。
由于卵母细胞减:数分裂的恢复通常又称为卵母细胞成熟，所以Masui和Markert将他们新发现的这种减数分裂,调节因子命名为”成熟促进因子”。
发表论文
Masui Y, Markert CL.
Cytoplasmic control of nuclear behavior during meiotic maturation of frog!oocytes, J Exp Zool,1971,177:129-146.
后续影响:在非洲爪蛛卵母细胞中发现MPF后，人们在体细胞中也发现了MPF。
在体细胞有丝分裂;过程中，MPF诱导细胞从G2期向M期转换。
因此，MPF似乎是使有丝分裂和减数分裂进入M期的共同调节剂。
1988年研究者们终于从非洲爪蛛卵母细胞中纯化出MPF，并结合酵母遗传学以及对每胆胚胎的研究，鉴别出了这种关键的细胞周期调节剂。
也就是说，研究发现MPF是由周期蛋白B和Cdk I蛋白激酶组成的二聚体复合物。
进一步的研究确定，周期蛋白B和Cdk i1分别为两类蛋白质大家族中的成员，这两类蛋白质大家族包含了不同的周期蛋白和Cdk I相,:关蛋白激酶，它们在调节细胞周期的其他转换时起类似于MPF的作用。
,MPF在蛙卵母细胞中的发现促使人们了解到一种保守存在于所有真核生物中细胞周期的!:调控元件。
、、、`--·俨~-~-:~-~-------------------------------------------------------------------------------------·----------------------------------------一一一---------一一一·一一一，·'丿（三）细胞周期检测点监控细胞周期的运行个心M循环运转，虽然细胞周期进程不可逆，但如果细胞G1-SG2下顺序性地按细胞周期在正常条件--事件受到影响或干扰时，为确保细胞周期的正确性，可发生细胞周期的所处环境变化，细胞周期正常发生的重要事件及出现的故障加以检测，只有当这些事件完成或故障修复后，保证细胞周期的每个关DNA检测，包括未复制(checkpoint)键环节准确完成后才能进入下个环节，该监控系统即为检测点5)。
13-1DNA损伤检测点（图点、纺锤体组装检测点、染色体分离检测点及。
细胞周期检测点又称细胞周期检测系统，本质是由众多蛋白质分子构成的复杂信号转导网络)实施信号转导，最终由效(conducto一旦捕捉到异常信号，通过转导分子(sesor)该系统中感受分子rn。
细DNA双链断裂，细胞周期终止而细胞发生凋亡如果错误无法纠正，例如核辐射等导致的严重的胞通过严格的细胞周期检测系统，可最大限度地保证遗传稳定性，相反，在失去检测点机制的细胞中，。
发生基因扩增、重排、点突变等几率增高，可导致肿瘤发生DNA基因组高度不稳定，纺锤体组装检测点上CdhlAPC-4..-Sic I Cdcl M~d2化_._cyclinB的多聚泛素上损伤检测点邵DNAi末期dc20APC-C石三匾凹、的气后泛期素化4,isecurn ATi/R进人期心
cl3Ml
A列复杂的监控系统，可对细胞周期胞中存在着一系DNA突变，细暂停乃至终止。
为防止子细胞出现(cell cycle。
细胞周期检测系统首先启动细胞周期阻滞(effector)直接执行细胞周期负性调控应分子)即细胞周期暂停，细胞将不能从一个阶段转向下一个阶段，进而通过应激启动基因表达，合成tarres，修复系统DNA损伤条件触发细胞周期阻滞时，将动员强大的。
例如DNA特定蛋白质，实施故障修复DNA的修复，当故障排除后，细胞周期阻滞解除，细胞周期开启向下一个阶段的运行；但是，实施损伤昙T21
dec
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yeepp
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Cd T||h1未复制DNA检测点在正常的细胞周期中，DNA未发生复制时，细胞不能进入有丝分裂。
未复制DNA检测点的作用主要包括识别未复制DNA并抑制MPF激活。
在裂殖酵母与爪蟾卯细胞提取物中，有两种蛋白激酶在未复制DNA检测点有重要的功能，即ATR与Chkl，它们能阻止未经DNA复制的细胞发生分裂。
在DNA复制进行过程中，ATR在与DNA复制叉结合后被激活，由此引起一系列蛋白激酶级联反应，即：ATR磷酸化激活Chkl激酶，Chkl再磷酸化Cdc25磷酸酶，使其不能去除M期Cdk上抑制其活性的磷酸基，cyclinA/B-Cdk1复合物保待被抑制状态，不能磷酸化启动M期的靶蛋白。
上述活动可待续发生直至所有复制叉上DNA合成全部完成，复制叉解体，由此使得M期必须在DNA合成结束后才能发生。
2纺锤体组装检测点该检测点的作用主要是阻止纺锤体装配不完全或发生错误的中期细胞进入后期，即使细胞中仅有一个染色单体上的动粒未与纺锤体微管正确相连，后期也不能发生。
\,1ai对酵母纺锤体组装检测点突变体的研究证实，Mad2是纺锤体组装检测点作用机制中关键的蛋白质。
在细胞周期进程中，APC所介导的sec urin蛋白的多聚泛素化控制着中期向后期的转化，Mad2对APC的激活因子Cdc20有抑制作用。
在中期染色体上，若有某一动粒未与纺锤体微管相连接，Mad2将结合于该动粒上并短暂激活，与Cdc20附着使其失活，APC活化及securin蛋白的多聚泛素化受阻，染色单体着丝粒间不能分离，由此阻止了细胞进入后期。
一旦染色体上所有的动粒均被动粒微管附着，纺锤体组装完成，Mad2与动粒的结合停止，恢复其无活性状态，Cdc20活性抑制状态被解除，引起APC相继活化及sec urin蛋白的多聚泛素化启动染色单体的分离及细胞向后期的转化。
3染色体分离检测点在细胞周期进程中，末期发生的各种事件及随后的胞质分裂，均需要MPF的失活。
Cdcl4磷酸酶的活化，能促使M期cyclin经多聚泛素化途径被降解，导致MPF活性的丧失，引发细胞转向末期。
染色体分离检测点是通过监测发生分离的子代染色体在后期末细胞中的位置，来决定细胞中是否产生活化的Cdcl4磷酸酶，以促进细胞进入末期，发生胞质分裂，最后退出M期。
该检测点的存在阻止了在子代染色体未正确分离前末期及胞质分裂的发生，保证了子代细胞含有一套完整的染色体。
4. DNA损伤检测点在细胞周期过程中，DNA可能因外界化学及物理因素的影响而被损伤，此时，DNA损伤检测点将阻止细胞周期继续进行，直到DNA损伤被修复。
如果细胞周期被阻在GI或S期，受损的碱基将不能被复制，由此可避免基因组产生突变以及染色体结构的重排。
若细胞周期被阻在化期，可使DNA双链断片得以在细胞进行有丝分裂以前被修复。
在DNA损伤检测点，有三种肿瘤抑制蛋白起着关键的作用，它们是ATM/ATR、C h Kl/2及p53。
当DNA因紫外线或射线的作用出现损伤时，DNA损伤检测点将被激活，在活化蛋白激酶Chk2后，可使磷酸酶Cdc25磷酸化，Cdc25最终经多聚泛素化标记后发生降解；Cdc25失活将导致Cdk2不能活化，由cycl i nE/A-Crlk2介导的跨越G期或S期的进程将不能发生，细胞因此被滞留千G或S期。
活化的ATM/ATR也能通过磷酸化作用，稳定原本在细胞中极不稳定的p53蛋白，使其对某些特异性基因转录的促进能力增强，其中包括编码p21Ci1'的基因，由此产生的p21“可将哺乳动物所有的cyclinCdk的活性抑制，进一步使细胞在DNA修复完成以前，被阻留在G或G2期。
以上四种细胞周期检测点的特点及作用机制总结见表13-4。
检测点类型作用特点与作用相关的主要蛋白质
未复制DNA检测点监控DNA复制，决定细胞是否进入M期ATR、Chk l、Cdc25、cyclin A/B-Cdkl纺锤体组装检测点监控纺锤体组装，决定细胞是否进入后期Mad2、APC、securin染色体分离检测点监控后期末子代染色体在细胞中的位置，决定细Teml、Cdcl4、M期cyclin胞是否进入末期及发生胞质分裂DNA损伤检测点监控DNA损伤的修复，决定细胞周期是否继续ATM/ATR、ChKl/2、p53、Cdc25、进行cyclin El A-Cdk2（四）多种因素与细胞周期调控密切相关1.生长因子生长因子(growth fac t or)是一类由细胞自分泌或旁分泌产生的多肤类物质，在与细胞膜上特异性受体结合后，经信号转换及多级传递，可激活细胞内多种蛋白激酶，促进或抑制细胞周期进程相关的蛋白质表达，由此可参与对细胞周期的调控。
生长因子的作用为细胞周期正常进程所必需。
处于G，早期的细胞，若缺乏生长因子的刺激，将不能向S期转换，进而脱离细胞周期，进入静止状态，成为G。
期细胞。
细胞周期被细胞外信号调控的例子是生长因子对动物细胞增殖的效应。
此外在细胞周期进程中，细胞周期的不同阶段，例如细胞生长、DNA复制和有丝分裂必须是协同的。
能影响细胞增殖及调控细胞周期的生长因子有多种，常见的如：表皮生长因子(epidermal growth,,.
factor, EGF)、血小板衍生生长因子(p l atele t-derived growth factor, PDGF)、转化生长因子(transforminggrowth factor, TGF)、白介素(interleukin, IL)等，这些因子对细胞周期的主要作用阶段均在G,期与S期，可剌激或抑制静止期细胞进入G期或S期。
不同的因子在淜控的具体时段上存在差异，PDGF的调节点一般在G，期以前的G。
向G,期转变过程中。
EGF、IL、TGF-a, TGF-~的调节点则在G,期向S期转换过程中。
一种细胞的细胞周期可受到多种生长因子的调控，而同一种生长因子又可作用于多种类型细胞的增殖过程，并随细胞类型的不同，作用效应也表现出差异。
如TGF-~对细胞增殖是促进还是抑制，取决于所作用的细胞类型，就大多数类型细胞而言，TGF-~在细胞周期中具有抑制细胞分裂的作用，而对少数间质来源的细胞，如成骨细胞，TGF-~却表现为促进细胞分裂。
生长因子对细胞周期的调控效应还与生长因子浓度及其与受体的亲和性相关，当生长因子浓度升高或与受体亲和性增强，对细胞周期的调控作用将得到促进。
2抑素抑素(chalone)是一种由细胞自身分泌的，能抑制细胞周期进程的糖蛋白，通常分布于其发挥作用的特异性组织中。
抑素主要在G，期末及化期对细胞周期产生调节作用，在G，期发挥作用的抑素通常被称为S因子，能阻制G，期细胞进入S期。
在化期起作用的抑素又称为M因子，能抑制G2期细胞向M期的转变。
抑素可通过与细胞膜上特异性受体结合，引起信号的转换及向胞内的传递，进而对细胞周期相关蛋白的表达产生影响，这种调控方式与生长因子的作用极其类似。
抑素对细胞周期的作用具有无毒及可逆的特点，并表现出较强的细胞系特异性，可随细胞类型不同而有所差异，如红细胞、淋巴细胞、肝细胞、表皮细胞等均存在其特异性的抑素。
3.胞内信使cAMP与cGMP均为细胞信号转导过程中重要的胞内信使，在细胞周期中，两者可相互拈抗，控制细胞周期的进程。
cGMP能促进细胞分裂中DNA及组蛋白的合成，cAMP对细胞分裂有负调控作用，其含量降低时，细胞DNA合成及细胞分裂将加速。
细胞中cAMP与cGMP两者数量的平衡，是维持正常细胞周期进程的一个重要因素，cGMP浓度升高常发生于一些恶性肿瘤的细胞中。
4. RNA剪接因子真核细胞基因在表达为蛋白质前，均需经历一个RNA剪接的过程。
两种影响RNA剪接的因子，即剪接因子SR蛋白与SR特异激酶(SR protein-specific kinase, SRPK l)，已被证实与细胞周期调控相关。
第三节细胞周期与医学的关系
—、细胞周期与组织再生
机体内细胞由于各种生理或病理原因而不断死亡，需要新细胞，这一过程即为组织再生。
人体组织细胞每天的细胞更新率约1%～2%。
细胞增殖是组织再生的基础。
生理性再生与干细胞分裂增殖直接有关，常见于正常人体的骨髓、皮肤表皮和肠上皮等组织中，新的细胞也在不断地产生以补充逐渐进入衰老死亡的细胞，藉此维持组织细胞数量的基本恒定，同时使组织处千不断更新的状态。
生理性再生与干细胞分裂增殖直接有关，如造血干细胞在骨髓细胞中所占比例仅为0.25%，但一个造血干细胞经一天分裂后，经分化可形成12种结构与功能不同的血细胞，其中，仅外周血红细胞数量就可达200000个，粒细胞1000个左右。
如果细胞增殖受到抑制，会导致相关疾病，如造血干细胞增殖障碍会导致再生障碍性贫血，生殖细胞增殖障碍引起不育等。
补偿性再生是指机体一些高度分化，一般不发生增殖的组织如肝、肾、骨骼等，在组织损伤后可恢复增殖能力的现象。
补偿性再生形成的机制被认为是损伤刺激了原处于乌期的细胞，使其重新进入了细胞周期进程，恢复细胞分裂，同时细胞周期的进程也加快，所需时间显著缩短，千是在短时期内可产生大量的新生细胞，以促进创伤后组织的修复。
若切除小鼠70％的肝脏，存留的肝细胞24小时后分裂指数可提高近200倍。
因此，在临床治疗中，刺激细胞增殖以增强补偿性再生是治疗创伤等相关疾病的重要策略多使用促使分化细胞重新分裂、增殖的细胞因子、生长因子等以促进创伤组织的修复、愈合治疗，常见有EGF、IL-2、bFGF等，如角膜移植和外科手术后，常用EGF来促进伤口的愈合，而成纤维生长因子则可用千慢性软组织溃疡的治疗。
二、细胞周期异常与肿瘤发生
肿瘤是生物体正常组织细胞过度增殖后形成的赘生物，其产生与细胞周期调控发生异常相关。
了解肿瘤细胞周期的特点，研究其形成的机制，对于临床上肿瘤的诊断及治疗有重要的意义。
（一）肿瘤细胞具有高增殖性肿瘤细胞可以自分泌大量生长因子，摆脱对细胞外生长因子的依赖，以及获得抵御细胞外因子抑制增殖的能力，从而极大程度刺激自我生长及增殖。
肿瘤细胞总体活跃细胞多，使细胞群体数目增加很快，因此表现出肿瘤细胞一般比正常组织细胞增殖快的特点。
肿瘤细胞中也存在少量G。
期细胞，这些细胞可能为肿瘤前体细胞，虽暂不增殖，但在一定条件下可重新进入细胞周期，补充产生新的肿瘤细胞，如在放、化疗治疗下，肿瘤细胞大量死亡，可激发G。
期肿瘤细胞或肿瘤千细胞的增殖、分化，成为肿瘤复发的根源。
肿瘤细胞周期中某些重要调节因子发生异常，正负调节因子间作用失去平衡是导致肿瘤高增殖性的重要原因，其中，原癌基因与抑癌基因的平衡失调是肿瘤无限增殖的重要机制。
原癌基因(proto oncogene)，是细胞内与细胞增殖相关的基因，是维持机体正常生命活动所必需的，在进化上高等保守。
原癌基因包括s rc、ras、S IS、myc、myb等基因家族成员，其产物种类较多，主要可分为生长因子类蛋白、生长因子受体类蛋白、细胞内信号转导相关的蛋白及转录因子类蛋白，参与对细胞周期的调控。
与原癌基因作用相反，抑癌基因为正常细胞所具有的、能抑制细胞恶性增殖的另一类基因。
这类基因编码的蛋白质通常能与转录因子结合或本身即为转录因子，可作为负调控因子，影响细胞周期相关蛋白的合成及DNA复制，进而调控细胞周期的进程。
迄今已有几十种抑癌基因被分离、鉴定，其中Rb、p53、p21、pl6的作用机制研究较为深入。
细胞增殖有赖于原癌基因与抑癌基因的阴阳平衡。
一旦原癌基因过度促进增殖或抑癌基因抑制细胞增殖作用减弱或丧失，此平衡打破，其结果导致细胞增殖失去控制。
原癌基因可发生点突变、基因扩增、重排等基因改变，导致原癌基因转化成为癌基因(o n coge n e)，而癌基因通常因获得新的表达产物而过度刺激细胞增殖。
例如，Ras基因突变构成癌基因，其表达产物Ras蛋白发生构型改变，Ras蛋白和GTP解离减少，由于失去了GTP与GDP的有节制的调节，结合GTP的Ras蛋白呈现持续的活化状态，从而持续地激活磷脂酶C(p hospholipase C)产生第二信使，造成细胞不可控制地增殖。
同样，抑癌基因功能的丧失也是促进肿瘤细胞增殖失控的重要因素。
例如，p53作为重要的抑癌基因，在多个环节发挥重要的抑制细胞增殖的功能。
在约50％的人类肿瘤中，均发现p53基因突变，导致P53蛋白失活。
p53可作为转录因子，促进p21e,p l八!la fl基因转录。
p21(;pl/Wafl为一种CKI，它可抑制Cdk的活性，使Rb蛋白磷酸化受阻，与S期相关的转录因子E2F不能被释放，DNA复制不能进行，细胞无法从G期进入S期。
p53基因也可在细胞周期检测点发挥关键的枢纽作用。
当细胞在DNA损伤条件下，在启动细胞周期阻滞、DNA修复乃至细胞凋亡等多个细胞事件中，P53蛋白均发挥关键的中枢作用，决定细胞转归和命运。
（二）肿瘤细胞周期异常导致基因组高度不稳定性细胞通过严格的细胞周期检测系统，可最大限度地保证遗传稳定性，相反，肿瘤细胞各个周期检测点均可能发生异常，失去检查点机制的细胞中，DNA发生基因扩增、重排、点突变等几率增高，基因组高度不稳定。
肿瘤细胞通常存在染色体异常，包括染色体数目异常及结构异常。
分离纺锤体检测点系统的异常，可导致一些还没有完成纺锤体组装的细胞中发生姐妹染色单体的提前分离。
有丝分裂中纺锤体的一些其他行为的异常也常常伴随肿瘤细胞染色体异常，如动粒的附着、姐妹染色单体的粘连与解离等。
此外，中心体数目的扩增是肿瘤细胞重要的细胞特征之一。
正常细胞1个中心体，在,1,细胞周期S期完成中心体复制后形成2个中心体，能保障纺锤体形成两个分裂极；而超过1个乃至数个中心体的肿瘤细胞，将导致细胞分裂时形成多极分裂极，结果导致染色体无法均等分配到子细胞中。
（三）肿瘤细胞周期特点的研究可能为肿瘤治疗提供新思路阐明肿瘤细胞周期的特点，可为临床上肿瘤的治疗提供理论依据。
化疗是肿瘤治疗中常用的方法。
通过选择一定的化学药物，可有效地干扰肿瘤细胞代谢过程，阻止肿瘤细胞增殖。
化疗中常用的一些药物总结千表13-5。
名称细胞周期中的作用点作用相关机制
放线菌素D G1期、S/G2期抑制DNA聚合酶、D NA解旋酶及组蛋白等的合成；也能抑制rRNA的合成光辉霉素GI期阻止DNA解链，干扰RNA合成阿糖胞啥唗专一作用于S期抑制三磷酸核背还原酶，使脱氧核昔酸形成受阻，进而阻止DNA的合成秋水仙碱特异性地作用于M结合微管蛋白、促使纺锤体微管的解聚；阻止中期染色体向两极的移期动，将有丝分裂阻断在中期氮芬无特异性的作用点与DNA结合使其分子结构改变三、细胞周期与其他医学问题细胞周期的异常与艾滋病相关。
当T细胞受艾滋病病毒感染后，在队向M期转化中有重要作用的C dk l酪氨酸残基将发生过度磷酸化，由此丧失激酶活性，细胞不能向M期转换而滞留于立期，最终发生凋亡。
细胞在衰老时，其细胞周期也呈现某些异常的特征，包括细胞分裂速度明显降低，cycl i nA、B表达下降，cyclinE不稳定性增加，变得更易被降解，使得Rb蛋白不能被磷酸化，与Rb蛋白结合的转录因子不能发挥其相应的作用，细胞被阻留于GI期，而不能进入S期，因此，与正常细胞相比，衰老细胞中GI期可持续更长的时间。
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小结
细胞分裂是细胞重要的生命特征之一。
细胞分裂不仅是单细胞生物个体繁殖的重要方式，也是多细胞生物组织生长及个体形成基础。
真核细胞中存在有丝分裂、减数分裂及无丝分裂三种方式。
有丝分裂是高等真核生物细胞分裂的主要方式，过程较为复杂，染色质凝集、纺锤体及收缩环的形成是三个重要的特征，而蛋白质磷酸化与去磷酸化，是众多形态变化的分子基础。
有丝分裂的结果是遗传物质被平均分配到两个子细胞，由此保证了细胞的遗传稳定性。
减数分裂是发生于配子成熟过程中的一种特殊的有丝分裂，由两次连续的分裂组成，因整个分裂过程中DNA只复制一次，所产生的子细胞中朵色体数目与亲代细胞相比减少一半，这有利于维持有性生殖的生物上下代遗传的稳定性。
笫一次减数分裂过程复杂，同源染色体配对及遗传物质的交换等变化均发生于该次分裂中。
笫二次减数分裂与有丝分裂过程相似。
细胞周期是指细胞从上次分裂结束到下次分裂终了所经历的过程，包括分裂期及间期两个阶段。
分裂期细胞形态变化明显，间期细胞中进行着活跃的蛋白质、核酸等物质的合成。
根据DNA合成的情况，间期可被进一步细分为三个时期，即G1期、S期及G2期。
细胞周期各期主要的动态变化围绕DNA复制或细胞分裂展开，S期为DNA合成期，G1期处于S期与上次分裂期之间，S期DNA复制所需的多种酶与蛋白质在该期合成。
化期是S期与下次分裂期之间的一个时期，为S期向M期的转变提供条件。
细胞周期进程严格受控于细胞中由多种蛋白构成的复杂调控网络。
细胞周期蛋白(cyclin)与细胞周期蛋白依赖激酶(Cdk)是这一调节体系的核心。
cyclin是一类在细胞周期进程中可周期性表达的蛋白质。
Cdk为一类必须与细胞周期蛋白结合，才具激酶活性的蛋白激酶。
Cclk的激酶活性需要在cyclin及磷酸化双重作用下才能被激活。
Cdk的活性也受到Cclk激酶抑制物(CKI)的负性调控。
在细胞周期进程中，周期性表达或消失的不同种类的cyclin与Cclk之间的适时结合，进而通过磷酸化一系列特定的底物，可引发细胞周期进程中特定事件的发生，促成G1期向S期，G2期向M期，中期向后期等关键过程不可逆的转换。
位期晚期由cyclin B-Cclk1形成的复合物，在促进G2期向M期转换的过程中起着关键作用，被称为成熟促进因子(MPF)。
为确保细胞周期的正常进行，梒剧点能对细胞周期发生的重要事件及出现的故障加以监控，包括未复制DNA桧测点、纺锤体组装桧剧点、染色体分离梒剧点及DNA损伤栓测点。
其作用和调控机制与胞内多种蛋白质、酶及cyclin-Cclk复合物等组成的生化路径相关。
细胞周期调控的遗传基础涉及编码多种调节蛋白质及酶的基因，其中，癌基因通过其多样的产物对细胞周期进行调控，而抑癌基因可在转录水平上影呴细胞周期的进程。
细胞周期与医学关系密切，细胞分裂、增殖构成组织再生的基础，细胞周期的异常可导致肿瘤产生。
细胞周期中某些重要调节因子发生异常、癌基因与抑癌基因失衡可导致肿瘤增殖的无限性。
细胞周期桧剧点异常及中心体扩增等导致肿瘤细胞基因组高度不稳定。
了解肿瘤细胞周期的特点有利于肿瘤的临床治疗，帮助确定有效的治疗方法及指导用药。
（杨劲）
第十四章生殖细胞与受精
生殖是生命的基本特征之一。
通过生殖，生命才得以繁衍，并不断适应环境的变化，呈现生命的显示许多精子附着在一个卵细胞的表面染色体为XX)。
精子和卵子的细胞核中储存有双亲的遗传物质拷贝，由于双亲遗传物质中所携带的遗传信息不同，所以，受精后就会增加变异性，从而表现出复杂的遗传现象，扩大了新个体的适应范围。
因此，与无性生殖相比，有性生殖是一种高级生殖方式。
本章主要介绍哺乳类动物的生殖细胞及其受精过程。
第一节生殖细胞的起源与发生—、生殖细胞的起源在哺乳动物，如小鼠受精后，受精卵经卵裂(cleavage)、桑其胚(morula)、毅胚(blastocyst)发育形成具有三胚层的原肠胚(gastrula)。
毅胚由两层不同的细胞构成，分别为上胚层(epiblast)和上胚层内面的内细胞团(inner cell mass)。
在三胚层形成之前，上胚层中的祖细胞(progenitor cell)群区域化，产生原始生殖细胞(primordial ge1m cell,PGC)。
PGC的产生需要产生自内脏内胚层(visceral endoderm)与胚外外胚层(extraemb1-yonic ectoderm)的TGF-13和Wnt等信号转导途径的参与。
产生的PGC迁移到生殖崝(genital ridge)（即未来的性腺）（图14-2)。
在生殖峭处，PGC分化成为生殖干细胞(germ stem cell)。
生殖干细胞提供能用千生殖的配子。
PGC的迁移和增殖受到周围体细胞分泌的许多因子（如PRDMl和PRDM14)的控制。
PGC迁移到生殖峙时，性别决定(sex determination)即开始。
人类性分化大致开始于孕后第6周。
通常认为分化成为卵巢是默认途径，因为XY型生殖帷分化成为睾丸是在SRY(sex-de termining region on the chromosome Y)基因控制下进行的，而XX型生殖崝没有SRY基因，因而发育成卵巢。
一旦PGC迁移到生殖腺崝中，性腺即开始发育，性腺的发育受到体细胞产生的许多转录因子（如GATA4、FOX区、LHX9、WTl、WNT4和SFl)的调控。
324第四篇细胞的基本生命活动
原始生殖细胞
女气'／7.
图14-2原始生殖细胞及其迁移示意图高等动物和人类原始生殖细胞起源于上胚层（即外胚层），然后不断迁移，先是迁移至靠近尿毅基部的卯黄粱背侧内胚层细胞间，后来，以变形运动方式迁移至背肠系膜，之后原始生殖细胞进入初级性索(primary sex cord)，最后定位于中肾内侧和背肠系膜之间由脏壁中胚层形成的生殖腺崝中在哺乳动物，位于胚胎性腺的原始生殖细胞通过有丝分裂增殖并分化为生殖细胞，生殖细胞经历了两种类型的分裂，即有丝分裂和减数分裂，最终分化为成熟的配子（精子和卵子）。
精子和卵子的形成，称为配子发生(gametogenesis)，是指二倍体的生殖细胞发育成单倍体的精子或卯子的过程。
也可分别称为精子发生(spermatogenesis)和卯子发生(oogenesis)。
二、精子的发生
(—)精子由精原细胞发育而来
在胎儿期，睾丸中的生殖细胞并不进入减数分裂，而是停留在G。
/G1期，直到出生后才继续增殖，其中一部分迁移到睾丸的生精小管的基底膜(basement membrane)，并转变为精原细胞(spermatogon ium)或精原干细胞(spermatogonial stem cell)。
精原细胞可以通过有丝分裂增殖，并通过减数分裂产生精细胞(spermatid)。
这些精细胞通过核凝缩、胞质的减少、顶体和鞭毛的形成，而在功能和形态上成为精子。
人类精子的发生开始千青春期，产生于睾丸的生精小管（即曲细精管），然后迁移到附睾中成熟并排出。
生精小管是一种特殊的复层上皮管道，称这种上皮为生精上皮(germinal epithelium或serminiferou s epithelium)。
生精上皮包含两种类型的生发细胞(germinal cell)，一种是形成精子的生精细胞，自生精小管外表面至腔面分别分布精原细胞、初级精母细胞、次级精母细胞、精子细胞和精子；另一种是起支持、免疫、营养及分泌等功能的支持细胞(sertoli cell)，为精子产生所必需。
精原细胞发育为精子的过程称为精子发生，在人类约为64天，其发生过程可分为增殖期、生长期、成熟期和变形期4个时期。
1.增殖期为精原细胞的有丝分裂精原细胞位于基膜上，呈圆形，直径约12µ,m，分化程度较低。
青春期后，精原细胞开始不断增殖，可分为A、B两型。
A别精原细胞不断增殖，一部分保留下来作为干细胞，稳定精原细胞数量和保持活跃的生精能力；另一部分分化为B型精原细胞，可生长分化为精子。
精原细胞细胞核中染色体数目为2倍体(2n)，入精原细胞为46条染色体。
2.生长期的本质是初级精母细胞的形成与发育B型精原细胞体积增大，形成初级精母细胞，其染色体数目仍为2n。
初级精母细胞处于第一次减数分裂期，随着染色质的变化，可分为细线期(leptolene)偶线期(zygoten e)及粗线期(pachytene)精母细胞。
粗线期精母细胞的体积可达到细线期的两倍以上。
第一次减数分裂的时间较长，在入可达22天，分裂后形成次级精母细胞。
3成熟期为精母细胞的减数分裂期初级精母细胞形成后，迅速进入减数分裂I（即第一次分裂），形成2个次级精母细胞(secondary spermatocyte)。
次级精母细胞存在的时间较短，很快完成减数第十四章生殖细胞与受精325分裂lI（即第二次分裂），最终形成4个精细胞。
上述两次分裂，只在第一次分裂中染色体复制一次，而细胞却分裂两次，结果形成的4个精子细胞中染色体数目都减少一半，由2n变为n（参见图146A)。
人的精细胞有23条染色体(n)。
4变形期的本质是精细胞特化为成熟的精子精细胞位千生精小管的近腔面，体积更小，细胞呈圆形（称为圆形精子，round spermatid)，细胞不再分裂，经复杂的变态发育后形成精子(elongating sperma ti d)（图14-3)，其过程如下：(1)顶体形成：精细胞的高尔基复合体经过变化形成一个嵌泡，称为顶体损泡。
顶体痪泡与核膜相粘并增大，变为半球状毅盖于核前面，不断增大呈帽状，套千核前2/3形成顶体(acroso me)。
顶体中含有透明质酸酶、酸性磷酸酶、神经氨酸昔酶及蛋白酶等。
顶体具有类似溶酶体的功能，在受精时顶体释放这些酶，消化卵表面的透明带，形成通道，有助千精子穿过透明带进入卵子细胞内。
(2)中心粒的变化：中心粒移至顶体的对侧，近侧中心粒保留，远侧中心粒形成轴丝，颈部的外面由漏斗状结构包裹，涌斗的扩大部分固着千核的尾端，而另一端则与精子尾部的中段相连。
在轴丝的外侧出现与之平行的9条外周致密纤维，构成主段的纤维鞘。
哺乳类动物的远侧中心粒一般在身部形成后将消失。
(3)线粒体改变：精子细胞的线粒体体积变小并伸长，且迁移到终端，围绕着中央轴丝形成螺旋状排列的线粒体鞘。
线粒体鞘为鞭毛运动提供能量，使精子得以快速运动。
(4)细胞核的特化：精子细胞由圆形变为长形，细胞核变为扁平梨形。
精子生成过程的早期，DNA与组蛋白结合，但是随后大部分精子中的组蛋白被精蛋白(pro tamjne)所取代，使得染色质以一种特殊的方式包装，浓缩形成精子头部。
精蛋白与DNA的结合也抑制了DNA的表达，增加了抗机械损伤的能力。
精子在生成过程中，组蛋白被替代是逐步进行的，首先是睾丸特异的组蛋白变异体取代正常的组蛋白，然后转变蛋白(tran s山on protei n)取代组蛋白变异体。
最后，精蛋白取代了转变蛋白。
受精后，精子中的精蛋白被卵子中的组蛋白重新取代。
精蛋白或转变蛋白的缺陷会导致小鼠精子不育或增加不育性。
鞭毛
轴丝
顶体
细胞核
外层致密纤维
A.纵切而；B中段横切面
326第四篇细胞的基本生命活动
(5)尾部形成：构成尾部全长轴心是轴丝，来自位于细胞核后端的基体(basal body)，由“9+2”排列的微管组成，随细胞变长相应伸长。
细胞质向尾部汇集并脱落，精子细胞从圆形变为蜊斛状精子。
精子包括两个形态与功能不同的区域，即头和鞭毛（头和鞭毛连接处特称为颈部），这些区域均为质膜所包裹。
头部(h ead)含有凝缩的单倍体细胞核，被称为顶体(acrosome)的毅泡所包裂，顶体来自高尔基复合体，含有穿透卵外被的蛋白水解酶；鞭毛(flagellum)区域又可细分为中段、主段和端部。
中段(body)含有中心粒，富含线粒体，中心粒可作为产生鞭毛的基体，而线粒体产生鞭毛运动所需要的能量。
（二）多种因子影响精子的发生
精子发生是一个高度复杂的细胞分化调节过程，受到诸多因素的影响。
一般而言，这些因素可分为外源性的和内源性的。
外源性因素主要包括内分泌、旁分泌和自分泌因子的调控，而内源性因素主要是指生精细胞内基因水平的调控。
1分泌因子的调控支持细胞、睾丸间质(Leydig)细胞、生殖细胞以及周围的其他细胞分泌的因子都参与了精子的发生。
睾丸生成睾酮(testos terone)和精子。
下丘脑和垂体以及睾丸本身所产生的激素调节睾酮和精子的产生。
下丘脑分泌的促性腺素释放因子(gonadotropin-releasing hormone, GnRH)通过垂体刺激促黄体素(luteinizing hormone, LH)和促卵泡激素(follicle stimulating hormone, FSH)的产生，LH通过血液运输到睾丸，并在睾丸处刺激间质细胞产生睾酮（作为雄激素），睾酮也可环化雌激素。
睾酮也可反馈下丘脑和垂体，抑制GnRH等的产生。
雄激素和FSH也可以对支持细胞产生效应，形成最适的精子发生环境。
2基因的调控从分子水平上来看，精子的发生和成熟分化过程是一系列特定基因程序性表达的结果。
近年来发现越来越多的基因参与了精子发生的调控。
参与调控的有转录因子基因、细胞周期相关基因、原癌基因、凋亡及自噬相关基因、热休克蛋白基因、细胞骨架蛋白基因、核蛋白转型相关基因等。
涉及基因的转录凋控、前体RNA剪切及翻译水平的调控、蛋白质的稳定性调控（如泛素化）等。
人类Y染色体上存在一些精子发生所必需的基因，如AZF(azoospermi a factor)DNA序列，可亚分为AZFa、AZFb、AZFc和AZFd四个区域，这四个区域包含至少12个基因。
AZFa区域DNA长度为400-600kb，该区域的缺失导致精子发生阻滞在青春期前阶段，表现为唯支持细胞综合征(Sertoli-cell only syndrome)和小睾丸；AZFb区域DNA长度为l-3Mb，其缺失导致精子发生阻滞在减数分裂前或减数分裂期间；AZFc区域DNA长度为3.5Mb，含有无精子缺失基因(deleted in azoospermia, DAZ)家族。
又如，Piwi蛋白家族通常在睾丸中表达，它们在小鼠稍子形成中起重要作用。
Piwi蛋白家族成员包括MILl,MIWI和MIWI2，任一成员基因的剔除都将通过凋亡的增加而导致生殖细胞的丧失。
MILi在精子发生的早期阶段表达，即从精原细胞的有丝分裂到初级精母细胞减数分裂的粗线期，缺失MILi的小鼠则停止在粗线期；MIWI的表达则要晚一些，从粗线期到圆形精细胞期，基因敲除MIWI的小鼠会导致精子发生停止在圆形精细胞期。
而基因敲除MIWI2的小鼠表现为减数分裂早期的缺陷。
DNA甲基化、miRNA和组蛋白－精蛋白转变对精子的发生也有重要的作用。
例如，生殖细胞的调节基因DAZL在不育精子中甲基化缺陷增加；miR-196和let-7a在不育的精子中表达要高于可育的精子；MTHFR、PAX8、NTF3和SFN等基因启动子处的超甲基化也与精子的浓度、移动性和形态相关；组蛋白精蛋白替换异常可导致精子中染色质凝缩提前、转录停止，甚至不能产生正常的精子。
又如pi RNA(P iwi-interacting RNA)是一类长度为24~32核昔酸的小RNA，这些小RNA只有与Pi wi蛋白家族成员相结合才能发挥它的调控作用。
piRNA主要分布在包括人类等数种动物睾丸的精原细胞内，它们在减数分裂开始时大址积聚，在成熟的精子产物中消失。
研究结果提示，piRNA与Piwi共同作用调控生殖干细胞的自我更新及精子的发育成熟。
其主要机制是Piwi-piRNA复合物引起基因沉默、维持基因组稳定。
新近研究表明，缺少一种粗线期p iRNA(pachytene piwi-interacting RNA)，精子的发育将受阻。
第十四章生殖细胞与受精327
此外，环境因子影响精子的发生。
通常环境因子分为下列类型：雌激素类似物、二氧（杂）芭（二噫英）、邻苯二甲酸盐、多氯化联（二）苯、娠化合物、多环芳经、澳系阻燃剂以及重金属。
这些环境因子存在于土壤、空气和河流，可通过呼吸、身体接触、食品和饮用水进入入体，通过不同的分子机制，对男性的生殖细胞和精子的产生产生不利的影响，导致精子质量和浓度下降。
三、卵子的发生
（一）卵子由卵原细胞发育而来、直至受精后才发育成熟卵原细胞(oogonium)发育为卵子的过程称为卵子发生，一般可分为增殖期、生长期、成熟期三个时期。
1增殖期的特点是有丝分裂和卵原细胞的形成PGC在生殖啃中，经过多次有丝分裂，成为卵原细胞。
卵原细胞通过有丝分裂迅速增殖，在入体中可达到5百万～7百万个细胞，但是其中大部分卵原细胞将会死亡，仅留下约5万个。
2生长期是初级卵母细胞的再发育卵原细胞体积增大并进一步发育成初级卵母细胞(primary oocyte)，在这个时期（通常为哺乳动物出生以前），减数分裂I开始：DNA进行复制，结果是每条染色体由两条姊妹染色单体组成，同源染色体沿其长轴配对，配对的非姊妹染色单体之间发生交换。
此后，初级卵母细胞停留在减数分裂I的分裂前期（前期I的双线期），此期可长达数月（小鼠）或数十年（女性）。
在绝大多数哺乳类动物中，LH可诱导卵细胞的最后成熟。
此后，初级卵母细胞进一步发育，在细胞内积累大量卵黄、RNA和蛋白质等物质，为受精后的发育提供信息、物质和能蜇的准备，其染色体数仍为二倍体(2n)。
雌性生殖细胞是在卵泡(follicle)中发育成熟的。
初级卵母细胞在原始卵泡和生长卵泡内进一步发育。
328第四篇细胞的基本生命活动
及营养物质成分。
卵泡液是由卵泡细胞分泌液和卵泡膜血管渗出液组成的。
随着卵泡液的增多及卯泡腔扩大，卵母细胞居于卵泡的一侧，并与其周匣的颗粒细胞一起突向卵泡腔，形成卯丘(cumulus oophorus)，此时的卵泡称为近成熟卯泡(premature follicle)。
紧贴透明带的一层柱状卵泡细胞呈放射状排列，称放射冠(corona rad iata)；分布在卵泡腔周边的卵泡细胞较小，构成卵泡壁，称为颗粒层(stratum驴·anu losum）。
在卵泡生长过程中，卵泡膜分化为内、外两层。
卯泡的生长主要受LH和FSH的影响。
3.成熟期的标志是次级卵母细胞的形成当卵泡增大至直径约l5~20mm时向卵巢表面突出，即为成熟卵泡(mature folli cle)。
成熟卵泡的卵泡腔很大，颗粒层甚薄，颗粒细胞也不再增殖。
成熟卵泡由卵丘细胞、透明带、卵周腔和卵子细胞组成。
成熟卵泡是卵泡发育的最后阶段，通常是在性成熟时期发生的。
发育成熟的初级卵母细胞在激素的影响下，细胞开始完成减数分裂I，染色体重新凝缩，核被膜裂解，复制的同源染色体在后期1分离，成为两个子细胞核，每个都包含了原有染色体的一半，但是细胞质不对称分裂产生两个在大小上有很大不同的细胞：一个是小的极体(polar body)（即第一极体），另一个是大的次级卯母细胞。
在此阶段，每个染色体仍然是由两个姐妹染色单体构成。
在大多数哺乳类动物中，次级卵母细胞紧接着进入减数分裂II，并被阻断在减数分裂II的中期，只有在受精后才最终完成减数分裂。
人卵巢中的初级卵母细胞大约只有400个能进入成熟期，发育为排卵时停止在减数分裂1I的中期的次级卵母细胞。
排卵(ovulation)是指突出千卵巢表面的成熟卵泡发生破裂，包含有卵丘细胞的卵母细胞随卵泡液排除的过程。
每月有1个卵细胞成熟并被排出。
4次级卵母细胞在受精后完成减数分裂II而形成成熟卵子受精后，次级卵母细胞的姐妹染色单体在减数分裂1I后期分离之后，大的次级卵母细胞的细胞质再次发生不对称分裂产生成熟的卵子和一个小的第二极体。
极体与卵子一样，也是单倍体。
因在卵细胞发育全过程中，细胞质发生了两次不对称分裂，使卵细胞保持了较大的体积。
所形成的三个极体（第一极体仍可分裂为2个极体）体积很小，最终将退化消失（图14-6B)。
发育成熟的卵子细胞具有显著特征：心在其质膜外有一层卯外被(egg coat)，为一种特殊形式的细胞外基质，主要由大量的糖蛋白分子构成。
在哺乳动物卵外被即为透明带；非哺乳动物为卵黄膜。
卵外被可以保护卵细胞免受机械损伤，同时又是受精过程中精子的种属特异性屏障，它只允许物种相近或相同的精子进入卵子细胞。
＠包括哺乳动物在内，许多卵子细胞在其质膜下靠近胞质外侧的区域为皮层(cmtex)，是一层5µm厚的胶状胞质，内含高浓度的肌动蛋白分子和内含特化的分泌艇泡，即皮层颗粒(cortical granule)。
皮层颗粒包含有消化酶、黏多糖、黏性糖蛋白和透明蛋白，当卵子被精子激活时，这些皮层颗粒成分通过胞吐作用(exocytosis)被释放出来，改变卵外被（在哺乳动物为透明带；非哺乳动物为卵黄膜）的性质，以阻止多精入卵。
＠成熟卯了中合成了大量的蛋白质、核糖体，以及tRNA和mRNA等，某些mRNA和蛋白质为指导受精卵发育的形态发生因子(morphogenetic factor),它们通常定位于卵细胞的不同区域，呈极性分布，在卵裂过程中被分离到不同的细胞中去，这些成分在胚胎极性的确定及模式形成中起重要作用。
（二）卵母细胞减数分裂的调控
卵母细胞减数分裂的第一个调控位点在第一次减数分裂双线期。
卵母细胞可以在该期停留很长时间（在人类可以达到50年），其间染色体去凝聚并进行活跃的转录，转录活性升高可表现为卵母细胞体积明显增大。
例如，人卵母细胞在这一时期的直径可达到lOOµm，蛙卵母细胞直径甚至接近1mm。
此期中，细胞生长的同时，卵母细胞蓄积大量RNA和蛋白质等支持胚胎早期发育所需要的物质。
不同物种的卵母细胞重新进入减数分裂和受精的发生过程是不同的。
某些动物的卵母细胞在受精前一直停留在减数分裂I的双线期，在受精后才完成减数分裂。
但是，大多数脊椎动物（包括蛙、鼠和入类）的卵母细胞在受到激素刺激后发生减数分裂的恢复，并在受精前完成第一次减数分裂。
接着，产生的次级卵母细胞在没有重新形成细胞核，染色体也没有去凝聚的情况下进入第二次减数分裂。
然后，大多数脊椎动物卵母细胞又会停滞在减数分裂II中期，并维持在这个时期直到受精。
卵母细胞停止在前期I是由于MPF活性低造成的，恢复减数分裂需要MPF的活化。
MPF由p34cdc2激酶(CDK l或Cdc2)亚基和周期蛋白Bl所构成。
CDKl在G2/M－期转变过程中也是必需的。
几种信号转导途径能确保停止在前期I的卵母细胞中的MPF处千低活性状态，然后再活化MPF重新进入减数分裂。
在卵母细胞停留在前期I时，壁颗粒细胞(mural granulosa cell)产生Nppc,Nppc刺激卵丘颗粒细胞(cumulus granulosa cell)产生鸟昔酸环化酶NPr2,NPr2催化GTP生成cGMP。
cGMP通过Cx37缝隙连接进入卵母细胞，防止了PDE3A在卵母细胞中水解cAMP成为5'－腺昔酸。
cAMP活化PKA,PKA转过来活化WeelB激酶，并抑制Cdc25B磷酸酶，WeelB激酶磷酸化CDKl，导致了CDKl的活化，即MPF的活化。
APC/CCdhl介导周期蛋白Bl(cyclin Bl)连续降解，阻止了MPF在前期I停止的卵母细胞中的活化。
APC/CCdhl(APC/C是一个多亚基的E3泛素连接酶，正向调节蛋白Cdhl是APC/C活化和底物特异性所必需）。
前期I停止的卵母细胞中可被Emil蛋白抑制。
低MPF活性也有利于PPl的活化，PPl可连续地去除减数分裂蛋白的磷酸化（图l4-5A)。
排卵时LH的增加导致了缝隙连接的关闭，阻止了cGMP进入卵母细胞。
从而增加了PDE3A介导的cAMP的水解。
低水平的cAMP和PKA不再活化WeelB和Cdc25B, CDKl去磷酸化并活化。
活化MPF磷酸化并活化PPl，这有利于其他CDKl底物处于磷酸化状态的维持。
MPF可磷酸化核纤层蛋白A，从而使核被膜破裂，继续进行减数分裂（图14-5B)。
A．前期1停止期
__.-GPCRs卵母细胞
颗粒细胞/Gs
三勹r
B.LH增加后
卵母细胞GB,
颗粒细胞卵丘颗粒细胞
四、哺乳动物的精子和卵子在发生上的差异
尽管精子和卵子的发生过程都经历减数分裂，但在大多数哺乳动物，精子和卵子的产生过程有很大不同，主要表现在：心在发生与成熟的时间上不同，例如，在入类女性，卵原细胞仅在胎儿时期增殖，出生以前就进入了减数分裂I期，并且停留在卵母细胞状态，可以持续50多年。
卵细胞按照严格的，儿oij330第四篇细胞的基本生命活动发育程序成熟并定期排卵，基本上从青春期开始第一次排卯，而且排卵后的次级卵母细胞的核仍是二倍的，直到受精后减数分裂才完成；与女性相比，男性精原细胞的减数分裂和精子的形成直到青春期才在睾丸中开始。
＠在形成成熟生殖细胞的数量上不同，精子发生中的减数分裂，细胞为对称分裂，产生四个相同的精子细胞；而卵子发生的减数分裂是不对称的，形成一个卵子和三个极体（图14-6)。
剿BA虏
＠utA累累雯9@
＠原始生殖细胞
原始生殖细胞
进人生殖腺（睾丸）
＠精原细胞
卵原细胞
/勹盓盓笃芦原细胞
森念刘把
森尔刹把
殖原增卵裂的分体丝倍有
二过中通巢胞卵细
＠初级精母细胞
初级卵母细胞第一次减数分裂时
成为停滞在分裂前
森念妃噬
/:分裂II
森{谈蹙森会谈埏
第一极体
0000精细胞
期的初级卵母细胞
人减数分裂I
初级卵母细胞
进一步发育
oc次级妇细胞
被外卵
皮质颗粒
次级卵母细胞
第二极
\\tt分化的精子
减数分裂II成熟的卵子
图14-6精子和卵子发生的比较A精子发生过程模式图；B卵子发生模式图受精(fertilization)是精子与卵子融合形成受精卵的过程。
成熟的精子和发育中的卵子（处千减数分裂I1中期的次级卯母细胞）如果不发生受精，将会在几分钟或数小时内死亡。
受精挽救了精子和卵子，标志着一个新生命的开始。
受精与医学关系极为密切，阐明受精的过程与机制，对解决临床适龄妇女或男性的不育症及无害避孕有重要意义。
—、受精的条件
在哺乳动物和人类，受精一般发生在输卵管壶腹部。
因此，作为受精的条件，除取决于精子和卵第十四章生殖细胞与受精331子（次级卵母细胞）的发育成熟之外，性交后进入雌性生殖管道的精子必须获得活力，即游动与受精的能力。
完成减数分裂变形阶段的精子脱离睾丸的支待细胞，进入曲细精管的管腔中，而后开始迁移，依次通过直细精管、睾网、输出小管进入附睾管和输精管，在附睾尾和输精管内储存、成熟，直至射精。
精子在附睾内受其分泌的甘油磷酸胆碱、内毒碱、唾液酸糖蛋白等作用下，逐渐达到功能上的成熟。
研究发现，哺乳动物的精子进入雌性生殖管道后并不立即受精，而是停留一段时间，以获得对卵子受精的能力，这一过程称为精子的获能(capacitation)。
在人类，精子的获能需要5~6小时。
获能后的精子表现为游动和细胞呼吸能力的增加，它们像卫星一样围绕着卵子细胞游动，其运动力的增加提高了精子与卵子细胞相互作用而接近的概率。
性交后射出的3亿个人精子中，只有200个能够到达输卵管的受精地点。
有证据表明，排卵周酣的卵泡细胞释放化学信号来吸引精子到达卵细胞，但这种化学信号的本质尚不清楚。
精子获能的机制尚未完全阐明。
一般认为它是由射精后精子所处的雌性生殖管道的液体环境所决定的，其获能的本质是：精子因雌性生殖管道的“特殊条件”而被改变。
较多的实验证据表明，在精子进入雌性生殖管道后，先由于某种未知的原因造成精子内部的钾离子外流，引起质膜静息电位发生变化，增加了质膜的不稳定性，致使膜胆固醇脱落，促使雌性生殖管道中的HC03一和Ca2＋进入精子细胞，继而激活了质膜上的腺甘酸环化酶，使精子细胞内cAMP水平升高，通过PKA激活胞内蛋白酪氨酸激酶，促使多种蛋白质产生磷酸化，从而提高了精子的代谢和运动能力，并使细胞膜处千超极化状态。
获能也改变了精子细胞膜的脂质和糖蛋白的组分。
例如，精液中含有唾液酸糖蛋白，并附着在精子头部的外表面，阻止其顶体酶(acrosomal enzyme)的释放；当精子在子宫和输卵管中运动时，该糖蛋白被此处分泌物中唾液酸酶a和B淀粉酶等降解，使精子获得授精能力。
虽然正常悄况下获能在雌性生殖道中发生，但也可用各种实验条件离体诱发，这也是临床上进行人工体外授精得以成功的基础。
运用合适的获能液可以使受精在体外进行，并由此在体外受精中得到了广泛应用。
体外获能的研究也促进了人类对精子获能的认识。
精子的数量和质量是保证受精的条件之一。
一次射精的精液中，精子总数大于4xl07，其中能向前运动的大于50%，精子形态正常的大于30%。
受精虽然只由一个精子和一个卵子完成，但因精子与卵子的接触有一定的随机性，所以需要较多的精子到达输卵管壶腹部，才能在限定时间内有正常精子完成与卵细胞的结合。
二、受精过程
在哺乳动物和入类，性交后，当获能的精子与发育中的卵子（处于减数分裂I1中期的次级卵母细胞）相遇时，将引发系列连锁反应，包括：精子识别卵细胞并诱发顶体反应，精子穿过卵外被抵达卵细胞膜，精－卵质膜融合后精子细胞核等成分进入卵细胞，次级卵母细胞完成减数分裂，皮层反应阻止多精入卵，以及精－卵核融合等事件（图14-7)。
精子与卵子的融合，标志着一个新生命的开始。
（一）精子识别卵细胞并穿过卵外被
1精子－卵子识别诱发顶体反应精子一旦获能，便穿过卵泡细胞层，结合到透明带。
透明带是受精的种属屏障，去除透明带就等于消除了这个屏障。
例如，如果将大鼠卵子的透明带经酶消化去除后，入类的精子就可以使其受精，当然，这样的杂合子受精卵无法继续发育。
哺乳动物卵子的透明带主要由ZPl、ZP2和ZP3这3种糖蛋白质组成，它们均由生长中的卵母细胞产生。
3种ZP蛋白在透明带中的排列不是随机的，ZP2和ZP3聚集成长丝状，而ZPl则将这些长丝交联在一起成为三维的网络结构。
在这三种蛋白中，ZPl仅具有结构功能，而ZP2和ZP3则同时参与配子间的相互作用。
一般认为ZP3是精子与透明带结合的主要受体，可以诱导顶体反应(acrosome reaction);ZP2可作为经过顶体反应的精子的次级受体(secondmy receptor)。
ZP3受体的特异性由其肤链上的O－连接寡糖所决定。
ZP3缺陷会导致雌性小鼠不育。
\n:tl332第四篇细胞的基本生命活动精子与卵细胞透明带上的ZP3受体结合后，将触放射冠发Ca2＋向精子细胞质的内流，进而引发顶体反应，即精子的顶体成分通过胞吐作用被释放出来，所释放的明带多种水解酶可以消化卵子的透明带，以帮助精子穿过卵母细胞透明带；同时顶体反应也把精子中某些能与ZP2结合中期的蛋白质释放到精子的表面，使精子在进入卵子过程中与透明带紧密连接。
在顶体反应期间，与ZP3结合的顶体前端发生胞吐作用，致使精子表面与ZP3结合的配体蛋白随之丢失，精子必须继续与透明带结合才能完成穿透过程，此时是通过顶体内膜上的特殊蛋白与透明带中的ZP2糖蛋白结合而实现的。
这表明，顶体反应后精子与透明带的结合由ZP3转到ZP2,ZP2作为精子的次级受体进一步加固精子与透明带的结合。
顶体反应是一种特殊的细胞胞吐过程。
研究表明，精子中顶体的系列变化自获能的精子接触放射冠皮质反应，卵细胞完成第二次减数分裂时即开始。
获能的精子首先与卵子周围的放射冠接触。
这时精子顶体的前膜即与表面的细胞膜融合，继而破裂形成许多小孔，顶体内含的酶（酸性水解酶）逐渐释放出来。
当精子与透明带上的ZP3受体结合后，导致顶体破裂，内含物完全释放。
在精子接触透明带之前，卵丘细胞分泌的孕酮启动顶体反应，而精子与透明带结合后启动顶体反应的是ZP3。
如此，顶体反应中释放的顶体酶先解离放射冠的卵泡细胞，继而分解透明带，形成一个精子穿过的通道。
2.精子穿过透明带抵达卵细胞膜在卵子的受精过程中，精子以种特异性的方式结合到透明带上，从而完成顶体反应，穿过透明带到达质膜，精子与卵子细胞膜的直接接触，标志受精的开始。
（二）精卵融合1.精－卵质膜融合、精子细胞核等成分进入卵细胞受精开始时，精子头侧面的细胞膜与卵细胞膜融合，随即精子的细胞核和细胞质进入卵内。
扫描显微镜观察发现，卵子细胞膜表面覆盖有许染色体排列千赤道平面，卵裂开始多的微绒毛，精子首先作用于微绒毛顶端的细胞质图14-7哺乳动物受精过程膜，邻近的微绒毛随即迅速地伸长、聚丛，包绕着精子，从而保证精子与卵子紧密结合并发生质膜融合。
当精子质膜与卵子质膜融合时，微绒毛被吸收，精子以头部先入的方式进入卵子细胞质中。
精－卵质膜融合的机制至今尚不清楚。
迄今人们在精子中的ADAM(a disintegrin and metallopro tease)家族成员和卵子细胞膜上的整联蛋白(integrin)在精－卵质膜融合中的作用，进行了较多研究。
研究发现，小鼠精子细胞膜上存在有ADAM家族成员受精素(fertilin)，它是在顶体反应后暴露千精子细胞表面的跨膜蛋白，能够帮助精子结合到卵子质膜并促进精－卵质膜融合。
受精素由两个糖基贫o·1·化的跨膜亚单位a链和B链组成，它们之间以非共价键结合。
受精素的细胞外N－端区域能够同卵子^
0宁
0了。
第十四章生殖细胞与受精333
质膜上的整联蛋白(a6阳）结合，使精子黏附在卯子的表面以便为精－卵融合做准备。
受精素a亚单位的胞外部分含有一个疏水区，它在结构上类似千介导病毒与感染细胞融合的病毒融合蛋白，该区域的人工合成多肤能够诱导试管内的精－卵质膜融合。
也有研究表明，受精素缺失的雄性鼠是不育的，它们的精子同卵子质膜的结合能力比正常的精子低8倍，与卵子融合的能力只有正常的50%。
然而一些体外实验发现，受精素缺失的精子仍然可以使卵子受精，这提示尚存在其他精子蛋白参与到精卵质膜融合过程。
剔除基因lzumo l的小鼠是完全不育的，尽管这些小鼠的精子能够穿过透明带，但是不能与卵子融合形成受精卯，提示lzumol是精－卵融合所必需的。
进一步的实验标明，lzumo突变的精子与活化的卵子融合并不影响合子的发育。
睾丸生殖细胞特异表达的Tssk6(testis-specific serine kinase6)的基因剔除小鼠，其精子不能结合透明带，对lzumol蛋白在精子中的分布也无调节作用。
新近发现，卵细胞膜上的整联蛋白相关蛋白CD9在精－卵质膜融合中起重要作用。
2次级卵母细胞完成减数分裂过程精子进入卵子后，激发次级卵母细胞迅速完成第二次减数分裂，形成一个成熟的卵子和一个第二极体，卵子细胞单倍染色体向中央移行，核膜形成，形成雌原核(female pronucleus)。
精子进入卯后，核膜崩溃，尾部退化消失，细胞染色质解聚，核内精蛋白被组蛋白替换，新形成的原核膜包在染色质外周，形成雄原核(male pronucleus)。
3精卵膜融合后发生皮层反应阻止多精入卵虽然有许多精子可以与卵子结合，但通常只有一个精子能够与卵子的胞膜融合并向卵子细胞质内释放出它的细胞核和其他细胞器。
如果有多余一个的精子与卵子融合，则称为多精入卵(polyspermy)，此时多极或过多的纺锤体形成，将导致细胞分裂时染色体的错误分配、非二倍体细胞的产生以及发育的停滞。
迄今研究表明，有两个调控机制可以确保只有一个精子与卵子结合。
一是卵子与第一个精子融合后将引起卵子质膜的快速去极化，以阻止其他精子与已受精卵子的融合，这是一个快速的早期阻止多精入卵的机制。
但卵子质膜的极性在受精作用后很快恢复正常，因此需要另外一个作用时间长的机制来阻止多精入卵，这就是卵子的皮层反应(cortical reaction)，即卵子通过胞吐作用将其皮质颗粒释放出来，改变卵外被结构。
哺乳动物的研究表明，皮层颗粒中的糖昔酶降解透明带中的ZP3为ZP3f,ZP3f缺少糖基，致使精子膜表面蛋白无法识别；皮层颗粒中的蛋白酶降解ZP2为ZP2f, ZP2f不能与顶体反应精子结合，使多余的精子不能进入，从而阻止多精入卵。
卵子细胞中储存的Ca2•的释放与皮层反应直接相关。
精子与卵子的质膜融合，将激活胞内内质网上存在的Ca2＋通道，引起储存Ca"的释放，导致卵子局部细胞质内游离Ca2＋浓度的增加，并形成钙波(calcium wave)传播到整个卵子，启动皮层反应。
在卵子发生过程中，透明带蛋白是泛素化的。
用泛素蛋白酶体抑制剂处理卵子，可阻止精子进入卵子的透明带，表明去泛素化也可阻止多精入卵。
（三）精卵核融合完成受精过程
卵子一旦受精后即为合子。
只有当两个单倍体的细胞核（雄原核和雌原核）融合在一起，并且它们的染色体“混合”成为一个二倍体的细胞核时，受精过程才算完成。
在哺乳动物，受精卵内的两个原核并不像其他物种那样直接融合，它们彼此接近但是保持距离，这种状态一直持续到合子细胞准备进行第一次有丝分裂（即卵裂）时为止。
此时，在卵子胞质中的微管和微丝作用下，雌原核、雄原核相互靠近，接触处原核膜呈指状，相互交错对插；同时染色体浓缩，原核膜崩解、消失，精－卵染色体组合在一起，形成合子染色体组，定位千纺锤体上。
此时细胞即为受精卵，受精至此完成。
多数动物（包括人类）在受精时，精子为合子提供的不仅仅是DNA，它还提供中心粒（在人类未受精的卵子里不存在）。
精子中心粒伴随着细胞核和尾端进入卵子，并在其周围形成中心体。
在人类，精子中心粒进行复制并且组织合子细胞第一次有丝分裂的纺锤体装配。
这也解释了在多精入卵时为什么有多极现象和多余的纺锤体形成（由于多个精子的中心粒进入卵子）。
受精具有重要意义：心受精使卵子的缓慢代谢转入代谢旺盛期，从而启动细胞不断地分裂；＠精334第四篮细胞的基本生命活动子与卵子的结合，恢复了二倍体，维持物种的稳定性；＠受精决定性别，带有Y染色体的精子与卵子结合发育为男性，带有X染色体的精子与卵子结合则发育为女性；＠受精的染色体来自父母双方，加之生殖细胞在成熟分裂时曾发生染色体联会和片断交换，使遗传物质重新组合，使新个体具有与亲代不完全相同的性状。
三、辅助生殖技术
在临床工作中发现，一些适龄妇女或男性患有不育症，这为患者本人及其家庭带来巨大痛苦。
目前受精过程及其机制的研究成果在临床上的应用，为患者及其家庭带来了福音。
这得益于辅助生殖技术(assisted reproductive technology, ART)。
ART是指应用现代生物医学知识、技术及方法对配子、合子及胚胎进行人工操作，代替人类自然生殖过程中的某些步骤，以达到受孕目的的一项技术，主要包括体外受精、胚胎移植及其衍生技术。
辅助生殖技术的应用不仅从技术上解决了长期困惑医学界的不孕不育难题，也给无数家庭带来了欢乐。
迄今辅助生殖技术已催生出四代试管婴儿：
(1)第一代试管婴儿：1978年，英国学者利用体外受精(in vitro fertilization, IVF)技术，产生了世界上第一例试管婴儿。
体外受精是指分别将卵子与精子取出后，置于试管内使其受精，经过数天的生长后（卵裂期或痰胚期），再将胚胎移植(embryo transfer, ET)到母体子宫内发育成胎儿并分挽的技术，该技术统称为常规IVF-ET，最终分挽的婴儿称为试管婴儿（第一代试管婴儿）。
该成果在2010年获得诺贝尔医学奖。
IVF-ET的适用范围是：心因女性因素所致不孕问题，如各种原因导致的输卵管不通或功能障碍（输卵管切除、输卵管阻塞、盆腔严重粘连及输卵管结扎再通术失败等）；＠男方少、弱精子症；＠不明原因的不育；＠免疫性不孕等。
IVF-ET的受精率只有30%-40%。
(4)第四代试管婴儿：有些女性虽然有排卯功能，但是身体条件不好，或年龄偏大，致使卵子质量不高、活力差、线粒体异常等，不适合使用上述技术。
这时可从新鲜的卵子抽出细胞质，输入另一位健康女性卯细胞质形成一个新的优质卵细胞，将此新的卵子与其丈夫精子结合成受精卯，植入子宫内，妊娠分挽。
此技术称为卵浆置换(exchange of cytoplasmic and nucleus)技术（第四代试管婴儿）。
目前，世界上已普遍开展了精子和胚胎的冷冻和复融技术，而卵子的冷冻和复融成功率较低，正在探索中。
国内现在大部分IVF实验室也相继建立了精子及胚胎冻融技术。
ART有利千解决不孕症，但也引发许多伦理问题，如生育与性行为的分离，传统家庭模式的解体，亲子关系的破裂，代孕母亲的利弊，精子库、卵子库的功过、胚胎的地位、服务分配的公正、辅助生殖技术与领养孤儿的伦理冲突，知情同意和保密，儿童的身心健康，等等。
小．结
生殖是生命的基本特征之一。
生殖分为无性生殖和有性生殖，有性生殖需要配子参与。
哺乳动物中的配子系精子和卵子，精－卵结合形成合子或受精卵，由受精卵发育成新的个体。
配子发生是指二倍体的生殖细胞发育成为单倍体的卵子或精子？
分别称为卵子发生和精子发生。
原始生殖细胞未自上胚层，并迁移至生殖崝，在生殖崝中增殖并分化为生殖干细胞，同时开始生物的性别决定。
原始生殖细胞的迁移和增殖受到许多因子的调控。
卵原细胞发育为卵子的过程一般可分为增殖期、生长期、成熟期三个时期，经过一系列变化特别是减数分裂过程，由二倍体的卵原细胞转变为单倍体的卵子。
精原细胞发育为精子的过程与此类似，但是形态差异极大。
Cdkl/cyclin B复合体及细胞静止因子在卵母细胞分裂调控中起重要作用；精子的发生受多种基因调控，如AZF、P皿及piRNA等。
受精过程一般可分为三个主要步骤，笫一步是荻能的精子与卵子细胞外被（如透明带）的识别与结合，笫二步是通过顶体反应穿过卵被，笫三步是精子与卵子质膜的结合和融合。
受精过程涉及许多基因编码的蛋白的作用，如ZPl~3、生育素(Fertilin)、整联蛋白(a6但）及整联蛋白相关蛋白CD9等。
辅助生殖技术(ART)是指应用现代生物医学知识、技术及方法对配子、合子及胚胎进行人工操作，代替人类自然生殖过程中的某些步骤，以达到受孕目的的一项技术，主要包括体外受精、胚胎移植及其衍生技术。
ART在治疗不育等方面起着越来越重要的作用，但同时也带来了新的技术挑战和伦理问题。
（范礼斌）
第十五章细胞分化
脊椎动物和人体由约200多种不同类型的细胞组成，如神经元伸出长的突起，并在末端以突触方式与其他细胞接触，具有传导神经冲动的功能；肌细胞呈梭形，含有肌动蛋白和肌球蛋白，具有收缩功能；红细胞呈双凹面的圆盘状，能够合成携带氧气的血红蛋白；胰岛细胞则合成调节血糖浓度的胰岛素，等等。
这些由单个受精卵产生的细胞，在形态结构、生化组成和功能等方面均有明显的差异，形成这种稳定性差异的过程称为细胞分化(cell differentiation)。
由一个受精卵来源的细胞为什么会变得如此多样与不同？
一直是数百年来许多生命科学家付出毕生精力而至今尚未完全解决的课题。
细胞分化是个体发育的核心事件。
阐明细胞分化的机制，对于认识个体发育的机制和寻找新的疾病防治措施具有重要意义。
第一节细胞分化的基本概念—、多细胞生物个体发育过程与细胞分化潜能细胞分化是个体发育过程中细胞在结构和功能上发生差异的过程。
多细胞生物的个体发育一般包括胚胎发育和胚后发育两个阶段，前者包括卵裂、翍胚、原肠胚、神经轴胚期及器官发生等阶段，衍生出与亲代相似的幼小个体；后者则是幼体从卵膜孵化出或从母体分挽以后，经幼年、成年、老年直至衰老、死亡的过程。
细胞分化贯穿千个体发育的全过程，其中胚胎期最明显。
（－）动物和入类胚胎的三胚层代表不同类型细胞的分化去向卵细胞在受精后立刻进入反复的有丝分裂阶段，这一快速的分裂时期称为卵裂(cleavage)。
动物早期胚胎发育中受精卵经过卵裂被分割成许多小细胞，这些小细胞组成的中空球形体被称为埏胚(blastula）。
翍胚形成后，便进入原肠形成(gastrulation)期。
原肠胚期之前，细胞间并无可识别的明显差异。
在原肠胚期，产生了内、中、外三个胚层，它们具有不同的发育和分化去向：内胚层(endoderm)将发育为消化道及其附属器官、唾液腺、胰腺、肝脏以及肺等的上皮成分；中胚层(mesoderm)将发育成骨骼、肌肉、纤维组织和真皮，以及心血管系统和泌尿系统；外胚层(ectoderm)则形成神经系统、表皮及其附属物（图15-1)。
受稍卵
原肠胚
表皮经元细胞细胞肌肉细胞
第十五章细胞分化337
（二）细胞分化的潜能随个体发育进程逐渐“缩窄＇，随着个体发育进程，来源于单一受精卯的细胞逐渐产生出形态结构、功能和生化特征各不相同的细胞类群，其结果在空间上细胞产生差异，在时间上同一细胞和从前的状态有所不同。
研究表明，两栖类动物在裳胚形成之前的卵裂球细胞、哺乳动物桑甚胚的8细胞期之前的细胞和其受精卵一样，均能在一定条件下分化发育成为完整的个体。
通常将具有这种特性的细胞称为全能性细胞(totipotent cell)。
在三胚层形成后，由于细胞所处的空间位置和微环境的差异，细胞的分化潜能受到限制，各胚层细胞只能向本胚层组织和器官的方向分化发育，而成为多能细胞(pluripotent cell)。
经过器官发生(organogenesis)，各种组织细胞的命运最终确定，呈单能(unipotency)化。
这种在胚胎发育过程中，细胞逐渐由“全能”到“多能”，最后向“单能”的趋向，是细胞分化的一般规律。
近些年从襄胚内细胞团(inner cell mass, ICM)中分离到的胚胎干细胞(embryonic stem cell, ES细胞），它们具有分化成熟为个体中所有细胞类型的能力，但不能分化为胎盘和其他一些发育时所需的胚外组织，这种早期胚胎细胞被称为多能干细胞(pluripotent stem cell, multipotential stem cell)。
因此，从干细胞角度看细胞分化，细胞呈现出由“全能干细胞”到“多能干细胞＂，最后向“定向干细胞”和“前体细胞＂的趋向（图15-2)。
多潜能细胞Q：多潜能干细胞
定向干细胞
亡前体细胞八
外胚层中胚层内胚层
勺？
分化细胞
图15-2细胞分化潜能逐渐缩窄示意图A细胞分化的过程犹如从山顶到谷底的飞流直下的瀑布；B细胞分化的节点或路径应当指出的是，大多数植物和少数低等动物（如水螅）的体细胞仍具有全能性；而在高等动物和人类，至成体期，除一些组织器官保留了部分微分化的组织干细胞之外，其余均为终末分化细胞。
（三）终末分化细胞的细胞核具有全能性
动物受精卵子代细胞的全能性随其发育过程逐渐受到限制而变窄，即由全能性细胞转化为多能和单能干细胞，直至分化为终末细胞。
但在细胞核则完全不同，终末分化细胞的细胞核仍然具有全能性，谓之全能性细胞核(totipotent nucleus)。
20世纪60年代初期，用非洲爪赡为材料，进行的核移植实验首次证明了终末分化细胞的细胞核具有全能性（见本章经典实验和图15-3)。
1997年，英国爱丁堡Roslin研究所工作人员将成年绵羊乳腺上皮细胞的细胞核移植到另一只羊的去核卵细胞中，成功地克隆出世界上第一只哺乳动物一一“多莉"(Dolly)羊（见：第十八章，图18-7)。
继之，世界上有多个实验室培育出包括非人灵长类动物称猴在内的多种体细胞克隆动物。
这些实验结果表明，已特化的体细胞的细胞核仍保留形成正常个体的全套基因，具有发育成一个有机体的潜能。
338第四篇细胞的基本生命活动
未受精的卵（含2个核仁）蜊料（含1个核仁）
二、细胞决定与细胞分化_＿＿
圈一～亡(—)细胞决定先千细胞分化并制约着将肠上皮细胞核分化的方向移植到去核的卵在个体发育过程中，细胞在发生可识别的分化特征之前就已经确定了未来的发育命肠上皮细胞核运，只能向特定方向分化的状态，称之为细胞去核的宿主卵细胞决定(cell determination)。
在原肠期的内、中、外三胚层形成时，虽然在形态上看不出有23什么差异，但此时形成各器官的预定区已经确定，每个预定区决定了它只能按一定的规律发育分化成特定的组织、器官和系统。
埏胚痪胚埏胚不分裂细胞决定可通过胚胎移植实验(grafting4experime nt)予以证明。
例如在两栖类胚胎，如果将原肠胚早期预定发育为表皮的细胞i配_（供体）移植到另一个胚胎（受体）预定发育蜊斜i为脑组织的区域，供体表皮细胞在受体胚胎蜊料（死亡）中将发育成脑组织，而到原肠胚晚期阶段移异常胚胎植时则仍将发育成表皮。
这表明，在两栖类的早期原肠胚和晚期原肠胚之间的某个时期便开始了细胞决定，一旦决定之后，即使外界的因素不复存在，细胞仍然按照巳经决定的图15-3爪蟾细胞核移植实验证明了已分化细胞的细胞核具有全能性命运进行分化（图15-4)。
细胞的分化去向源于细胞决定，是什么因素决定了胚胎细胞的分化方向？
迄今尚不清楚。
现有研究资料提示，有两种因素在细胞决定中起重要作用：一是卵细胞的极性与早期胚胎细胞的不对称分裂，二是发育早期胚胎细胞所处的位置差异及胚胎细胞间的相互作用。
细胞的不对称分裂是指存在于核酸蛋白颗粒(RNP)中的转录因子mRNA在细胞质中的分布是不均等的，当细胞分裂时，这些决定因素(mRNA)被不均匀地分配到两个子细胞中，结果造成两个子细胞命运的差异。
（二）细胞决定具有遗传稳定性细胞决定表现出遗传稳定性，典型的例子是果蝇成虫盘细胞的移植实验。
成虫盘是幼虫体内已在明显分化之前。
宿主＼宿主＼
在明显分化之后
第十五章细胞分化339
决定的尚未分化的细胞团，在幼虫发育的变态期之后，不同的成虫盘可以逐渐发育为果蝇的腿、翅、触角等成体结构。
如果将成虫盘的部分细胞移植到一个成体果蝇腹腔内，成虫盘可以不断增殖并一直保待于未分化状态，即使在果蝇腹腔中移植多次、经历1800代之后再移植到幼虫体内，被移植的成虫盘细胞在幼虫变态时，仍能发育成相应的成体结构。
这说明果蝇成虫盘细胞的决定状态是非常稳定并可遗传的。
人们在认识到细胞决定的稳定性和可遗传性的同时，也开始探索细胞决定的可逆性。
在果蝇研究中发现，有时某种培养的成虫盘细胞会出现不按已决定的分化类型发育，而是生长出不是相应的成体结构，发生了转决定(transdetermination)。
探讨转决定的发生机制对了解胚胎细胞命运的决定具有重要意义。
细胞命运的决定机制一直是细胞分化研究的重要课题。
近年来有关细胞命运决定的主要研究策略：一是利用模式生物，分析选择性干预（如基因敲除）早期胚胎中某个基因的表达对内、中、外三胚层形成的影响；二是基于ES细胞，寻找决定ES细胞向三胚层细胞分化的决定因子。
三、细胞分化的可塑性
一般地，细胞分化具有高度的稳定性。
细胞分化的稳定性(s tab山ty)是指在正常生理条件下，已经分化为某种特异的、稳定类型的细胞一般不可能逆转到未分化状态或者成为其他类型的分化细胞。
例如，神经元在整个生命过程中都保持着特定的分化状态。
已分化的终末细胞在形态结构和功能上保持稳定是个体生命活动的基础。
细胞分化的稳定性还表现在离体培养的细胞，例如，一个离体培养的皮肤上皮细胞保持为上皮而不转变为其他类型的细胞；黑色素细胞在体外培养30多代后仍能合成黑色素。
然而，在特定条件下细胞分化又表现出一定的可塑性。
细胞分化的可塑性(plasti c i ty)是指巳分化的细胞在特殊条件下重新进入未分化状态或转分化为另一种类型细胞的现象。
细胞分化的可塑性是目前生物医学研究的热点领域。
（一）已分化的细胞可发生去分化
一般情况下，细胞分化过程是不可逆的。
然而在某些条件下，分化了的细胞也不稳定，其基因活动模式也可发生可逆性的变化，而又回到未分化状态，这一变化过程称为去分化(dedifferentiation)。
高度分化的植物细胞可失去分化特性，重新进入未分化状态，成为能够发育分化为一株完整植物的全能性细胞，这可以在实验室的培养条件下达到，也可以在营养体繁殖过程中出现。
在动物和人类，体细胞部分去分化的例子较多（如蛛螺肢体再生时形成的胚芽细胞及人类的各种肿瘤细胞等），但体细胞通常难以完全去分化而成为全能性细胞。
目前，尽管入们对生物个体中发生去分化现象机制的认识不清，但近些年干细胞领域研究的进步，已能通过人为手段成功地将分化成熟细胞逆转为未分化细胞，此即细胞重编程(cellular reprogramming)。
前面讲到的基于体细胞核移植技术进行的动物克隆实验就是细胞重编程的例子。
然而细胞重编程概念的真正形成和发展，源于2006年日本科学家S.
Yamanaka（山中伸弥）等入的工作。
山中伸弥借助逆转录病毒载体，将四个转录因子(Oct3/4、Sox2、c-Myc、Klf4)基因导入小鼠皮肤成纤维细胞(fibroblast)中，可以使来自胚胎小鼠或成年小鼠的成纤维细胞获得类似胚胎干细胞(emb1-yonic stem cell)的多能性。
一般将通过这种方法获得的多能性细胞称为诱导多能干细胞(induced pluripotent stem cells, iPS细胞）（详见第十七、十八章）。
继山中伸弥的工作之后，有关基于基因转移技术的细胞重编程研究成果层出不穷。
应用细胞重编程技术直接将体细胞（成纤维细胞）转变为组织干细胞如造血干细胞、神经干细胞及肝干细胞等也是近年来的热点领域。
此外，在细胞重编程策略研究上，许多研究者也寄希望绕开基因转移步骤，试图寻找能够启动细胞发生重编程的小分子化合物。
（二）特定条件下已分化的细胞可转分化为另一种类型细胞在高度分化的动物细胞中还可见到另一种现象，即从一种分化状态转变为另一种分化状态这种吐{t}340第四篇细胞的基本生命活动情况称为转分化(transdifferentiation)。
细胞通过转分化能形成一种发育相关的细胞类型。
典型的例子可见于肾上腺的嗜辂细胞。
体积较小的嗜铭细胞源千神经峙并且分泌肾上腺素入血。
在培养条件下，加入糖皮质激素可以维持嗜铭细胞的表型，但是当去除肖体激素并在培养基中加入神经生长因子之后，嗜铅细胞转分化成交感神经元，这些神经元比嗜铭细胞大，带有树突样和轴突样突起，并且分泌去甲肾上腺素而非肾上腺素（图15-5)。
另一个转分化的例子是，如果把鸡胚视网膜色素上皮细胞置于特定培养条件下，细胞色素则渐渐消失并且细胞开始呈现晶体细胞的结构特征，并产生晶体特异性蛋白一晶体蛋白。
上面的两个例子，通过转分化生成了一种发育相关的细胞类型：交感神经元和嗜铭细胞均来源于神经啃；色素细胞和晶体细胞均来源千外胚层并且涉及眼的发育。
转分化为交感神经元肾上腺嗜铭细胞
从培养基中去除
糖皮质激素并加
入神经生长因子
肾上腺素—_＿＼》.＇，）辜｀，去甲肾上腺素通过转分化形成不同发育类型细胞的例子也较常见。
例如，水母横纹肌可由一种细胞类型连续转分化成两种不同类型的细胞。
离体的横纹肌与其相关的细胞外基质共同培养时，可以保持横纹肌的状态。
在用能降解细胞外基质的酶处理培养组织之后，细胞将形成一个聚合体，其中有些细胞在l~2天内转分化为平滑肌细胞，继续培养时，可形成第二种类型的细胞一神经元。
另一些例子是：经生肌蛋白(myogen i n)基因MyoD转染的成纤维细胞或脂肪细胞可转分化为成肌细胞；生命周期较长的神经元，一且分化就不再分裂，且分化状态稳定许多年，但近些年研究发现，在特定条件下可转变为血细胞和脂肪细胞。
必须指出的是，无论是动物还是植物，细胞分化的稳定性是普遍存在的，可以认为分化具有单向性、序列性和终末性（一般情况下都会到达分化的目标终点，成为终末分化细胞），而去分化是逆向运动，转分化是转序列运动。
发生细胞的转分化或去分化是有条件的：心细胞核必须处于有利于分化逆转环境中立）分化能力的逆转必须具有相应的遗传物质基础。
通常情况下，细胞分化的逆转易发生于具有增殖能力的组织中。
四、细胞分化的时空性
在个体发育过程中，多细胞生物细胞既有时间上的分化，也有空间上的分化。
一个细胞在不同的发育阶段可以有不同的形态结构和功能，即时间上的分化；同一种细胞的后代，由于每种细胞所处的空间位置不同，其环境也不一样，可以有不同的形态和功能，即空间上的分化。
在高等动植物个体胚胎发育过程中，随着细胞数目的不断增加，细胞的分化程度越来越复杂，细胞间的差异也越来越大；同一个体的细胞由于所处的空间位置不同而确定了细胞的发育命运，出现头与尾、背与腹等不同。
这些时空差异为形成功能各异的多种组织和器官提供了基础。
五、细胞分裂与细胞分化
细胞分裂和细胞分化是多细胞生物个体发育过程中的两个重要事件，两者之间有密切的联系。
彷叮1通常细胞在增殖（细胞分裂）的基础上进行分化，而早期胚胎细胞的不对称分裂所引起的细胞质中转录因子的差异制约着细胞的分化方向和进程。
细胞分化发生千细胞分裂的GI期，在早期胚胎发育阶段特别是卵裂过程中，细胞快速分裂，GI期很短或几乎没有GI期，此时细胞分化减慢。
细胞分裂旺盛时分化变缓，分化较高时分裂速度减慢是个体生长发育的一般规律。
例如哺乳动物的表皮角化层细胞等终末细胞分化程度较高，分裂频率明显减慢，而高度分化的细胞，如神经元和心肌细胞则很少分裂或完全失去分裂能力。
第二节细胞分化的分子基础一、基因组的活动模式（一）基因的选择性表达是细胞分化的普遍规律细胞分化的实质是细胞的特化，即分化的细胞表达特异性蛋白（保持特化特征）。
人们在认识细胞分化机制中，曾根据少数分化细胞的染色体丢失现象而错误地认为细胞分化的本质是源于遗传信息的丢失或突变。
后来大量的实验证明，细胞分化过程中一般并不伴有基因组的改变。
比较著名的实验，如体细胞核移植实验，即将动物体细胞的核移植到去核的卵细胞或受精卵的细胞质中，然后观察重组的卵细胞（有新的细胞核）是否能够发育成为成体，如此相继克隆出爪蟾、多莉羊等动物，证明了细胞分化并不是由于基因丢失或永久性地失去活性造成的，维持发育所需要的基因并没有发生不可逆的改变，当体细胞核暴露于卵细胞质中之后，它的作用就如同一个受精卵的细胞核基因一样。
此外，细胞转分化现象的发现，以及细胞融合实验等也表明细胞分化过程中一般不发生基因组的改变。
'，＿－-－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－-－－－---－--－－－－－－－一经典实验：细胞核移植与细胞分化机制研究}研完背景:细胞分化的本质和规律一直是细胞生物学家和发育生物学家关注的的重要研究领域。
在:早期研究中，细胞分化过程中是否伴随基因组的改变一直困扰着生物学家，特别是在果蝇的一些细胞中观察到基因组的扩增，在马蛔虫发育过程中发现染色体的不断丢失；同时在早期胚胎细胞的全能性研究中，因实验条件的限制，所荻得的实验结果也各异。
这就要求生命科学工作者回答，细胞分化的本质是什么，已分化细胞的细胞核是否具有全能性。
1938年，诺贝尔奖荻得者H.
Spemann在他所著的《胚胎发育和诱导》一书中，提出了一个设想性方案：将一个分化了的细胞核导入到去核的卵细胞中，然后观察其发育情况。
但这类工作直到14年之后才开始进行。
1952至1962年间，R.
Briggs、T.
King和J.
Gurdon等开展了细胞核移植实验。
Gurdon成功地克隆出了成体爪榜。
实验内谷
为证明细胞分化过程中是否伴随遗传信息（基因）的不可逆变化，在20世纪60年代初期，Gurd on用非洲爪浇为材朴，进行了著名的细胞核移植实验。
他从一种突变型蜊蚌（细胞核中只有1个核仁）的肠上皮细胞中取出细胞核，将其移植到事先用紫外线照射的胞核有2个核仁的野生型爪蟾的未受精卵中（紫外线照射破坏了野生型未受精卵中的细胞核），这种含有肠上皮细胞核的受精卵有的能发育成棠胚，其中有少数可发育成蜊蚌和成体爪榜，成体爪榜中的细胞核均含一个核仁。
该实验结果表明，已分化的肠上皮细胞核中仍然保持着能分化出成体爪榜各种组织细胞的全部基因（见图15-3)。
发表论文
Gurdon J.
The developmental capacity of nuclei taken from intestinal epithelial cells of feeding tadpoles.
J Ernbryol Exp Morphol,1962,10:622-640342第四脯细胞的基本生命活动Gurdon最初的想法是研究分化成熟细胞的细胞核是否伴随基因组的改变，却意外地克隆了蛙。
他的实验不仅为细胞分化的本质和规律提供了有力证据，而且为动物克隆(animal clone)研究提供了完整的技术路线。
1997年，英国爱丁堡Roslin研究所的Wilmut和其同事将成年绵羊的乳腺上皮细胞的细胞核移植到另一只羊的去核的卵细胞中，成功地克隆出世界上笫一只哺乳动物一“多莉"(Dolly)羊。
随后，一系列克隆动物如克隆牛、克隆狗及非人灵长类动物克隆猴等也相继问世。
这些克隆性动物研究进展，给人类难治性疾病的治疗和器官移植材料的来源带来了期盼，一种以疾病治疗为目的的人类治疗性克隆研究在不断的伦理争吵声中逐步迈向医学科学殿堂。
Gurdon被视为动物克隆的先驱，其研究结果也在一定程度上催生了“细胞重编程”领域的形成与发展，该领域的标志性成果是日本学者S.
Yamanaka构建的iPS细胞。
Gu rdon与Yamanaka共同荻得了2012年诺贝尔生理学或医学奖。
已如上述，细胞分化不伴随基因组的改变，那么基因组的活动模式是什么？
大量研究表明，多细胞生物个体发育与细胞分化过程中，其基因组DNA并不全部表达，而呈现选择性表达，即它们按照一定的时空顺序，在不同细胞和同一细胞的不同发育阶段发生差异表达(d iffere ntial expressi on)。
这就导致了所谓的奢侈蛋白(luxury protein)即细胞特异性蛋白质的产生，如红细胞中的血红蛋白、皮肤表皮细胞中的角蛋白、肌细胞的肌动蛋白和肌球蛋白等。
编码奢侈蛋白的基因称奢侈基因(luxury gene)，又称”组织特异性基因(tissue-specific gene)”，是特定类型细胞中为其执行特定功能蛋白质编码的基因。
不同奢侈基因的选择性表达赋予了分化细胞的不同特征。
当然，一个分化细胞的基因表达产物不仅仅是奢侈蛋白，也包含由持家基因表达的持家蛋白。
持家基因(house-keeping gene)，也被称为管家基因，是生物体各类细胞中都表达，为维持细胞存活和生长所必需的蛋白质编码的基因，如细胞骨架蛋白、染色质的组蛋白、核糖体蛋白、以及参与能矗代谢的糖酵解酶类的编码基因等。
一些简单的实验便可证明细胞分化的本质。
例如，鸡的输卵管细胞合成卵清蛋白，胰岛细胞合成胰岛素，成红细胞合成B－珠蛋白，这些细胞都是在个体发育过程中逐渐产生的。
用相应的基因制作探针，对三种细胞总的DNA的限制性酶切片段进行Southern杂交实验。
结果显示，上述三种细胞的基因组DNA中均存在卵清蛋白基因、胰岛素基因和B－珠蛋白基因。
然而用同样的三种基因片段作探针，对这三种细胞中提取的总RNA进行Northern杂交实验，结果表明，输卵管细胞中只有卵清蛋白mRNA,胰岛素细胞只有胰岛素mRNA，成红细胞只有B－珠蛋白mRNA。
因此，细胞分化的本质是基因的选择性表达，一些基因处于活化状态，同时另一些基因被抑制而不活化。
（二）基因组改变是细胞分化的特例
早期的研究显示，一些分化的细胞例如果蝇的卵巢滤泡细胞，在其分化过程中基因组发生了量的变化，表现为特定基因的选择性扩增；在果蝇的其他一些细胞，像卵巢滋养细胞、唾液腺细胞和马尔皮基氏管细胞的发育过程中，还呈现出基因组扩增现象，染色体(DNA)多次复制，形成多倍体(polypl o id)和多线体(polyteny)。
与上述情况相反，一些细胞在分化过程中则发生遗传物质（染色质或染色体）的丢失。
典型的例子是来源于对马蛔虫(Ascaris equorum)发育过程的研究。
在马蛔虫个体发育中，只有生殖细胞得到了完整染色体，而体细胞中的染色体只是部分染色体片段，其余的染色体丢失了。
在其他的一些例子中，还可观察到完整的染色体或完整的核丢失。
例如在摇蚊发育中，许多体细胞丢失了最初40条染色体中的38条；而哺乳动物（除骆驼外）的红细胞以及皮肤、羽毛和毛发的角化细胞则丢失了完整的核。
在脊椎动物和人类免疫细胞发育研究中发现，执行抗体分泌功能的B淋巴细胞分化的本质是由于编码抗体分子的基因发生了重排。
在B淋巴细胞分化期间，胚细胞DNA通过体重组(somatic recombination)，使DNA序列中不同部位的部分基因片段连接在一起，组成产生抗体mRNA的DNA序列，从而产生多种多样的抗体分子。
基于以上事例，人们对细胞分化的机制曾提出过一些假说，如基因扩增、DNA重排和染色体丢失等。
但这些现象并不是细胞分化的普遍规律。
二、胞质中的细胞分化决定因子与传递方式
(—)母体效应基因产物的极性分布决定了细胞分化与发育的初始命运一些研究提示，成熟的卵细胞中储存有20000~50000种RNA，其中大部分为mRNA。
这些mRNA直到受母源bicoid mRNA精后才被翻译为蛋白质。
其中部分mRNA在卵质中的分布不均，如爪蟾未受精卵中，有些mRNA特异地分布于动p物极，有些则分布在植物极，它们在细胞初始发育命运的决定中起重要作用。
通常将这些在卵质中呈极性分布、在受精后被翻译为在胚胎发育中起重要作用的转录因子和翻译调节蛋白的mRNA分子称为母体因子。
编码母体因BICOID蛋白子的基因谓之母体效应基因(maternal effect gene)，也称“母体基因(maternal gene)，即在卵子发生过程中表达，表p达产物（母体因子）存留千卵子中，受精后通过这些母体因子影响胚胎发育的基因。
在果蝇中，母体效应基因得到了比较深入的研究。
果蝇和一般的脊椎动物有所不同，其母体效应基因预先决定了子代未来的相互垂直的前～后轴和背－腹轴。
例如果蝇bicoid基因的mRNA，在未受精时，它定位千卵母细胞的一端，即将来发育为胚胎的前端。
受精后加oid mRNA被翻译为蛋白质，因有限的扩散，建立了BICOID I A p蛋白梯度：BICOID蛋白沿胚胎前－后轴呈浓度梯度分布，越靠近胚胎的前端，其浓度越高（图15-6)。
BICOID蛋图15-6受精前后bicoid基因mRNA白含有一个螺旋－转角－螺旋结构域(helix-turn-helix do及其翻译蛋白的浓度梯度分布果蝇胚胎的核酸原位杂交（上图）和免疫main)，它与卯前部区域的胚胎细胞核染色质DNA结合组化（中图）照片；下图为受精前后浓度（果蝇的早期胚胎为多个细胞核共存于一个细胞质中的梯度分布示意图（A：前端；P：后端）合胞体），高浓度的BICOID蛋白启动了头部发育的特异性基因的表达，而低浓度的BICOID蛋白则与形成胸部的特异性基因表达有关。
（二）胚胎细胞分裂时胞质的不均等分配影响细胞的分化命运在胚胎早期发育过程中，细胞质成分是不均质的，胞质中某些成分的分布有区域性。
当细胞分裂时，细胞质成分被不均等地分配到子细胞中，这种不均一性胞质成分可以调控细胞核基因的表达，在一定程度上决定细胞的早期分化。
例如在果蝇感觉器官的发育过程中，细胞命运的决定物之一是numb基因编码的转录因子。
该转录因子蛋白在感觉性母细胞的胞质中呈非对称分布，以致细胞在第一次分裂时只有一个子细胞中含有numb蛋白，这个子细胞在第二次分裂时产生了神经元及鞘层细胞，而缺乏numb蛋白的细胞则分化为支持细胞（图15-7)。
numb蛋白对神经元及鞘层细胞的形成是
必需的。
在缺乏numb蛋白的胚胎中，那些本应该发育成神经元和鞘层细胞的细胞却发育成为外层的支持细胞。
@344第四篇细胞的基本生命活动支持细胞感觉性鞘层神经元细胞三、基因选择性表达的转录水平调控在多细胞生物个体发育过程中，基因的表达具有严格的时间和空间（或组织）特异性。
在不同分化类型的细胞中，基因的表达差异很大。
某个基因在一类细胞中激活而在另一种细胞中却相反。
那么，是什么因素决定了分化细胞中的特异性基因表达呢？
研究表明，细胞分化的基因表达调控主要发生在转录水平。
调节基因转录的因素有很多（详见第九章），这里主要介绍在细胞分化过程中基因表达调控的特点。
（一）基因的时序性表达
某一特定基因表达严格按照一定的时间顺序发生，这称为基因表达的时间特异性(temporal speci如ty)。
从受精卵到组织、器官形成的各个不同发育阶段，都会有不同的基因严格按照自己特定的时间顺序开启或关闭，表现为分化、发育阶段一致的时间性，也称为阶段特异性(stage specificity)。
关千基因时序性表达的机制，人们在血红蛋白的表达和形成过程中得到了较深入的研究。
表达血红蛋白是红细胞分化的主要特征。
脊椎动物的血红蛋白由2条a－珠蛋白链和2条B－珠蛋白链组成。
a－珠蛋白和B－珠蛋白基因分别定位于不同染色体上，它们都由一个基因簇（基因家族）构成。
在哺乳动物，每个家族的不同成员都在发育的各个时期被表达，这样，在胚胎、胎儿和成体中分别生成不同的血红蛋白。
入B－珠蛋白基因簇包括五个基因—6、C'Y、A'Y、8和f3，这些基因在发育的不同时期表达：e在早期胚胎的卵黄襄中表达；为和A'Y在胎儿肝脏中表达心和B基因在成人骨髓红细胞前体细胞中表达。
所有这些基因的蛋白质产物都与由a－珠蛋白基因编码的a－珠蛋白结合，从而在发育的三个时期中分别形成有不同生理特性的血红蛋白（图15-8)。
在个体发育过程中依次有不同的B－珠蛋白基因的打开和关闭，这与B－珠蛋白基因簇上游的基因座控制区(locus control region, LCR)有关（图15-8)。
LCR最初是应用DNase I消化实验鉴定的。
在成体，只有红细胞（前体细胞）中的LCR对DNase I敏感。
对DNase I如此敏感意味着在该区域的染色质没有被紧密包裹，转录因子易于接近DNA。
B－珠蛋白基因簇中每个基因的有效表达，除受到每个基因5端上游的启动子和调控位点及基因下游(3'端）的增强子控制之外，还将受到远离B－珠蛋白基因簇上游的LCR的严格制约。
LCR距离c基因的5'末端约10OOObp以上。
研究发现，LCR可使任何与它相连的B－家族基因呈高水平表达，即使B－珠蛋白基因本身距离它约50OOObp,LCR也能指导转基因小鼠中整个B－珠蛋白基因簇的顺序表达。
有研究者认为，LCR区和珠蛋白基因启动子之间的DNA呈拌环状，这样，结合到LCR的蛋白能够比较容易地与结合到珠蛋白基因启动子上的蛋白发生相互作用。
例如，在胚胎的卵黄埏细胞中，LCR将与c基因的启动子相互作用，在胎肝中则与两个'Y基因启动子相互作用，最后在骨髓来源的红细胞中，与B基因启动子相互作用。
在LCR区域中含有分别为300bp左右的4个“核心＂控制区，其中的每个区都有与少数几个特异胚胎期（卵黄襄）胎儿肝脏成人骨髓图15-8LCR控制的p珠蛋白基因活化的可能机制A人珠蛋白基因结构；B.
LCR控制的B－珠蛋白基因活化，LCR在发育的不同阶段依次与每个基因的启动子相互作用，从而控制它们的时间顺序性表达性转录因子的结合位点，如转录因子NF-E2和在红细胞中高水平表达的GATA-I。
（二）基因的组织细胞特异性表达
在个体发育过程中，同一基因产物在不同的组织器官中表达多少是不一样的。
一种基因产物在个体的不同组织或器官中表达，即在个体的不同空间出现，这就是基因表达的空间特异性(spatial spec ifi c i ty)。
不同组织细胞中不仅表达的基因数量不相同，而且基因表达的强度和种类也各不相同，这就是基因表达的组织特异性。
一般地，发育中基因的转录要求激活因子结合千基因的调控区(control region，启动子区和其他能调节基因表达的DNA位点）。
与基因表达调控区相结合的转录因子可区分为通用转录因子和组织细胞特异性转录因子两大类，前者是指为大量基因转录所需要并在许多细胞类型中都存在的因子；后者则是为特定基因或一系列组织特异性基因表达所需要，并在一个或很少的几种细胞类型中存在的因子。
通过替换组织特异性（表达）基因的调控区实验就可证明组织特异性转录因子的存在。
例如，在小鼠中弹性蛋白酶仅在胰腺中表达，而生长激素只在脑垂体中形成，将人生长激素基因的蛋白编码区连接于小鼠弹性蛋白酶基因的调控区之后，再将此重组的DNA注射到小鼠受精卵中，使其整合到基因组中，在由此发育而来的转基因小鼠的胰腺组织中可检测到人生长激素，表明胰腺组织中的特异转录因子通过作用于弹性蛋白酶基因调控区，启动了胰腺细胞表达人生长激素。
迄今已鉴定出一些组织特异性转录因子，如在红细胞中表达的血红蛋白的EFI因子、在胰岛中表达的胰岛素的Isl-I因子、在骨骼肌中表达的肌球蛋白的MyoD I因子等。
通常情况下，细胞特异性的基因表达是由千仅存于那种类型细胞中的组织细胞特异性转录因子与基因的调控区相互作用的结果。
应该指出的是，在个体发育或细胞分化期间被激活的基因通常有复杂的调控区。
一个转录因子是否影响特定基因的活动取决千许多因素，除了基因的调控区是否含有该转录因子的结合位点之外，346第四篇细胞的基本生命活动转录因子的转录活性还受到转录因子调节蛋白的严格制约。
在调控区上不同转录调节因子（转录因子和转录因子调节蛋白）的相互作用决定了基因是否被激活。
（三）细胞分化过程中基因表达调控的复杂性动物受精卵第一次卵裂后的裂球，在个体发育中通过细胞分裂产生大蜇多代各种成体细胞，祖细胞与分化细胞的先后连续的宗系关系被称为细胞谱系(cell lineage)。
在特定谱系细胞形成过程中，转录因子（或转录调节蛋白）比较普遍的作用方式是：CD一个表达的转录因子能同时调控几个基因的表达，表现为同时发生的某些基因的激活和某些基因的关闭；＠组合调控(combin atm-y control)，即转录起始受一个基因调节蛋白的组合而不是单个基因调节蛋白调控的现象。
这两种转录水平的调控方式在细胞分化过程中起重要作用。
1一个关键基因调节蛋白的表达能够启动特定谱系细胞的分化在个体发育过程中，一个关键基因调节蛋白的表达能够引发一整串下游基因的表达。
这种调控方式表现为某些基因的永久性关闭和一些基因的持续性激活，同时作为转录因子的基因产物本身起正反馈调节蛋白作用。
这样一来，维持一系列细胞分化基因的活动只需要激活基因表达的起始事件，即特异地参与某一特定发育途径的起始基因。
该基因一旦打开，它就维持在活化状态，表现为能充分的诱导细胞沿着某一分化途径进行，从而导致特定谱系细胞的发育。
具有这种正反馈作用的起始基因通常称为细胞分化主导（或主控）基因(master control gen e)。
例如，在哺乳动物的成肌细胞向肌细胞分化过程中，myoD基因起重要作用。
myoD在肌前体细胞和肌细胞中表达，它的表达将引起某一级联反应，包括MRF4、myogenin基因的顺序活化，导致肌细胞分化（图15-9)。
myoD、MRF4和myogenin都编码一个含有碱性螺旋—环—螺旋(bHLH)的DNA结合域的转录因子。
一般将myoD基因视为肌细胞分化的主导基因。
有趣的是，经myoD基因转染的成纤维细胞以及其他一些类型的细胞也能够转分化为肌细胞。
研究资料也表明myf-5具有myoD的类似功能。
在正常情况下，myoD的表达对myf-5的表达有抑制效应，Myf-5蛋白能补偿MyoD功能的缺失。
细胞命运决定细胞扩增细胞停止扩增细胞融合、分化细胞有肌肉（通过激活myoD（生长因子(MRF4,myogenin(Meltrin和肌肉继续融合收缩功能或myf-5)作用）依次激活，同时需要特异性蛋白表达）细胞粘附因子参与）
图15-9沓椎动物骨骼肌细胞分化机制外部信号（旁分泌因子Wnt,Shh)通过myoD和myf
-5基因启动肌细胞分化，这两个基因中的哪一个优先表达取决于物种的不同，它们的基因活化形成交互抑制并维持自身状态，其编码蛋白进一步激活MRF4和myogenin基因，最终导致肌细胞特异性蛋白表达单个基因调节蛋白不仅在特定谱系细胞的分化过程中起重要作用，而且还能触发整个器官的形成。
这种结果来自于对果蝇、小鼠和人类眼器官发育的研究。
在眼发育过程中，有一个基因调节蛋白（在果蝇中称为Ey，在脊椎动物中称为Pax-6)很关键，如果在适当的情况下表达，Ey能触发形成的不只是一种类型细胞，而是由不同类型细胞组成的在三维空间中正确组织起来的整个器官（眼）。
2一些基因调节蛋白的组合能产生许多类型的细胞组合调控的一个条件是许多基因调节蛋白必须能共同作用来影响最终的基因转录速率。
不仅每个基因拥有许多基因调节蛋白来调控它，而且每个基因调节蛋白也参与调控多个基因。
虽然有些基因调节蛋白对单个细胞类型特异（如myoD),但大多数基因调节蛋白存在千多种类型细胞，在体内多个部位和发育期间多次打开。
图15-10显示了组合调控能够以相对较少的基因调节蛋白产生多种类型细胞。
第十五章细胞分化347
调控蛋白G)的诱导
工o~细胞分裂＼七．，二
|^|细胞A调控蛋白＠和＠的诱导`
细胞C细胞D细胞E细胞F
1。
^@`调i蛋白＠和＠的`1`I
细胞G细胞H细胞I细胞J细胞K细胞L细胞M细胞N
```｀动心心心
图15-10发育过程中—些基因调节蛋白的组合能产生许多细胞类型在这个简单且理想化的体系中，每一次细胞分裂之后就会做出一个决定，合成一对不同基因凋节蛋白的其中一个（用标上数字的圆圈表示）。
调控蛋白O可因（受精后）母体效应基因产物的诱导产生，随后胚胎细胞感受到其所在胚胎中的相对位置，朝向胚胎左侧的子细胞常常诱导合成每对蛋白质中的偶数蛋白，而朝向胚胎右侧的子细胞诱导合成奇数蛋白。
假设每种基因调节蛋白的合成一旦起始就自我待续下去，通过细胞记忆，逐步建立最终的组合指令。
在图中假设的例子中，利用5种不同的基因调节蛋白最终形成8种细胞类型(G-N)3.同源异形框基因的时空表达确定了机体前－后轴结构的分化与发育蓝固1983年，瑞士Gehring实验室的工作人员在研究绘制果蝇触角足复合体(Antennapedia complex, Antp，昆虫中对胸部和头部体节的发育具有调节作用的基因群）基因外显子图谱过程中发现，Antp cDNA不仅与A几tp基因编码区杂交，也与同一染色体上相邻的fiz(fushi匡azu，如）基因杂交，提示在Antp和如基因中都含有一个共同的DNA片段。
随后利用这个DNA片段为探针，相继发现在果蝇的许多同源异形基因(ho meotic gene)中都含有这个相同的DNA片段。
序列分析显示这个共同的DNA片段为180bp，具有相同的开放读码框架，编码高度同源的由60个氨基酸组成的结构单元。
后来，这－DNA序列又相继在小鼠、入类、甚至酵母的若干基因中被发现。
这个共同的180bp DNA片段被称为同源异形框(homeo box)，含有同源异形框的基因谓之同源异形框基因(homeobox gene)。
迄今为止，已发现的同源异形框基因有300多种，它们广泛分布于从酵母到人类的各种真核生物中，如果蝇的HOM基因，动物和人类的Hox基因。
由同源异形框基因编码的蛋白称为同源异形域蛋白(homeodo main protein)。
同源异形域蛋白含有同源异形域(homeodomain)和特异结构域(specific domain)，特异结构域通常位千同源异形结构域的上游，靠近蛋白的N端，而同源异形结构域则靠近蛋白的C端，这两个结构域在其蛋白作为转录因子发挥作用时均起决定性的作用。
研究发现，由高度保守的60个氨基酸组成的同源异形结构域，表现为一种拐弯的螺旋－回折－螺旋(HLH)立体结构，其中的9个氨基酸片段（第42~50位）与DNA的大沟相吻合，即它能识别其所控制的基因启动子中的特异序列（应答元件），从而引起特定基因表达的激活或阻抑。
348第四篇细胞的基本生命活动
目前认为，HOM或Hox基因产物是一类非常重要的转录调节因子，其功能是将胚胎细胞沿前－后轴分为不同的区域，并决定各主要区域器官的形态建成。
例如，果蝇HOM基因的功能是决定一组细胞发育途径的一致性，确保体节或肢芽的典型特点。
当HOM基因突变时，可发生同源异形转变(homeosis)，即由于与发育有关的某一基因错误表达，导致一种器官生长在错误部位的现象。
例如果蝇的第三胸节转变为第二胸节，形成像第二胸节一样的翅膀（双翅膀果蝇）。
果蝇的HOM基因位于3号染色体上，由两个独立的复合体组成，即触角足复合体和双胸复合体(bi thorax co mplex)，含有这两个复合体的染色体区域通常称为同源异形复合体(homeotic complex, HOM-C)。
由于进化，果蝇HOM基因在哺乳动物中出现了4次：Hox-A,Hox-B,Hox-C,Hox-D，分别定位于人的7,17,12和2号染色体；在小鼠则分别定位于6,11,15和2号染色体上。
HOM或Hox基因在染色体上的排列顺序与其在体内的不同时空表达模式相对应，即：这些基因激活的时间顺序表现为越靠近前部的基因表达越早，而靠近后部的基因表达较迟；这些基因表达的空间顺序表现为头区的最前叶只表达该基因簇的第一个基因，而身体最后部则表达基因簇的最后一个基因（图15-11)。
图15-11同源异形框基因在果蝇和小鼠染色体上的排列顺序及其基因表达的解剖顺序数字与颜色表示跨越两种动物之间的结构相似性；基因的表达顺序与其在染色体上的排列顺序相对应，越靠近前部表达的基因转录越早（四）染色质成分的化学修饰在转录水平上调控细胞的特化基因表达的激活，首先需要将致密压缩的染色质或核小体舒展开来，该过程涉及染色质成分的化学修饰，以及具有酶活性的蛋白复合体参与。
染色质成分的化学修饰，包括DNA甲基化和组蛋白修饰等，都会引起染色质结构和基因转录活性的变化。
染色质成分(DNA和组蛋白）的修饰性标记在细胞分裂过程中能够被继承并共同作用决定细胞表型，因此被称为表观遗传(epigenetics, DNA序列变化以外的可遗传的基因表达改变）。
1. DNA甲基化在转录水平上调控细胞分化的基因表达在甲基转移酶催化下，DNA分子中的胞啥唗可转变成5－甲基胞啼唗，这称为DNA甲基化。
甲基化常见千富含CG二核昔酸的CpG岛。
甲基化是脊椎动物基因组的重要特征之一，它可以通过DNA复制直接遗传给子代DNA。
哺乳动物基因组中约70%-80％的CpG位点是甲基化的。
甲基化主要集中千异染色质区，其余则散在千基因组中。
DNA甲基化对基因活性的影响之一是启动子区域的甲基化。
研究表明，甲基化程度越高，DNA转录活性越低，而绝大多数管家基因持续表达，它们多处千非甲基化状态。
DNA甲基化参与转录调控的直接证据，来自对基因的活化与胞啼唗甲基化程度的直接观察。
例如，在人类红细胞发育中，与珠蛋白合成有关的DNA几乎无甲基化，而在其他不合成珠蛋白的细胞中，相应的DNA部位则高度甲基化。
在胚胎期卵黄痰，e－珠蛋白基因的启动子未甲基化，而丫－珠蛋白基因的启动子则甲基化，因此在胚胎期e－珠蛋白基因开放，Y－珠蛋白基因关闭；至胎儿期，在胎儿肝细胞中与合成胎儿血红蛋白有关的基因，如丫－珠蛋白基因没有甲基化，但在成体肝细胞中相应的基因则被甲基化（图15-12)。
这说明在发育过程中，当某些基因的功能完成之后，甲基化可能有助千这些基因的关闭。
未甲基化启动子甲基化启动子5'e－珠蛋白基因y－珠蛋白基因3'失活甲基化启动子活化玉丫－珠蛋白DNA甲基化导致基因失活（或沉默）的可能机制是：心甲基化直接干扰转录因子与启动子中特定的结合位点的结合。
＠甲基化导致的基因沉默可能是由特异的转录抑制因子直接与甲基化DNA结合引起的。
人们利用随机甲基化DNA序列作探针进行凝胶阻滞实验，在哺乳动物细胞中找到了与甲基化DNA结合的多个蛋白，如MeCP-1(met hyl cytosine binding protein1)、MeCP-2。
＠甲基化导致的基因沉默是由染色质结构的改变引起的。
研究表明，DNA甲基化只有在染色质浓缩形成致密结构以后才能对基因的转录产生抑制作用。
甲基化作用也与基因组印记(genomi c imprinting)有关。
哺乳动物细胞是二倍体，含有一套来自父方的基因和一套来自母方的基因。
在某些情况下，一个基因的表达与其来源有关，即只允许表达其中之一，这种现象称为基因组印记，与之相关的基因谓之印记基因(imprinted gene)。
印记基因在哺乳动物的发育过程中普遍存在。
多数情况下来源于父方和母方的等位基因都同时表达，但印记基因仅在特定的发育阶段和特定的组织中表达等位基因中的一个，即在某种组织细胞中，有些仅从父源染色体上表达，有些仅从母源染色体上表达。
例如编码胰岛素样生长因子2的基因(Igf2)即是印记基因，来自母本的Igf2基因拷贝是沉默的。
研究资料显示，在小鼠配子生成和胚胎发育早期，印记基因是选择表达还是关闭，其可能机制是在特定发育时期对印记基因的甲基化。
\I,`t:350第四觞细胞的基本生命活动此外，在哺乳动物（雌性）和人类女性的两条X染色体中，其中一条灭活（钝化）的X染色体就与DNA的甲基化有关，去甲基化可以使钝化的X染色体基因重新活化。
2组蛋白的化学修饰影响基因的转录与细胞分化在第九章我们讨论了组蛋白的共价化学修饰，如组蛋白的氨基酸残基能够被乙酰化、甲基化、磷酸化、泛素化、sumo化(sumoylation)及糖基化。
这些修饰将引起染色质结构改变（即染色质重塑），而导致基因转录或沉默。
近年研究表明，组蛋白的化学修饰所引起的染色质结构的动态变化能够影响细胞的分化状态的转变(transition)。
例如，在ES细胞向神经元分化过程中，组蛋白的甲基化和乙酰化状态，特别是一些与神经元分化相关的因子（如Mashl、Pax6)的启动子区域组蛋白的修饰状态呈现出明显差异。
在果蝇研究中发现，scrawny基因（因突变的成熟果蝇的外观而得名）的编码产物为泛素蛋白酶(ubiquitin protease)，其功能是通过抑制组蛋白H2B的泛素化而沉默细胞分化关键基因，使果蝇的多个干细胞（生殖干细胞、皮肤上皮和肠道的组织干细胞）维持于未分化状态。
在scrawny功能缺失的果蝇突变体，其生殖组织、皮肤和肠道组织中过早失去了它们的干细胞。
3.染色质成分的共价修饰具有时空性已如上述，基因表达的激活，首先需要将致密压缩的染色质／核小体舒展开来，该过程涉及组蛋白的化学修饰、DNA甲基化，以及具有酶活性的功能蛋白复合体参与。
影响染色质结构变化的因素，除组蛋白修饰和DNA甲基化之外，还包括组蛋白组分的改变、染色质重建子(remode ler)和非编码RNA等。
这些因素或染色质上的这些标记在细胞分裂过程中能够被继承并共同作用决定细胞的表型，即表观遗传。
表观遗传是近些年形成的研究领域，从分子或机制上可将其定义为“在同一基因组上建立的能将不同基因转录和基因沉默模式传递下去的染色质模板变化的总和＂。
在由单个受精卵发育为多细胞个体（如脊椎动物）过程中，从一个受表观遗传调控的单基因组逐渐演变为存在于200多种不同类型细胞中的多种表观基因组（图15-13)。
这种程序性的变化被视为组成了一种“表观遗传密码”，从而使经典遗传密码中所隐藏的信息得到了扩展。
可以认为，染色质的共价化学修饰和非共价机制（如组蛋白组分改变、染色质重建子和非编码RNA作用）相互结合促使形成一种染色质状态，使其在细胞的分化和发育过程中能够作为模板。
非编码RNA在染色质重塑中的作用已得到初步阐释。
例如，miRNA通过调控染色质状态而发挥转录抑制的机制是，miRNA与蛋白质复合体－RITS(RNA-induced transcriptional silencing)结合，解离后的一条miRNA链将RITS复合体引导至miRNA同源基因处，通过募集组蛋白甲基转移酶，使组蛋白H3的赖氨酸－9发生甲基化，导致异染色质形成，最终抑制基因的转录（详见第九章图9-24)。
染色质的共价修饰在细胞分化与发育中的作用是目前研究的前沿领域，涉及的机制才刚刚被人们加以阐释。
人们在哺乳动物的发育过程中了解到：在生殖细胞发育后期将发生DNA甲基化，包括亲本特异性的基因印记。
受精后，雄原核基因组迅速去甲基化，而雌原核基因组则维持不变。
受精卵中的雄原核被包装上组蛋白，但其组蛋白上缺乏H3K9me2和H3K27me3，而此时雌原核则具有这些标记。
合子细胞基因组后续的去甲基化发生于前着床发育期，直至毅胚期。
在毅胚期，内细胞团开始出现DNA甲基化，组蛋白H3K9me2和H3K27me3水平上升；而由滋养外胚层(troph ectoderm)发育而来的胎盘则表现出相对较低的甲基化水平。
已如上述，基因表达的转录水平调控极其复杂，新的转录调控机制被不断揭示。
新近研究发现，增强子在细胞特化中的作用还表现为多个增强子丛(cluste1)组合在一起形成超级增强子(super-enhancers)而发挥功能。
超级增强子是具有转录活性增强子的一个大簇，富集高密度的关键转录因子(master tran scrip tion factors)、辅因子(cofactor)和增强子表观修饰标记(histone mod山cation marks)。
在功能上超级增强子能够驱动控制细胞身份(cell i denti ty)基因的表达，可以用来解释细胞类型特异的表达模式。
目前已经在哺乳动物细胞中鉴别出超过一百万个控制基因表达的增强子，这些增强子控制着数以万计的基因表达，其中只有数百个超级增强子控制赋予每个细胞特性和功能的大多数关键基因的表达。
现有研究资料提示，在发育过程中超级增强子的活性被不断地打开或关闭，旧的超级增强子失活、新的超级增强子活化，驱动了细胞身份的变化。
超级增强子对细胞分化的转录调控是一个染色质经共价和非共价修饰而归类的信息
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类型的细胞图15-13表观基因组与细胞分化基因组：某一个体不变的DNA序列（双螺旋）。
表观基因组：染色质模板的总体构成，分别对应特定细胞中的整个染色体。
表观基因组随细胞类型的不同而变化，并能对其收到的内、外界信号发生反应。
表观基因组会在多细胞生物由一个受精卯发育到许多已分化细胞这一过程中发生变化。
图中的......
表示分化或去分化的转变需要细胞的表观基因组重编程新兴领域，可以认为，本领域研究的不断深入，将有助于阐明基因表达盘的改变或基因表达水平的临界值与细胞表型特化的关系，同时也将促进对既往研究中鉴定的基因座控制区(locus control region)、DNase I超高敏位点(DNase I super-hypersensitive s ites)等在调控细胞分化中所起作用的认识。
四、基因选择性表达的转录后调控
生物体发育和细胞分化的过程，实质上也是特异蛋白质不断合成的过程。
在真核生物，基因的表达，也即基因向蛋白质的信息流向，在转录之后，还存在RNA加工、RNA转运、mRNA降解、蛋白质翻译及蛋白质活性修饰等调控过程，它们均涉及生物体发育和细胞分化。
在此仅从RNA剪接和mRNA降解两个方面阐述基因选择性表达的转录后调控在细胞分化中的作用。
1. RNA剪接与细胞分化RN A剪接对细胞分化的一种调控方式为可变剪接(alternative splic ing，也称选择性剪接），即在同一基因中，其剪接位点和拼接方式可以改变，从而导致一个基因能产生多个具有明显差异的相关蛋白产物。
例如，RNA可变剪接能使B－原肌球蛋白(~-tropmyosin)基因编码出骨骼肌细胞和成纤维细胞两种形式的蛋白。
B－原肌球蛋白的前体核RNA含有11个外显子，其中外显子1~5、8和9是表达这一基因的所有mRNA共有的，外显子7和10被用于骨骼肌的B原肌球蛋白合成中，而外显子6和11则被用在成纤维细胞和平滑肌细胞中（图15-14)。
2.非编码RNA与细胞分化非编码RNA(non-coding RNA)在细胞分化中的作用是近些年被揭示的。
哺乳动物基因组中近98％不与蛋白质编码基因相对应。
在入类，虽然基因组组成多达约32亿个碱基，但编码蛋白质的基因仅约2万～3万个，其余绝大部分为非编码序列。
这些非编码序列是产生微小RNA(microRNA, mi RNA)、内源性siRNA（称endo-siRNA)、piRNA(Piwi-interacting RNA)等非编码小RNA，以及长链非编码RNA(long non-coding RNA, ln cRNA)的基础。
非编码小RNA主要在转录后水平调控细胞的分化。
小RNA通过与靶基因mRNA3'端UTR互补352第四篇细胞的基本生命活动纠1|2|3|4|5|7|8|9|10卢、、'，.`＇.、、、z、'·',2|3|415|6|8|9|11户成纤维和平滑肌细胞P－肌球蛋白图15-14~－原肌球蛋白mRNA前体的可变剪接图解在骨骼肌细胞中，外显子6和11被当作内含子剪接掉了；而在成纤细细胞和平滑肌细胞中，外显子7和10被当成内含子，6和11则被用作外显子结合，抑制靶基因的蛋白质合成或促使靶基因的mRNA降解，从而参与细胞分化与发育的基因表达调控。
小RNA在生物体发育中的调控作用，起初是在研究秀丽隐杆线虫(C.
elegan)细胞命运的时间控制过程中被发现的：高浓度的转录因子LIN-14可特异性地促进早期幼虫器官的蛋白质合成，但在后续的发育中，尽管体内一直存在侐－14mRNA却检测不到LIN-14蛋白。
后来发现在线虫的第一、二龄幼虫期存在一个22nt的miRNA，即lin-4RNA。
Lin-4RNA通过与lin-14mRNA3'端UTR互补结合，短暂下调LIN-14蛋白水平，促进线虫从第一龄幼虫期向第二龄幼虫期发育。
如果lin-4基因突变而失去功能，那么线虫幼虫体内可持续合成LIN-14蛋白，使线虫长期停滞在幼虫的早期发育阶段。
随后在线虫体内又发现了另一个miRNA—let-7RNA。
let-7RNA长为21nt，存在于线虫的第三、四龄幼虫期及成虫期，其功能是决定线虫从幼虫向成虫的形态转变。
后续研究发现，let-7RNA不仅存在于线虫，也存在于脊椎动物和入类。
越来越多的研究资料表明，小RNA广泛地存在于哺乳动物，具有高度的保守性。
目前在各种生物中已发现数千中miRNA，大部分miRNA的产生机制和功能尚有待阐明。
迄今已鉴定了系列与细胞分化有关的miRNA，如miR-143和miR-145参与调控平滑肌细胞的分化；miR-126特异性表达千内皮细胞，调控血管形成。
piRNA与PIWI蛋白家族成员的结合在调节精子成熟发育中起重要作用。
非编码小RNA与细胞分化和发育的关系也是目前生物学研究中的热点领域，有待探索的问题很多。
长链非编码RNA与细胞的分化和发育密切相关。
细胞中lncRNA的来源极其复杂，有资料显示，哺乳动物基因组序列中4%~9％的序列产生的转录本是lncRNA。
lncRNA可通过多种方式调控基因表达，如通过在蛋白编码基因上游启动子区发生转录，千扰下游基因的表达；通过抑制RNA聚合酶II或者介导染色质重建，影响下游基因表达；通过与蛋白编码基因的转录本形成互补双链而干扰mRNA的剪接；通过结合到特定蛋白质上，调节相应蛋白的活性。
已有研究表明，在细胞分化与发育过程中lncRNA能调控基因组印记和X染色体失活；许多lncRNA在Hox基因座的选择性表达中发挥重要调控作用，它们决定这些基因座染色质结构域中组蛋白甲基化修饰是否会发生、染色质结构是否允许RNA聚合酶转录等。
第三节细胞分化的影响因素
一、细胞间相互作用对细胞分化的影响
在个体发育过程中，随着胚胎细胞数目的不断增加，细胞之间的相互作用对细胞分化的影响越来越重要。
原肠胚以后，三个胚层的发育前途虽已确定，但各胚层进一步发育还有赖于细胞群之间的相互作用，这种作用可视为细胞外的因素对细胞分化的调节。
胚胎细胞间的相互作用协调了细胞分化的方向。
（一）胚胎细胞间相互作用的主要表现形式是胚胎诱导胚胎发育过程中，一部分细胞对邻近细胞产生影响并决定其分化方向的现象，称为胚胎诱导(embryonic induc tion)。
起诱导作用的细胞或组织称为诱导细胞或诱导组织，被诱导而发生分化的细胞或组织称为反应细胞或反应组织。
胚胎诱导现象最初是由Spemann在胚胎移植(embryonic graft)实验过程中发现的，他因此获得了1935年的诺贝尔生理学或医学奖。
研究表明，胚胎细胞间的相互诱导作用是有层次的。
在三个胚层中，中胚层首先独立分化，该过程对相邻胚层有很强的分化诱导作用，促进内胚层、外胚层各自向相应的组织器官分化。
例如，中胚层脊索诱导其表面毅盖的外胚层形成神经板，这是初级诱导；神经板卷成神经管后，其前端进一步膨大形成原脑，原脑两侧突出的视杯诱导其上方的外胚层形成晶状体，此为次级诱导；晶状体又诱导覆盖在其上方的外胚层形成角膜，这为三级诱导（图15-15)。
不同胚层细胞通过这种进行性的相互作用实现胚胎细胞分化。
个体发育过程中，胚胎诱导具有严格的区域特异性和发育时空限制性。
为什么会发生胚胎诱导现象，胚胎诱导的分子基础是什么？
研究表明，胚胎诱导是通过诱导组织释放的各种旁分泌因子(paracrine factor)实现的。
这些旁分泌因子以诱导组织为中心形成由近及远的浓度梯度，它们与反应组织细胞表面的受体结合，将信号传递至细胞内，通过调节反应组织细胞的基因表达而诱导其发育和分化。
发育过程.
族，由30多个结构相关的成员组成，包括TGF-13家族、活化素(activin)家族、骨形成蛋白(bone morphogenetic protein,BMP)家族及Vgl家族等。
这些因.仁..
杯视体
杯状视晶
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前＼＼人』后
中常见的旁分泌因子有：心成纤维细胞生长因子(fibroblast growth factor, FGF);(2)Hedgehog家族蛋白，脊椎动物中至少有三个果蝇Hedgehog基因同源体：shh A(sonic hedgehog), dhh(desert hedgehog)和巾h(indian hedgehog);@Wnt家族蛋白，为富含半胱氨酸的糖蛋白，在脊椎动物中至少有15个家族成员，其名称由wingless和integrated融合而成。
wingless为果蝇分节极性基因，integrated是它的脊椎动物同源体；＠TGF-!3超家子在胚胎的不同发育阶段以及处于不同位置的胚胎细胞中的表达差异，提供354第四篇细胞的基本生命活动了胚胎发育过程中的位置信息。
典型的例子是含有产生sonic h edgehog蛋白的胚胎细胞团的移植实验。
原位杂交结果显示，sonic hedge hog mRNA也存在于胚胎的翅芽中，但仅定位于将来发育为翅膀小趾的翅芽后部。
如果把另一产生sonic hedgehog蛋白的翅芽后部细胞团移植到受体宿主翅芽的前部，那么，受体宿主在以后发育成的翅膀上将出现镜向的趾重复（图15-16)。
位置信息还表现在不同部位胚胎细胞对同一种旁分泌因子的分化效应不同，如son ic hedgehog蛋白诱导翅芽细胞发育为趾，而由脊索产生的sonic hedgehog蛋白则诱导邻近的神经管细胞分化成底板(floor plate)和运动神经元。
信号通路配体家族受体家族细胞外抑制或调节因子受体酪氨酸激酶EGF EGF受体Argos FGF(Bra nchless)FGF受体(B reat hl ess)ephn ns Eph受体TGF(3超家族TGF~TGF[3受体chordin(Sog), noggin BMP(Opp)BMP受体Nodal Wnt Wnt(Wmgless)Fnzzled Dickkopf, Cerberus Hedgehog Hedgehog Patched, Smoothened Notch Della Notch Fringe（二）胚胎细胞间的相互作用还表现为细胞分化的抑制效应抑制是指在胚胎发育中已分化的细胞抑制邻近细胞进行相同分化而产生的负反馈调节作用。
例如，把发育中的蛙胚置于含蛙心组织碎片的培养液中，胚胎将受到抑制不能产生正常的心脏。
这说明，已分化的细胞可产生某种物质，抑制邻近细胞向其相同方向分化，这种物质称为抑素(chalone)。
另一种抑制现象表现为，在具有相同分化命运的胚胎细胞中，如果一个细胞＂试图”向某个特定方向分化，那么，这个细胞在启动分化指令的同时也发出另一个信号去抑制邻近细胞的分化，这种现象被称为侧向抑制(lateral i nhi bi tion)。
比如在脊椎动物的神经板细胞向神经前体细胞(neuronal precursor cell)分化过程中，尽管这些神经板细胞均有发育为神经前体细胞的潜能，但只有其中的部分细胞可发育为神经前体细胞，其余的则分化为上皮性表皮细胞。
这种现象是由神经板细胞间的侧向抑制作用所决定的。
正是由于有诱导分化和抑制分化的存在，才使胚胎发育有序地进行，使发育的器官间得以相互区别、避免重复。
二、激素对细胞分化的调节
激素是远距离细胞间相互作用的分化调节因子。
在个体细胞分化与发育过程中，除相邻细胞间可发生相互作用之外，不相邻的远距离的细胞之间也可发生相互作用。
与介导邻近细胞间相互作用的旁分泌因子不同，远距离细胞间的相互作用由经血液循环输送至各部位的激素来完成。
激素所引起的反应是按预先决定的分化程序进行的，是个体发育晚期的细胞分化调控方式。
激素可分为肖类激素和多肤类激素两大类淄类激素如类固醇激素、雌激素和昆虫的蜕皮素等为脂溶性，分子小，可穿过靶细胞的细胞膜进入细胞质，与细胞质内的特异受体结合形成受体－激素复合物，该复合物入核后，能作为转录调控物，直接结合到DNA调控位点上激活（或在一些情况下抑制）特异基因的转录；多肤类激素如促甲状腺素、肾上腺素、生长激素和胰岛素等为水溶性，分子量较大，不能穿过细胞膜，而是通过与质膜上的受体结合，并经过细胞内信号转导过程将信号传递到细胞核，影响核内DNA转录。
如同许多其他的细胞内信号转导途径一样，这个过程包括蛋白激酶的顺序激活。
激素影响细胞分化与发育的典型例子是动物发育过程中的变态(metam01JJhos is)效应。
所谓变态，是指动物从幼体变为在形态结构和生活方式上有很大差异的成熟个体的发育过程。
例如，蝇类和蛾类等昆虫，其幼虫身体被一坚硬的角质层所覆盖，运动能力有限，它需要经过多次蜕皮才能成为在空中飞舞的成虫；在两栖类，只能在水中生活的有尾蜊抖需经过变态发育才能形成可在陆地生活的无尾的蛙。
研究表明，昆虫的变态发育受蜕皮激素的影响，而两栖类的变态则与甲状腺激素(T3'T4)有关。
在哺乳动物和人类，乳腺的发育自胚胎期已开始，但直到青春期受雌激素的作用才开始迅速发育。
三、环境因素对细胞分化的影响
细胞分化的方向可因环境影响而改变。
环境因素在调节或影响动物细胞分化与发育方面的研究越来越受到人们的重视。
目前已了解到，物理的、化学的和生物性因素均可对细胞的分化与发育产生重要影响。
在两栖类动物，其受精卵的背－腹轴确定除了取决千精子穿透进入卵的位点之外，还和重力的影响有关。
在低等脊椎动物，性别决定与分化受环境因素的影响较大，环境信号启动基因的表达不同，从而影响动物的性别。
比如，孵化温度可以决定某些爬行动物（如鍔鱼）的性别，在其受精卵发育的一个特定时期，温度是性别分化的决定因子，在低温下孵化产生一种性别，在高温下孵化则产生另一种性别。
而哺乳类动物（包括人类）B淋巴细胞的分化与发育则依赖于外来性抗原的刺激。
目前已发现许多环境因素可干扰入类的正常发育。
例如，殃缺乏将引起甲状腺肿、精神发育和生长发育迟缓；在妊娠期感染风疹病毒易引起发育畸形，该病毒主要作用千胚胎的视觉器官和心脏，引起先天性白内障和心脏发育畸形。
有关环境因素影响细胞分化与发育的机制也是目前生物医学研究的重要领域之一。
该领域的深入研究，可望为环境有害物质引起的出生缺陷和发育畸形等提供新的干预靶点。
第四节细胞分化与医学
细胞分化是包括人类在内的多细胞生物个体发育的核心事件。
细胞分化与发育异常将引起多种出生缺陷。
许多疾病如肿瘤等与细胞分化密切相关。
不仅如此，细胞分化的可塑性，即细胞分化状态的转变也与再生医学关系密切。
这里以肿瘤和再生为例，简述细胞分化的医学意义。
—、细胞分化与肿瘤
(—)肿瘤细胞是异常分化的细胞肿瘤细胞和胚胎细胞具有许多相似的生物学特性，均呈现出未分化和低分化特点。
肿瘤细胞除了具有其来源组织细胞的部分特性之外，主要表现出低分化、高增殖和高侵袭（即高迁移）的特征。
1肿瘤细胞的异常分化肿瘤细胞具有某些其来源组织细胞的分化特点，但更多见的是缺少这种特点甚至完全缺如。
高度恶性的肿瘤细胞，其形态结构特点为，细胞核大、核仁数目多，核膜和核仁轮廓清楚。
电镜下的超微结构特点是，细胞质呈低分化状态，含有大量的游离核糖体和部分多聚核糖体；内膜系统、尤其是高尔基复合体不发达；微丝排列不够规则；细胞表面微绒毛增多变细；细胞间连接减少。
分化程度低或未分化的肿瘤细胞缺乏正常分化细胞的功能，如胰岛细胞瘤可无胰岛素合成，结肠肿瘤可不合成黏蛋白，肝癌细胞不合成血浆白蛋白等。
从细胞分化观点分析肿瘤，认为分化障碍是肿瘤细胞的一个重要生物学特性，甚至有人认为肿瘤本身是一种分化疾病，是由于正常基因功能受控于错误的表达程序所致。
包括人类在内的复杂的多细胞生物，需要胚胎细胞分化为各种具有特殊功能的细胞，并进一步组成各种组织和器官。
分化是一个定向的，严密调节的程序控制过程，其关键在于基因按一定的时空顺序有选择地被激活或抑制。
多数情况下，终末分化细胞不再具有增殖能力，而肿瘤细胞在不同程度上缺乏分化成熟细胞的形态和完飞1:i整的功能，丧失某些终末分化细胞的性状，并常对正常的分化调节机制缺乏反应。
因此，有学者提出，恶性肿瘤是细胞分化和胚胎发育过程中的一种异常表现。
这一见解对于理解肿瘤起源和本质特征具有重要意义。
2肿瘤细胞是丧失接触性抑制的高迁移性”永生“细胞一般情况下，体外培养的大部分正常细胞需要黏附千固定的表面进行生长（依赖铀泊），增殖的细胞达到一定密度，汇合成单层以后即停止分裂，此过程称为接触抑制或密度依赖性抑制(densi ty-depend e nt inh加tion)。
而肿瘤细胞和转化细胞则缺乏这种生长限制，甚至可在半固体琼脂中呈悬浮生长，不需要依附于固定表面，不受密度限制，可持续分裂，达到很高密度而出现堆积生长，形成高出单层细胞的细胞灶。
正常二倍体细胞的培养基中必须含有一定浓度的血清（5％以上）才能维持培养细胞分裂增殖。
肿瘤细胞或转化细胞的生长对生长因子或血清的依赖性降低，甚至在缺乏生长因子或低血清(2%）状态下也可生长、分裂。
人类正常细胞在体外培养传代一般不能超过50次，而恶性肿瘤细胞则可以无限传代成为“永生”的细胞系。
在体内，肿瘤细胞不但增殖失控形成新的肿块，而且侵袭破坏周围正常组织，进入血管和淋巴管中，转移到身体其他部位滋生继发性的肿瘤，这些继发性的肿瘤再侵袭和破坏植入部位的组织，致使肿瘤细胞在宿主体内广泛散播。
肿瘤细胞的这些特征与胚胎细胞具有共性，比如胚胎细胞的高迁移特性。
肿瘤细胞的高转移特性也反映出细胞分化状态的转变在肿瘤进展中的重要作用。
人们现在认识到，肿瘤细胞在发生转移之前，必须经过上皮－间质转换(epithelial mese nchymal transit ion, EMT)，即上皮细胞向具有高侵袭（或迁移）力的间质细胞的转变；同时，迁移到距离原发灶远处组织中的间质性肿瘤细胞也必须经过间质－上皮转换(MET)，才能形成转移性或继发性肿瘤。
（二）细胞分化的研究进展促进了对肿瘤细胞起源的认识肿瘤细胞是从机体内正常细胞演变而来的，正常细胞转变为恶性肿瘤的过程称为癌变。
绝大多数肿瘤呈单克隆生长的特性说明，肿瘤中的全部细胞都来源于同一个恶变细胞。
根据生长动力学原理，肿瘤细胞群体大致可分为四种类型：心干细胞，它是肿瘤细胞群体的起源，具有无限分裂增殖及自我更新能力，维持整个群体的更新和生长；＠过渡细胞，它由干细胞分化而来，具备有限分裂增殖能力，但丧失自我更新特征；＠终末细胞，它是分化成熟细胞，已彻底丧失分裂增殖能力；＠G。
期细胞，它是细胞群体中的后备细胞，有增殖潜能但不分裂，在一定条件下，可以更新进入增殖周期。
其中肿瘤干细胞在肿瘤发生、发展中起关键作用。
大量证据表明，肿瘤起源于一些未分化或微分化的干细胞，是由千组织更新时所产生的分化异常所致。
组织更新存在千高等生物发育的各个时期。
在成年生物组织如骨髓等，存在着未分化干细胞。
干细胞的增生和分化使衰老和受损的组织、细胞更新或恢复，这些正常千细胞常是恶性变的靶细胞。
肿瘤起源千未分化或微分化于细胞的直接证据来自小鼠的畸胎瘤(teratocarcinoma)实验：将12天胚龄的小鼠胚胎生殖啃移植到同系成年小鼠睾丸被膜下，移植17天后，发现80％的睾丸有胚胎性癌细胞病灶，并且很快发展成典型畸胎瘤细胞。
胚胎性癌细胞形态上非常类似原始生殖细胞，都具有未分化的细胞质；同时，将早期发育阶段的胚胎包括受精卵移植至同系成年小鼠睾丸被膜下，也获得畸胎瘤。
受精卵、原始生殖细胞都处于相同的未分化状态，因此，正常未分化生殖干细胞是畸胎瘤的起源细胞。
白血病的发生也遵循这一规律，它起源千未分化或微分化的干细胞。
这种认识可从白血病细胞免疫表型、免疫球蛋白和T细胞受体基因分析及其与正常造血干细胞发育、分化比较中找到依据。
上皮细胞作为由干细胞自我更新的组织和细胞类型更容易发生癌变。
据统计，目前入类肿瘤的90%以上是上皮源性的，这是因为上皮包含有许多分裂中的干细胞，易受到致癌因素的影响发生突变，转化为癌细胞。
在正常组织更新过程中，致癌因素如放射线、化学致癌物等可作用于任何能合成DNA的正常干细胞，而受累细胞所处的分化状态可能决定了肿瘤细胞的恶性程度。
一般认为，受累细胞分化程度越低所产生的肿瘤恶性程度越高；反之，若受累细胞分化程度越高，所产生肿瘤恶性程度越低，甚至只产生良性肿瘤。
仍以小鼠畸胎瘤为例，若将E l2.5-El3d的小鼠胚胎生殖帷作异位移植，可致畸胎瘤，而将E13.5d的生殖崝作同样的异位移植，则丧失致畸胎瘤的能力，说明分化程度不同的细胞会产生截然不同的结果。
（三）肿瘤细胞可被诱导分化为成熟细胞
基于恶性肿瘤细胞的本质是增殖分化失去控制、正常程序化的增殖分化机制丧失特点，迄今探索出诱导肿瘤细胞”改邪归正＂的两种策略。
1．小分子诱导剂诱导肿瘤细胞向成熟细胞分化肿瘤细胞可以在高浓度的分化信号诱导下，增殖减慢，分化加强，走向正常的终末分化。
这种诱导分化信号分子被称为分化诱导剂，它可以是体内的或人工合成的。
分化诱导剂对肿瘤的这种促分化作用，称为分化诱导作用。
20世纪70年代，人们开始发现肿瘤细胞的诱导分化现象，先后发现细胞膜的环磷酸腺甘(cAMP)衍生物，如环丁酰cAMP、8－澳cAMP可使神经母细胞瘤的某些表型逆转，二甲亚砚(DMSO)在体外可使小鼠红白血病细胞发生部分分化。
继而有入用微量注射法将小鼠睾丸畸胎瘤细胞注入小鼠痪胚，经培养后植入假孕的雌鼠子宫，结果生出“正常的小鼠＂。
这证明恶性肿瘤细胞在某些物质作用下可以改变其生物学性状，使恶性增殖得到控制。
但是，这些结果仅适用千实验研究而无临床应用价值。
20世纪80年代，T.
R. Breitman利用原代细胞培养实验，发现维生素A衍生物一维甲酸对人急性早幼粒细胞白血病具有诱导分化作用，并在两例队型病人中观察到疗效。
Flynn使用13－顺维甲酸治疗病人取得成功。
中国学者应用全反式维甲酸治疗急性早幼粒细胞白血病在大样本病例中获得成功，证明全反式维甲酸可诱导白血病细胞沿着粒细胞系进行终末分化。
后来的研究相继证实，许多细胞因子、小剂量的化疗药物都具有诱导分化作用。
至20世纪90年代以来，随着肿瘤外科手术治疗、化疗和放疗取得的成就，肿瘤的诱导分化治疗也从实验室走向临床。
目前，诱导分化治疗的研究与观察巳涉及多种人类肿瘤，如结肠癌、胃癌、膀胱癌、肝癌等。
但不同肿瘤细胞可有多种分化诱导剂，并有相对的专一性，其中研究及治疗最深入的是全反式维甲酸和三氧化二碑对人急性早幼粒细胞白血病的诱导分化治疗（见本章推荐读物）。
全反式维甲酸和三氧化二珅联合应用可以使90％的患者达到5年无病生存，这是中国学者对人类的重大贡献。
虽然诱导分化治疗仅在这单一病种上最为成功，但其意义重要。
它揭示了一个肿瘤治疗的方向，即通过诱导肿瘤细胞分化来实现肿瘤细胞的”改邪归正＂，改变肿瘤细胞恶性生物学行为，达到治疗的目的。
2细胞重编程促使肿瘤细胞逆分化为“正常“细胞目前人们对细胞重编的研究兴趣已扩展到肿瘤研究领域。
肿瘤细胞，经细胞重新编程后将会如何呢？
新近来自肉瘤细胞的重编程研究表明，肉瘤细胞经重编程后，分化成了具有类似间充质干细胞和类造血干细胞，并最终能分化为成熟的结缔组织和血红细胞。
全基因组DNA启动子甲基化和基因表达谱分析显示，比对人类癌细胞和重编程细胞，发现重编程会导致癌基因和抑癌因子发生大幅表观遗传修饰。
这些数据表明重编程能恢复癌细胞向终末细胞分化的潜力，并且无需恢复到胚胎（千细胞）状态。
本领域研究将为解析肿瘤细胞癌变过程提供新途径，也让人们期盼细胞重编程能否成为癌症治疗的一个新方向。
应当指出的是：将肿瘤细胞重新编程回归“正常”，虽如同电影中所描述的搭乘时间车回到了过去，但也要防止肿瘤细胞又搭乘时间车回到现状（肿瘤复发）。
二、细胞分化与再生医学
一些发育成熟的成年动物个体有再生(regeneratio n)现象，表现为动物的整体或器官受外界因素作用发生创伤而部分丢失时，在剩余部分的基础上又生长出与丢失部分在形态结构和功能上相同的组织或器官的过程。
机体在正常生理条件下由组织特异性成体干细胞完成的组织或细胞的更新，如血细胞的更新、上皮细胞的脱落和置换等，虽然与再生相似，但性质上有所不同。
不同动物的再生能力有显著差异。
一般来说，高等动物的再生能力低千低等动物，脊椎动物低千无脊椎动物，而哺乳动358第四篇细胞的基本生命活动物的再生能力很低，仅限于肝脏等少数器官。
为什么低等动物有很好的再生能力，再生过程的机制是什么？
阐明这些问题有重要的医学意义。
(—)再生的本质是多潜能未分化细胞的再发音
自然界动物的再生方式并不完全相同。
概括起来，有三种方式：第一种，如水螅等低等动物，其再生是通过已存在组织的重组分化，即组织中的多潜能未分化细胞的再分化和部分细胞的转分化，此现象称为变形再生或形态重组再生(morphallaxis regeneration)。
第二种方式是，组织器官内没有干细胞，在受伤时，受伤部位组织中的部分细胞通过去分化过程形成未分化的细胞团（原基细胞），再重新分化形成再生器官。
这种形式的再生称为微变态再生(epi morphosis regen erat ion)，是两栖类动物再生肢体的主要方式。
第三种再生是一种中间形式，被认为是补偿性再生(compensatory regenerat ion)，表现为细胞分裂，产生与自己相似的细胞，保持它们的分化功能，如哺乳动物肝脏的再生。
戏剧性的去分化：骨细胞、软骨细胞、成纤维细胞、肌细胞和神经元失去了它们的分化特性，其中在分化组织中表达的基因，例如在肌细胞中表达的MRF4和myf5基因被下调，而与胚胎样肢体的区域间充质增生过程有关的基因如msxl的表达则明显的升高了。
由此在截面处的肢体组织区域形成了在顶端外胚层帽之下的不能辨别的去分化的细胞增殖团块，称为再生胚芽(regeneration blastema)，其中的细胞称为胚芽细胞。
关于胚芽细胞，以往人们一直认为这是一组均一的多潜能未分化细胞，它能够再分化形成再生组织中所有类型细胞。
新近基于GFP技术的特定组织细胞标记分析结果显示，胚芽细胞是一个不均一的各种类型前体细胞(progen itor cell)的“混合体”，每个前体细胞由残留肢体中的成熟组织细胞去分化而来，它们仍保持着其来源组织的＂记忆＂。
例如由肌组织来源的肌前体细胞在再生时仅形成肌组织，而不是其他类型细胞。
这表明，蛛螺肢体再生并不要求成体细胞完全去分化成一种多能状态。
2胚芽细胞的增生和再分化胚芽细胞在经过分裂增殖之后即开始再分化，肌细胞开始合成肌蛋白，软骨细胞分泌软骨基质，等等，直至形成与原来肢体相同的新结构。
3再生胚芽的模式形成再生胚芽在很多方面与肢体正常发育区域的肢芽相似。
残肢和再生组织之间的腹－背轴和前－后轴是一致的，细胞和分子水平的研究证实了肢体再生与正常发育的机制十分相似。
通过把再生肢体胚芽移植到发育中的肢体芽上，证明了胚芽细胞可对肢体芽的信号产生反应并有助于肢体发育。
正如信号分子Sonic hedgehog被发现存在于肢芽发育区域间充质的后区一样，Sonic hedgehog也存在于早期再生胚芽的后部区域。
以上蛛螺肢体切除再生的研究表明，再生的本质是成体动物为修复缺失组织器官的发育再活化，是部分细胞进入去分化的自我重编程(self-repro驴·amming)过程。
尽管人类和其他哺乳动物没有蛛姬如此的幸运，但只要还有足够的指（趾）甲，就可以再生出指（趾）尖。
最近纽约大学Mayumi Ito领导的研究小组揭示了指尖再生的秘密：在指甲根处下存在一个干细胞群，这些细胞可以协调修复部分切除的指头。
哺乳动物指尖再生的分子程序与两栖类动物肢体的切除再生极为相似，指甲干细胞作为一个“信号传导中心”，利用了一种对于胚胎四肢发育至关重要的Wnt信号通路，在组织再生过程中帮助了神经、新指甲以及骨细胞协调信号传导。
当小鼠趾尖被截去后，剩余趾甲下的上皮组织中的Wnt途径被激活，并将神经吸引至此，通过FGF2蛋白，神经驱动间充质细胞的生长（间充质细胞可恢复骨、肌腮及肌肉组织），数周后，小鼠的趾尖恢复如初。
不过，如果趾尖被截断过多、趾甲上皮组织丢失过多或整个指甲被移除，则无法再生。
（二）动物的再生策略给人类以重要启示
除肝脏之外，入类不会再生器官，至多在儿童期还可以再生指尖，但是至成人就丧失了这种能力。
由千再生损伤组织在医学上的重要性，许多生命科学工作者根据低等动物的再生机制，试图找出激活曾经是人体器官形成的发育程序的方法。
其中一种方法是寻找相对未分化的多潜能干细胞；另外一种方法是寻找能够允许这些细胞开始形成特定组织细胞的微环境。
迄今在寻找未分化的多潜能干细胞及＂诱导“细胞具有多能性的方法上取得了新进展，例如人ES细胞的发现、iPS细胞的建立等。
（三）细胞分化的可塑性研究显示体细胞重编程的巨大可能性哺乳动物中不同组织来源的成体干细胞具有横向分化和跨胚层分化潜能的发现，特别是iPS细胞被建立以来，基于细胞重编程技术而获取有治疗意义细胞的研究成果层出不穷。
应用细胞重编程技术，不仅能将体细胞转变为多潜能未分化干细胞和组织特异性干细胞，而且还可绕开细胞重编程的干细胞阶段，将皮肤成纤维细胞(fibrob l ast)直接转化为血细胞、心肌细胞及神经元等（详见第十六章干细胞）。
人们对细胞分化机制的不断探索，包括体细胞核移植研究、细胞分化主控基因的发现和ES细胞研究，催生了细胞重编程技术的诞生。
可以确信，随着对细胞分化机制研究特别是对低等动物再生本质和细胞分化可塑性认识的不断深入，真正实现按照人们的意愿去再生细胞和组织器官，以达到彻底修复和替代病变器官的时代将会逐渐变为现实。
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小结
细胞分化是个体发育中细胞在生化组成、形态结构和功能上发生稳定差异的过程。
分化的细胞荻得并保持特化特征，合成特异性的蛋白质。
细胞分化是多细胞生物个体发育的核心事件。
细胞分化机制的研究对于阐明生命的奥秘、推动医学的发展具有重要意义。
在个体发育过程中，细胞分化的潜能由“全能”到“多能“再到“单能”。
细胞分化的方向由细胞决定所选择。
已分化的细胞通常是稳定的，但在特定条件下细胞分化表现出明显的可塑性：可发生转分化，成为在形态结构和功能上不同于原来的细胞；可去分化，回到未分化状态或被重编程为i PS细胞。
细胞分化的分子基础是基因的选择性表达。
母体效应基因产物的极性分布和胚胎发育早期细胞的不对称性分裂决定或影响细胞的早期分化命运。
细胞分化的基因表达调控主要发生在转录水平：细胞内组织特异性转录因子和活性朵色质结构的特异调控区决定了分化细胞的特异性蛋白表达；一个关键基因调节蛋白（细胞分化主导基因）的表达能够启动特定谱系细胞的分化，而一些基因调节蛋360第四篇细胞的基本生命活动白的组合能产生许多类型细胞；DNA甲基化将导致基因表达的凡默；组蛋白的乙酰化则有利于基因的转录；高度保守的Hox基因是同源异形框基因家族的主要成员，在机体前－后轴结构的形成和分化过程中起重要作用。
非编码RNA（小RNA和长链非编码RNA)能同时在转录和转录后水平调控蛋白基因的表达。
细胞分化受多种因素的调节。
随个体发育进程，不断增加的胚胎细胞间的相互作用对细胞分化的影响越来越明显，其主要表现形式是由旁分必因子和细胞间位置信息所介导的胚胎诱导；而激素则是个体发育晚期细胞分化的调节因素。
细胞分化与肿瘤的发生和机体的再生关系密切。
肿瘤细胞和胚胎细胞间具有许多相似的生物学特性。
肿瘤细胞的典型特点是细胞增殖失控和分化障碍，可视为细胞的异常分化状态。
恶性肿瘤可以向正常成熟细胞诱导分化。
低等动物能再生缺损器官，其本质是缺损器官处的成体细胞能够去分化为未分化细胞。
再生是个体发育的再活化，是细胞分化可塑性的集中体现。
由一个受精卵分化未的细胞为什么会变得如此多样与丰富多彩？
这一问题，数百年来虽经许多生命科学家前赴后继的工作，但至今仍不清楚。
非人灵长类克隆猴的诞生，人胚胎干细胞的建系，体细胞重编程与体细胞向iPS细胞的＂诱导”成功，细胞分化的表观遗传调控机制，以及基因编辑技术的有效应用等，成为近年来细胞分化研究领域的亮点，并正在向彻底修复疾病的再生医学等领域迈进。
（陈誉华）
第十六章细胞衰老与细胞死亡
在高等动物，大多数机体细胞都经历了由未分化到分化、分化到衰老、衰老到死亡的过程。
生物体内每时每刻都有细胞在衰老、死亡，同时又有增殖和新生的细胞进行补偿。
细胞衰老与细胞死亡是生物界的普遍规律，是一种不可抗拒的生理现象。
入体内有200多种细胞，它们的寿命各不相同，例如，红细胞的寿命仅为120天，肝细胞的寿命约18个月，神经元的寿命与机体寿命大致相同。
阐明细胞的衰老与死亡的机制，对千揭示生命的奥秘和延缓个体的衰老具有重要的意义。
第一节细胞衰老
一、细胞衰老的概念
细胞衰老(cellul釭aging或cell senescence)是指随着时间的推移，细胞的增殖能力和生理功能逐渐发生衰退的变化过程。
衰老的细胞呈现出一种不可逆的生长停滞状态，其最终结果将导致细胞死亡。
细胞衰老是生物个体衰老的细胞基础，个体的自然衰老并不是疾病，但它与许多老年性疾病紧密关联。
(—)细胞衰老与机体的衰老既有区别又有联系
机体衰老是指绝大多数生物性成熟以后，机体形态结构和生理功能逐渐退化或老化的过程，是一个受发育程序、环境因子等多种因素控制的、不可逆的生物学现象。
机体的衰老与其物种的寿命密切相关。
对多细胞生物来说，细胞的衰老与机体的衰老是两个不同的概念。
个别细胞，甚至机体局部许多细胞的衰老与死亡并不影响机体的寿命；同样，机体衰老并不代表所有细胞的衰老，如70岁老人的生精细胞仍可以活跃地发生。
同时，机体衰老与细胞衰老之间又有着密切的联系。
个体的衰老是建立在总体细胞衰老的基础上的，各种衰老都有其细胞学基础，如老年人运动功能衰退与其体内的运动神经元的衰老密切相关。
细胞是组成生物有机体的基本结构和功能单位，也是机体衰老的基本单位。
因此，机体衰老是以细胞总体的衰老为基础的，细胞总体的衰老反映了机体的衰老。
为此，阐明机体衰老机制必须从细胞衰老机制研究入手。
（二）机体内各类细胞的寿命不同
在成年体内的组织器官中总有细胞不断地衰老，不同类型细胞的寿命很不一致。
除于细胞外，根据寿命情况将细胞分为三类：第一类细胞的寿命接近千动物的整体寿命，如神经元、脂肪细胞、肌细胞等；第二类是缓慢更新的细胞，其寿命比机体的寿命短，如肝细胞、胃壁细胞等；第三类是快速更新且寿命较短的细胞，如皮肤的表皮细胞、红细胞和白细胞等。
一般情况下，体内更新较快的细胞，其寿命较短。
体内基本不更新的细胞，在分化成熟后可以保持与机体相同的寿命。
细胞寿命除与细胞的种类有关外，也受到内、外环境条件的影响。
（三）细胞在体外培养条件下的寿命
离体(in vitro)细胞与在体(in vivo)细胞一样，也有一定的寿命。
对千体外培养的细胞，其寿命长短取决于培养细胞的平均代数，并与所取培养细胞的组织年龄、种属等特性密切相关。
1961年，Hayflick首次报道了体外培养的人成纤维细胞(fibroblast)具有增殖分裂的极限，即Hayflick界限(Hayflick life span)。
他利用来自胚胎和成体的成纤维细胞进行体外培养，发现胚胎的成纤维细胞分裂传代50次后，进入生长停滞状态；而来自成年组织的成纤维细胞只能培养15~30代就开始出现生长停362第四篇细胞的基本生命活动滞。
Hayflick等还发现，动物体细胞在体外可传代的次数，与物种的寿命有关。
同时，细胞分裂能力与个体的年龄有关。
由千上述规律是Hayflick发现的，故称为Hayflick界限。
二、细胞衰老的表现
细胞衰老的主要表现是对环境变化的适应能力，以及维待细胞内环境稳定的能力降低。
这些都是以细胞的形态结构和生化方面的改变为基础的。
（一）细胞衰老伴随着形态学改变衰老细胞的形态变化主要表现在细胞皱缩、膜通透性和脆性增加、核膜内陷和细胞器数量减少，特别是线粒体数量减少，胞内出现脂褐素等异常物质沉积，最终出现细胞凋亡或坏死。
通常衰老细胞的各种结构呈退行性变化（表16-1)。
细胞组分形态变化
核增大染色深、核内有包含物染色质凝聚、固缩、碎裂、溶解质膜黏度增加、流动性降低细胞质色素积聚、空泡形成线粒体数目减少、体积增大、mtDNA突变或丢失高尔基复合体碎裂尼氏体消失包含物糖原减少、脂肪积聚核膜内陷（二）细胞衰老过程中有生物大分子和代谢的改变衰老细胞会出现脂类、蛋白质和DNA等细胞成分损伤，细胞代谢能力降低，主要表现在以下方面：(1)DNA复制与转录受到抑制，但也有个别基因会异常激活，端粒DNA丢失，线粒体DNA特异性缺失，DNA氧化、断裂、缺失和交联，甲基化程度降低。
(2)RNA:mRNA和tRNA含量降低。
(3)蛋白质：含量下降，细胞内蛋白质发生糖基化、氨甲酰化、脱氨基等修饰反应，导致蛋白质的稳定性、抗原性和可降解性下降，自由基使蛋白质肤键断裂，交联而变性。
氨基酸由左旋变为右旋。
(4)酶分子：活性中心被氧化，金属离子Ca2+,Zn2+,Mg2+,Fe2＋等丢失，酶分子的二级结构、溶解度第二代鼠成纤维细胞第八代鼠成纤维细胞图16-1衰老成纤维细胞6－半乳糖昔酶活性增强鼠成纤维细胞B－半乳糖昔酶(SA-i3gal)染色（中国医科大学曹流提供）
第十六章细胞衰老与细胞死亡363
和等电点发生改变，总的效应是酶失活；但B－半乳糖昔酶(senescence-associated[3-galactosidase, SA[3gal)活性增强（图16-1)。
(5)脂类：不饱和脂肪酸被氧化，引起膜脂之间或与脂蛋白之间交联，膜的流动性降低。
三、细胞衰老的学说与机制
由于衰老是一个十分复杂的生命现象，又受到多种因素包括环境因素和体内因素的影响，任一角度的阐述都难以使衰老机制得到圆满解释，因而仍未形成较为一致的观点。
目前，关于细胞衰老的机制仍然是假说众多，但有关衰老的分子研究还是取得了较多进展。
（一）有许多学说诠释细胞衰老过程
1.遗传决定学说认为衰老是遗传上的程序化过程该学说认为衰老是遗传上的程序化过程，其推动力和决定因素是遗传的基因组；控制生长发育和衰老的基因都在特定时期有序地开启和关闭。
在人类，有两个典型的例子：一个是患婴幼儿早衰症(Hutchinson-Gilford syndrome)的儿童，患儿很早就出现明显的衰老症状（图16-2),12-18岁即过早夭折。
该病是由于编码核膜蛋白的基因突变所引起的，为常染色体隐性遗传疾病；另一个是成人早衰症(Werner syndrome)，病人平均39岁时出现衰老，47岁左右生命结束。
体外培养的成人早衰症患者的成纤维细胞与正常人的成纤维细胞相比，只分裂了较少的次数就发生了衰老和死亡，人们发现引起该病的基因与DNA的解旋有关（患者的DNA不图16-2早衰儿童（不足8岁就表现出衰能够正常修复）。
这些都促使人们推测，衰老在一老特征）定程度上是由遗传决定的。
（弓I自Gilbert S.
F.,2006)迄今在人和动物体内已发现了多个与衰老有关的基因，根据其功能，可区分为衰老基因和抗衰老基因两大类。
细胞衰老时，一些衰老相关基因(senescence associated gene)的表达水平显著高于年轻细胞。
在人的1、2、4、6、7、11、18及X号染色体上都存在有这类基因，它们可使永生化细胞逆转而衰老，其丢失或激活可引起细胞永生化。
例如：MORF4(mortality factor from chromosome4)基因，它能表达一种与细胞衰老死亡有关的转录因子，该基因突变可导致细胞永生化，将MORF4基因片段导入到缺失MORF4基因的永生化细胞后，可使永生化细胞衰老；p/6基因，其基因产物是细胞周期依赖性激酶抑制因子，研究发现，细胞衰老时，pl6基因mRNA的转录及蛋白质表达水平增高，p16表达增强将使细胞寿命缩短，抑制p/6基因的表达，细胞的寿命则延长。
由此，p/6被视为细胞寿命的关键调控基因，是入类细胞衰老遗传控制程序中的关键效应物。
抗衰老基因也称长寿基因(longevi ty gen e)。
研究人员将蛋白质生物合成延长因子－压(EF－压）基因转入果蝇生殖细胞，结果发现子代果蝇的寿命延长了40%，说明EF-la具有长寿作用。
在酵母中发现了一种sgsl基因突变体，其寿命明显短于野生型酵母，sgsl基因的编码产物为DNA解旋酶。
前述提到的Werner早衰症，其体内8号染色体上编码DNA解旋酶的基因发生了突变，称为WRN基因，该基因与酵母中的sgs l基因同源，均是保证DNA复制所必需的基因，它们突变将引起衰老提前和寿命缩短。
此外，还发现了一些抗衰老相关基因，例如，Klotho基因和SIRTI基因。
Klotho基因缺陷的小鼠，在出生后4周左右即可出现一系列类似人类的早衰症状，Klotho基因的突变和低表达会引起衰老和相关性老年病；SIRTJ基因则与清除体内的胆固醇有关，被认为是能延长寿命的基因。
364第四篇细胞的基本生命活动
2自由基学说认为活性氧基团导致细胞损伤和衰老自由基是指那些在原子核外层轨道上具有不成对电子的分子或原子基团。
所谓未成对电子，是指在原子或分子轨道中未与其他电子配对而独占一个轨道的电子。
如A、B两个原子各提供一个电子通过共价键形成一个分子A B，这两个电子是配对的。
如果在化学反应中发生了均裂，A和B各带走一个电子，它们就是未成对电子。
A·和．B就称为自由基。
在正常条件下，人体内自由基的产生有两方面：一是环境中的高温、辐射、光解、化学物质等引起的外源性自由基；二是体内各种代谢反应产生的内源性自由基。
内源性自由基是人体自由基的主要来源，其产生的主要途径有：CD由线粒体呼吸链电子泄漏产生；＠由经过氧化物酶体的多功能氧化酶(MFO)等催化底物胫化产生。
此外，机体血红蛋白、肌红蛋白中还可通过非酶促反应产生自由基。
自由基是一类高度活化的分子，当这种分子与其他物质反应时，力图得到电子，而对细胞及组织产生十分有害的生物效应。
由千自由基活性强，容易与细胞内的生物大分子发生反应，过多的自由基会对许多细胞组分造成损伤。
它们能使质膜中的不饱和脂肪酸氧化，从而使膜内酶活性破坏、膜蛋白变性、膜脆性增加、膜结构发生改变，因而膜的运输功能紊乱以致丧失；它们还能将蛋白质中的琉基氧化而造成蛋白质发生交联、变性，使酶失活。
另外，它们还能使DNA链断裂、交联、碱基轻基化、碱基切除等，从而对DNA造成损伤。
有学者认为，在衰老的原因中，99％是由自由基造成的。
老年人皮肤上的老年斑(age spots)就是自由基对细胞破坏的见证。
3端粒钟学说认为端粒随细胞分裂不断缩短为衰老的主要原因端粒(telomere)是染色体末端的一种特殊结构，其DNA由简单的串联重复序列组成。
人的染色体端粒由TTAGGG/CCCTAA重复序列组成。
在细胞分裂过程中，由千端粒不能为DNA聚合酶完全复制而逐渐变短，除非有端粒酶的存在。
端粒酶是一种由RNA和蛋白质组成的核糖核蛋白酶，常见于生殖细胞和肿瘤细胞等细胞中，而正常的体细胞中则缺乏端粒酶或端粒酶活性很低。
1990年，Harley等用人工合成的(TTAGGG汃作为探针，测定了不同年龄段的人成纤维细胞中的端粒长度，结果发现端粒长度随年龄增长而下降。
在体外培养的成纤维细胞中，端粒长度也随分裂次数的增加而下降。
在这些研究的基础上形成了细胞衰老的“有丝分裂钟“学说，或称＂端粒钟(telomere clock)学说＂。
该学说认为，正常情况下，随着细胞的不断分裂，染色体末端的特殊结构“端粒“会逐渐缩短当端粒缩短到一定程度时，细胞增殖停滞，发生细胞衰老。
1998年，Wri gh t等提供了更令人信服的证据，他们将人的端粒反转录酶亚基(hTRT)基因通过转染，引入正常的人二倍体细胞（入视网膜色素上皮细胞和成纤维细胞），发现表达端粒酶的转染细胞分裂旺盛，端粒长度明显增加，作为细胞衰老标志的B－半乳糖节酶活性则明显降低，这些与对照细胞存在鲜明的差异，而且表达端粒酶的细胞寿命比正常细胞至少长20代，且其核型正常。
此外，对提前衰老的克隆羊“Dolly"的研究发现，其细胞中端粒的长度较同龄羊缩短20%。
这些研究表明，端粒长度的确与衰老有着密切的关系。
目前将端粒缩短诱发的细胞衰老称为复制性衰老(replicative senescence)。
当然也有一些不支持这一学说的报道，在二倍体的仓鼠胚细胞分裂的各个阶段，细胞始终表达端粒酶，其端粒长度亦保持恒定，然而经过20~30代的分裂后，细胞仍然进入衰老；某些小鼠终生保持较长的端粒，但并未因此获得较长的寿命。
特别是剔除端粒酶基因的小鼠，在其前5代中，并未观察到寿命缩短的现象。
尽管如此，目前入们根据端粒与端粒酶在细胞衰老上的研究成果，已将细胞衰老区分为两大类：一类是与端粒、端粒酶直接相关的复制性衰老；另一类是氧化应激诱导的非端粒依赖性衰老，也被称为早熟性衰老(premature se n escence)。
有研究者认为，某些终生保持较长端粒小鼠的衰老即属于氧化应激诱导的非端粒依赖性衰老。
彸；4．细胞代谢废物累积可引起细胞衰老代谢废物累积（was le produ cl accu mulation)学说是指由第十六章细胞衰老与细胞死亡365于细胞功能下降，一方面细胞不能将代谢废物及时排出胞外，另一方面又不能将其降解与消化，这样代谢废物越积越多，在细胞中占据的空间越来越大，影响细胞代谢废物的运输，以致阻碍了细胞的正常生理功能，最终引起细胞的衰老。
哺乳动物脂褐质的沉积是一个典型的例子。
脂褐质是一些长寿命的蛋白质和DN八脂类共价缩合形成的巨交联物，次级溶酶体是形成脂褐质的场所，由于脂褐质结构致密，不能被彻底水解，又不能排出细胞，结果在细胞内沉积增多，阻碍细胞的物质交流和信号传递，最后导致细胞衰老。
在老年性痴呆患者脑组织中有大械B淀粉样蛋白沉积，而B－淀粉样蛋白可作为老年性痴呆的鉴定指标。
5基因转录或翻译差错导致细胞衰老随着年龄的增长，机体的细胞内不但DNA复制效率下降，而且常会发生核酸、蛋白质、酶等大分子的合成差错，这种逐渐累积的差错最终引起细胞功能降低，并逐渐导致细胞衰老、死亡，这就是细胞衰老的基因转录或翻译差错学说。
6其他学说除了上述学说外，还有“神经免疫网络论”"钙调蛋白学说”“微量元素学说”等。
（二）复制性细胞衰老和氧化应激诱导的非端粒依赖性细胞衰老的调控细胞衰老的主要变化是细胞进入一种不可逆的生长停滞状态。
迄今对细胞衰老分子机制的认识，主要来源千对细胞衰老过程中细胞增殖周期停滞在G1期和S期的衔接期机制的研究。
G l-S期是真核细胞周期中重要的限制调控点，其中G期限制点是增殖细胞唯一能够接受外界增殖和抑制信息的调控点。
DNA复制发生在S期，在M期发生染色体的分离和胞质分裂，M期之后，细胞重返G。
期而撤离细胞周期。
研究表明，未能通过G1/S检查点的细胞也将退出细胞周期，并走向衰老（图16-3)。
目前认为，主要有两条途径调控细胞的衰老：一是复G。
期制性衰老的调控，它依赖于p53----+p21、pRb一E2F信号通（撤离细胞周期）路的调控；二是氧化应激诱导的非端粒依赖性细胞衰老，它受ERK一p38MAPK一p16一pRb信号通路的调控。
在复制性衰老中，当细胞染色质末端端粒显著缩短时，p53G2期被激活，促进p2J c;p//Wafl基因转录，p2l Cipl/WaO为一种CKI,衰老它通过抑制Cdk的活性，使pRb蛋白磷酸化受阻，与S期（撤离细胞周期）相关的转录因子E2F不能被释放，DNA复制不能进行，S期细胞无法从GI期进入S期，导致细胞周期停滞；在氧化(DNA合成）图16-3细胞周期与细胞衰老应激诱导的非端粒依赖性细胞衰老中，ERK的激活促使丝裂原启动激酶(MKK3和MKK6)的积累，进而激活p38MAPK通过Cdk抑制因子p16影响Rb磷酸化而导致细胞周期停滞。
总之，细胞衰老的原因及其机制是非常复杂的，虽然关于衰老的研究巳引起人们广泛的关注，近年来对其分子机制的探讨也取得了一些突出的、很有意义的成果，但要真正揭示衰老的机制，显然还有很长的一段路要走。
四、细胞衰老与疾病
除前面提到的早老性疾病，如Hutchin son-Gilford和Werne1早衰症之外，一般认为，细胞衰老与老年性疾病如神经退行性疾病、动脉粥样硬化性心血管疾病、糖尿病及肿瘤等密切相关。
许多研究表明，组织干细胞衰老是机体衰老的重要原因之一，也与某些老年性疾病的发生相关联。
例如，人间充质干细胞(mesenchymal stem cell, MSC)随着年龄的增加，其增殖和分化能力逐渐下降；随着年龄的增长，神经干细胞分化为神经元的能力也逐渐下降。
可以相信，尽管衰老与死亡是不可避免的生命规律，但随着衰老机制的阐明，延缓衰老特别是对阐述老年性疾病的发生机制和防治退行性疾病是能够做到的。
366第四篇细胞的基本生命活动
第二节细胞死亡
细胞死亡是指细胞生命现象的终结。
细胞死亡的进程可以很快，如剧烈的理化因子可使细胞迅速死亡。
但在非剧烈因素作用时，细胞死亡有一定的自然过程，尤其从细胞衰老到细胞死亡是一个渐进的过程，并且常有特征性的形态改变：细胞核对各种有害因子的反应最为敏感，如果核内的基因及其控制系统受到损伤，则转录、翻译等过程将中断，细胞的生命过程将改变或停止，细胞接近死亡时，核膜多发生断裂，DNA与蛋白质降解产物泄涌至核外，核仁亦逐渐溶解和消失；胞质内可发生内质网、线粒体肿胀，线粒体蜡断裂和消失；细胞表面微绒毛逐渐减少、消失；细胞的体积因失水而变小或因细胞间水分内渗而变大。
由于细胞死亡原因的多样性，细胞死亡时形态改变的过程和程度也不完全一样。
引起细胞死亡的原因很多，细胞死亡的现象也错综复杂。
根据死亡原因的不同，可以将细胞死亡分为正常死亡和非正常死亡。
正常死亡一般表现为个体发育过程中的生理性死亡，但在某些病理因素条件下也呈现出这种死亡状态；非正常死亡主要指超过细胞可以承受的强度或阙值的环境因子引起的死亡，以及由千机体病理状态导致的细胞死亡。
一、细胞死亡的方式
在正常生理和病理条件下，细胞可呈现出多种类型的死亡方式，目前发现主要有以下几类：1.细胞凋亡细胞凋亡指在特定信号诱导下，细胞内的死亡级联反应被触发所致的生理或病理性、主动性的死亡过程。
细胞凋亡多发生于生理情况下，也可发生在病理情况下。
细胞凋亡时，质膜始终保持完整，胞膜内陷将细胞内容物包被成一些痪状小体，即凋亡小体(apoptot i c body)，后者被周围吞噬细胞吞噬，不引起炎症反应。
近些年来发现，过度的细胞自噬将导致细胞死亡，因其死亡过程（程序性死亡）同细胞凋亡，被称为JI型凋亡。
二、细胞凋亡的概念与特征
（一）细胞凋亡是由死亡信号诱发的受调节的细胞死亡过程细胞凋亡(apop tosi s)是细胞在一定的生理或病理条件下，遵循自身的程序，自己结束其生命的过程。
“apoptosis”来源于希腊语，“apo”意为“分离”,“plo si s”指花瓣或树叶的脱落、凋零。
当时选用这个词，是为了强调这种细胞死亡是自然的生理学过程。
目前很多情况下，细胞凋亡亦被称作程序性细胞死亡(programmed cell death, PCD)，即在一定时间内，细胞按特定的程序发生死亡，这种细胞死亡具有严格的基因时控性和选择性。
但有些学者认为细胞凋亡与PCD有一定的区别，PCD是一个功能性概念，描述在一个多细胞生物体中，某些细胞的死亡是个体发育中一个预定的，并受到严格控制的正常组成部分，而凋亡是一个形态学概念，指与细胞坏死受到不同的基因控制的细胞死亡形式；PCD的第十六章细胞衰老与细胞死亡367最终结果是细胞凋亡，但细胞凋亡并非都是程序化的。
此外，细胞凋亡也可见千PCD之外的病理状气硒态，如抗癌药所致的癌细胞死亡、循环负荷过重引起的细胞死亡等（动画16-1“细胞凋亡的动态过程”)。
细胞凋亡现象普遍存在于人类及多种动、植物中，是多细胞生物体个体正常发育、维持成体组织结构不可缺少的部分，贯穿于生物全部的生命活动中，它是细胞生理性死亡的普遍形式。
例如人体内每天有5xl011个血细胞通过细胞凋亡被清除，以平衡骨髓中新生的血细胞。
哺乳动物神经系统的发生过程也是细胞凋亡的典型例子。
在脊椎动物发育早期，一般先要产生过量的神经元，但后来近一半的神经元发生凋亡，只有那些与靶细胞（如肌肉细胞、腺体细胞等）建立起良好的突触联系，并充分接受了靶细胞分泌的存活因子的神经元才保留了下来（图16-4)。
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A靶细胞
图16-4细胞凋亡的事例A发育中神经细胞的凋亡；B哺乳动物手指和脚趾在发育早期是连在一起的，指（趾）间的蹊通过细胞凋亡被清除，使单个指（趾）分开；C幼体的蜊斛向成体发育过程中尾部细胞的凋亡一旦正常的细胞凋亡过程受到破坏，将引起一系列的疾病，包括癌症、感染性疾病、自身免疫性疾病等。
例如，肿瘤的侵袭转移涉及肿瘤细胞黏附、基质降解、肿瘤细胞的迁移等，而失巢凋亡在肿瘤细胞的扩散和转移中起重要作用。
（二）细胞凋亡呈现出特征性形态学变化主要包括细胞皱缩(cell shrinkage)、染色质凝聚(chromatin condensation)、凋亡小体形成、细胞骨架解体等，其中以胞核的变化最为显著。
1细胞核的变化凅亡细胞的核DNA在核小体连接处断裂成核小体片段，并向核膜下或中央部异染色质区聚集，浓缩成染色质块，使细胞核呈现新月状、花瓣状等多种形态（图16-5)，染色质进一步聚集使核膜在核膜孔处断裂，形成核碎片或核残片。
368第四篇细胞的基本生命活动
2细胞质的变化由于脱水作用，凋亡细胞的胞质发生明显浓缩，其中的细胞器也发生不同程度的变化，尤其是线粒体和内质网。
凋亡早期，可观察到细胞内线粒体增大，崝增多，接着线粒体出现空泡化。
多数•情况下，凅亡细胞内的内质网腔增殖膨大，并为凋亡细胞形成的自噬体结构提供包裹膜。
凋亡细胞原有的疏松有序的细胞骨架结构也变得致密和紊乱。
细胞骨架的改变不仅仅是细胞凋亡的后果，还影响到细胞凋亡的过程。
3.细胞膜的变化凋亡细胞表面原有的特化结构，如微绒毛、细胞突起及细胞间连接等逐渐消失，细图16-5凋亡细胞核的“新月状”结构（由浙江大学李继承提供）胞膜起泡，但细胞膜仍保持完整，没有失去选择通透性。
一些与细胞间连接有关的蛋白质从凋亡细胞的膜上消失，但正常情况下位于细胞膜内侧的磷脂酰丝氨酸(phosphatidylserine, PS)则从细胞膜的内侧翻转到细胞膜的表面，暴露于细胞外环境中。
这些分子可能与凋亡细胞的清除过程有关。
4凋亡小体的形成凋亡小体的形成有三种方式：心发芽脱落机制。
凋亡细胞内聚集的染色质块，形成大小不等的核碎片后，整个细胞通过发芽(budding汃起泡(zeiosis)等方式，形成一个球形的突起，并在根部绞窄脱落，形成一些大小不等，内含胞质、细胞器以及核碎片的膜包小体，即凋亡小体（图16-6);(2)分隔机制。
在凋亡细胞内由内质网分隔成大小不等的分隔区，靠近细胞膜端的分隔膜与细胞膜融合并脱落形成凋亡小体；＠自噬体形成机制。
凋亡细胞内线粒体、内质网等细胞器和其他胞质成分一起被内质网膜包裹形成自噬体，自噬体在与凋亡细胞膜融合后排出胞外，形成凋亡小体。
有些细胞不形成凋亡小体，而仅仅发生核固缩和胞质浓缩，成为单个致密的结构，这也被称为凋亡小体。
在病毒性肝炎中见到的嗜酸性小体(councilman body)就是凋亡小体的例子。
图16-6扫描电镜下的凋亡细胞表面变化（山东大学辛华提供）A正常细胞；B微绒毛消失；C.凋亡小体（三）细胞凋亡时细胞生化改变的复杂性和多样性1.
DNA片段化核小体(nucleosome)是基因组染色体的基本结构，它和连接区(linker)组成核心核小体亚单位(core n ucleosomal subunit)，总长度为180~200bp。
细胞凋亡时，细胞的内源性核酸内切酶(endon uclease)活化，特异地在连接区切断DNA链。
因此，形成长度为180~200bp整数倍的寡聚核背酸片段，这种DNA片段化(fragmentation)的结果是在进行琼脂糖凝胶电泳时，凋亡细胞表现出特征性的DNA梯状条带(DNA ladde1)（图16-7)。
而细胞坏死时，DNA随意断裂为长度不一的片段，琼脂糖凝胶电泳呈＂弥散状”(smear)。
因此，尽管不是所有凋亡细胞都出现DNA梯状条带，人们仍把它«？
勹？
作为细胞凋亡最典型的生化特征之一。
第十六章细胞衰老与细胞死亡369
亡凋
慫笭
`淤淤
令心勹§吃
DNA内切酶
A核小体B
图16-7凅亡细胞DNA凝胶电泳时呈现梯状条带A细胞凋亡中DNA内切酶的活化；B细胞凋亡所形成的180~200bp整倍性DNA片段2细胞凋亡中的蛋白酶细胞凋亡的始动，以及发生、发展，主要是通过多种蛋白酶控制的，蛋白酶级联切割可能是凋亡最关键的过程，因此有学者提出蛋白酶的作用是凋亡机制的核心部分。
控制凋亡的蛋白酶有多种，如胱夭蛋白酶(cystein aspa rtic acid specific proteas e, caspase)家族、端粒酶或分裂素及钙蛋白酶(calpain)等。
3胞质Ca气pH的变化有研究认为C汒能通过两条途径诱导细胞凋亡。
一是胞内Ca2＋库释放，胞外C汒内流使胞质内Ca2＋持续升高，作为凋亡信号启动凋亡；二是Ca2＋的释放打破了细胞内结构的稳定，使细胞凋亡系统的关键成分与正常时不能接触到的基质发生反应，从而触发凋亡。
胞内的W和Ca2＋一样，其浓度对生命活动影响重大。
用地塞米松诱导巨噬细胞凋亡时，可观察到胞质内的pH先是急速升高，之后又缓慢降低，胞质逐渐碱化，这表明胞质碱化和酸化均能影响细胞凋亡，前者可能与细胞凋亡的启动有关，而后者可能是细胞凋亡的必然结果。
4线粒体在细胞凋亡中的作用细胞凋亡有胞核和胞质两条途径，即胞质中的细胞器也是凋亡的主要目标，尤其是凋亡时，线粒体发生一系列显著的变化：心线粒体呼吸链受损，能量代谢受到破坏，导致细胞死亡；＠线粒体释放细胞色素C(cytochrom e C, cyt C)，而cy t C是凋亡所必需的胱天蛋白酶家族的激活物；＠线粒体是细胞产生活性氧类物质(reactive oxygen species, ROS)的主要来源，ROS是细胞凋亡的信使分子和效应分子，凋亡时线粒体生成ROS增多；＠线粒体渗透转变孔(permeab山ty transition pore, PT pore)通透性增高这是凋亡早期的决定性变化。
PT孔是线粒体内膜和外膜在接触部位协同组成的一条通道，PT孔的开放可导致线粒体呼吸链解耦联，并且线粒体内的cy t C可通过开放的PT孔释放至胞质，进而触发caspase级联反应。
PT孔开放抑制剂，如环抱素(cyclosporin)，能够阻断细胞凋亡，表明PT孔在凋亡过程中具有重要作用。
此外，有学者曾提出线粒体调控细胞凋亡的观点，可见线粒体在细胞凋亡过程中起很重要的作用。
（四）失巢凋亡是又一种形式的细胞程序死亡
失巢凋亡(ano如s)是又一种形式的细胞程序死亡，是因细胞与细胞外基质和其他细胞脱离接触而诱发的。
正常的上皮或内皮细胞具有黏附依赖性，其存活依赖于细胞间和细胞与基质间的信号传递，称为铀定依赖。
正常上皮细胞或不具备转移性质的实体瘤细胞从原位脱落进入血流后就会引发细胞凋亡，这种在脱离原来生存环境的特殊情况下发生的细胞凋亡称为失巢凋亡。
这种现象在某些细胞分化生长周期短、组织更新快的细胞中表现更为明显。
例如，小肠上皮是入体内更新最快的组织之一，小肠上皮细胞从基底膜移动到上皮表面只需要6~7天的时间。
小肠上皮细胞的生长和分化对基底膜的依赖性更为明显。
因此，一旦发生脱落，细胞就很容易发生凋亡。
在体外培养的情况下，小肠上皮细胞也很容易出现凋亡现象，因此经常以小肠上皮细胞作为研究凋亡现象的对象。
除上皮细胞和内皮细胞外，其他类型的细胞也出现失巢凋亡现象，如骨骼肌细胞某些致瘤潜力低的黑色素瘤370第四篇细胞的基本生命活动细胞以及胚胎成纤维细胞等。
失巢凋亡的意义在于防止这些脱落的细胞种植并生长于其他不适宜的地方。
而肿瘤细胞，尤其是一些容易发生远处转移的恶性肿瘤细胞，具有极强的抗失巢凋亡特性，从瘤体上脱落进入循环系统后并不发生凋亡，从而完成转移过程。
恶性肿瘤的这种抗失巢凋亡特性已经在肺癌、肠癌、卵巢癌、恶性黑色素瘤、口腔鳞状细胞癌等的癌细胞体外培养实验中得到证实。
（五）细胞凋亡与细胞坏死的比较
由于细胞凋亡是一种主动的、由基因决定的细胞自杀(cell su i cide)过程，其性质与细胞坏死完全不同，两者属千截然不同的细胞学现象。
细胞坏死是指细胞受到激烈的物理、化学刺激或严重的病理性刺激后，引起的细胞损伤和死亡。
细胞坏死时，细胞膜发生渗漏，细胞内容物（包括膨大、破碎的细胞器以及染色质片段等）释放到胞外，导致炎症反应；而在细胞凋亡过程中，细胞膜反折并包裹断裂的染色质片段或细胞器等，随后逐渐分离而形成众多的凋亡小体，并最终为邻近的吞噬细胞所吞噬破坏。
行使吞噬功能的细胞一般是巨噬细胞，有时是上皮细胞或血管内皮细胞。
整个凋亡过程中，细胞膜的完整性保持良好，死亡细胞的内容物不会逸散到胞外环境中，因此并不引发炎症反应（图16-8)。
细胞坏死凋亡
细胞器肿胀石
染色质凝集呈絮状
戎尽豐詈尽密呈半月状
核固缩DNA片段化
乙＼产凋亡小体形成
霄勹1吞噬
凋亡小体
释放细胞内容物
吞噬细胞
炎症反应
三、细胞凋亡的影响因素
随着细胞凋亡在医学、生物学方面研究的深入，人们发现能诱导细胞凋亡的因素越来越多。
同一组织和细胞受到不同凋亡诱因的作用，其反应结果不尽相同，而同一因素对不同组织和细胞诱导凋亡的结果也各不相同。
目前，多数研究者认为，细胞凋亡的发生受以下两种因素调节。
B)、神经递质（谷氨酸，多巴胺，N－甲酰－D－天门冬氨酸）、Ca气糖皮质激素等。
第十六章细胞衰老与细胞死亡371
(2)损伤相关因子：热休克、病毒感染、细菌毒素、原癌基因（如myc, rel，腺病毒EJ A等）、抑癌基因（如野生型p53基因）、细胞毒性T淋巴细胞、氧化剂、自由基、缺血、缺氧等。
(3)疾病治疗相关因子：化疗、放疗、生物治疗、中药治疗等。
(4)其他有某些细胞毒性物质：如乙醇、氧化碑、B－淀粉样肤等。
2细胞凋亡的抑制因素(1)生理性抑制因子：如bcl-2原癌基因、突变型p53、各种生长因子、细胞外基质、CD40配体、一些中性氨基酸、锌以及雌、雄激素。
(2)病毒基因：如腺病毒EJ B、杆状病毒、牛瘛病毒crmA、EB病毒BHRFJ及LMP-1、单纯疤疹病毒等基因。
(3)其他：线虫的ced-9基因、半胱氨酸蛋白酶抑制剂、钙蛋白酶抑制因子、促癌剂（如PMA等）。
四、细胞凋亡的分子机制
大量的研究资料表明，细胞凋亡与某些基因的调控作用密切相关，因此人们将这些基因称为凋亡相关基因，并开始用它们来解释凋亡的分子机制。
（一）细胞凋亡受多种基因调控1调控细胞凋亡的ced基因和caspase基因家族(1)从线虫中发现调控细胞凋亡的ced基因：有关细胞凋亡的基因调控资料，最早和最完整的都来自对线虫体细胞凋亡的研究。
由于线虫成虫的体细胞仅有1090个，在发育过程中共有131个体细胞发生凋亡，研究者们可以从其受精卵起追踪每一个胚胎细胞的发育和分化过程。
研究巳发现有15个基因在不同程度上与线虫的细胞凋亡有关，并可大致分为4组：第一组基因在线虫的凋亡调控中有重要意义，包含ced-3、ced-4和ced-9基因；第二组包含7个基因，即ced-1、ced-2、ced-5-ced-8以及ced10，它们与凋亡细胞被吞噬清除过程有关，但与细胞死亡本身无关；第3组包含核酸酶基因1(nmc-1),如果nmc-1发生突变，则DNA裂解受阻，但并不能抑制细胞死亡，这也表明nmc-1并非凋亡所必需；第4组是影响特异细胞类型凋亡的基因，包括ces-1、ces-2(ces表示线虫细胞存活的调控基因）以及egl-1和her-I，它们与某些神经元和生殖系统体细胞的凋亡有关。
ced-3和ced-4基因：在线虫所有凋亡细胞中，均有ced-3和ced-4的表达，这两个基因的激活是线虫细胞凋亡起始或继续所必需的。
一旦基因突变使ced-3或ced-4灭活，将阻碍正常凋亡的发生，使发育过程中本该死亡的细胞也存活下来。
ced-3和ced-4基因主要表达在线虫胚胎发生期，此期正是凋亡多发期。
ced-9基因：ced-9基因的作用与ced-4基因相反。
ced-9能抑制胱夭蛋白酶的活化，从而抑制线虫体细胞凋亡的发生，因此ced-9也被称为“抗凋亡基因“(an t i-apoptosis gene)。
ced-9的显性突变可阻止那些注定要死亡的细胞不发生凋亡，而其突变失活则导致正常情况下应存活的细胞发生凋亡。
(2)哺乳动物的caspase家族蛋白是ced基因产物的同源体：人们已发现哺乳类细胞中存在ced-3的同源物胱夭蛋白酶家族，后者是一组半胱氨酸天冬氨酸酶，它们的共同特点是能特异性地断开天门冬氨酸残基后的肤键。
胱夭蛋白酶家族有十余个成员，是凋亡过程最重要的影响因素之一，但不同成员在凋亡中起的作用不全相同，如caspase-1, caspase-11主要参与白细胞介素前体的活化，并不直接参加凋亡的信号转导；而caspase-2、caspase-8、caspase-9和caspase-10参与凋亡的起始；参与凋亡执行的是caspase-3、caspase-6和caspase-7，它们能降解多种底物，导致核纤层和细胞骨架的断裂崩解等。
目前认为，凋亡的起始者（如caspase-8)与执行者（如caspase-3)之间存在上下游的关系，即起始者活化执行者。
ced-4的哺乳类同源物直到1997年才被证明是细胞凋亡蛋白酶活化因子－1(apoptos is protease acti vating factor-I, Apaf-1); ced-9与哺乳动物的bcl-2家族具有一定的同源性。
经典实验：细胞程序性死亡相关基因的鉴定背景知识自20世纪60年代起人们认识到细胞死亡是动物发育过程中的正常事件，可能是某些注定死亡的细胞受到精细调控的结果。
线虫作为生物发育研究中的重要的模式生物，在细胞程序性死亡的调节和机制研究方面起着至关重要的作用。
70年代，通过显微分析的方法构建了线虫发育的图谱，这一研究成果使人们得以了解线虫胚胎起源和每个细胞的定向分化情况，尤其是引入了一种特殊的细胞程序性死亡模式。
1977年，J.
Sulston和H.
R. Horvitz发现在线虫成虫发育早期的1090个细胞中，有131个发生程序性死亡。
同一类型的细胞在所有的胚胎中同时死亡，说明这种类型的细胞在胚胎发育中死亡是正常的发育现象。
并且这种类型的细胞在死亡过程中呈现出相似的形态学变化，提示这种细胞的程序性死亡过程受相同的机制调控。
为进一步探讨线虫发育过程中细胞程序性死亡的机制和调节方式，Horvi tz等进行了一系列遗传学分析。
在1986年发表于Cell的文章上，H.
M. Ell is和Horvitz首次报道了2个线虫发育过程中的细胞程序性死亡相关基因。
自此，拉开了凋亡分子生物学研究的序幕。
实验内容
线虫中发生程序性死亡的细胞在镜梒时呈现较高的折光率，因此Ellis和Horvitz可以运用这种分析方法识别未发生死亡的突变动物。
为了分离死亡过程中出现异常的突变体，他们用能与DNA结合的化学诱变剂甲磺酸乙酣(eth yl methanes ulfonate, EMS)处理大约4000条线虫，最终发现了2个未发生预期死亡的突变体。
这2个突变体都在ced-3基因上发生了隐性突变。
进一步研究发现ced-3基因突变阻碍了131个发育过程中的正常的程序性细胞死亡过程。
在后续的研究中他们鉴定了另一个与ced-3基因类似的抑制细胞程序性死亡的突变。
这个基因叫ced-4，定位于另一条朵色体上。
ced-4隐性突变也可以阻碍线虫中所有的程序性细胞死亡进程。
发表论文Ellis HM, Horvitz HR.
Genetic control of programmed cell death in the nematode C.
elega瓜Cell,往。
11986,44:817-829.
第十六章细胞衰老与细胞死亡373
后续影响
Ell is和Horv itz通过分离线虫突变体首次鉴定了细胞程序性死亡相关基因。
ced-3、ced-4以及后未鉴定的ced-9基因编码的蛋白在生物进化中高度保守，是凋亡发生中的起主要作用的调节因子和效应因子的蛋白前体。
ced-3的克隆和测序结果显示它与之前在哺乳动物中鉴定的caspase蛋白酶原同原。
线虫ced-9基因与人B淋巴细胞中分离的凋亡抑制因子bcl-2原癌基因同源。
Ced-4与人类凋亡蛋白酶原激活因子1(Apaf-1)同源。
线虫中这些细胞程序性死亡相关基因的鉴定为深入理解凋亡的分子基础和正常组织发育的机制奠定了基础。
由于凋亡的异常,调节与包括癌症、自主免疫系统疾病、神经退行性疾病在内的许多疾病相关，Ellis和Horvi tz的:科学发现在生物学和医学领域产生了深远的影呴。
由于其贡献，Ho1-vitz和英国的S.
Brenner以'及Suls ton共同荻得了2002年诺贝尔生理学或医学奖。
2既能抑制又能促进细胞凋亡的bcl-2基因家族bcl-2基因是B细胞淋巴瘤／白血病－2(B-cell lymphoma/leukemia-2, bcl-2)的缩写。
bcl-2蛋白不仅存在千B细胞淋巴瘤中，也见千许多正常组织和胚胎组织中，如神经组织、分泌腺的导管细胞、人和胚胎的皮肤，以及胚胎的肾脏与软骨组织。
随着研究的深入，bcl-2蛋白家族不断扩大，其中有的成员对凋亡起抑制作用，如bcl-2可防止或延迟由丫－辐射、糖皮质激素、热休克和多种化疗药物所诱导的细胞凋亡，故b cl-2基因也被称作“存活基因“(sm-vival gene)；但有的是凋亡的促进者，如bad、bax等。
bcl-2家族的氨基酸序列除了在BHl、BH2和BH3三个区段有高度保守性外，在氨基端还有一个比较保守的区段S1，这可能是调节凋亡以及蛋白质相互作用所必需的结构。
3.可促进细胞凋亡的ice基因白细胞介素－1~转换酶(interleukin-!~converting enzyme, ICE)基因与线虫的ced-3基因在DNA序列上高度同源。
ICE蛋白是一种半胱氨酸蛋白酶，其作用是将前白细胞介素－1~分解成有生理活性的白细胞介素－l B。
ICE过度表达可诱导哺乳动物成纤维细胞发生凋亡，而ICE的抑制剂，如牛痉病毒cr-mA基因产物可通过抑制ICE阻断凋亡的发生。
4可触发细胞凋亡的Fas和Fasl Fas是属于肿瘤坏死因子受体(tumor necrosis factor receptor, TNFR)和神经生长因子受体(nerve growth factor receptor, NGFR)超家族的细胞表面分子，Fas配体(Fas ligand, FasL)是TNF家族的细胞表面分子。
多种哺乳动物细胞表达Fas，而FasL仅表达于活化的T细胞。
FasL与其受体Fas结合将导致携带Fas的细胞凋亡。
入的Fas基因位于第10号染色体的长臂上，FasL的基因定位于第1号染色体，在结构上与TNF-a基因相似。
Fas/FasL的重要生理作用表现在：(DFas/FasL触发细胞凋亡。
抗Fas抗体、表达FasL的细胞，以及可溶性的FasL与Fas交联后均产生细胞凋亡信息；＠Fas/FasL对免疫系统细胞的死亡起重要作用。
以Fas为基础的和以穿孔素为基础的机制，是迄今发现的两种T细胞介导的细胞毒机制；＠Fas/FasL介导免疫＂豁免＂。
正常情况下，眼睛是免疫豁免区，因病毒感染而进入前房的炎症细胞将通过Fas/FasL系统出现凋亡，然而缺乏有功能的FasL的突变小鼠在受到感染时，眼内出现了明显的炎症反应。
Fas系统参与清除活化的淋巴细胞和病毒感染的细胞，而Fas和FasL功能丧失的突变可致淋巴细胞积聚，进而导致自身免疫疾病；另一方面，一次注射抗Fas抗体足以使成年小鼠在几个小时内死亡，这些研究结果表明Fas系统具有重要的病理学意义。
、5参与调节细胞凋亡的p53基因1979年，Li nzer研究病毒转染的哺乳动物细胞时发现了分子量为53kD的p53蛋白。
后来，用克隆的鼠p53基因和激活的ras基因共同转染细胞，成功地诱发了肿瘤。
到1989年，发现此前转染所用的是突变型p53基因，而野生型p53对细胞的生长有负调节作用，从而认定p53是抑癌基因。
p53基因是肿瘤中突变频率最高的抑癌基因，研究表明它能引起细胞周期阻滞，诱导凋亡和促进细胞终末分化，因此与细胞凋亡存在密切关系。
人类p53蛋白存在两种形式—野生型(wt p53)和突变型(mt p53)，二者均参与调节细胞凋亡，但前者对细胞增殖、转化有抑Qi}374第四篇细胞的基本生命活动制作用，故能促进凋亡，而后者可灭活前者的功能，抑制凋亡并导致细胞转化和过度增殖而产生肿瘤行为。
现已明确化疗药物、放射线及多种细胞因子等诱导的肿瘤凋亡过程中需要p53基因的参加，而糖皮质激素、钙离子载体和衰老等引起的凋亡却无需p53蛋白的存在，其中的确切机制尚不清楚。
目前认为，p53基因产物p53蛋白是转录激活蛋白，作为“基因警卫“维持细胞基因的完整性、DNA损伤的修复以及细胞周期的正常运转。
当p53基因缺失或异常时，p53失去监视作用，使细胞带着损伤的DNA进入S期，结果细胞因遗传不稳定性而产生突变和畸变，最后导致细胞癌变。
可见，p53基因产物诱导细胞凋亡可提供一种防护机制，使DNA损伤的细胞不能存活。
6. c-myc基因既是凋亡的激活因子又是抑制因素c-myc基因可以产生两种翻译产物c-Mycl和c-Myc2，两者的作用不同，有时甚至是相反的。
c-myc主要参与转录，在转录过程中可以激活并诱导细胞周期进程和分化，也可以阻止细胞分化或引起凋亡，因此它既是凋亡的激活子又是凋亡的抑制因素。
c-Mycl和c-Myc2的作用不能一概而论，并受作用细胞的微环境、时期、位点以及自身的质和量的影响。
除了上述基因或蛋白产物，其他一些基因如jun基因、c-fos基因及myb基因等都已证明与凋亡有关。
然而，由千凋亡的研究起步较晚，凋亡的过程又异常复杂，至今有很多间题尚无法阐明，因此我们只能将这些基因称为凋亡相关基因，而不能简单地称之为凋亡基因，它们所引起的凋亡是在一定条件下、对特定的细胞而言的。
（二）细胞凋亡的信号转导通路主要由死亡受体和线粒体介导细胞凋亡与细胞生长、分化一样，其过程一方面受细胞内和胞外多种信号的调控，另一方面也借多种生物信号在细胞间和细胞内的传递而得以实现。
目前的研究表明，细胞凋亡的信号传导途径具有以下特点：心传导途径的启动可因细胞的种类、来源、生长环境及诱因的不同而存在差异；＠凋亡信号传导系统具有多样性；＠细胞凋亡的信号途径与细胞增殖、分化的途径存在一些共同通路；＠凋亡的多条信号途径间存在互通的交叉部分。
现有研究表明，死亡受体和线粒体介导的细胞信号转导通路在细胞凋亡中起重要作用（图16-9)。
1死亡受体介导的信号转导通路细胞外的许多信号分子可以与细胞表面相应的死亡受体(death recep tor, DR)结合，激活细胞凋亡信号通路，导致细胞凋亡。
哺乳动物的死亡受体属千肿瘤坏死亡受体介导的细胞凋亡途径线粒体介导的细胞凋亡途径i歹包）．/．=、:.
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靶细胞<—_图16-9哺乳动物细胞凋亡的主要信号转导通路第十六章细胞衰老与细胞死亡375死因子受体和神经生长因子受体超家族，主要成员有Fas/Apo-l/CD95、DR-4/TRAIL-Rl、DR3/WSL1/Apo-3/TRAM P等。
配体FasL与死亡受体Fas结合后，诱导Fas胞质区内的死亡结构域(death domain,DD)结合Fas结合蛋白(FADD),FADD再以其氨基端的死亡效应结构域结合caspase-8前体，形成Fas-F ADD-caspase-8前体组成的死亡诱导复合物(deat h inducing signaling complex, DISC)，激活caspase-8，活化的caspase-8可以进一步激活执行死亡功能的效应蛋白caspase-3,6,7等，导致细胞凋亡。
2线粒体介导的信号转导通路研究表明，线粒体在细胞凋亡中处于凋亡调控的重要位置，许多凋亡信号（如DNA损伤、氧化剂等）都可以引起线粒体的损伤和膜渗透性改变。
很多bcl-2家族的蛋白，如bcl-2、bax、bcl-XL等都定位于线粒体膜上，bcl-2通过阻止cyt C从线粒体释放来抑制凋亡；而bax则通过与线粒体上的膜通道结合，促使cyt C的释放而促进凋亡。
进入胞质的cy l C可以与Apai--1一起与caspase-9的前体结合，从而导致caspase-9的活化，后者可以激活caspase-3，引起细胞凋亡。
此外，活化的caspase-8，一方面作用于caspase-3前体，另一方面催化BID(bcl-2家族的促凋亡分子）裂解成两个片段，其中含有BH3结构域的C－端片段被运送到线粒体，引起线粒体内cyt C高效释放。
BID诱导cyt C释放的效率远高于bax。
最近的研究表明，线粒体内可能存在核酸内切酶G(endonuclease G)、凋亡诱导因子(AIF)和凋亡抑制因子(IAP)的抑制蛋白Smac/D iablo，这些蛋白因子可能参与了不依赖caspases的凋亡途径。
3其他转导通路内质网和溶酶体在细胞凋亡中也起重要作用。
内质网与细胞凋亡的联系主要表现在两个方面：心内质网对Ca2窟离子浓度的调控。
很多细胞在凋亡早期会出现胞质内Ca2•浓度的升高，这种浓度的升高由细胞外Ca2＋的内流和胞内钙库（内质网）中Ca2＋的释放所致。
胞质内高浓度的Ca2＋一方面可以激活胞质中的钙依赖性蛋白激酶，另一方面可影响线粒体外膜的通透性促进细胞凋亡。
而内质网膜上的凋亡抑制蛋白Bcl-2则具有维持胞质内Ca"浓度稳定、抑制凋亡的作用。
(2)caspase在内质网的激活。
胞质内Ca2＋浓度的升高等因素可激活位于内质网膜上caspase-12，活化的caspase-12被转运到胞质中参与caspase-9介导的凋亡过程。
五、细胞凋亡的检测
检测细胞凅亡的方法有很多，归纳起来，可分为三方面：形态学检测、生化检测和流式细胞仪检测。
(—)形态学检测
形态学检测是鉴定细胞凋亡最可靠的方法之一。
主要是通过光学显微镜和电子显微镜，对组织或细胞进行各种染色，如HE染色、甲基绿－派诺宁染色、Gi emsa染色，可在普通光学显微镜下观察；用荧光染料，如叮唗橙，Hoech s t33258染色，在荧光显微镜下观察；或制成超菏切片用电子显微镜观察，都可以区分细胞凋亡与坏死。
（二）生化特征检测
细胞凋亡最显著的生化特征是Ca2•,M忙依赖的内源性核酸酶激活后，将细胞核染色体从核小体间断裂，形成约为180-200b p或其多聚体组成的舞核昔酸片段。
针对此寡核昔酸片段发展了检测凋亡的琼脂糖凝胶电泳法、原位末端标记法和ELISA法等，这些方法具有很高的特异性和敏感性，为凋亡的研究提供了强有力的工具和手段。
（三）流式细胞仪检测
用流式细胞仪检测细胞凋亡有其他方法不可比拟的优越性，既可定性又可以定械，且具有简单、快速和敏感性高等优点通过流式细胞仪，还可以将细胞分类后作进一步形态学和生化分析。
流式细胞仪检测凋亡的原理，主要是根据凋亡引发的在细胞、亚细胞和分子水平所发生的特征性改变（包括细胞膜细胞器和细胞核等的改变），造成染色体荧光染料(fluorochromes)对凋亡细胞DNA可染性(DNA s La inab山ty)发生改变，以及细胞形态的改变影响了光散射特性。
用流式细胞仪可以检测出凋硕01}376第四篇细胞的基本生命活动亡的亚二倍体细胞，即凋亡细胞在DNA直方图上正常二倍体细胞的G。
/GI峰前出现一个亚二倍体峰，即凋亡峰(apoptoti c peak, AP峰）。
已有研究人员开发出用千检测细胞凋亡的试剂盒，如双重凋亡检测试剂盒，它利用凋亡细胞中NO合成水平的变化，以及胞膜内侧的磷脂酰丝氨酸在凋亡时翻转到膜外的特点，结合荧光染色，实现在同一个细胞中检测上述两个凋亡事件，灵敏度和特异性都很高。
六、细胞凋亡与疾病
细胞凋亡是机体维持自身稳定的一种生理机制。
机体通过细胞凋亡清除损伤、衰老与突变的细胞，维持生理平衡。
某些致病因子可使细胞凋亡的基因调控失常，致使细胞凋亡减弱或增强，从而破坏了机体细胞的自稳态，最终导致各种疾病的发生。
（一）细胞凋亡过低导致相关的疾病发生
1细胞凋亡与肿瘤细胞凋亡在肿瘤的发病机制中占有重要地位。
癌变前的细胞可以通过细胞凋亡的正常调节而被清除。
恶性肿瘤发病过程中，常可见到凋亡抑制基因和凋亡活化基因表达异常。
如在入的肿瘤细胞中常常检测到p53基因的突变或缺失，使细胞对DNA损伤敏感性大大降低，细胞凋亡发生障碍进入无序、失控的生长状态。
一般肿瘤细胞高表达FasL，借以凋亡淋巴细胞，而又低表达Fas，而降底凋亡，这就形成肿瘤细胞有逃逸免疫及凋亡耐受的特性。
2.细胞凋亡与系统性红斑狼疮系统性红斑狼疮(systemic lupus e1-ythematosus, SLE)是典型的自身免疫性疾病。
由千Fas表达缺陷，引起自身反应性T细胞阴性选择的凋亡功能丧失，导致T淋巴细胞凋亡障碍，因此在外周淋巴器官出现大量CD4+,CD8十的T淋巴细胞，这些细胞具有自身反应性，从而引起SLE自身免疫性疾病。
（二）细胞凋亡过度导致相关的疾病发生
1.细胞凋亡与神经退行性疾病中枢神经系统不同部位特殊类型神经元的丧失是各种神经退行性疾病的病理特点，细胞凋亡与神经元的丢失密切相关。
现已发现，caspase-3在神经退行性疾病的病理过程中担任重要的角色，它不仅是起着凋亡的效应器作用，还能直接与阿尔茨海默病(AD)、帕金森病(PD)、亨廷顿舞蹈病、脊椎小脑失调等疾病的致病蛋白质分子相互作用，参与致病过程。
AD伴随B－淀粉样蛋白在病灶中央进行性堆积，研究结果显示，B-淀粉样蛋白能诱导神经元凋亡，但能被抗氧化剂阻断。
已经在肌萎缩患者体内发现有与神经元凋亡抑制蛋白有关的基因突变，使神经元凋亡抑制蛋白缺乏，导致脊髓前角运动神经元凋亡，肌肉出现失用性萎缩。
2细胞凋亡与AIDS病人类免疫缺陷病毒(human immunodeficiency virns, HIV)感染，可导致艾滋病(AIDS)。
HIV感染的宿主细胞膜表面，可表达gp l20，其受体存在于CD4+T淋巴细胞膜上。
因此，当gpl20与CD4+T淋巴细胞结合后，可诱导CD4+T淋巴细胞凋亡，导致免疫系统崩溃。
另外，HIV感染的外周血T淋巴细胞对TRAIL和FasL的诱导凋亡特别敏感。
3.细胞凋亡与心血管疾病人类的血管内皮细胞、平滑肌细胞和心肌细胞的凋亡是多种心血管疾病发生与演变的病理学基础。
在动脉粥样硬化、心肌病、急性心肌梗死，以及心力衰竭中均伴随着细胞凋亡。
近年来对动脉粥样硬化的研究发现，细胞凋亡主要以血管平滑肌细胞和巨噬细胞凋亡为主。
窦房结、房室结和希氏束细胞发生过多凋亡，引起心脏传导系统障碍而致心功能不全。
第三节细胞自噬
细胞自噬(autophagy)最早由T.
P. Ashford和K.
R. Porte t于1962年通过电子显微镜在人的肝细胞中观察到，是生物进化过程中被优先保留下来的一种维持细胞稳态的生理机制，其功能异常与许多疾病的发生发展密切相关。
第十六章细胞衰老与细胞死亡
—、细胞自噬的定义与分类
(—)细胞自噬的定义自噬源于古代希腊语，是“auto"(自我）与“phagy”（吞噬）的结合，顾名思义就是细胞的自我消化。
自噬是指胞质内大分子物质和细胞器在膜包艇泡中大量降解的生物学过程。
在自噬过程中，部分或整个细胞质、细胞器被包裹进双层膜的娱泡，形成自噬泡(autoph agic vac uole)或自噬体(au tophagosome)（图16-10)。
自噬体形成后很快变成单层膜，然自噬体后与溶酶体结合形成自噬溶酶体(autop hagolysosome or autolysosome)。
在自噬溶酶体中，待降解的物质在多种酶的作用下分解成氨基酸和核昔酸等，进入三狻酸循环，产生lµm小分子和能量，再被细胞所利用，实现细胞图16-10自噬体本身的代谢需要和细胞器的更新。
所以，自显示在电镜下观察到的自噬体，自噬体内含有一个线粒噬作用在消化的同时，也为细胞内新细胞器体和一个过氧化物酶体的构建提供原料，即细胞结构的再循环。
研究表明，细胞自噬与生物体的发育、分化相关，尤其是在低等生物中，受到环境胁迫因子的影响可以诱导细胞自噬现象的产生。
因此，长期以来细胞自噬被认为是细胞的自救行为。
但近年来发现，在某些条件下，细胞自噬也能导致细胞死亡，并证明细胞自噬的发生受多种基因的调控，如ATC(autophagyrelated)基因、蛋白激酶基因和磷酸酶基因等。
目前的研究认为，细胞自噬只发生在细胞进入周期后，静止期细胞对自噬诱导因素不敏感。
（二）细胞自噬可区分为几种类型根据细胞内底物运送到溶酶体腔方式的不同，哺乳动物细胞自噬可分为3种主要类型：微自噬(microautophagy)、巨自噬(macroautophagy)和分子伴侣介导的自噬(chaperone-medi ated autophagy, CMA)。
巨自噬即通常所指的自噬，是自噬形式中最普遍的一种。
巨自噬过程中，细胞质中的可溶性蛋白和变性坏死的细胞器被非溶酶体来源的双层膜结构包裹，即自噬泡，并被自噬泡携带到溶酶体中降解加工。
微自噬主要是溶酶体的膜直接包裹，如长寿命蛋白并在溶酶体内降解。
分子伴侣介导的自噬首先由胞质中的分子伴侣Hsc73识别底物蛋白分子的特定氨基酸序列并与之结合，分子伴侣－底物复合物与溶酶体膜上的受体结合后，转运到溶酶体腔中，被溶酶体酶降解，整个过程不需要痰泡的参与。
CMA的底物是可溶的蛋白分子，所以，CMA降解途径在清除蛋白质时是有选择性的，而前两者无明显的选择性。
为此，根据对降解底物的选择性，细胞自噬又分为非选择性自噬和选择性自噬两大类。
非选择性自噬中，蛋白质或细胞器被随机运送到溶酶体中降解；而选择性自噬对降解的底物具有专一性，如线粒体自噬(mitophagy)就是这样一种通过自噬机制选择性清除受损伤或不必需的线粒体的过程，以保证细胞正常生命活动的进行。
线粒体自噬的异常可能与神经退行性疾病，糖尿病和肿瘤的发生有密切关系。
此外，分泌自噬(crinophagy)、过氧化物酶体自噬(pexophagy)、内质网自噬(reticulophagy)、核糖体自噬(ribophagy)、细胞核碎片状自噬(nucleophagy)、蛋白聚集物自噬(aggrephagy)、噬脂(l i poph agy汃异源自噬(xenophagy)等都属于有选择性的自噬。
这些选择性自噬对特异性底物的清除通常包
括两部分：待降解底物的识别与传递和利用自噬核心机制来实现降解。
选择性自噬丰富了自噬的形式，使人们对自噬的形成机制有了更加深刻的认识。
@378第四篇细胞的基本生命活动二、细胞自噬的发生过程与调控细胞自噬的发生过程主要包括4个阶段，即底物诱导自噬前体(proaulophagosome, PAS)的形成、自噬体形成、自噬体与溶酶体融合和自噬体内容物被降解。
在即将发生自噬的细胞胞质中会出现许多游离双层膜结构，称为自噬前体。
自噬前体逐渐形成杯状凹陷，包裹细胞质或损伤／衰老的细胞器（如线粒体、内质网等），形成自噬体（图16-llA)。
然后与溶酶体融合成自噬溶酶体。
在自噬溶酶体中，其内含物被水解酶重新降解成各自底物，如氨基酸、核昔酸等，供细胞重新利用。
自噬体双层膜的起源尚不清楚，有人提出来源千粗面内质网，也有人认为来源千晚期高尔基复合体及其膜嵌泡，也有可能是重新合成的。
因此，尚有待进一步研究证实。
有多种基因产物参与到细胞自噬的发生过程。
目前已经鉴定出几十种自噬相关基因ATC及其同源物，随着研究深入，越来越多ATC基因被发现。
在哺乳动物自噬体形成过程中，由Atg3、Atg5、Atg7、AtglO、Atgl2参与的Atg复合蛋白过程和LC3(microtubule-associated protein l light chain3, MAP1-LC3)泛素化过程起着至关重要的作用。
在自噬体形成的早期阶段，由Atgl2-Atg5-Atg16L形成的复合物即与其外膜结合，促进前自噬体的伸展扩张，使之由开始的小痰泡样、杯样结构逐渐发展为半环状、环状结构；此时，浆溶性LC3-I蛋白开始被泛素化修饰成LC3-II，并向膜上募集定位。
当双层膜结构的自噬体即将形成环状闭合结构或刚刚闭合时，Atg5复合物便从膜上脱离下来，只留下膜结合形式的LC3-II定位千自噬泡膜上（图16-11B)。
因此，LC3-II含址与自噬体数址的多少成正比，LC3-II蛋白表达水平或LC3II/I比可以用来衡量细胞自噬水平。
（动画16-2“细胞自噬泡的形成过程及命运”).`.
之，又R
待降解物分隔膜包绕自噬体形成
之飞}
自噬体与溶酶体结合降解、再~环利用
图16-11细胞自噬过程A细胞自噬过程示意图；B自噬体（膜）形成（二）细胞自噬的调控细胞自噬作为生命现象中重要的生理性反应，其在不同条件下，以不同形式，形成不同程度的“动态平衡＂，这种平衡通常受到严格调控，以保持相对稳定。
岔，，自噬体的形成依赖千ill型磷脂酰肌醇三磷酸激酶(Class ill PI3K)的作用。
Class ill PI3K可磷酸第十六章细胞衰老与细胞死亡379化磷脂酰肌醇(Ptdlns)，生成3－磷酸磷脂酰肌醇(Ptdlns3P)~Ptdlns3P募集胞质中含-FYVE－或－PX－基序的蛋白质，用千自噬体膜的形成，由此参与对细胞自噬的正向调控。
此外，Class皿PI3K还可与Beclin l形成复合物参与自噬体的形成。
自噬反应调控路径的mTOR信号途径，对细胞生长具有重要调节作用，可抑制自噬反应的发生，是重要的自噬反应直接负反馈调节分子。
肿瘤抑制因子PTEN（为一磷酸酶）可促使PIP3去磷酸化，从而解除Class I PI3K/Akt(PKB)途径对自噬反应的抑制，是自噬反应的间接正反馈调节蛋白。
p53作为重要的肿瘤抑制因子在多种生理和病理状态下参与自噬反应的正、负向调控，提示自噬反应在肿瘤的发生发展过程中起着重要作用。
由千对细胞自噬研究时间不长，许多自噬相关基因的调控机制尚有待进一步深入研究。
三、细胞自晊的医学意义
自噬可以帮助细胞抵抗衰老、饥饿等外界压力，但过度的自噬又将导致细胞发生程序性死亡，被称为Il犁凋亡。
自噬对细胞的两面性作用导致其在疾病中起到复杂双刃剑效应。
近期研究表明自噬作用在生物体生长发育、细胞分化及对环境应激的应答方面极为关键，对防止某些疾病如肿瘤、肌病、神经退行性疾病以及对抵御病原微生物的感染和延缓衰老、延长寿命等方面发挥重要作用。
但在恶性肿瘤中，自噬的作用尚未确定。
在恶性肿瘤的进展阶段，自噬可以帮助癌细胞对抗营养缺乏和缺氧，尤其是血供不良的实体性肿瘤。
但研究表明，某些抗肿瘤治疗药物有可能通过自噬机制发挥作用，如被广泛用于乳腺癌治疗的药物它莫西芬可能通过激活细胞自噬，由神经酰胺介导上调Beclin1表达发挥作用。
目前，自噬淜控机制、对疾病的意义尚有待进一步深入研究。
随着科学研究的深入，自噬的进一步解密将帮助人们更好理解自身，基于自噬机制的临床治疗方法有望帮助人们缓解并治疗多种疾病。
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小结
细胞的衰老和死亡是有机体生命发展的必然阶段。
衰老的细胞在生理生化等各方面都发生了变化，如细胞皱缩，膜通透性和脆性增加，核膜内折，细胞器数量特别是线杠体数量减少，胞内出现脂褐素等异常物质沉积和脂类、蛋白质、DNA等细胞成分损伤，细胞代谢能力降低，最终出现细胞凋亡或坏死。
衰老的发生不光受有机体本身基因的调控，也受到环境条件的影响。
对于细胞衰老的原因也提出过各种假说。
细胞死亡有两种形式：细胞坏死和细胞凋亡。
细胞坏死指在外来致病因子作用下，细胞生命活动被强行终止所致的病理性、被动性的死亡过程。
细胞凋亡指在特定信号诱导下，细胞内的死亡级联反应被触发所致的生理或病理性、主动性的死亡过程。
细胞坏死时，细胞膜和细胞质中细胞器的质膜发生破裂，细胞质外溢，细胞解体并引起周围组织发生炎症反应。
然而，细胞凋亡时，质膜始终保持完整，胞膜内陷将细胞内容物包被成一些囊状小体，即凋亡小体，后者被周围细胞吞噬，不引起炎症反应。
细胞焦亡是新发现的细胞死亡方式，常伴随强烈的炎症反应，是机体一种重要的天然免疫反应。
梒测细胞凋亡可分为三方面：形态学检剧、生化检测和流式细胞仪检测。
细胞凋亡是机体维持自身稳定的一种生理机制。
机体通过细胞凋亡清除损伤、衰老与突变的细胞，维持生理平衡。
某些致病因子可使细胞凋亡的基因调控失常，致使细胞凋亡减弱或增强，从而破坏了机体细胞的自稳态，最终导致各种疾病的发生。
目前认为，细胞凋亡受许多基因调控；细胞凋亡380第四篇细胞的基本生命活动的信号转导通路主要由死亡受体和线拉体介导。
细胞凋亡的分子机制研究备受关注，细胞凋亡理论仍在不断的发展更新中。
尽管细胞的自噬与凋亡在形态、生化指标、参与分子和机制方面均存在不同，但越来越多研究表明二者在某些情况下可以相互桔抗或促进，可先后发生或同时共存于同一细胞，相同诱导因素在不同细胞中可分别诱发自噬或凋亡。
参与自噬和凋亡的分子也可能存在交又，如beclin1作为自噬重要调控基因，也可参与细胞凋亡的调控。
随着研究的深入，两者之间的相互关系似乎变得越来越复杂。
（李继承）
岔。
第五篇干细胞与细胞工程
第十七章干细胞与组织的维持和再生
干细胞(stem cell)一词，最早出现千1896年E.
B. Wilson关于蠕虫发育的研究论文中，但对于干细胞的深入研究，主要发生在近几十年。
20世纪60年代，发现了小鼠骨髓中有造血干细胞的存在，并认识到了它可以分化为不同类型的血液细胞。
80年代初，小鼠胚胎干细胞(embryon i c stem cell)被成功分离和培养，并证实了其具有形成三个胚层（外胚层、中胚层和内胚层）细胞的分化潜能。
随后，干细胞研究领域便进入了一个快速发展阶段。
特别是90年代以来，人类胚胎干细胞和一些组织干细胞陆续被分离培养成功，人们对其生物学特性认识也在不断深入，某些类型的干细胞（如造血干细胞、间充质干细胞等）巳经获批应用到疾病的临床治疗中。
干细胞在肿瘤、衰老和再生等重大医学问题研究中的重要意义开始显现，干细胞治疗也逐渐成为最具潜力的新型治疗方法用来治疗某些难治性疾病，因此干细胞生物学已经成为连接生命科学和医学两大研究领域的一门重要学科。
第一节干细胞概述
一、干细胞的概念和分类
干细胞存在于人体或动物个体整个发育过程中的各种组织中，具有自我更新(self-renewal)和多向分化潜能(plurip o t e n cy)的基本生物学特性，是个体的生长发育、组织器官的结构和功能动态平衡的维持，以及其损伤后的再生修复等生命现象发生的重要基础。
入和动物的个体都来自于一个单细胞，即受精卵。
受精卯经过卵裂、燧胚、原肠胚及器官发生等胚胎发育阶段，以及胚后发育过程，最终发育成为一个成熟的个体，直至衰老死ICM
亡。
受精卯细胞的分裂即卵裂，在其分裂3次（即8细胞期）之前，所产生的每一个细胞（包括受精卵）都具有全能性，也
胚胎胚泡期-i就是说，如果将处于这种状态的任何一个细胞植入子宫后，它,们都具有发育为一个完整个体的可能性。
这种具有发育全能胚状体性的早期胚胎细胞，谓之全能干细胞(toti potent stem cell)。
随/i\着发育的进行，早期胚胎形成一个中空的球性结构，称为胚外胚层中胚层内胚层泡。
在胚泡内的一侧出现一个小的细胞团，即内细胞团(inne1i i i cell mass, ICM)。
内细胞团细胞具有分化为成熟个体中所有类型细胞的潜能，是一种多能干细胞(pluripotent stem cell)。
然而，单就内细胞团细胞来说，则没有形成一个完整个体的能力，因为它们不能分化为胎盘和其他一些发育时所必需的胚外组织。
若将内细胞团细胞在体外培养，这就是习惯上所说图17-1胚胎干细胞的来源与早期分化目前胚胎干细胞(ES细胞）的主要来的胚胎干细胞(embryoni c stem cell, ES细胞）（图17-1)。
随着源是植入前毅胚泡的内细胞团，在体外胚胎的继续发育，内细胞团细胞（即多能性细胞）将快速增殖培养环境中ES细胞首先形成胚状体和进一步地分化，逐步地形成三个胚层，以及相应的组织器(e mbryoid body)，并分化为三胚层干细官。
这时，存在于各种胚胎组织器官发育的或在成体器官和胞，然后胚层干细胞再分化成不同的组组织中存在的干细胞，通常只分化成相应组织器官组成的细织细胞第十七章干细胞与组织的维持和再生383胞。
如造血干细胞具有分化成血液系统所有细胞类型的潜能，参与肝脏发育的肝干细胞具有分化为成熟肝细胞和胆管上皮细胞的潜能，参与神经系统发育的神经干细胞具有分化为神经元、神经胶质细胞的潜能。
这类在组织器官发育过程和成体组织修复和再生中起着重要作用的干细胞被称为组织特异性干细胞(tissue-specific stem cell，简称组织干细胞），或者成体干细胞(adult stem cell)，它是一种专能性干细胞(mult i potent stem cell)。
另外成体组织中还有一种干细胞被称为单能干细胞(un ipotent stem cell)，但只能向一种密切相关的细胞类型分化，与分化细胞不同的是它具有自我更新能力，如上皮组织基底层干细胞，肌肉中的成肌细胞等。
从以上叙述可以看出，个体发育的各个阶段都有干细胞的存在。
从全能性的受精卯到多能性的内细胞团再到专能性的成体干细胞直至成体内的单能干细胞，随着个体发育的进行，干细胞的分化潜能是一个逐渐变窄的过程。
可以说，受精卵、内细胞团细胞的增殖和分化是机体发育的基础，成体干细胞的增殖和分化是成年动物组织和器官稳态的维持、损伤修复以及再生的基础。
经典实验：小鼠胚胎干细胞的分离培养背景知识早期胚胎细胞具有独特的增殖和分化的能力，它可以分化为身体的各种细胞，并形成相应的组织和器官。
早在1970年，就有人发现小鼠的早期胚胎细胞从子宫移植到其他部位后有易发畸胎瘤(teratocarcinoma)的现象。
而且发现，畸胎瘤细胞可在体外培养，并可分化为许多不同类型的细胞。
进而也发现，如果采用显微注射的方法将它们移植到小鼠的袁胚内，它们还可以参与其胚胎小鼠的个体发育。
这些结果，暗示了畸胎瘤细胞可能具有正常胚胎干细胞特性的可能性，但并没有涉及畸胎瘤发生的原理。
G. R.
Marti n曾假设在畸胎瘤中的畸胎瘤细胞可能是正常的胚胎细胞，而它们在异常部位易发畸胎瘤的现象，可能是因为它们在异常的部位得不到本来在子宫中应有信号的诱导的结果。
基于这一假说，她培养了小鼠的胚胎细胞，而且得到正常的小鼠胚胎干细胞系。
她的研究与当时M.
J. Evans和M.
H. Kaufman的类似研究都为小鼠的遗传操作和发育分析，以及后来的人胚胎干细胞的研究奠定了基础。
实验内容
根据畸胎瘤细胞是起源于正常胚胎干细胞的假设，Marti n从小鼠裳胚中培养胚胎干细胞。
她最初从大约30个胚胎中分离到了4个克隆，证明了它们可以在体外连续地传代。
而且发现，这些细胞系（即胚胎干细胞系）与畸胎瘤的畸胎瘤细胞很相似。
当然，最重要的是这些胚胎干细胞在体外培养的条件下能被诱导分化为各种类型的细胞，其中包括：内胚层细胞、软骨细胞和神经样细胞。
而且，若将这些胚胎干细胞移植到小鼠体内，它们还可以形成含有多种分化细胞类型的肿瘤。
这些结果表明了采用体外培养的方法，可以从正常的小鼠胚胎中建立具有多向分化，替能的胚胎干细胞系。
发表论文M釭tin GR.
Isolation of a pluripotent cell line from early mouse emb1--yos cultured in medium cond山on ed by teratocarci noma cells.
Proc.
Natl.
Acad.
Sci. USA,1981,78:7634-7638.
Evans MJ, Kaufman MH.
Establishment in culture of pluripotent cells from mouse embryos.
Nature,1981,292:154-156.
后续影响
小鼠胚胎干细胞系的建立，已经对小鼠遗传学和小鼠的生长发育，以及与人类健康相关的许多医学问题等方面的研究产生了重要的影响。
后未的大量研究，也都证明了小鼠胚胎干细胞在被移植入小鼠裳胚后确实可以参与小鼠的正常发育。
特别是基因转移、基因定点突变以及干细胞转化后的双向选择等技术体系在胚胎干细胞中的成功应用，使得基因工程小鼠（如基因剔除小鼠、基因替换小鼠以及大片段转基因小鼠等）的产生有了可能。
基因工程小鼠的出现，为进行基因功能研究提供了一个完美的研究体系。
当然，1998年建立的人胚胎干细胞系，对生物医药领域的影响也是巨大的，因为它的增殖和分化特性，为人类疾病治疗方法的发展带来了新的希望。
现在已经知道，组织干细胞参与组织器官的生长发育，并持续存在千其个体的整个生命过程。
成体组织中的组织干细胞（也称成体干细胞，adu l t stem cell)存在于相应的干细胞巢(stem cell n iche)内，其基本生物学功能是通过有序的增殖与分化，以实现其所在组织中细胞的新旧更替，并维持组织器官结构和功能的稳态(h omeostasi s)。
一般认为，在哺乳动物的所有组织中都有组织于细胞的存在。
然而，由于不同的组织干细胞都具有各自的时空特性，对于它们的研究通常都需要特定的研究策略和研究方法，这就增加了研究的复杂性。
但随着研究的深入，研究手段越来越丰富，入们对组织干细胞的生物学特性的认识也越来越深入和全面，目前人们关注的热点更多地集中在组织千细胞与疾病发生或个体衰老等医学问题的关系上。
二、干细胞的基本特征
已有的证据表明，所有干细胞在形态学上都具有原始细胞的一些基本特征，其主要表现为细胞的体积较小（相对千所在组织中的细胞而言）、核／质比例相对较大，以及细胞质中各种细胞器（如内质网高尔基复合体及线粒体等）不够发达等。
胚胎干细胞和组织干细胞的生化特性具有明显差异，而不同组织的干细胞更是具有各自特有的生化特性，而且与其所处的分化等级有关，常被用作鉴定干细胞在组织中存在和评价其分化程度的标志。
如胚胎于细胞表达OCT4(oc tamer-binding transcription factor4)、SOX2[(s ex determini ng region Y)box2]、Nanog、STAT3(s ignal transducer and activator of transcript ion3), SSEA-1(stage-spec ific embryonic antigens I)碱性磷酸酶等分子；神经干细胞表达中间纤维nes li n、EGF(e pidermal growth facto)受体和FGF2(fibroblast growth factor2)受体等分子。
细胞角蛋白是特异性存在于上皮细胞中的细胞骨架成分，也常被用作上皮组织干细胞的标志分子；造血干细胞的端粒酶(telomerase)活性很高，但当它分化后，其端粒酶活性便随之降低。
第二节胚胎干细胞
在个体发育的袋胚阶段，其嵌胚腔中的内细胞团细胞具有多向分化潜能，它可以分化为胎儿或成体组织中的各种细胞类型。
若采用实验的手段，将内细胞团细胞分离出来，并将其在体外稳定培养，所得到的这种细胞就是一般所说是的胚胎干细胞(ES细胞）。
胚胎干细胞的另一个来源是原肠胚之后的原始性腺中分离获得的，也被称为EG细胞(embryon i c germ cell)，与ES细胞具有相似的性质。
—、胚胎干细胞的生物学特性
胚胎干细胞为未分化多能性细胞，它可表达早期胚胎细胞的分子标记，但在不同的物种之间，其表面抗原的表达情况可有很大的差异，例如，小鼠的胚胎干细胞可以表达阶段特异性胚胎抗原－1(SSEA-1)、不表达SSEA-3和SSEA-4，但人的胚胎干细胞则不表达SSEA-1，而表达SSEA-3和SSEA-4。
此外，分离自内细胞团发育阶段之后的早期胚胎中的具有多向分化潜能的EG细胞(e mbryoni c germ cell)，由千细胞所处的发育阶段不同，其分子标志与胚胎干细胞也是不完全一致的。
例如，人EG细胞可表达SSEA-1，但入胚胎干细胞则不表达SSEA-1。
(—)胚胎干细胞体外培养中呈现克隆化生长和快速增殖的特性胚胎干细胞具有原始细胞的形态和生化特征。
胚胎干细胞的体积较小，核质比例较大，内质网及第十七章干细胞与组织的维持和再生385高尔基复合体等细胞器不发达。
在娱胚中，它们以致密的集落样的形式（即内细胞团）生长，并附着于裴胚的内侧壁。
在体外培养的条件下，胚胎干细胞的体积仍然很小，核质比例很大，核中可有多个核仁，它们也是以致密的集落样的形式生长，形似鸟巢（图17-2)。
胚胎干细胞可以在体外无限扩增，增殖迅速，可以进行传代、遗传操作和冻存，表现并保持稳定的、正常的二倍体核型。
现在已经知道，各种哺乳动物的胚胎干细胞在体外培养条件下都具有相似的形态特征。
图17-2体外培养的人胚胎干细胞A内细胞团细胞形成的原代克隆，标尺l OOµm; B H9株人胚胎干细胞的克隆，标尺100µ,m; C放大的H9株人胚胎干细胞的克隆，标尺50µ,m; D.
l-19株人胚胎干细胞分化后的形态，标尺100µ,m（二）胚胎干细胞具有向三个胚层分化的潜能在个体发育中，存在于痪胚内细胞团中的千细胞具有分化为后续发育个体的任何组织细胞的潜能。
由千胚胎千细胞体外培养的成功，这一概念已经通过实验的方法得到了充分的证实。
其大致的做法有三个方面：少将培养的胚胎干细胞在体外条件下进行诱导分化，然后观察其分化的情况。
例如，将人胚胎干细胞在没有胎鼠成纤维细胞作为饲养层的条件下进行培养，其胚胎千细胞就会发生分化，而且在其培养液中还可以检测到a-甲胎蛋白和人绒毛膜促性腺激素(h CG)的存在，这表明有向内胚层和滋养层方向分化的现象发生。
又如，将胚胎生殖细胞置于白血病抑制因子存在的条件下，其中的部分细胞能分化成胚状体(embroyoid body，曾称类胚体、拟胚体）。
在所形成的类胚体中，可以发现有属千三个胚层的各种类型的分化细胞的存在，这就说明了胚胎生殖细胞具有多能性干细胞的特性。
＠将体外培养的胚胎干细胞移植到免疫缺陷型小鼠的皮下，然后观察是否可以形成混合组织瘤。
例如，将人胚胎干细胞移植到重症联合免疫缺陷小鼠的皮下，其移植细胞就可以产生胚胎组织瘤，而且在其瘤组织中观察到了胃上皮（内胚层），骨和软骨组织、平滑肌和横纹肌（中胚层），神经表皮、神经节及复层鳞状上皮（外胚层）等细胞的存在，这就提示了人胚胎干细胞具有形成内、中、外三个胚层的潜能。
＠＂嵌合体”实验。
将体外培养的胚胎干细胞移植到小鼠娱胚腔中，观察植入的细胞是否可以分化为各组织细胞。
1990年，A.
Nagy等通过显微注射的方法，将体外培养的小鼠胚胎千细胞植入小鼠的痪胚腔，使其参与内细胞团的继续发育，进而通过对所发育小鼠的各种组织的分析，发现组成这些组织的细胞有些来源千植入毅胚腔的外源ES细胞，故称该小鼠为＂嵌合体小鼠＂。
该实验证明了胚胎千细胞确实具有分化为包括生殖细胞在内的各种组织细胞的潜能。
这种形成＂嵌合体”的实验被认为是证明ES细胞多分化潜能的“金标准＂。
然而，由于伦理道德等方面的原因，这种方法不能用于人胚胎千细胞的分化评价（图17-3)。
巨尸壬
体外培养
低密度培养＼巨氢三，2
拟胚体
注射入NOD/SCIO小鼠皮下组织学分析
析记的E::｀'
未标记的宿主胚胎
目前，随着研究的深入，ES细胞多能性、自我更新与定向分化机制也被逐渐阐明。
当前研究证明，入与小鼠的胚胎干细胞在诸多方面存在差异，比如两种胚胎干细胞所需的培养条件完全不同，细胞所形成克隆的形态、生长、表面标记及潜能状态均不一样，但是不论小鼠还是人类，细胞的多能性主要由一个由转录因子Oct4为核心，同时包括Sox2与Nanog的多能性网络调控。
尽管该多能性环路在人与小鼠多能干细胞中相对保守，但多能性因子的下游通路以及相应的精细调控可能并不完全一致。
至于这种差别是由种系的不同引起，抑或是由千发育时程的不匹配所致，目前还没有确切的结论。
二、胚胎干细胞的体外分化
一般认为，ESC的分化受到内源性和外源性因素的共同调节。
内源性因素即不同基因在不同时间和空间的开启和关闭，涉及各种转录因子的作用。
外源性因素则是指细胞间的分化诱导、分化抑制作用及细胞外物质的介导作用。
ESC的分化研究分为一般诱导分化和定向诱导分化两类。
前者是指加入一定的分化诱导剂，常用的是全反式维甲酸(RA),ESC就可以同时或先后分化出不同类型的细胞，这反映了ESC不受约束的自我分化，应用意义不大。
目前主要目标是针对不同的终末目标细胞，通过改进培养方式、选择分化诱导剂，研究ESC的定向分化。
目前已报道的由ES细胞诱导分化的细胞主要有造血细胞、心肌细胞、神经细胞、脂肪细胞、胰岛细胞、内皮细胞、上皮细胞、肝细胞、成骨细胞和软骨细胞、胰岛素分泌细胞等等。
目前的研究方法大约分成两大类，一种方法是胚状体的诱导分化。
先诱导胚胎干细胞形成胚状体，然后再从胚状体中分离所需要的目标细胞，进而扩大培养获得一定数量的目标细胞。
胚状体通常由具有三个胚层特性的衍生物所组成，可以认为是大多数成熟体细胞系的前体细胞。
中胚层和外胚层的前体细胞在几天内便可形成，而一些内胚层的细胞类型则需要较长的时间，一般在10天以后。
第二种方法是不经过胚状体，而是利用单层培养的ES细胞，直接诱导获得目标细胞，当然这种诱导往彸凸？
往要经过分步诱导才能完成。
第十七章干细胞与组织的维持和再生
(—)将ESC诱导分化为中胚层细胞
胚状体形成之后，可将其调整为一般的正置状态进行培养，使其附着千培养皿的表面上生长，这时有可能在胚状体上观察到个别正在发生＂搏动”的区域。
在随后的正置贴壁培养中，可以看到大片状的、呈同步收缩的细胞。
在具有收缩特性的细胞群中，反映心脏不同特殊功能的细胞可以用电生理方法检测出来，包括心房样细胞、心室样细胞、浦肯野细胞样细胞和结细胞样细胞。
研究发现，将胚胎于细胞来源的心肌细胞植入小鼠体内之后，这些胚胎千细胞来源的心肌细胞能够整合入小鼠心脏组织中，并参与血管形成，而且还能在所植入的位置上继续增殖与分化。
目前，巳经可以基千鼠胚胎干细胞诱导分化的方案，从人类胚胎干细胞中产生心肌细胞，这无疑为再生医学中的心脏组织工程提供了一个全新的思路。
但是，该方案也存在一些问题。
例如，除了组织免疫相容性的问题之外，胚胎干细胞来源的心肌细胞的分化状态也正在得到关注，这些在体外状态下所得到的分化细胞更多地表现为胎儿心肌细胞的特征，而没有成人心肌细胞的基本表型。
也有研究发现，植入的具有自主＂搏动”特性的心肌细胞还可能会引发严重的心律失常，这些细胞一旦整合入内源性的心脏组织中，这种心律失常则很难加以纠正。
因此，胚胎干细胞的治疗在从实验室研究到临床应用之前，还有许多问题需要解决，其中最为重要的一点就是要证实，由胚胎干细胞分化产生的各种类型的分化细胞是否具有与宿主组织之间发生完全的功能性整合的能力。
（二）将ESC细胞诱导分化为外胚层细胞
依据发育生物学的基本理论，现已在体外建立起了一套化学成分确定的人类多能干细胞向神经定向分化的诱导系统，能较好地模拟了人类神经发育早期的主要过程，且时间区分明显，各时期的标记物清楚，是研究人类神经发育的良好模型。
例如，由ES细胞形成的胚状体在不加额外的诱导因子的清况下，细胞在第7天开始表达转录因子Pax6(Pai red box protein6)。
如果生长于培养皿面上，这些早期的神经上皮细胞于一周后形成明显的花环状结构，并开始表达其他神经系的标记物如Soxl。
激活FGF信号通路，或抑制SMAD通路，会明显促神经分化。
细胞表达Pa:x6但尚未表达Soxl时，它们能在塑型因子的作用被定向分化至特定细胞谱系。
例如，在视黄酸RA作用下，本来向颅侧分化的细胞转而向脊髓分化。
但是，RA能对细胞起作用的时间窗口往往非常短暂，只有几天时间，一旦细胞开始表达Soxl，这些细胞便不能再被分化为脊髓细胞。
小鼠胚胎干细胞向神经外胚层的分化相对容易，目前已有几种不同的方案来得到大量的神经元样、星形胶质细胞样或少突胶质细胞样细胞。
这些方案可以不必经过胚状体的步骤，而是直接通过胚胎于细胞的单细胞层培养的方式，使其分化为神经外胚层细胞。
这种分化方案可以将超过80％的人多能干细胞转变为PAX6十神经系细胞，进而能分化为各种细胞亚类。
有研究表明，这些分化细胞被植入小鼠模型后，仍然具有功能活性（即可以形成突触并产生动作电位），而且能够整合入大脑，并可纠正某些神经变性疾病的表型。
（三）将ESC细胞诱导分化为内胚层细胞
由于在胚胎发育过程中，内胚层的出现最晚，所以其细胞特化过程较为复杂，所以ES细胞的体外诱导分化获得内胚层细胞，理论上也更困难一些。
关于胚胎干细胞向肺泡上皮细胞的分化，虽然目前也有一些工作，但由于肺的细胞组成和组织结构复杂性以及对肺前体细胞缺乏确切的定义，以及诱导效率较低而且纯化困难而始终无法得到广泛推广。
目前也有通过先将ES细胞诱导成内胚层来源的前体细胞然后再进一步诱导成肺、肝、胰腺等组织细胞。
随着胚胎发育的分子机制研究的深入，控制分化的关键基因逐渐清晰，通过优化体外诱导体系获得内胚层细胞也是比较可行的路线。
尽管目前在实验室里确实可以将胚胎干细胞诱导分化为许多类型的具有相应表型的细胞，但在其分化的效率、成熟的程度、分离的纯度以及在活体中是否具有真正的功能等方面则仍然还有许多问题需要解决。
388第五篇干细胞与细胞工程
三、诱导性多潜能干细胞的获得及生物学特性
2006年，日本科学家山中伸弥团队成功地利用病毒载体转染将四个转录因子Klf4、Sox2、Oct4及c-Myc导入小鼠成纤维细胞获得了多潜能细胞，仅仅一年后，人的多潜能细胞也通过相同的转录因子体系或不含有c-Myc的转录因子体系而成功建立，这些重编程的多潜能细胞现在被称为诱导性多潜能干细胞(induced Pluripo lent Stem Cells, i PSCs)。
虽然这些人iPS细胞的多潜能性质与人ES细胞并不完全一致，但是他们的确在形态和分化能力上面与人ES细胞极其相似，比如在体外能分化成三胚层而且能在免疫缺陷小夙体内形成畸胎瘤。
人们最初对iPS的兴趣主要集中在iPS细胞在药物筛选、模拟人类疾病和病人个体化治疗方面的潜在应用前景上。
最初的诱导体系使用了逆转录或慢病毒载体基因转导体系来构建iPS细胞，其潜在的不利后果是转基因可随机插入到基因组中，可能会破坏正常基因表达，所以后来很多实验室的工作集中在如何避免使用病毒和不引起插入突变方面。
最近出现的方法中有利用非整合型质粒载体和可移除的转座子进行基因转染的，有通过直接导入转录因子雷组蛋白的方法进行重编程的。
比较有临床应用价值的是利用某些小分子化合物来诱导细胞重编程为iPS细胞的方法。
通过高通扯药物筛选可以获得这些有效小分子的最佳组合，这种方法由于诱导成分明确而且没有外源基因的导入，安全性会更高。
虽然目前还没有利用iPS治疗疾病的临床前和临床实验报道，但是由于其来自于病人自身，使用中不会产生免疫排斥反应，使得i PS细胞在某些疾病治疗方面显示出ES细胞所没有的优越性。
对某些遗传缺陷的病人，可以将他们的iPS细胞进行基因打靶或者基因编辑技术对基因缺陷进行修复，然后再移植到病人体内，达到恢复正常基因功能的目的，这种设想在小鼠锁刀型贫血症的治疗中已经取得成功。
基因修正的iPS细胞来源的肺前体细胞也同样被证明在治疗遗传突变引起的肺病，像森性纤维化、al－抗胰蛋白酶缺乏，和表面活性蛋白不足等疾病治疗中具有很好的效果。
第三节组织干细胞
组织干细胞是在成体组织内具有自我更新能力及能分化产生一种或一种以上特化细胞的原始细胞。
在活体内，组织干细胞存在千特定的微环境(mi croenv i ronme nl)中，具有直接参与其组织器官结构和功能动态平衡的维持的功能。
所以，对于组织干细胞生物学特性的认识，不仅需要研究干细胞本身，而且更需要研究千细胞与其微环境之间的关系。
随着研究的深入和研究手段的不断进步，人们对组织干细胞自身的生物学特性有了逐渐深入的认识，包括造血干细胞在内的许多其他组织的细胞已被成功分离或鉴定（图17-4)，而且对其生物学行为和其发生机制也开始有了很深入的研究。
—、组织干细胞的基本特征
(—)组织干细胞的增殖相对缓慢而且具有自稳定性1干细胞的增殖速率相对较缓慢生理状态下成体组织中干细胞的分裂比较慢，例如小鼠的造血干细胞每2.5周才复制一次，人的造血干细胞每10个月才复制一次。
目前认为，于细胞的这种缓慢增殖对维持组织稳态具有重要意义。
一方面有利于干细胞对特定的外界信号作出反应，以决定其细胞是进入增殖状态，还是进入特定的分化程序，另一方面还可以减少DNA复制过程中基因发生突变的概率，降低突变的累积。
2.干细胞增殖系统具有自稳定性自稳定性(self-maintenance)是指干细胞可以在生物个体生命期间内自我更新(self-ren ewing)并维持其自身数目恒定的特性，它是干细胞的基本特征之一。
干细胞要维持自我更新，干细胞必须要进入细胞周期进行分裂，而且后代细胞必须至少有一个细胞能保待未分化状态，这两个方面如果不能保持相对平衡就会导致细胞缺损或者组织异常。
研究表明，这种平衡第十七章干细胞与组织的维持和再生389.
期皮曼
』一』一』－－
细胞维持自身数目恒定的基本方式。
例如，在果蝇的外周神经组织中，其感觉器官的前体细胞的不对称分裂是受一系列基因调控的，insc基因就是其中的一个。
该基因的表达产物（即Insc蛋白）至少在三个方面对不对称分裂进行调控：心不对称地A.干细胞的简单不对称分裂；B干细胞的群体不对称分裂Numb;＠不对称地分配细胞内mRNA;＠决定细胞分裂时纺锤体的取向。
但对哺乳动物而言，却并非如此简单。
除了存在与上诉类似的单个细胞的不对称分裂外，在有些哺乳动物的可自我更新的组织中，干细胞产生的两个子细胞既可能是两个千细胞，也可能是两个特定分化细胞，即所谓的对称分裂。
但平均而言，每一个干细胞可以产生一个子代干细胞和一个特定分化细胞。
因此，从某种意义上讲，哺乳动物的干细胞是种群不对称分裂(populational asy mmetry division)。
干细胞不对称分裂机制的存在，使得机体对干细胞的询控更具灵活性，可以更灵活的应对机体生理变化的需要。
为了保持千细胞数目的恒定，机体需要对干细胞的分裂进行十分精密的调控。
有研究表明，在小肠隐窝(crypt)中，如果额外多产生一个干细胞，则该干细胞进而就会多产生64-128个子代细胞，而每个正常隐窝仅由大约250个细胞组成。
由此可见，维持干细胞数目的恒定有保持组织的稳定和功能的重要性。
以此，哺乳动物干细胞分裂方式的调控机制也一度成为研究入员关注的热点。
不对称分裂是维持干细胞数量和干细胞特性的重要条件，但分裂后千细胞静息状态的维持和激活的调控更是在组织维持、再生、功能发挥、可塑性以及组织衰老和死亡中起决定作用的因素。
目前研究试图解释干细胞维持静息状态的机制，比如E.
Llorens-Bobadilla等2015年利用二代测序技术（见第三章），从成体脑室管膜下区中分离出几种神经干细胞并对其单细胞基因表达谱进行了分析，发现＼。
叮i}头D大脑，C小肠隐窝干细胞；B毛痰，千细胞位于膨胀部位表皮组织，干细胞位于基底层；A；干细胞位于室管膜或下脑室（V：脑室区；SVC：下脑室区；E：室管膜；OB：嗅觉球）；E造血系统(HSC：造血干细胞；A：脂肪细胞；M：巨噬细胞；T-L:T沿巴细胞；B-L:B淋巴细胞；B：嗜碱性粒细胞；E：嗜酸性粒细胞；N：中性粒细胞心：红细胞；P：血小板；S：基质细胞；V：静脉；Arl：动脉）
的实现，即干细胞自我更新的维持，是通过干细胞不对称分裂来实现的。
当干细胞发生分裂后，如果所产生的两个子代细胞都是干细胞或都是分化细胞，这种分裂方式称为对称分裂(symme try di vision)；如果产生一个干细胞和一个分化细胞，则称之为不对称分裂(asymmet1-y divi s i on)（图17-5)。
"对无脊椎动物而言，不对称分裂是干分配细胞膜上的膜联细胞命运因子(mem图17-5干细胞的不对称分裂加ne-associated cell fate determinant)，如
埏毛
毛,壬驳.
初／突质
层层层
鳍卿赞黜
化分
A表皮
胞间细干
390第五篇干细胞与细胞工程
这些细胞对大脑急性缺血性损伤的反应各不相同。
这些处于从静息到激活之间各种状态的于细胞共存于一个干细胞巢内。
单细胞基因表达谱的分析为解释千细胞静息状态的维持和激活机制提供了重要的资料。
此外，毛痪干细胞也是研究这一问题的很好的模型。
但是静息干细胞由千缺乏明确的分子标志而且数量较少，所以分离和鉴定都非常困难，而通过组织损伤等手段分离获得的干细胞往往被认为是被激活的干细胞。
3过渡放大细胞的增殖速率远高于干细胞在发育过程中，当新的组织和器官形成需要时，干细胞分裂会相应加快，但是，当机体成熟，干细胞分裂会逐渐变慢，并逐渐进入静息状态，以避免成熟前过度消耗和减少突变概率。
过渡放大细胞(tran s it amplifying cell,TAC)是激活的干细胞经过不对称分裂产生的位千干细胞和分化细胞之间的一种细胞类型（图17-6)，具有一定的分化潜能，所以也有人将其称为过渡放大前体细胞(transit amplifying progenitor cell, TAP)，其主要特性就是其增殖速率显著高于千细胞。
如小肠过渡放大细胞比小肠干细胞分裂速度大约快一倍。
目前发现有很多组织干细胞都会通过不对称分裂产生过渡放大细胞，包括人和小鼠的角膜干细胞、人乳腺干细胞、前列腺上皮、哺乳动物表皮、胃肠道干细胞、哺乳动物毛溪干细胞等。
一方面，干细胞可以借助这种不对称分裂，保持自身干细胞特性和数目的稳定性，另一方面可以借助千过渡放大细胞较高的增殖速率和分化潜能来增加分化细胞的数目，以满足组织更新或修复的需要。
例如小鼠表皮基底层的干细胞所产生的过渡放大细胞对维持表皮的组织稳态有重要作用。
表皮基底层细胞通过不对称分裂产生一个子代细胞（干细胞）保留在基底层，另一个子代细胞位千基底上层，也就是会快速分裂的过渡放大细胞。
由千不对称分裂，基底层的干细胞数目能够保持稳定，而过渡放大细胞的数址快速上升，并继而分化产生新的表皮层或进行组织修复。
可以观察到在成层活动发生时，在基底表皮层中，有丝分裂纺锤体超过70％的是垂直朝向基底膜的。
（二）组织干细胞分化具有很强的可塑性
1组织干细胞的分化具有谱系限定性在个体发育的整个过程中，其个体的各种组织中都有干细胞的存在，处于不同发育阶段和不同组织器官中的干细胞的分化潜能，则具有严格的谱系限定性。
一种组织干细胞它通常只能分化产生其所在组织内的或与之相应的特定功能的细胞，即只产生其细胞谱系以内的细胞类型，而不产生其他组织中的细胞类型，如小肠干细胞可分化产生小肠组织细胞（即吸收细胞、杯细胞、嗜酸细胞和肠内分泌细胞），神经干细胞只能产生神经组织细胞（即神经元、星形胶质细胞或少突胶质细胞）。
干细胞（包括全能干细胞、多能干细胞和位于各种成体组织中的组织特异性干细胞）分化谱系的限定性有其复杂而严格的调控机制，由于它是认识和理解许多生物医学现象的复杂性以及其发生机制的基础，所以，干细胞分化调控机制的研究是当今干细胞生物学中的重要研究领域之一。
2组织干细胞的分化潜能又可称之为干细胞分化的可塑性可塑性是指细胞对外源和内源因子作出反应从而改变细胞现有状况的能力。
从分化的角度，干细胞的分化潜能又可称之为细胞的可塑性，比如神经千细胞可以分化为神经元、星形胶质细胞和少突胶质细胞。
而在某些特殊的条件下，神经千细胞的分化为造血细胞，甚至有的研究结果提示植入小鼠胚胎内的神经干细胞可以分化成三个胚层来源的细胞，这也是干细胞分化的可塑性。
1997年，M.
A. Egli t i s等人将从成年雄性C57BU6j小鼠中分离的造血干细胞移植到受亚致死扯照射的雌性WBB6F l/J-kitW/k itW-V小鼠体内，三天后在受体雌鼠的胶质细胞中检测到Y染色体的存在，虽然该实验方法受到一定的质疑，但这暗示了成年动物的造血干细胞可分化成为脑组织中的胶质细胞。
随后，类似的发现还包括成体造血千细胞分化形成肌细胞和肝细胞。
然而，在活体内（包括在生理状态和病理状态下），组织千细胞是否具有这种特性，则目前尚不明确，但要强悯的是，不论是离体还是载体研究，都要通过利用报告基因追踪观察这些细胞的活动，不仅要证明被标记的成体干细胞具备新组织的关键结构和生化特性，还要证明这些细胞能适应新组织的内环境并能生存下来，同时也能像该组织内的其他成熟细胞那样发挥作用。
3分化细胞可以通过去分化过程获得组织干细胞可塑性一般认为，组织和器官稳态的维持主第十七盎干细胞与组织的维持和再生391要是靠组织千细胞的增殖和分化来补充或替代受损细胞来实现，但近年来研究表明，内源性的非干细胞在组织更新中的作用也是非常重要的，该结论在三肠涡虫、两栖类、鱼类、甚至是哺乳动物非上皮组织中都得到了证实。
研究发现，非千细胞参与损伤组织的修复主要是通过自身的去分化和转分化的过程实现的，这也可以说是组织细胞的”可塑性”。
所谓去分化(dedifferentiation),用分化细胞失去原来的分化特性获得了同样组织谱系的前体细胞的能力，而转分化(transdifferentialio.1走指分化细胞在某个既定的组织中变成了相同组织谱系的分化细胞（图17-6)。
虽然转分化的过程中似乎并不涉及干细胞可塑性的获得，但是也并不排除该组织细胞经过了短暂的千细胞阶段然后形成另外一种组织细胞的可能性。
静息干细胞活化的干细胞
霆二＠勹自我更新
干细胞巢信号
z z过渡放大细胞
,,/-于己）包芦婴
/\D)/@l\aI/＿转砰、v勹/＼三分化的细胞近年来细胞重编程(cellular reprogramming)领域的发展也支待了包括干细胞在内的许多其他类型的细胞的分化行为的可塑性，研究人员可以在体外对干细胞或分化细胞进行各种诱导转变，除了转分化和去分化，还可以将一种分化细胞直接诱导为另一细胞谱系的干细胞，但是入们最关心的还是在体内，分化末端的细胞是否能通过转分化和去分化从而获得干细胞的特性，然后行使组织千细胞在组织修复中的作用呢？
目前很多利用谱系示踪(lineage tracing)方法进行的体内研究，从多个角度证实了体内分化细胞的可塑性。
比如小肠中Lgr5十小肠干细胞的活动是正常生理状况下小肠隐窝维持的主要成员，它能分化成多种细胞，其中Biml十细胞就是由Lgr5十小肠干细胞分化而来，但是在小肠干细胞－巢单元受到破坏时，Biml十细胞能通过去分化形成新干细胞池行使干细胞功能（图17-7)；哺乳动物成体肾中的上皮细胞可以通过去分化执行肾修复的功能；在毒物损伤和胆管结扎的清况下，成熟肝细胞可以转分化为胆管细胞。
据此有人提出组织特异性的再生策略除了“干细胞策略“外，如何在体内或体外唤醒分化细胞的可塑性也是值得深入探讨的。
二、组织干细胞生理活动的微环境
增殖与分化是调控组织中干细胞群体稳定性的基本方式，也是调控组织器官结构和功能动态平衡的基本方式。
目前一般认为，干细胞的增殖与分化存在一个严密的调控机制，这个调控机制可能就A LgrS十肠干细胞（绿色）谱系追踪观察肠隐窝稳态B肠隐窝底部Lgr5十肠干细胞（绿色）动态演变标记阳性细胞几周后几个月后C肠隐窝边缘区Lgr5十肠干细胞（绿色）动态演变D Lgr5十肠干细胞缺失时肠稳态维待依靠Bmil十细胞在隐窝内肠隐窝边缘区Lgr5十细胞形成克隆E每个Lgr5十肠干细胞（用不同颜色代表）均可-以形成完整的肠隐窝”>与它所在的组织中的微环境有关，这种微环境也可称为干细胞巢或干细胞龛(stem cell niche)。
目前已经知道，不同干细胞巢的结构和组成存在很大的差别，这也许就是不同千细胞的生物学行为都受到特定机制调控的结构基础。
目前一般认为，干细胞巢中各种因素的相互作用决定了干细胞的休眠、增殖或分化状态的转变。
于细胞巢的重要性还体现在，即使在没有于细胞的情况下（如通过照射治疗去除干细胞后），干细胞巢的微环境仍可保留其关键作用，允许招募外源性干细胞并使其归巢到原有的干细胞巢。
另外，干细胞巢的功能紊乱与干细胞衰老或肿瘤转化有密切关系。
由千干细胞与赖以生存和维持功能的微环境之间不可分割的关系，所以目前经常会用“干细胞－巢单元”(stem cell-niche u n it)来代替“干细胞巢”或“干细胞龛＂的惯用名词。
（一）“干细胞巢单元”由执行不同功能的异源性成员组成1干细胞巢单元不仅仅指干细胞的定居的物理位置各种组织干细胞的存在虽然都有相对固定的组织学部位，但千细胞－巢单元却不仅仅后代细胞是指干细胞定居的物理部位。
这里是干细胞细胞|与外源性信号发生相互作用的场所，在结构上是一个由干细胞及其外围细胞、细胞外基细胞夕质以及参与其增殖分化调控的相关因子所组成的，并具有动态平衡特性的局部环境（图17-8)。
2整联蛋白和胞外基质参与干细胞－巢单元的结构体系的形成整联蛋白(in tegr·in)彸•.；户是一类细胞黏附分子，其作用依赖于Ca2+，介第十七章干细胞与组织的维持和再生导细胞与细胞间的相互作用以及细胞与细胞外基质间的相互作用。
现在已经知道，几乎所有动植物细胞均表达整联蛋白。
其中细胞与胞外基质的附着可以由多种受体介导，但目前认识最多的是整联蛋白。
高表达B－整联蛋白对维持表皮干细胞(epidermal stem cell)的增殖分化至关重要。
B－整联蛋白还通过MAP激酶(mitogen-activated protein kinase, MAPK)途径调节角质化细胞等细胞的分化。
此外，整联蛋白有维系干细胞在组织中空间位置的作用，否则干细胞会脱离生存环境而分化或凋亡。
胞外基质还有调节干细胞微环境中局部分泌因子浓度的作用，整联蛋白的激活和表达也要受胞外基质蛋白的调节。
3.干细胞－巢单元中的分泌因子是干细胞增殖分化的调控因子在干细胞－巢单元中，分泌因子(secreted fac tors)可以是干细胞自身分泌的，也可以来自外围细胞或者其他组织细胞。
它们对于干细胞增殖与分化的调控具有重要作用。
在不同的干细胞微环境中，以及不同的生理或发育状态下，分泌因子的种类及其水平可有很大差别，但这种差异总是与机体发育或生理状态的需求是相适应的。
目前发现，TGF-!3(tran sforming growth factor be ta)和Wnt家族的信号分子在多种干细胞的不对称分裂以及维持干细胞自我更新方面起重要作用。
4.干细胞巢单元中过渡放大细胞和分化的子代细胞对干细胞产生反馈调控由干细胞不对称分裂产生的过渡放大细胞也成为干细胞－巢单元的一个组成部分。
目前认为干细胞－巢单元成员通过刺激活化的干细胞进行分裂从而建立“过渡放大细胞池”(TAC pool)，过渡放大细胞池又能够反过来作为信号中心提供某些干细胞－巢单元信号，从而调控干细胞的增殖状态，体现出调控的“双向性”。
最近的研究提出一些分化的干细胞后代也能够作为巢成员并对干细胞产生反馈调控。
例如，毛毅中已经分化的干细胞在干细胞－巢单元内形成由分化的Keratin6飞K6+）细胞组成的隆起的内层，这层细胞能够抑制隆起外层干细胞的激活；造血系统中，分化的巨噬细胞归巢到骨髓后，能增强造血干细胞的滞留，限制其向外周血移动。
总之，目前认为，处于分化末端的子代细胞形成的＂谱系反馈循环”在其所处的千细胞巢单元中发挥调控干细胞分化的作用。
（二）器官水平上各干细胞－巢单元之间存在协同作用“干细胞－巢单元”的研究让我们了解到干细胞－巢单元和干细胞之间相互作用的基本模式，但是放眼千器官或组织再生、重塑等问题的研究，研究人员不能忽略的是散布在整个组织和器官的所有干细胞－巢单元之间的相互协同作用。
这些单元组成成员的分子特性、分裂模式、群体大小的差异非常大。
目前也有越来越多的研究结果支持大部分自我更新的组织是受到多维度千细胞－巢单元的支持的，所以组织和器官更新过程所面临的挑战呈现多层次的特点，不但包括单个干细胞－巢单元内部的调控，还包括组织和器官中所有巢之间的协同调控。
这也是干细胞生物学研究所面临的下一个挑战。
三、几种组织干细胞的研究现状
(—)造血干细胞
20世纪40年代后期，在核辐射对造血系统损伤的动物实验发现，正常骨髓可以修复巳被严重损伤的骨髓，由此出现了造血干细胞(h ematopo山c stem cell, HSC)的概念。
l961年，J.
E. Till和E.
A. McCuUoch首次通过小鼠脾集落形成实验(spleen colony-forming assay)证实了造血干细胞在成体内的存在。
造血干细胞在所有骨韵细胞中所占的实际比例很少，但它们却具有强大的增殖和分化能力。
有研究表明，一个单独的造血干细胞就可以重建整个造血系统。
在哺乳动物的个体发育中，造血干细胞最早被发现于早期胚胎的卵黄痪毅壁的血岛(blood I sland)中，随后被发现千”主动脉－性腺－中肾"(Aorta-gonad-mesonephros, AGM)区，进而被发现于肝和脾中，最后被发现于骨髓中。
骨韵是胚胎中后期和出生后整个生命期间的造血场所。
造血干细胞的分离纯化可以通过表面标志来实现。
目前比较明确的人造血干细胞的表面标志有CD34+,CD38-、L面、HLA-、DR-、Thy\c-K正、CD45RA和CD71等。
其中，CD34是临床上应用最多的造血干细胞标志物。
394第五篇干细胞与细胞工程
造血干细胞特性的维持与细胞分化方向的抉择与造血微环境有着密切的关系。
研究发现，在哺乳动物骨髓中，一部分HSC存在千骨小梁的骨内膜区，紧靠成骨细胞；另一部分HSC与血窦周围的血管内皮细胞相连。
这提示HSC栖息于两种微环境一成骨巢和血管周围巢。
研究显示成骨巢维持HSC的静态，成骨细胞提供了涸节HSC数量及功能所需的调节因子；血管巢调控HSC的增殖、分化和动员等行为。
目前临床上常用的骨髓移植或造血干细胞移植疗法，实际上就是利用了造血干细胞可以再殖(repop ulate)损伤骨髓的生物学特性。
这种疗法在白血病的治疗中取得巨大的成功，使白血病患者的长期生存率提高到50%~70%，其疗效远远地胜于化疗。
美国医学家托马斯(E.
D. Thomas)千1956年成功执行了世界上首例人类骨髓移植手术，他也因此而获得了1990年度的诺贝尔医学奖。
（二）间充质干细胞
间充质千细胞(mesenchymal stem cell, MSC)起源于胚胎期中胚层的间充质，已发现在许多由间充质分化来的成体组织都可以分离出来，包括脂肪组织、胎盘、皮肤、肪带血、肪带血管周细胞、牙髓、羊水、滑膜，以及母乳等。
目前已有的研究结果证明了间充质干细胞的多向分化潜能，在体内或体外特定的诱导条件下，可分化为脂肪、骨、软骨、肌肉、肌健、韧带、神经、肝、心肌、内皮等多种组织细胞。
尽管间充质干细胞的研究已有很多，但这些研究大多是基千培养的间充质干细胞的体外研究，而MSC的体内鉴定则迟迟没有令人信服的方法和结论，所以关于间充质干细胞的基本生物学特性的认识基本上都是体外培养的间充质干细胞的特性。
不同来源的MSC的生物学特性存在着一定差异，这与组织来源，供体种属特性、分离技术，培养条件以及传代次数都有关系。
目前根据国际细胞治疗学会(Internatio nal Society for Cellular Therapy,2006)的标准，MSC的基本特性是：心能够在塑料培养皿上黏附生长；＠具有“三向分化”(tri-li neage differentiation)潜能，即脂肪细胞、软骨细胞和成骨细胞。
在此基础上，还要求具有的特性是，其细胞表面表达CDI05(e ndoglin, SH2)、CD73(ecto-50-nucleotidase)及CD90(Thyl)等分子标志，不表达CD45、CD19或CD79、CD14或CDll b及HLA-DR等分子标志。
尽管这样，单就MSC的鉴定来说，目前存在的一个最大的问题仍然是缺乏特异性的分子标志。
在近十年中，虽然间充质干细胞的基础研究仍存在很多问题，但是间充质干细胞临床应用却得到飞速发展，成为了干细胞研究中的热点领域之一，主要应用包括：心造血千细胞移植，包括增强造血功能，促使造血干细胞移植物的植入，治疗移植物抗宿主病。
＠组织损伤的修复，包括骨、软骨、关节损伤，心脏损伤；肝脏损伤；脊髓损伤和神经系统疾病。
＠自身免疫性疾病，包括系统性红斑狼疮、硬皮病、炎性肠炎等。
＠作为基因治疗的载体。
有学者认为，MSC在临床应用方面取得如此大的发展，很大一方面原因并不因为它的干细胞性质，而是得益千MSC的免疫调节功能，这一独特的性质使临床研究为异基因型MSC的移植打开了方便之门。
（三）神经干细胞哺乳动物胚胎发育中，在神经外胚层形成后，神经分化就开始了。
在邻近神经诱导信号的作用下，神经外胚层形成一个盘样结构，称为神经盘。
最早的神经干细胞就位于神经盘中。
传统观点认为，哺乳动物的中枢神经系统在出生后不久就丧失其再生能力，成人脑组织一经损伤就不能再生。
然而，近些年的研究发现，在大多数成体哺乳动物神经系统的侧脑室壁的室管膜下区(s ubventricular zone, SVZ)和海马齿状回的颗粒下区(subgranular zone, SGZ)有神经干细胞(n eu ral stem cells, NSC)的存在（图17～趴图17-10)。
NSC具有自我更新能力和分化产生成熟神经元、星形胶质细胞和少突胶质细胞的潜能，由此而赋予了成年个体整个生命期间神经系统特定结构和功能维持的基础。
在正常生理情况下，SVZ NSC通常处于静息状态。
但在损伤或其他特定病理清况下，这种细胞可以分化产生增殖性的过渡放大细胞，进而可以产生具有迁移特性的神经母细胞(neuroblast)。
然后，第十七章干细胞与组织的维持和再生395图17-9成年哺乳动物SVZ部位NSC的微环境与神经发生过程A成年小鼠脑冠状切面(LV：充满脑脊液的侧脑室）；B为A图中方框显示部分的放大图，示SVZ结构[B细胞：SVZ中的干细胞，有些B细胞形成一根纤毛，与脑室腔接触；C细胞：正在快速分裂的过渡放大细胞，由B细胞生成；A细胞：由C细胞产生的神经母细胞，它们能向嗅球部位迁移；BV：血管，周围有巨噬细胞（点状）；BL：基底膜，从血管伸出，并与SVZ细胞发生广泛的交叉；纤毛状的室管膜细胞沿着室管膜壁排列，室管膜细胞能够产生对于干细胞微环境很重要的Noggin分子；Noggin, BMPs, Shh, Notch, TGF-et, Eph/ephri ns和VEGF在神经干细胞微环境的调控中发挥重要作用】；C.
SVZ细胞谱系发生简图(C细胞能够在EGF信号的作用下发挥干细胞的功能）
c0嘈气；，飞
图17-10成年哺乳动物SGZ部位N SC的微环境与神经发生过程A在海马部位的成年小鼠脑冠状切面(DG：齿状回，布满深色点状物，如箭头所指）；B.显示SGZ神经千细胞微环境的结构。
图中As细胞（神经干细胞）产生神经前体细胞（图中的D细胞），神经前体细胞成熟后形成新的颗粒神经元（图中G细胞，绿色），之后这些颗粒神经元掺入到齿状回的颗粒层（图中呈棕色的G细胞），血管(BV)与SGZ邻近，在SGZ部位的血管周的基底膜(BL)与在SVZ中发现的基底膜层相似。
Sh h和VEGF在体内SGZ神经干细胞微环境中起到调控作用；C.
SGZ细胞谱系发生简图神经母细胞可以通过由胶质细胞所形成的轨道网络从SVZ区域向嗅球迁移。
SVZ NSC的分子表型为：GFAP+,nesti旷及Lex/CD15飞过渡放大细胞的分子表型为：Dlx+, nestin+, Tbr2十及Lex/CD15飞神经母细胞的分子表型为：Dex·'mx2·'PSA-NCAM+及nestin飞嗅球神经元的分子标志为：NeuN十和DABA飞同样地，在海马齿状回SGZ区域中的NSC的分子标志与SVZ NSC相似，而且也可以分化为神经元，但其产生的过程有些特殊性。
SVZ和SGZ这两个神经干细胞微环境中，主要包括下述细胞组分：CD星形胶质细胞，该细胞是微环境中的主要细胞组成成分；＠基底膜以及伴随基底膜生成的血管，它们是微环境中的重要成分；＠在微环境中存在着某些“胚胎”形态发生因子，这些因子在成年个体的神经发生中发挥重要作用。
NSC的体外培养由B.
A. Reynolds和S.
Weiss千1992年首先建立。
他们发现，这种细胞在EGF存在的条件下以非贴壁的球形（可称其为“神经球”)的方式生长，当在生长因子被撤出后，就可分化为神经元和胶质细胞。
（四）肝脏干细胞肝脏起源于前肠内胚层，与胚胎心脏相接触的前肠部分受到来自心脏间充质细胞分泌的FGF家族细胞因子的作用而形成肝脏的原基。
在肝的原基中，存在肝脏的前体细胞也被称为肝母细胞(h epatoblast)。
成体肝脏于细胞(hepatic stem cell或liver stem cell)是指存在千成年个体肝脏中，具有分化为肝细胞和胆管细胞能力的一类干细胞。
通过多年的研究，目前通常认为存在于肝细胞和小叶内胆管交界处的赫令管(canal of Hering)或者小叶间胆管的胆管腺(peribiliary gland)上（图17-11)，但是成体肝干细胞对肝脏稳态的维持方面的贡献，一直是颇受争议的。
管管
霆＿,,,.勹
共同肝胰导
肝胰管壶腹
图17-11肝脏内肝干细胞巢和肝外胆管系统肝脏内肝干细胞巢位于赫令管（红色圆圈）。
肝干细胞是肝母细胞(hepat ic blast cells)的前体细胞，即过渡放大细胞，该细胞首先产生定向前体细胞，然后产生肝细胞和胆管。
胆周腺也包含干细胞巢（蓝色圆圈），分布比较广泛肝脏是一个十分独特的器官。
与造血、小肠和皮肤等器官不同，生理状况下肝脏细胞的新旧更替是通过成熟的肝细胞和胆管细胞的增殖来实现的，特别是巳高度分化的成熟肝细胞，具有强大的增殖能力。
1931年G.
M. Higgins和R.
M. Anderson建立了肝再生的经典实验模型，即通过简单的手术方式切除大鼠2/3的肝组织，大鼠的肝脏可进行再生并在两星期内恢复至原来大小。
在一些慢性药物损伤中，肝细胞也发挥了主要的修复作用。
肝细胞强大的自我修复能力削弱甚至掩盖了肝干细胞的贡献。
虽然目前还没有发现肝干细胞在2/3切除后的肝再生过程中起作用，也没有证据表明肝干细胞在肝脏的生理性更新中起作用，但是，有些实验室观察到在经典肝损伤模型中包括饲喂DDC(3,5-d氐thoxycarbonyl-1,4小hydror.ollidine)饲料，CDE饮食（胆碱缺乏、甲硫氨酸补充饲料）或者四氯化碳长期损伤后，源于胆管的肝干／前体细胞，可以一定程度的参与肝脏损伤修复，分化为成熟肝细胞或者胆管细胞。
随着近年来体内细胞示踪技术的发展，许多研究团队陆续证明了成体肝脏中不同细胞的作用，这也同时揭示了肝脏稳态维持机制的复杂性，肝细胞，肝星状细胞，胆管细胞在不同的肝损伤情况下都有可能参与肝脏的修复。
（五）精原干细胞
精原干细胞(spermatogon i al stem cell)存在千睾丸曲细精管内，紧贴于曲细精管的基底膜。
精原干细胞在曲细精管内的精原细胞(spermatogon ium)中所占的比例很小，是分化程度最低的一类原始细胞，它是精子发生的细胞基础，对维持睾丸曲细精管结构和功能的稳定与平衡具有重要作用。
精原干细胞是研究较早、较多的组织于细胞。
早在60多年前，E.
Rolshoven(1941)关千精原细胞的研究实际上就已经涉及了精原干细胞的内容。
经过这些年的发展，目前对千精原千细胞的生物学特性已经有第十七童干细胞与组织的维持和再生397了较多的认识，并在技术上也已经能够对精原干细胞进行分离培养和活体睾丸内移植，这在一定程度上显示了它在生殖医学中的意义和作用。
精原干细胞是精子发生的细胞基础。
精子发生(spermatogenesi s)的全过程都发生在睾丸的曲细精管内，其过程详见第十四章。
对于所有哺乳动物来说，其精子发生都遵循这一基本规律。
但目前已经知道，精子发生的细节在哺乳动物的不同物种之间则存在一定的差异，而这种差异主要存在千从精原干细胞到初级精母细胞形成的这一分化阶段。
小鼠为嗤齿类哺乳动物，它的精原细胞分A、B两型。
从精子发生的角度来讲，它们是处于两个连续分化阶段的细胞，即A型精原细胞是较原始的精原细胞，B型精原细胞是由A型精原细胞分化而来的精原细胞。
根据各种精原细胞的形态特征，以及其在曲细精管的管壁内的空间排布特征，可以观察到的A型精原细胞有单体A型精原细胞(Asingle, As)、双合体A型精原细胞(Apai red, Ap1)及链状体A型精原细胞(Aaligned, Aal)三型。
现在一般认为，As才是真正的精原干细胞，而Apr和Aa1仅为精子发生的前体细胞(progenitor cell)。
As分裂可能有两种方式：一是其子细胞是互相分离的两个干细胞（即仍然是As型精原细胞）。
通过这种分裂方式，可以保持干细胞数量的平衡，以维持其干细胞库的稳定性；二是其细胞核分裂，但其细胞质分裂不完全，成为以胞质间桥(cytoplasm i c bridge)相连的Apr。
Ap1的形成，就标志着该细胞已经进入精子发生的程序。
在此基础上，Apr便可以同样的方式进行多次分裂（即细胞核分裂而细胞质为不完全分裂），由此可以形成四合体细胞、八合体细胞、十六合体细胞，甚至三十二合体细胞。
由于这些合体细胞中的核呈线性排列，其间是以胞质间桥连接，故将它们统称为链状体A型精原细胞。
接下来，链状体A型精原细胞将连续分裂6次，所产生的子细胞依次称为Al、A2、A3、A4、In(intermediate，中间型）和B型精原细胞。
B型精原细胞的分裂形成初级精母细胞，进而通过减数分裂I形成次级精母细胞，再通过减数分裂lI形成精细胞，进而演变为成熟的精子。
如果将链状体A型精原细胞按十六合体计算，那么，1个精原干细胞（即As)进入精子发生的程序后，经过10次有丝分裂，就可产生1024个初级精母细胞，再经过两次减数分裂，就可产生4096个染色体为单倍体的精细胞。
人和非灵长类动物的精子发生过程的细节目前尚不十分明确。
研究表明，基底膜的曲细精管上皮含有未分化型的精原干细胞(Ada,k and Apale)和分化型精原干细胞(B型）。
A，lurk是最初的精原千细胞，它经过AP·,1仁阶段而分化为B型细胞。
B型精原千细胞产生初级精母细胞进入减数分裂并从基底膜移出，后续经减数分裂和精子发生依次产生精母细胞、精子细胞、和终末分化的精子，并释放到曲细精管的管腔。
精原干细胞的分化具有一个复杂的调控机制。
目前已获较多进展，如已发现Kit受体是精原细胞分化早期的一个关键的调控因素，而干细胞因子(stem cell factor, SCF)是Kit受体的配体，它可通过Ki t受体促进细胞增殖。
而且已经知道，精原细胞能表达kit受体，而支持细胞表达其配体一—SCF。
第四节干细胞与医学
随着对干细胞与个体生长发育相互关系的认识的不断加深，科学家们开始意识到了许多重大疾病或特殊生物学现象的发生机制都可以从干细胞角度进行重新认识，这意味着临床上的许多疾病的防治研究可以从干细胞的角度进行，也意味着一些新的防治方法和手段的产生。
现就以下几个方面为例，以显示干细胞生物学在医学科学中的地位和作用。
—、干细胞与器官和个体衰老
细胞衰老是细胞的一个基本的生命现象。
尽管从形态学和分子生物学方面已有很多的认识，但仍有很多细节尚不清楚，特别是细胞衰老与组织、器官和个体衰老之间的关系仍知道甚少。
近几年中，干细胞概念的引入，形成了以组织特异性干细胞为基础，以个体生长发育为主线的四维研究思路，使得这一领域的研究进入了一个新的发展阶段。
通过前文的叙述我们知道，几乎所有的组织器官中都有干细胞的存在，它们的基本功能是要维持其组织器官的结构和功能在其生命过程中的稳定性和平衡性，而且要避免过度生长（如丿l巾瘤）或萎缩的发生。
随着年龄的增加，组织干细胞发生了显著的变化，表现为干细胞数批的变化，静息和活化状态的改变以及增殖和分化能力的降低等（图17-12)，最终导致机体组织退化和功能啼碍，产生衰老相关的疾病，如贫血、帕金森、老年痴呆、肿瘤、肌肉萎缩及骨质疏松等。
干细胞后代细胞八年轻
庙, C,
`...
Q19=谱系特异性丢失....
细胞恶性转化
目前，已有一系列研究证据表明组织干细胞衰老是器官和个体衰老及疾病发生的先决条件。
例如：C.
Kollman(2001)就曾分析过6978例骨髓造血干细胞移植病人，骨髓造血干细胞供体的年龄越大，其成功率就越低，并发症的发生率也越高。
这一研究，就暗示了老年个体骨髓造血干细胞的增殖和分化能力的下降导致了移植后骨髓重建失败。
而且，这一概念在小鼠的研究中也得到了证实，并由此形成了一个解释造血干细胞衰老与个体相关疾病发生的关系的模型。
按此模型，在自然的状态下，造血干细胞的衰老表现为髓系细胞分化的潜能增加和淋巴性细胞的分化潜能的下降。
前者会导致髓性白血病基因表达增加和骨髓疾病发生率上升，后者则与免疫能力下降有直接关系。
这一机制与临床数据相符，即急性淋巴细胞白血病主要是青少年疾病，发病率随着年龄而下降，而急性骨髓性白血病的发病率随年龄而增加。
随着年龄增加，人头发的密度逐渐降低，并且花白，这也归功于毛袭干细胞衰老后表现出静息期的延长和生长期的缩短以及黑色素干细胞分化为黑素细胞能力的降低。
同样地，机体其他器官老年疾病产生和生理功能的下降都与干细胞的衰老有着密切的联系。
然而随着对组织千细胞衰老认识的不断加深，如何减缓干细胞衰老问题或衰老疾病的发生越来越受到关注。
组织干细胞存在千机体微环境中，其从静息到活化、增殖和分化都受到微环圾内因子和一系列转录信号的调控，因此，组织干细胞的衰老不可避免受到这些内在因素和外在环境的影响。
成体干细胞的衰老一直被认为不可逆转，但随着入们对干细胞衰老机制的认识和研究，发现可以通过认为干预干细胞本身的基因表达水平，信号通路、微环境因子或者清除衰老细胞等方式，有望使成体干第十七章干细胞与组织的维持和再生细胞发生衰老逆转。
近年来，年轻个体血液逆转干细胞衰老的研究成果为实现真正的＂返老还童”带来了新的希望。
研究显示，通过联体共生(parabiosis)的模型，使得年轻和老年小鼠血液、体液进行交互共享，年轻小鼠血液可以让老年小鼠骨骼肌千细胞回到更年轻状态，也可以逆转老年小鼠衰弱的心脏功能。
而后科学家又发现年轻血液中存在着某些蛋白，如GDFll和TIMP2，这些蛋白不仅可以改善小鼠骨骼肌干细胞、心肌细胞的功能，还可以改善老年小鼠大脑功能，提高学习和记忆功能。
因此，随着对干细胞衰老与微环境稳态的进一步理解和研究，有望建立临床上衰老相关疾病治疗和防治的可行方法，改善老年人的健康状况。
二、干细胞与肿瘤的发生和复发
肿瘤的发生和复发问题一直是困扰学术界和临床医生的难题，入们一直在试图从各种角度解释和找到根源以便能够彻底根治肿瘤。
T. Lapidot在1994年最早提出急性髓样白血病干细胞的概念，他们的研究证明了在体外培养的白血病细胞中只有不到1％的细胞能够在小鼠模型中重建白血病，而且只有CD34+CD38一细胞具有在小鼠体内形成白血病的能力，该分子表型与造血干细胞的分子表型一致。
2001年，通过类比干细胞与肿瘤细胞，T.
Reya等提出了肿瘤干细胞应该具有组织干细胞相似的性质，比如数蜇少；具有自我更新和分化潜能；对组织的形成起决定性作用；表达独特的与富集和鉴定相关的标记，使用相同的信号传导通路等等。
2004年，M.
Al-Hajj等第一次证明了乳腺癌干细胞的存在，认为在乳腺癌组织中存在的CD44+CD24-细胞对乳腺癌的形成起着决定性的作用。
2006年美国癌症研究协会专题讨论会将｝仲瘤干细胞定义为＂肿瘤组织中具有无限自我更新能力、能够产生肿瘤细胞的异源性后代并进而形成肿瘤的细胞＂，并将“在免疫缺陷型小鼠体内形成与原发肿瘤类型相同的肿瘤”作为鉴定肿瘤干细胞的金标准。
这个定义的提出为肿瘤干细胞的研究打开了一道门。
由于这个概念为临床药物研发提供了新的思路，所以引起了研究人员的广泛兴趣，随后脑瘤干细胞、慢性髓系白血病干细胞、结肠癌干细胞、胰腺癌干细胞、肺癌干细胞、前列腺癌千细胞、肝癌干细胞等相继被鉴定，但是同时也有很多相反的研究结果频频出现，甚至有研究表明肿瘤干细胞实际上是不存在的。
2012年来自美国、荷兰和比利时的研究组分别在《自然》和《科学》杂志报道，首次利用谱系示踪的方法在肿瘤的自然栖息地(native h abitat)中证明了癌千细胞的存在。
随着研究的深入，人们对肿瘤干细胞的认识也更加全面和完整。
在肿瘤干细胞学说出现后，对肿瘤的发生问题就有了三种模型，一是随机模型，这是一直以来人们对肿瘤的认识，认为所有的肿瘤细胞都有相同的形成肿瘤的能力，但是哪个细胞能形成肿瘤是随机事件；二是等级模型，即只有肿瘤干细胞能够形成肿瘤，所以治疗肿瘤的关键是杀死肿瘤干细胞；第三种模型是演化模型，这个模型引入了肿瘤微环境的概念，结合了上述两种模型的观点，但是认为肿瘤微环境的改变创造了普通肿瘤细胞演化为肿瘤干细胞的条件，所以近年来人们在关注肿瘤干细胞的同时，特别关注肿瘤微环境的检测和控制，也有很多研究证实了微环境的改变能够引起肿瘤细胞“去分化”，这也符合某些组织干细胞的性质。
也有实验证实放疗和某些化疗药物能够“激活＂静息的肿瘤干细胞从而促进了肿瘤的发生。
因此在利用肿瘤干细胞理论研究肿瘤发生、复发、转移时要将肿瘤细胞和其存在的微环境看成一个完整的＂肿瘤生态环境＂，肿瘤干细胞、肿瘤细胞可以在这个生态系统中相互转化，它们与肿瘤微环境之间更是相互依存和相互作用的，并在这个微环境中“物竞天择，适者生存”，从这样的角度去考虑，才能辩证地找出对付肿瘤的有效方法。
至于肿瘤干细胞的来源，目前尚无定论。
从理论上来讲，组织特异性干细胞、过渡细胞和成熟细胞都有可能是肿瘤干细胞的源头细胞，但组织中的干细胞发生突变的可能性为最大。
因为在那些细胞更新旺盛的组织器官内，总是持续地需要有分化成熟的细胞的补充，而这些分化成熟细胞是从所存在的其相应组织器官中的组织特异性干细胞分化而来的，这些细胞更新旺盛的组织器官中的干细胞发生突变和积累突变的可能性会很高，出现增殖和分化特性失控的异常干细胞系（即肿瘤干细胞系或癌干细胞系）的可能性也就相应地增大。
就现有的知识和活体内的实际情况的复杂性来看，肿瘤的发生是由其组织中的过渡细胞和成熟细胞的转化而来，或由其他因素所致的可能性还是不能排除的。
三、干细胞与组织再生
当组织器官受到某些外来因素的损伤或破坏时，机体可以启动一种修复机制，以使其受损的组织器官的结构和功能得以恢复。
在此过程中，在其损伤组织的局部可有大量的细胞增殖，并可伴随有细胞的分化和组织的形成，从而使得损伤部位在空间结构上得到修复，以及其功能的恢复。
机体修复组织器官损伤的这种现象就叫做组织再生。
在成年个体中，组织再生的细胞生物学基础可有多种情况。
其损伤较轻且其邻近的正常组织还有一定的增殖能力时，邻近组织的正常细胞就可以分裂而产生新生的细胞，以修复其损伤。
但如果其损伤的程度很重，而且涉及多种组织的损伤，此时就可能启动分化等级更低的细胞（如过渡细胞、前体细胞，甚至组织特异性干细胞）群体的增殖与分化。
例如，若采用外科手术的方法，将肝的2/3切除，剩余肝的细胞可以快速分裂增殖，并在一周左右便可使其肝体积恢复到本来的大小。
这一情况，说明了成熟的肝细胞也有强大的增殖能力，以使之能够适应各种有害因素所致肝急性损伤修复。
在此基础上，也有研究发现这种再生修复是通过成熟肝细胞的直接分裂来实现的，而并未直接涉及干细胞。
因为有证据表明，若用倒千里光碱(retrorsine，为一种生物碱）处理小鼠一个月后（以抑制其成熟肝细胞分裂增殖），再采用手术的方法将其小鼠的2/3肝切除，随后便可在肝组织中Hering管的附近发现有胆管反应的发生，而且可以直接观察到卵圆细胞(oval cell，为目前公认的一种肝干细胞）的出现。
进而，还可观察到肝再生现象的发生。
这一现象暗示，尽管这种再生修复现象可能是通过成熟肝细胞的直接分裂来实现的，但成熟肝细胞更替的来源则还是干细胞。
目前已有许多证据表明，在一般的组织中，都有处于不同分化状态的细胞群体的存在。
如果从分化程度的角度来看，它们之间有一个潜在的从低到高的等级关系。
其中，组织特异性干细胞处于最为基础的位置，随后是过渡细胞，最后是成熟细胞。
如果从时间顺序和空间结果的角度考虑，则可将它们比喻为一个“树枝＂样的结构，位于基部的相当千组织特异性干细胞，处于树叶位置的则相当于成熟细胞。
而且已经知道，从组织特异性干细胞到成熟细胞的发育过程中，其增殖能力和分化特性呈逐步降低趋势，到成熟细胞时，其增殖和分化的能力已经十分有限（成熟的肝细胞可以分裂2~3次），甚至已经完全丧失（人体内耳的毛细胞就不能增殖）。
其他组织器官也可能会有类似的修复机制，即：根据损伤程度的高低，以启动其组织中不同分化等级的细胞的增殖与分化的程序，来实现其修复的需求。
然而，不同的损伤程度和不同组织类型的修复结果是不一样的。
如果损伤程度较轻，而且邻近的正常成熟细胞还有一定的分裂增殖能力，其修复后的组织在结构上和功能上可与原先的组织完全一样，这种修复在医学上称为“完全修复＂。
但如果损伤的程度很重，或者涉及多种组织的损伤，或者其邻近正常成熟细胞己没有增殖能力，其修复后的组织在结构上和功能上都有可能与原先的组织不同（如形成肉芽组织或瘢痕组织），这种修复在医学上称为“不完全修复＂。
由此可见，组织再生的能力和类型与其组织中千细胞的功能行为是直接相关的。
四、干细胞与细胞治疗
许多疾病都是细胞功能缺陷或身体器官损伤造成的。
作为细胞治疗的选择之一，可以将正常的于细胞或由其分化产生的功能细胞植入病变部位并代偿病变细胞丧失的功能。
理论上，干细胞治疗最吸引人的地方在千它可以治疗一些常规治疗方法目前无法治愈的疾病，这些疾病几乎涉及各种器官系统，包括阿尔茨海默病、脑卒中、癫病、泰－萨克斯(Tay-Sachs)病、心脏病、股骨头坏死、关节炎、糖尿病、系统性红斑狼疮等。
目前可用于干细胞治疗的干细胞有两大类，一是多潜能干细胞，主要包括胚胎干细胞(ESCs)和第十七窒干细胞与组织的维持和再生401诱导型胚胎干细胞(iPSCs)，二是组织干细胞。
这两类细胞应用于临床治疗的主要策略如图17-13所示。
虽然在基础研究领域，针对这些干细胞的形态、生化特性、自我更新和分化潜能等诸多方面进行了深入而广泛的研究，利用动物疾病模型进行干细胞治疗效果评价也有很多成功的例子，但针对于临床应用的研究还是近几年的工作。
ES细胞
成了二言：
干细胞
ES细胞和iPS细胞具有多向分化潜能，是进行干细胞治疗的理想细胞，但是其成瘤性又成为一个致命的缺点。
而对那些难以获得功能性组织千细胞或者相应的组织干细胞难以在体外获得足够数量的疾病，ES细胞和iPS细胞就显示出应用上的优势。
据美国国立卫生研究院(NIH)的临床试验数据库(clin ical trial)的数据，现注册的利用人的ES细胞来源的视网膜色素上皮细胞治疗黄斑变性，利用ES细胞来源的胰腺内皮细胞治疗I型糖尿病，利用前体细胞治疗心脏衰竭，利用ES细胞来源的少突细胞治疗脊椎损伤，都进入了临床1期或2期研究，而利用iPS细胞诱导分化的实验研究目前还没有进入临床试验阶段。
组织干细胞的种类繁多，目前开展临床研究的涉猎范圃很广，就细胞而言包括间充质干细胞，内皮细胞和前体细胞，神经干细胞，角膜缘干细胞，胎盘来源干细胞等等；从治疗的疾病而言，单就神经干细胞，治疗疾病就包括肌萎缩侧索硬化症和慢性脊髓损伤、下肢缺血和休克、神经元蜡样脂褐质沉积症、颈髓损伤、黄斑退化、脊髓损伤、佩利措伊斯－梅茨巴赫病，等等。
造血干细胞移植己应用于临床，它是目前治疗血液系统恶性疾病、先天性遗传病，以及多发性和转移性恶性肿瘤疾病的最有效的方法之一。
早在20世纪50年代，临床上已开始应用骨髓移植方法来治疗血液系统肿瘤。
至80年代末，外周血干细胞移植发展成熟，在提高治疗有效率和缩短疗程方面优于常规疗法，且有令入满意的效果。
近年来，随着跻血干细胞移植技术的不断改善，可以部分代替目前自体外周血干细胞移植，为血液病及恶性肿瘤患者带来福音。
到2017年，在美国FDA网站上公布的已经批准上市的涉及干细胞的产品共有7个，其中5个是利用肪带血造血前体细胞进行造血和免疫系统重建的，可以进行异体移植。
近年来，非造血系统干细胞应用于临床治疗上最为成功的是角膜缘干细胞。
2015年，欧盟委员会批准可有条件用于治疗角膜缘干细胞缺乏症。
研究人员将患者未受伤眼的少量角膜缘干细胞取出、扩增并制成干细胞蒲膜，然后植入到经手术去除灼烧伤的角膜瘢痕组织的部位，结果薄膜能成长为新的角膜组织，取代旧有受损组织。
该项实验在十年间共治疗106名患者，其中完全恢复视力者81人、部分恢复者14人。
间充质干细胞(MSC)的临床应用研究也正在大范围的展开。
临床上应用的MSC，一般是借助千细胞的贴壁性质进行分离和大量培养，这些间质细胞都表达成纤维细胞的标志物。
因获取方法简单，安全性受到肯定。
2011年以来，在美国NIH临床试验数据库中注册的MSC相关项目不断增加，但大部分都处千临床一期研究阶段，个别项目（跻带血MSC治疗再生障碍性贫血）进入临床四期研究。
目前干细胞治疗的临床试验出现了较多的失败案例，其根本原因是对千细胞的生物学行为规律认识不够。
此外，干细胞治疗的伦理和法规问题，也应受到关注。
推荐读物
[I]Tapia N, Han OW, Scholer HR.
Restoring stem cell function in aged tissues by direct reprogramming?
Cell Stem Cell,2012,10:653-656..
小结
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个体的正常发育及其功能维持，有赖于干细胞在空间上和时间上的有序增殖与分化。
目前对于干细胞的认识还很初步，其概念正在被不断地补充和修正。
但在近些年中，干细胞分离培养技术的快速发展，以及对其分化特性的认识和其科学意义与实用价值的显示，使得干细胞研究领域一跃成为了医学科学，乃至整个生命科学关注的热点，并很快成为了相关领域知识体系的重要组成部分。
干细胞是指那些具有无限增殖能力、并能分化产生一种或一种以上特化细胞的原始细胞。
在个体的整个生长发育过程中的各种组织器官中，几乎都发现了干细胞的存在。
这些不同种类的干细胞的分化潜能，以及发挥的生物学作用可有很大的差别。
但一般地说，它们总是与其所在组织器官的结构与功能相适应。
现在已经知道，干细胞具有一般细胞的基本生命现象，如分裂、分化、迁移、衰老及死亡等，而且也同样地服从于一般细胞调控的基本原理。
但是，干细胞也有不同于一般细胞的生物学特性，如在增殖分裂方面的缓慢性和自稳性、以及在分化方面的多潜能性和可塑性等。
当然，存在于不同的组织器官、不同的发育阶段，以及不同的生理与病理状态下的干细胞的基本生物学特性和功能行为也是不同的，而且也相应地存在着不同的调控机制。
也许正是由于这种生物学基础的存在，干细胞才具备了调控个体生长发育和功能维持的基本能力。
目前，胚胎干细胞的培养体系已经比较成熟，已经能够常规地分离培养人类和小鼠等多个物种的胚胎干细胞。
但是，组织干细胞的培养技术则还有待发展。
这是因为组织干细胞的种类繁多，而每一种组织干细胞在活体中生活的微环境都是不同，即便是同一类干细胞，它们在不同生理或病理状态下生活的微环境也都会有很大的差别，因此，组织干细胞的培养技术的发展将是一个长期的任务。
关于干细胞的生物学特性及其功能行为调控机制的研究策略和技术体系，目前发展较快。
这主要是分子生物学的研究思路和研究技术的介入，以及细胞生物学中细胞培养技术（如三维培养）和分析方法（如各种示踪分析）发展的结果。
特别是各种生长因子、细胞因子、激素和黏附因子的发现与应用，以及其分化诱导体系的建立和各种定点干扰技术的应用，使干细胞的研究进入了一个全新的快速发展时期。
但人们也意识到了，对于干细胞各种生命现象发生机制的认识，以及人为干预能力的形成，还有待于系统生物学的概念和其相关技术的综合应用。
特别是时空的概念和整体的概念，以及各种高通量的、活体（如基因工程动物体系）的和定量的分析技术，将一定是必不可少的。
干细胞在人类疾病的治疗中已经显示出了很好的应用前景，但要真正地进入临床，则还有赖于干细胞生物学基础研究的进步。
就目前来看，干细胞的研究有两个方面最为人们所关注，一是干细胞在发育过程中和成体中的基第十七章干细胞与组织的维持和再生403本生物学特性的细节，二是干细胞在生物医学领域（如组织修复等再生医学问题）中的应用。
但是，无论其目的是基础生物学研究，还是生物医学应用，关键的问题还是在于是否能够以定量手段和系统生物学的概念，在分子水平上搞清楚干细胞的功能行为是如何控制的。
很显然，这一领域的未未发展是极其具有挑战性的。
例如，如何确认调控干细胞功能行为的关键信号以及其相关条件，如何有效地将这些信息应用于各种生物医药问题的解决，等等。
（朱每英）
第十八章细胞工程
生物工程(bioeng in eerin g)是指用生物体或其组成成分在最适条件下产生有益产物及进行有效生产过程的技术，所以又称为生物技术(biotechnology)。
到了近代，随着微生物学、细胞生物学、遗传学和分子生物学的发展，生物技术在内容、层次上有了迅速发展。
如今它已包含有基因与基因组工程、酶工程、发酵工程、细胞与组织工程、生化工程、微生物工程等诸多方面。
细胞工程(cell e ngin ee ring)，顾名思义，是将细胞生物学知识与生物工程学技术相结合而形成的一门新的学科领域。
具体说来，它主要是通过细胞融合或拆合、核质交换或核移植、染色体或基因转移以及经由细胞培养和筛选，按照人们预先的设计，产生出新的细胞，并最终用于生产或医疗实践，或进行更深层次的研究及开发。
组织工程(tissue engin ee ring)则更强调利用生物学和工程学的原理与技术，研究与开发出可修复或取代人体的组织或器官，用于医学实践。
种子细胞、支架材料和调控因子是构成组织工程的三大要素。
因此，细胞工程是组织工程的基础之一。
细胞工程在技术程序中避免了基因分离、提纯、剪切、拼接等分子水平的操作，一般只需将细胞遗传物质直接转移到受体细胞即可形成杂交细胞，因此，其过程相对比较简捷，不致造成对受体细胞的较大损伤，同时转移效率提高。
此外，细胞工程不仅可以在动物之间、植物之间、微生物之间进行，还可以在动物与植物间、动物与微生物间、植物与微生物之间进行，从而可产生新的品种，甚至物种。
目前，根据操作对象不同，细胞工程又分为动物细胞工程、植物细胞工程以及微生物细胞工程，本章介绍动物细胞工程。
正由于细胞工程有上述优势，近年来发展极为迅速，尤其在细胞治疗、动物克隆、转基因动物、再生医学等方面的研究与实践，已经引起全球的剧烈竞争以及科学研究之外的关注。
第一节细胞工程的主要相关技术
细胞工程涉及面很宽，所用技术方法也很多，但就总体来说，细胞工程可以认为是不同层次上的细胞拆合与重组工程。
这些层次是细胞整体层次，如细胞培养、细胞融合、细胞重编程；细胞器层次，如核移植；以及分子层次，如基因转移等。
一、大规模细胞培养
细胞培养是细胞工程中最基本、最常用的技术之一。
有关细胞培养的基本原理以及基本过程已在第一篇第三章叙述。
本节只介绍大规模细胞培养。
所谓大规模细胞培养(large scale cell c ulture)是指细胞的高密度(density)或高浓度(concenu·ation)培养，培养容噩在2L以上，需要借助细胞培养容器，目的是制备大噩的细胞或是以此来生产更多的细胞产物。
一般说来，lxlO9~l x lO10个细胞可以在1~lOL容积的简单搅拌瓶培养获得。
但lx lO11~l X1012个细胞的更大规模培养则需要一系列设备如生物反应器，培养规模可以是1OOL实验室规模，l00~lOOO L中试规模，5000-20000L产业化规模。
目前，大规模细胞培养的方法很多，大致可分为悬浮细胞培养和贴壁细胞培养两大体系。
但在实际应用中，常分为悬浮培养、固定化培养和微载体培养三种方法。
第十八章细胞工程405
（一）悬浮培养
细胞在培养液中呈悬浮状态生长和增殖的培养方法称悬浮培养(suspension c ulture)。
悬浮培养适用于血液淋巴组织细胞及其肿瘤细胞（小鼠骨髓瘤细胞SP2/0、NSO)、转化细胞(Namalwa细胞）、融合细胞（杂交瘤细胞）的培养。
随着规模化培养技术的不断发展，许多贴壁生长细胞如CHO细胞经悬浮驯化后也可进行悬浮培养。
悬浮培养多用于大量生产抗体、疫苗和细胞因子等重组蛋白类药物。
悬浮培养的优点是设备相对比较简单而容积可选择性大，培养容积最大可以达25OOO L。
这种方式培养可连续收集培养细胞或其产物进行分析，也可适时地传代，操作和控制简便。
还有一个优点是传代时无需消化，细胞不会因胰酶和EDTA（乙二胺四乙酸，elhylened iamine lelra acetic acid)的处理以及激烈的机械力分散而受损伤，而且细胞回收率高。
再者，由于细胞呈悬浮生长，而且处千不断搅动的动态生长过程之中，细胞的浓度（细胞数／ml)均一，因此可在线直接监测细胞生长情况，工艺可控性强，细胞的浓度可以得到及时有效的调控，细胞的产岳比较恒定。
悬浮培养的技术关键在于不断搅拌培养液以及连续通气供给CO2和空气，以便使细胞均匀有效地进行营养物质和气体交换（图18-1)，同时不致产生细胞沉降。
总体而言，营养物质和氧气的传递效率较好，培养条件均一。
悬浮培养条件下，渗透压、剪切力、气泡破裂均可引起细胞损伤。
非离子表面活性剂Pluroni c家族可有效保护细胞免受搅拌和通气反应器中的流体机械破坏作用。
常用保护性添加剂包括Plu ronic F68(0.01%-0.1%)，狻甲基纤维素(j%-2%）等。
（二）固定化培养加入细胞，排出CO2,使细胞限制或定位千特定空间位挡的培养技术称之为固定化培养。
几乎所有动物细胞都可采用固定化培养。
固定化培养的制备方法很0.22µm滤膜刁｀多，包括吸附法、共价贴附法、离子／共价交联如果培搅拌培养瓶>50cm,/法、包埋法和微毅化等，常用吸附法和包埋法两大方法。
磁化的旋转摆吸附法是最简单的固定化培养技术，即让细胞在适当的条件下贴附在载体（如陶瓷颗凹人的底-勹芒，屯夕粒、玻璃珠或硅胶颗粒）表面，或附着于中空纤维膜，或附着于培养容器表面。
包埋法是将细胞包埋于多聚物（如蛋白质、碳氢化物等）
等海绵状基质中进行培养的技术。
常用蛋白
速度控制开／关控制信号灯质多聚物有明胶、海藻酸钙疑胶、胶原和纤维图18-1搅拌瓶（容积8L)蛋白质等；对于贴壁依赖性细胞通常采用胶原包埋，而对于非贴壁依赖性细胞则常用海藻酸钙包埋。
最简单的固定`化培养系统是N un c细胞工厂。
该系统由一组长方形的Pe tri培养板组成，总面积可达600-2400cm2（图18-2)。
此外常用的还有中空纤维灌流法（图18-3汃螺旋卷膜培养等。
固定化培养对贴壁依赖性细胞和非贴壁依赖性细胞均适用，其优点在于细胞可维持在较小体积培养液中生长，细胞生长密度可达到很高。
如N un c工厂一次产认可高达3X108-3X l09个细胞。
此外，细胞易于产物分开，有利千产物的分离纯化。
（三）微载体培养
细胞贴附在一定的固相表而进行单层培养的技术称为贴壁细胞培养。
贴壁培养系统主要有滚瓶中空纤维、微载体等，尤以微载体常见。
微载体培养是让细胞吸附于微载体(m i croc釭ri ers)表面或内部进行生长与增殖的细胞培养技术，旋转细胞工厂，短边朝下，放平，使培养面呈水平位，开口位于最上方。
通入5%C02
中断培养液供应使细胞工厂长边
勹了细胞人口大分子产品出口如Vero细胞的培养（图18-4)。
细胞的贴附与细胞表面及t t微载体表面的化学物理性质有关。
微载体表面带有正电荷而细胞表面带有负电荷，这种静电吸引作用使细胞易千贴附于微载体表面。
用于制备微载体的材料首先应对细胞没有毒性作用；其次，应能够承受高压灭菌，并可重复利用。
微载体是直径在150~250µm的透明小颗粒，常用的材料有交联葡聚糖、塑料基质、聚苯乙烯、明胶、玻璃介质、胶原或胶原涂层、纤维素、生物玻璃等。
（四）三维细胞培养
三维细胞培养(three-dimensional cell cultur e, TDCC)是指将具有三维结构不同材料的载体与各种不同种类的细胞在体外共同培养，使细胞能够在载体的三维立体空间结构培养液储存器中迁移、生长，构成三维的细胞载体复合物。
三维培养体系以及氧和CO2交换为细胞提供类似体内生长环境，细胞通过紧密连接和（或）缝隙连接等连接方式建立细胞间及细胞与胞外基质间的联图18-3中空纤维灌流（截面图）系，形成一定的三维结构；这种培养方法获得的细胞在基因培养液通过蠕动泵从培养液储存器循环到培养小室；培养液储存器内进行换气表达、基质分泌及细胞功能活动、细胞分化等方面与传统二和C O2交换维培养的细胞均有明显差异，与体内细胞生长情况更为相似。
三维细胞培养既能保留体内细胞微环境的物质结构基础，又能体现细胞培养的直观性及条件可控性；它将单层细胞培养体系与组织器官及整体研究联系起米，甚至打一定程度上可以替代动物，进行药物研发与毒性试验。
二、细胞融合
细胞融合(cell fu s i o n)，又称细胞杂交(cell hybridization)，是指2个或2个以上的细胞合并成1个细胞的过程，所产生的细胞称杂交细胞(h y bri d)。
该过程涉及质膜的连接与融合，胞质合并，染色体、细胞器以及各种胞质成分的混合。
基因型相同的细胞融合所形成的杂交细胞称为同核体(homokaryon)，基因型不同的细胞融合所形成的杂交细胞称为异核体(he terokaryon)。
细胞融合现象最早是由G.
Bars如等入于1961年图18-4猴肾成纤维细胞Vero在发现，他们将高度恶性与低度恶性肿瘤细胞混合培养，微载体表面上的生长观察到细胞能自发融合产生杂交细胞。
1962年，Y.
Okada和J.
Tadokoro发现利用紫外线灭活的仙台病毒可以促进细胞的融合。
除了灭活的病毒之外，某些化学物质，如聚乙二醇(polyethyleneglycol, PEG)、溶血卵磷脂、油酸等以及物理性刺激，如电场、电脉冲等都可以促进细胞的融合。
细胞融合是否成功最为关键的技术之一在千对杂交细胞的筛选，即挑选出所需要的杂交细胞。
通常有下列三种方法：1抗药性筛选常用HAT培养基筛选。
HAT是由次黄嗦呤(hypoxanthino, H)、氨基蝶呤(aminopterin,A)和胸腺啼唗脱氧核昔(thymidine, T)组成的培养基，其原理是当一种胸腺啼唗核昔激酶缺陷(TK-)细胞与次黄噤呤鸟嗦呤磷酸核糖转移酶缺陷(HGPRT-）细胞融合后所得的是一种既含有TK的能力（图18-5)。
酶又含有HGPRT酶的杂交细胞，只有这两种基因互补的细胞才具有在HAT选择培养基中存活下来性顷。
:`GG酗ig（两个相似的（两个不同的亲代细胞亲代）亲代）同核体细胞亲代细胞2.营养缺陷筛选某些细胞在缺乏某种营养成分的培养基中不能存活，称之为营养缺陷型细胞，如5－漠脱氧尿瞪唗核昔(5-bromouridine deoxyribose)缺陷(BUdR-）细胞。
因此可以利用分裂细胞DNA中因掺入有BUdR而对紫外线更敏感的特性，先用光照来杀伤未融合细胞，再将存活下来的缺陷型细胞培养于完全培养基中使其增殖生长。
3.温度敏感筛选正常哺乳动物细胞可在32~40"C环境中存活，最适温度为37~38"C。
利用化学诱变的方法可使细胞发生突变，然后用非允许温度即38~39屯进行筛选，让温度敏感突变型细胞存活下来，这样的细胞株称为热敏感突变株。
反之，我们也可用低温来筛选，所得到的细胞为冷敏感突变株。
温度敏感突变的机制在于温度依赖性基因的产物只有在一定的温度下才具有功能，非此温度没有活性。
细胞融合技术的不仅为研究细胞的遗传变异、进化、发育等基础研究提供了有利的方法，而且它也是细胞工程的重要工具。
因为借此技术，人们可以在种内、种间、甚至动植物间进行细胞融合，产生新的品种，甚至物种，更可以借此生产单克隆抗体这样的生物制剂，用于临床实践。
在核移植的研究与实践中，最令入瞩目的是克隆羊多利(Dolly)的出生。
1997年2月23日，英国Roslin研究所宣布世界第一头克隆绵羊诞生。
该克隆羊的产生过程如图18-7所示。
首先从一个苏格兰母羊(A)体内取出卵母细胞，将其核去掉成为无细胞核的卵细胞。
再从另一头芬兰母羊(B)的乳腺上皮分离得到体细胞，将其细胞核取出，然后让它与上述去核的卵细胞融合，产生杂交细胞，这种杂交细胞在体外可以发育至痰胚期，然后再将该艇胚（胚泡）植入另一头苏格兰母羊(C)的子宫内，最后生产出小羊。
由于该小羊的遗传特性来源于供核母羊(B)，因此，该小羊是供核母羊的克隆。
母羊(A)主要是提供了细胞核发育所需的营养与环境，而母羊(C)只是＂代孕“母亲。
由于Roslin研究所I.
Wilmut在克隆羊多利中所用的是乳腺细胞核，所以该过程称为体细胞核移植(somatic cell nuclear transfer)。
多利羊的成功在理论上具有重要意义，即证明高度分化的成体体细胞核在成熟卵母细胞中仍然可以被激活并且重新编程(reprogramming)；另外，它还可以发育成为一个完整的个体。
因此，这种核仍然具有分化全能性(totipotency)，但是该细胞核－质间的相互作用过程及机制尚未完全阐明。
随着千细胞技术和核移植技术的快速发展，科学家成功制备了核移植胚胎干(nuclear-tran sfered{,`-'.'; embryonic stem, ntES)细胞。
尽管ntES细胞像ES细胞一样来自痰胚的内细胞团，具有多分化潜能和细胞核移植(nuclear transfer)是指通过显微操作(micromanipulation)将一个细胞的细胞核移植到一个去核的卵母细胞内的技术过程。
1938年德国发育生物学家H.
Spemann最早提出了进行两栖类动物核移植试验的设想。
1953年R.
Briggs和T.
J. King将一个已分化的细胞核移植入去除卵细胞核的豹蛙(Rana pipiens)卵中，观察到这种卵仍然可发育至豹蛙幼体。
1962年，J.
Gurdon将已分化的蜊斛肠上皮细胞核移植入去除细胞核的非洲爪蟾(Xenopus laevis)卵中，得到了发育完全正常的成体爪蟾。
1963年，我国科学家童第周将金鱼的袭胚细胞核植入去核的未受精卵内，首次得到了克隆鱼。
在细胞核移植方法方面，除了可用显微操作仪(micromanipulato1)外，利用游离的细胞核也可进行（图18-6)，即用细胞松弛素(cytochalasin)处理细胞结合离心方法使细胞脱核，然后经PEG将该细胞核融合进另一完整的细胞中，或者融合入一个胞质体内，这种杂交细胞称为胞质杂种(cybrid)，以别于有核间融合所产生的杂交细胞。
盖玻片
昙哥或
气二
细离用及
仿儿
第十八章细胞工程409
．有核卵细胞｀细胞核
`．无核卵细胞
取出细胞叭＠二，兰。
融合细胞融合细胞分裂（胚胎）
高增殖特性，可以向任何一种胚层的细胞发育，但是，它与传统意义上的胚胎干细胞具有很大的区别。
ntES细胞来自核移植胚胎而不是正常发育的胚胎，ntES的遗传物质与供体核完全一致，所以，ntES移植到供核体体内，理论上不会引起免疫排斥反应。
此外，就人胚胎干细胞(hESCs)建系，还可从三原核人受精卵(tripronuclera human zygote)获得二倍体(diploid)或三倍体(triploid)的干细胞，在动物还可从孤雌(parthenogenesis)激活的卵细胞建立千细胞系。
除了理论意义外，体细胞核移植技术更是细胞工程领域中的一个极为重大的突破，因为借此技术人们可以进行同种动物克隆以及异种间的克隆，还可以进行同源克隆(homologous cloning)，即将一个个体的体细胞核植入同一个体的去核的卵母细胞中，由此获得的干细胞植入供核（也供卵母细胞）供体体内不发生免疫排斥。
因此，具有极大的细胞治疗价值。
例如，治疗性克隆(th erape utic cloning)是胚胎干细胞技术与核移植技术相结合，用于产生疾病替代治疗细胞的新技术。
它以患者的体细胞核为供核，将重构胚培育至艇胚，从内细胞团中分离出ES细胞，为患者提供与其自身遗传物质一致的组织细胞或器官用千疾病治疗，这样就可以避免异种或同种间细胞／器官移植的免疫排斥反应。
该技术使许多目前医学上没有有效治疗方案的疾病获得了重新治愈的可能。
另一个核移植技术的应用是生殖性克隆(reproductive cloning)，指的是体细胞核移植后，任其发育直至产生一个新个体。
多利绵羊即是通过生殖性克隆产生的。
生殖性克隆技术应用于人类的实践即为克隆人。
对此，世界多数国家，包括我国政府均坚决反对，但赞同治疗性克隆的研究，因为它可以造福多种疾病的广大患者。
四、基因转移
基因转移(gene tran sfer)指的是将外源基因导入受体细胞并整合至受体细胞的基因组中，使受体细胞遗传性状及表型发生一定改变的技术。
借此过程人们可以选择出所需的新型细胞，乃至新的个体。
若外源基因不但能在动物体内表达，并且可以遗传，则该动物称为转基因动物(transgeni c a nimal)。
一般说来该技术包括如下过程：心选择与提取外源目的基因；＠用一定的方法将外源目的基因导入受体细胞；＠对整合有目的基因的细胞进行筛选、扩增及鉴定；＠若受体为卵细胞，则进行体外培育，并植入合适的动物子宫内；＠筛选并获得转基因动物以及进行后续的所需研究。
由上可知，基因转移是获得转基因动物的核心技术，图18-8示基因转移的基本步骤。
基因转移的方法很多，通常可分为：心物理学方法，包括电穿孔法、显微注射法、裸DNA直接注射法等；＠化学方法，包括DEAE-葡聚糖法、磷酸钙共沉淀法、脂质体包埋法等；＠生物学方法，包括病毒提取DNA或掺入至有扭取RNA并制备cDNA限制性内切酶酶切选择性标记的质粒中1r(.,,,(、在选择性培养基中生长用磷酸钙、脂质体转染或然后检测表达电穿孔技术转染至受体细胞介导法、体细胞核移植法、精子载体法以及胚胎干细胞转染法等。
下面简述几种常用的外源基因导入受体细胞的技术，即细胞转染(transfection)技术。
(—)磷酸钙介导的转染1973年F.
L. Graham等最早采用磷酸钙将外源基因导入哺乳动物细胞，由于该方法操作简单，无需昂贵的设备，迄今仍被实验室广泛采用。
其原理及基本过程是将氯化钙与外源DNA混合，然后加入到含磷酸根离子的溶液中，即可形成钙－磷酸－DNA共沉淀物；接着，该沉淀物可被培养的细胞内吞摄取进入细胞质，随后进入细胞核，DNA整合入细胞基因组中，并最终得到表达。
多种因素可以影响磷酸钙介导的转染效率，其中包括细胞的生长状态（一般以70％汇合为佳）、外源质粒DNA的纯度、所形成的磷酸钙沉淀颗粒的大小以及溶液pH。
为了保证DNA的高纯度、无内毒素，常通过阴离子交换层析提纯或CsCl离心纯化DNA。
（二）脂质体介导的转染
1987年P.
L. Felgne1等建立了阳离子脂质体介导的细胞DNA转染方法，其原理及基本过程是以一种多价阳离子脂质体(lipofectamine)取代单价阳离子载体，当DNA与脂质体通过离子相互作用时，可被直径为600-1200nm阳离子单层脂质体包被形成复合物，该复合物可与培养细胞的细胞膜融合，使DNA进入细胞并整合至受体细胞的基因组中得以表达。
阴离子脂质体也可作为细胞转染的试剂。
与其他转染方法相比，阳离子脂质体的主要优点在于转染成功率较高，70%-80％的离体细胞均可瞬时表达外源基因。
该方法用于大片段DNA、RNA、寡聚核节酸等转染，具有适应性广，细胞毒性较低的优点。
但脂质体作转染试剂比较昂贵，不利于大规模使用。
（三）电穿孔法
当把高浓度细胞悬液短暂地暴露于高压脉冲电流时，DNA可通过高电压在细胞膜上所形成的可复性小孔进入细胞质内，然后整合入细胞的基因组并得到表达。
电穿孔方法可用于对化学法转染不敏感的细胞。
在实践中，一般选择恒定的脉冲，在室温下进行电穿孔，即在500-1500kV/cm的场强下轰击细胞；然后将细胞置于冰上，以延长细胞膜孔道的开放时间。
一般情况下，经轰击后能有20%50％的细胞可以存活下来。
由于贴壁生长的细胞必须附着在培养皿表面才能生长，因此，与贴壁生长的细胞相比，悬浮细胞更适合用电穿孔法进行转染。
另外，该方法所需的细胞及DNA要比化学法更多，而且不同细胞间的最佳转染参数差异较大，因此常须摸索最适实验条件。
（四）病毒感染法
彷，这是一种通过病毒感染途径将外源目的基因导入受体细胞的方法。
根据受体细胞的类型不同，可选择具有不同宿主范围和不同感染途径的病毒基因组作为转染载体。
常用的病毒载体包括DNA病毒载体（腺病蒋载体、腺相关病毒载体、牛疮病毒载体等）和RNA病毒载体（逆转录病毒载体、慢病毒载体等）。
用作基因转染的病毒载体均为复制缺陷型病毒，感染细胞后仅能将基因组整合至细胞，但不能产生包装的病毒颗粒。
在各类病毒载体中，比较常用的是逆转录病毒载体和腺病毒载体。
逆转录病毒(retrovirus)是一种单链RNA病毒，它进入细胞后，在反转录酶作用下，RNA反转录为DNA，由于反转录病毒的长末端重复序列(LTRs)具有转录启动子的活性，因此将外源DNA连接到LTRs下游可进行重组，再包装为高滴度的病毒颗粒；转染方法为病毒直接感染细胞，或者注射病毒至动物体内，携带外源基因的反转录病毒DNA便可整合入受体的基因组内。
诱导多能干细胞即是利用逆转录病毒作为载体将OCT3/4、SOX2、c-myc和RFIA导入小鼠成体细胞而获得的。
腺病毒(adenovirus)为线型双链DNA，无包膜，其优点是安全性好，不整合入人染色体，不会导致肿瘤发生。
此外适用的受体细胞广，有多种血清型(serotypes)选择。
外源基因在载体上容易高效表达。
（五）显微注射法
该方法主要用千制备转基因动物，即在显微操作仪下，实验人员通过玻质注射针将DNA迅速注入受精卯内，通常注入雄性原核内或者在其附近，然后将受精卵移植至假孕动物的输卵管中，最后产生转基因动物。
该方法需要装备较昂贵的显微操作仪（图18-9)，操作人员必须经过培训方能操作自如，保证一定的成功率。
此外，由于成熟卵母细胞数量少，需用超数排卵(superovulation)技术方能获得较多的卵以供实验。
倒置显微镜
注射器卵细胞DNA显微操作仪
显微操作夜＼/
五、细胞重编程
细胞重编程(cellular reprogramming)是指已分化细胞的核基因组恢复其分化前的功能状态。
该技术是不改变基因序列的情况下，通过表观遗传修饰如DNA甲基化来改变细胞的命运，分为多能性重编程和谱系重编程两大类。
利用多能性重编程技术获得的诱导型多能干细胞，或谱系重编程技术获得的组织干细胞或组织细胞，既具有类似胚胎干细胞的多能性，又避开了胚胎干细胞应用的伦理学限制，同时具有患者特异性或疾病特异性，可显著减少免疫反应，因而极大程度缩短药物研发进程，并使细胞治疗的临床应用成为可能。
（一）多能性重编程
多能性重编程(pluripotent reprogramming)是指已分化细胞在特定条件下去分化恢复到全能性或多能性状态，通常可采取核移植、细胞融合、多能细胞提取物共培养以及诱导性重编程等手段实现。
其中，诱导性重编程是细胞重编程的一项重大进展，为干细胞研究领域，乃至整个生命科学领域带来了概念性的革新。
其他重编程技术，如核移植技术涉及伦理问题；而细胞融合方法即将体细胞与胚胎癌细胞、胚胎生殖细胞或者胚胎干细胞进行细胞融合方法得到的重编程细胞是四倍体，存在很大程度的基因组不稳定；使用多能细胞提取物与体细胞共培养依然需要干细胞，依然不能克服伦理学问题。
2006年，日本京都大学Yamanaka实验室利用逆转录病毒介导，将4种转录因子OCT3/4、SOX2、Cmyc和KFI.A导入小鼠分化细胞中，成功逆转了分化过程并得到功能上类似胚胎干细胞的细胞，将其命名为诱导多能千细胞(induced pluripotent stem cell, iPSC)。
iPSC对医学领域最直接的贡献在千为疾病研究提供了体外模型。
一方面，利用从患者身上建立iPSC疾病模型，可以简化疾病模型建立过程，用于疾病发病机制研究；另一方面，iPSC可以为新药开发提供评价模型，用于测试候选药物的疗效、毒性等。
2014年，日本进行了世界首例iPSC应用的临床研究。
科学家将iPSC分化出的视网膜色素上皮细胞移植到患者体内，用千治疗老年性黄斑，这是重编程细胞首次移植到人体内，展示了iPSC在临床疾病治疗方面应用前景。
（二）谱系重编程
谱系重编程(lineage reprogramming)指不经过多能性干细胞阶段，直接将已经分化的成熟细胞（或祖细胞）转换为另外一种成熟细胞或于／祖细胞的重编程策略，包括转分化、去分化、转决定、特定类型的化生等。
转分化(trans-differentiation)是指直接将一类已分化细胞重编程为另一类已分化细胞，且不经过多能性细胞阶段，也称为谱系转换。
去分化(de-differentiation)是指已分化细胞失去原有的分化结构和功能成为未分化细胞的过程；随后可将细胞再分化成另一种细胞。
诱导性重编程即是最彻底的一个去分化过程。
转决定(trans-determination)是指将一种定向的但尚未完全分化的细胞类型重编程为另一种细胞类型，如成体造血干细胞、间充质干细胞的可塑性研究。
化生(metaplas ia)是指组织中一种分化细胞被另一种分化细胞替代的过程，通常由慢性炎症刺激导致，常见的有鳞状上皮化生、肠上皮化生、间叶组织化生等。
SCNT细胞融合iPS谱系转化Oct4~Sox2+0c-Myc1贤腺
转录因子
ES细胞融合细胞ES细胞肝细胞
图18-10细胞重编程的主要策略A体细胞核转移(SCNT)：将体细胞核注射到去核的卵细胞，在体外特殊培养条件下，可以产生ES细胞；B细胞融合：将体细胞与ES细胞融合，可以产生杂合细胞，具备多能ES细胞的一些生物学特性；C.
iPS细胞：将体细胞通过诱导表达某些特定基因转变为多能干细胞，例如导入Oct3/4、Sox2、C-Myc和Kif4基因可以将小鼠成纤维细胞转变为多能干细胞；D谱系转化：例如直接将胰腺细胞转化为肝细胞。
在此过程中，将一种细胞类型转化为另一种细胞的特异性转录因子是非借助细胞工程技术可对细胞的遗传表型进行定向改造并获得新型细胞，以至新的个体。
因此，无论是细胞本身或是细胞的产物在医学实践中均具有广阔的应用领域，尤其是干细胞的研究与技术的兴起与发展，为治疗入类某些以往难以治疗的疾病开辟了前所未有的前景。
—、单克隆抗体的制备
自1975年G.
Kohler和C.
Milstein创建杂交瘤(hybridoma)技术之后，单克隆抗体(monoclonal antibody)已成为科学研究和疾病诊疗中不可缺少的重要工具，它也成为细胞工程中卓有成效的支柱技术之一。
经典的单克隆抗体制备方法是借助于聚二乙醇将不分泌抗体的骨髓瘤细胞与分泌抗体的B淋_巴细胞进行融合，并通过HAT选择培养基筛选得与TK一小鼠到杂交瘤细胞（图18-11)。
杂交瘤细胞从双方亲骨髓瘤细胞融合＼芦臂巨代细胞中获得遗传信息，一方面可如同骨髓瘤细胞那样无限生长，另一方面又如同B淋巴细胞那样分泌抗体。
由这种杂交瘤细胞产生的抗体称为在HAT中长成克隆~\单克隆抗体，它是一种免疫球蛋白，可用ELISA等测定克隆株，方法筛选杂交瘤细胞培养上清液中的抗体，并对$扩增阳性克隆株，阳性细胞进行亚克隆(sub-clone)，确定它们产生检测抗体产物及其特异性，冻存克隆的细胞系抗体的特异性。
由于这种抗体是针对单一表位(epitope)，因此它对于特定抗原具有高亲和力和图18-11杂交瘤的制备高特异性。
单克隆抗体在生物医学研究、临床诊断和治疗方面都得到了广泛的应用，是近年来最为成功的生物技术药物，现已上市73个抗体药物。
在实践中，人们多利用小鼠腹水和离体悬浮培养方法在体内(in vivo)或体外(in vitro)大量制备单克隆抗体。
杂交瘤细胞也可在多种中空纤维系统及搅拌罐生物反应器进行大规模悬浮培养。
二、药用蛋白的生产
用生物工程技术生产的制剂通称为生物制品，其中药用蛋白是重要的类别，包括疫苗（口蹄疫苗、狂犬病毒疫苗、脊髓灰质炎疫苗、牛白血病病毒疫苗、乙型肝炎病毒疫苗、瘛疹病毒I型及II型疫苗、巨细胞病毒疫苗等）、细胞因子（凝血因子Vlil和IX、促红细胞生成素、生长激素、IL-2、神经生长因子等）、免疫调节剂(a、B、丫干扰素）以及单克隆抗体等。
常用的表达系统分为细菌、酵母、昆虫以及哺乳动物细胞四大类。
就制备的方式而言，包括哺乳动物细胞生物反应器和动物生物反应器，其优点是投资少、污染少、工艺相对简单，而且产品的特异性较高等。
哺乳动物细胞生物反应器（下称生物反应器）是指在人工条件下，高密度大量培养动物细胞并生产有应用价值的细胞蛋白质产品的设备。
本章第一节中所介绍的细胞培养系统均属于生物反应器范畴。
20世纪90年代初，美国宇航局的生物反应器(NASA b i oreactor)即为一种旋转培养系统，它以一定的速度转动使得不会发生细胞沉降，并且细胞往往形成三维聚集体以增加产品的生成；当停止转动时，细胞聚集物沉降，此时可收集细胞以及同时更换新鲜培养液。
以转基因动物作为一种生物反应器来生产蛋白质最早由美国K.
Gordon等人于1987年报道，他们以小鼠乳腺细胞表达组织型纤溶酶原激活因子(tPA)。
2009年，美国GTC Biotherapeutics公司研制的世界上第一个利用转基因山羊奶液生产的药物一一重组人抗凝血酶皿(Atryn)上市，标志着转基因动物药物真正迈入产业化时代。
乳腺作为生物反应器具有许多优点：首先，动物乳腺是一个自我封闭的系统，乳腺细胞表达的蛋白质绝大部分随乳汁分泌，不会进入机体的血液系统中，这样便可以避免大量表达的外源型蛋白质干扰宿主动物的生理状况以及可能造成的伤害；此外，不论是转基因牛、绵羊、山羊、兔、或是猪等，它们乳汁的产量较高，而且源源不断，因此，可以获得较多的蛋白产品。
除了乳腺之外，血液、尿液也常是收集蛋白产品的原始材料。
三、疾病的细胞治疗
细胞治疗是将体外培养的具有正常功能的细胞植入患者体内（或直接导入病变部位）以代偿病变细胞（或细胞丢失）所丧失的功能。
另外，也可采用基因工程技术，将所培养的细胞进行体外遗传修饰，然后再将其导入体内，治疗机体的疾病。
(—)干细胞治疗
干细胞是个体的生长发育、组织器官的结构和功能的动态平衡以及其损伤后再生修复等生命现象的细胞学基础（详见第17章）。
正因为干细胞具有这些特性，因此可以用来治疗某些疾病，以替代机体内因细胞衰老退化、死亡或丢失所导致的功能障碍性疾病，即进行干细胞治疗。
截至2016年12月，全球已批准13项干细胞治疗产品。
通常，干细胞的获取、诱导分化以及在疾病治疗中的应用称之为干细胞工程。
1神经系统疾病不少神经系统的疾病都涉及神经元的损伤或死亡。
神经干细胞移植为诸如此类的神经系统疾病的治疗带来了曙光。
帕金森病是大脑黑质(substantia nigra)多巴胺分泌性神经元退化所引起的一种疾病。
黑质是中脑内一个很小的区域，它有协助控制运动的功能，该区的神经元一旦退化、死亡便不能再生。
黑质细胞释放神经递质多巴胺(dopamine)，多巴胺不足或缺如，患者便会出现运动障碍，即不随意肌的颤擂及反复的肌肉运动。
神经干细胞具有被诱导分化成为多巴胺神经元的潜能，将体外扩增的人神经干细胞移植至帕金森病大鼠模型中，能在大鼠体内分化为成熟的多巴胺神经元，并可建立突触连接，改善大鼠模型的帕金森病的症状。
帕金森病入接受人胚中脑组织移植已有十余年的历史，这也为干细胞治疗提供了研究与实践的基础。
2.心肌梗死这是由冠状动脉阻塞引起的心脏疾病。
人胚胎干细胞可被诱导形成胚胎样体，然后自发或诱导生成心肌祖细胞，它们不但具有心肌特征，而且当这些细胞聚集在一起时，它们可起始有规律的搏动，这为心肌梗死的治疗提供了前提（见第十七章）。
此外，间充质干细胞也可被诱导分化为心肌干细胞。
2011年7月，韩国FDA批准了FCB-Pharmicell公司的自体骨髓间充质干细胞上市，可被诱导分化为心肌细胞，用于急性心肌梗死治疗。
3.糖尿病该病的特征是机体不能分泌（或分泌不足）或不能（或有效）利用胰岛素所导致。
2001年美国科学家N.
Lumelsky从小鼠胚胎干细胞中获得可分泌胰岛素的细胞，将它们注入糖尿病小鼠的脾脏内，24小时后发现小鼠不仅可产生胰岛素，血糖水平也恢复正常。
以色列学者S.
Assady证明人胚胎干细胞也可诱导出分泌胰岛素的细胞，这为糖尿病干细胞移植治疗提供了细胞源泉。
此外，用异种细胞（如猪）进行移植的研究也在进行中。
所以选择猪，原因在千猪的生理、解剖结构与人有一定的相似性。
猪胰岛素与人胰岛素结构也极相似。
4.肿瘤对千多数肿瘤，目前1岱床尚无有效治疗手段。
随着干细胞研究的不断深入，干细胞治疗恶性肿瘤的研究也有了一定的进展。
干细胞通过自身多功能分化的特性对肿瘤进行直接杀伤，且干细胞还能对已损伤的机体组织进行修复和治疗，并可以主动修复免疫系统。
目前，造血千细胞移植现已成为根治恶性血液病（白血病、恶性淋巴瘤、多发性骨髓瘤）的有效手段。
间充质干细胞也是一,种骨髓来源的具有多功能分化能力的细胞，间充质干细胞移植是通过采集自体或供体的干细胞，扩增培养后，再由多种途径输入患者体内。
5.其他疾病干细胞研究的逐步深入，可为其他疾病的细胞治疗提供前景。
事实上早在上个世纪由E.
D. Thomus提出的骨髓移植其本质是干细胞治疗。
如今骨髓移植可用于白血病外，也用千再生障碍性贫血以及某些血液遗传性疾病的治疗。
肿瘤放疗或化疗后对造血系统的损伤也可用造血细胞移植的方法来重建及恢复其造血的功能。
此外，体细胞治疗角膜再生、用脂肪干细胞治疗消化道痰管、以干细胞再生肺组织均已取得较好效果。
（二）工程细胞的治疗运用
工程细胞是指采用基因工程手段对体外培养的细胞进行遗传修饰，并由此筛选出可以稳定高水平地表达外源基因的细胞系，进而将这些细胞进行体外扩增后植入患者体内或直接植入病变部位，从而达到治疗效果。
2001年，A.
Marti nez-Serrano利用温度敏感性Hi-85永生化细胞建立了高效神经生长因子(NGF)分泌的细胞系。
该细胞系含有神经生长因子基因的多个拷贝。
将这种细胞移植至切断穹隆的大鼠纹状体及中隔后，仍能持续分泌神经生长因子，并使90％的胆碱能神经元得到恢复。
同时，移植的细胞也能很好地在宿主动物脑组织中存活，并且在结构上已完全整合于受体的脑组织中。
此外发现所移植的工程细胞还能分化为神经胶质细胞，这项研究显示工程细胞的基因治疗在临床应用的可能性。
工程细胞除了用于恢复神经元功能之外，癌症的工程细胞治疗也是研究热点之一。
人们希冀将来源于干细胞的，可杀伤癌细胞的特殊细胞铀定到特定的癌细胞，从而直接将癌细胞杀伤；或是将修饰癌细胞的药物，其中包括可引起癌细胞凋亡的因子，输送至癌细胞，使癌细胞死亡。
由千干细胞具有长期增殖的特性，因此是用千基因治疗的良好细胞载体，该途径即称为千细胞／基因联合治疗(combined stem cell/gene therapy)。
在众多的干细胞中，骨髓间充质干细胞(bone marrow mesenchymal stem cell, BMMSC)比较受到人们的青眯，认为它是一个较为理想的候选细胞。
原因是间充质干细胞具有较大范围的跨系分化能力，此外，骨髓间充质干细胞的来源、分离和培养都比较容易。
例如，将血管内皮生长因子(VEGF)基因导入骨髓间充质干细胞，再诱导其分化为心肌细胞后植入心肌梗死区。
植入的细胞一方面可以替代死亡了的心肌细胞，同时由于VEGF的作用，可以刺激周围血管的形成。
这种将细胞治疗与基因治疗相结合起来的方法，为众多疾病治疗带来新的前景。
诚然，为了避免免疫排斥以及可能的潜在致病因素的影响，载体细胞最好是同一个体的，即用于遗传修饰的细胞最好来源于病入本身。
四、组织工程
组织工程的概念是由R.
Langer和J.
Pavcanti于1987年提出和确定的，是指运用细胞生物学和工程学的原理，研究和开发能修复或改善损伤组织的形态和功能的生物替代物，将其填入机体，恢复失去或下降的功能。
组织工程的基本原理和方法是将可体外扩增的正常组织和细胞吸附于一种生物相容性良好的、可被机体吸收的生物材料上，从而形成具有三维空间结构的复合体；然后将细胞－生物材料复合体植入机体器官的病损部位，替代受损的器官。
细胞在生物材料被机体逐渐吸收的过程中形成了新的具有相应形态结构和功能的器官或组织，恢复器官或组织的功能或部分功能，从而达到修复创伤或是重建的目的。
组织工程的主要研究内容包括如下几个方面：少种子细胞的性质；＠细胞外基质(extracellular matrix, ECM)替代物的研制与开发；＠组织工程化组织(ti ssue engineered tissue)对各种病损组织替代的研究。
其中关键问题是植入组织细胞多大程度可恢复或代偿机体失去的功能以及是否有免疫排斥等问题。
（一）组织工程皮肤
组织工程皮肤可分为三大类型：表皮替代物、真皮替代物和全皮替代物。
表皮替代物由生长在可降解基质或聚合物膜片上的表皮细胞组成，所谓活性绷带(living bandage)即是此类工程皮肤；真皮替代物是含有细胞或不含细胞的基质结构，用来诱导成纤维细胞的迁移、增殖和分泌细胞外基质；全皮替代物包含以上两种成分，既有表皮又有真皮结构。
一般认为，利用表皮于细胞或者混合有表皮千细胞的细胞所构建的真皮可以保持着自我更新能力，有利于皮肤的修复与维持；另外还可以形成较厚的表皮层，恢复皮肤对机体的保护功能。
（二）组织工程肾脏
随着组织工程技术的发展和临床肾脏疾病晚期患者肾脏新供源的迫切需求，组织工程肾脏全器官培养的研究日益深入。
Ross等利用组织工程技术，将大鼠肾细胞外基质和胚胎干细胞通过受鼠肾动脉和输尿管输注，结果发现在受鼠的肾小球，血管和肾小管等处均检测到供者胚胎千细胞源的组织特异性分化细胞。
目前，已经可以制备带有天然细胞外基质的无细胞支架及再种植非人灵长类供肾细胞的组织工程肾脏。
（三）组织工程骨和软骨
骨组织工程多用BMMSC作为种子细胞，通过培养过程中加地塞米松、维生素C或B－甘油磷酸钠等诱导为成骨样细胞，并用骨钙素、钙结节形成、碱性磷酸酶、1型胶原蛋白等来鉴定。
将这种细胞按工程程序培养即可形成组织工程骨。
此外，也可将BMMSC直接注入靶组织，它在局部微环境(niche)发生转分化，形成骨或软骨。
人MSC的培养基中加入一定量的转铁蛋白、丙酮酸、胰岛素、地塞米松、转化生长因子等，则MSC可分化成为呈II型胶原阳性的软骨细胞。
（四）人工工程血管
将内皮细胞和平滑肌细胞联合种植于多孔三维的多聚L－乳酸支架上，可形成血管。
也有学者用成肌细胞(myoblasts)、胚胎成纤维细胞以及内皮细胞联合种植于多聚L-乳酸(PLLA)和多聚乳酸－甘醇酸(PLGA)构成的可降解网格支架上，观察到血管的形成。
工程血管的形成将为器官移植的血液供应提供了前提条件。
（五）组织工程心脏瓣膜
目前对于组织工程心脏瓣膜的研究非常活跃。
其制备方法多样，主要包括：心在体外将细胞种植于生物降解的支架上并在生物反应器内发育成熟形成组织；＠将细胞种植在天然生物降解的支架上；＠通过植入降解组织引导组织再生，即由内源性细胞重塑组织；＠植入脱细胞瓣膜材料；＠利用内源性病理生理过程在体内生成组织。
经典的组织工程模式包括：构建细胞（包括分化不同阶段的干细胞）和细胞赖以生长的支架，然后将细胞／支架复合物放入生物反应器孵育以构建组织，将体外构建的组织植入体内后即发生组织生长和重塑。
此间发生的主要病理生理过程有：心细胞增殖和迁移；＠细胞外基质的生成和组织生长；＠支架降解；＠组织重塑。
体内组织工程瓣膜包含植入的细胞和（或）受者源的新细胞。
（六）其他工程器官
迄今组织工程角膜己比较成熟，其他组织或器官由于体积大、组成细胞多以及功能复杂等因素在实施中还存在一定困难，但已有组织工程膀胱、肝脏、小肠、食管等的报道。
随着对种子细胞及其分化潜能以及支架基质等方面的研究进展，组织工程器官的名单无疑会越来越宽，将对人类目前尚无法治疗的疾病带来光明前景。
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NewJersey：叭ley-Blackwell,2010[2]陈志南工程细胞生物学北京：科学出版社，2013细胞工程是现代生物技术的主要技术之一，它通过细胞融合或拆合、核－质交换或核移植、染色体或基因转移以及细胞培养和筛选，按照预先的设计，产生新细胞的技术。
新细胞的产生可在同种物种，甚至不同物种间进行。
大规模细胞培养是细胞工程的基本技术，实际应用中常用的有悬浮培养、固定化培养和微载体培养。
悬浮培养主要用于大量生产抗体、疫苗、细胞因子等重组蛋白类药物。
固定化培养适用于绝大部分动物细胞培养，细胞可在较小体积培养液中维持较高生长密度。
微载体培养是让细胞吸附于微载体表面或内部进行生长与增殖的技术。
细胞融合是细胞工程的重要工具，是将多个细胞合并成一个细胞的过程，通常用抗药性筛选、营养缺陷筛选及温度敏感筛选等方法荻得融合细胞。
它为研究细胞的遗传变异、进化、发育等基础研究提供了有利的方法，并且可用于生产单克隆抗体。
细胞核移植是将一个细胞的细胞核移植到一个去核的卵母细胞的过程。
其理论意义在于可借此探讨细胞核的全能性、细胞分化的调控，其应用价值在于该项技术可以进行细胞治疗。
基因转移是将外原基因导入受体细胞并整合至受体细胞的基因组中，使之遗传性状及表型发生一定改变的技术。
利用基因转移技术可荻得转基因动物。
常用的基因转移方法有磷酸钙介导的DNA转朵、脂质体介导的转染、电穿孔法、病毒感朵法以及显微注射法。
细胞重编程是指已分化细胞的核基因组恢复其分化前的功能状态。
该技术是不改变基因序列的情况下，通过表观遗传修饰如DNA甲基化来改变细胞的命运，分为多能性重编程和谱系重编程两大类。
细胞工程最有成效的应用是单克隆抗体的制备、生产药用蛋白、细胞治疗和组织过程。
细胞治疗是将体外培养的具有正常功能的细胞植入患者体内（或直接导入病变部位）以代偿病变细胞（或细胞丢失）所丧失的功能。
由这一技术衍生的组织替代技木则称为组织工程。
建立在干细胞基础上的细胞治疗与组织工程研究的不断深入将为多种人类难以治愈的疾病的彻底修复带来曙光。
（陈志南）
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